KR20130098749A - 상염색체 열성질환 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 상염색체 열성질환 진단용 키트 및 상기 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출함으로써 상염색체 열성질의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 키트를 사용하면, 종래에 진단이 어려웠던 상염색체 열성질환을 보다 간단하고 정확하게 진단할 수 있으므로, 상염색체 열성질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

상염색체 열성질환 진단용 키트{A diagnostic kit for autosomal-recessive Mendelian disorders}

본 발명은 상염색체 열성질환 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 상염색체 열성질환 진단용 키트 및 상기 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출함으로써 상염색체 열성질의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

멘델 유전성 질환은 특정한 유전자의 돌연변이로 인하여 독특한 유전양식을 나타내는 질환이다. 일반적으로, 대부분의 멘델 유전성 질환은 효과적이지 않은 치료만이 가능한 어린나이에 나타나는 치명적인 질환이다. 따라서, 수세기 동안 이들 질환의 발생정도를 감소시키기 위한 많은 노력이 수행되어 왔다. 특히, 아슈커나지 유대인과 지중해 영역의 민족 뿐만 아니라 유럽의 코커서스인 및 미국의 민족사이에 널리 퍼져있는 테이-삭스 질환, 낭포성 섬유증 및 겸상 적혈구증과 같은 질환은 이들 장애의 보인자를 검출하는 방법 등의 다양한 접근방법을 사용하여 예방하려는 노력이 계속되고 있다. 군집 스크리닝에 적합한 장애는 일반적으로 상염색체 열성질환이지만, 때로는 X 염색체성 멘델 유전성 질환이 될 수 있다. 이들 질환은 다음과 같은 특징을 갖는다: 첫째, 다양한 인종에서 서로다른 빈도로 발생된다. 둘째, 상기 장애 자체의 빈도는 낮지만, 보인자의 빈도는 상당히 높다. 셋째, 인종 특이적인 돌연변이가 있다. 넷째, 이들 돌연변이 중의 하나 또는 극히 일부는 우성이고, 보인자의 50-90%에서 나타난다.

이러한 멘델 유전성 질환의 일종인 상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs)은 그의 빈도가 매우 낮은 반면(1만명 내지 10만명 중의 하나), 보인자의 빈도는 상대적으로 높다(30명 내지 300명 중의 하나). 더욱이, 환자는 심각한 사회적 및 경제적 문제를 나타내는데 반하여, 보인자는 증상이 없거나 아주 미세하다. 그럼에도 불구하고, 최근의 연구에 의하면, 멘델 유전성 질환의 원인이 되는 유전자의 돌연변이의 보인자는 노년에 발생하는 증상을 갖을 수 있다. 예를 들어, 취약 X 증후군의 보인자는 50세 이후에 FXTAS(fragile X-associated tremor/ataxia syndrome)으로 발전할 수 있고, 고세병의 보인자는 파킨슨씨 병으로 발전할 수 있다. 환자 및 그들의 가족 구성원을 위한 적절한 유전적 상담은 그들의 개인적인 위험성과 다른 가족 구성원의 위험성을 이해하고, 시험, 방어전략 및 감시에 대하여 학습하는데 도움이 될 수 있다.

최근 10년간, 이들 질환과 연관된 많은 유전자들이 규명되었다. 더욱이, 돌연변이 분석은 한국인에서 두드러진 돌연변이 형질을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 이들 멘델 유전성 질환을 뒷받침하는 극히 일부의 제한된 유전자에 대한 보인자의 빈도와 돌연변이의 범위만이 공개되었다. 본 발명에서, 본 발명자들은 3,057명의 한국인 개개인의 유전형을 분석하였다.

본 발명의 하나의 목적은 상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs) 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상염색체 열성질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs) 진단용 키트를 제공한다.

통상적으로, AR-MDs는 상염색체에서 유발되기 때문에 출산직후 발달과정이 일어나기 전에 치료를 받을 경우, 높은 확률로 정상으로 치유될 수 있으나, 출산직후에 전형적인 AR-MDs 증상을 나타내지 못하는 태아에서 AR-MDs가 유발되는지의 여부를 확인하기 위하여는 전체 상염색체의 유전자를 분석하여야만 하지만 모든 태아를 대상으로 하여 전체 상염색체의 유전자를 분석하는 것은 실질적으로 불가능하기 때문에 필연적으로 산전진단을 통해 AR-MDs의 발병여부를 확인하는 방법이 개발되었다. 즉, 상염색체성 열성질환인 AR-MDs는 보인자에서는 발병되지 않지만, 양측부모가 모두 보인자인 경우에는 25%의 확률로 AR-MDs가 유발될 가능성이 있으므로, 임신한 여성이 AR-MDs에 대하여 보인자인지의 여부를 확인하고, 여성이 보인자인 경우 배우자가 AR-MDs에 대하여 보인자인지의 여부를 확인함으로써, 양쪽 부모가 모두 AR-MDs에 대하여 보인자인 태아에 대하여 전체 상염색체의 유전자를 분석함으로써, AR-MDs를 치료할 수 있다.

이러한 방법을 사용하기 위하여는 무엇보다도 AR-MDs에 대하여 보인자인지의 여부를 확인하는 방법의 개발이 요구되며, 이를 위하여 AR-MDs를 유발시킬 수 있는 원인 유전자를 규명하고자 하였다. 본 발명자들은 AR-MDs를 유발시킬 수 있는 원인 유전자를 규명한 결과, G6PC 유전자, TSHR 유전자, ATP7B 유전자, GJB2 유전자, SLC26A4 유전자, PAH 유전자 및 StAR 유전자의 돌연변이를 포함하는 보인자들에서 AR-MDs가 유발됨을 확인하고, 이들 유전자의 구체적인 돌연변이를 규명하고자 하였다. 그 결과, G6PC 유전자의 G122D 또는 c.648G>T, TSHR 유전자의 R450H, ATP7B 유전자의 R778L, A874V, T1029I, G1035V, L1083F, G1186S 또는 N1270S, GJB2 유전자의 V37I 또는 c.235delC, SLC26A4 유전자의 H723R, PAH 유전자의 IVS4-1G>A, Y204C, R241C, R243Q, T278I 또는 Y356X, 및 StAR 유전자의 Q258X를 확인할 수 있었다(표 1).

본 발명의 용어 "G6PC 유전자"란, 포도당 6 인산 가수분해 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 G6PC 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 G6PC 유전자의 돌연변이로는 G122D 또는 c.648G>T가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "진단 마커(diagnosis marker)"란 AR-MDs가 발병하거나 또는 발병할 가능성이 있는 보인자를 정상인과 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명의 용어 "TSHR 유전자"란, 갑상선 자극 호르몬 수용체(thyroid-stimulating hormone receptor)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 TSHR 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 TSHR 유전자의 돌연변이로는 R450H가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs)"이란, 상염색체상의 유전자에 의해 나타나는 열성 질환을 총칭하는 용어로서 사용되며, 구체적으로, 사람의 22쌍의 상염색체중의 어느 곳에 좌위를 차지하는 유전자의 이상에 의한 질환 중 대립유전자의 양쪽이 이상한 개체(aa)에서 발병하지만, Aa 또는 AA 개체에서는 증상이 나타나지 않는 질환을 의미한다. Aa개체(보인자)에서는 체내의 모든 세포에서 해당효소의 활성이 정상의50%이지만, 통상은 활성에 융통성이 있기 때문에 기질 축적 등 생명활동에는 문제가 생기지 않은 것으로 이해된다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 AR-MDs의 발병가능성 여부를 확인하는 것이다.

한편, 보다 효과적으로 AR-MDs를 진단하기 위하여 ATP7B, GJB2, SLC26A4, PAH 및 StAR로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 용어 "ATP7B 유전자"란, copper-transporting ATPase 2를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 ATP7B 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이로는 R778L, A874V, T1029I, G1035V, L1083F, G1186S 또는 N1270S가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "GJB2 유전자"란, gap junction beta 2를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 GJB2 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 8의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 GJB2 유전자의 돌연변이로는 V37I 또는 c.235delC가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "SLC26A4 유전자"란, solute carrier family 26, member 4를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 SLC26A4 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 10의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 SLC26A4 유전자의 돌연변이로는 H723R가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "PAH 유전자"란, phenylalanine hydroxylase를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 PAH 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 12의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 PAH 유전자의 돌연변이로는 IVS4-1G>A, Y204C, R241C, R243Q, T278I 또는 Y356X가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "StAR 유전자"란, steroidogenesis acute regulatory protein을 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 StAR 유전자는 그의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 14의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 될 수 있고, 상기 StAR 유전자의 돌연변이로는 Q258X가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 돌연변이를 검출할 수 있는 수단은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자와 결합하여 돌연변이를 검출하는 수단 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질과 결합하여 돌연변이를 검출할 수 있는 수단이 될 수 있다. 상기 유전자와 결합하여 돌연변이를 검출하는 수단으로는 상기 유전자에 직접적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머 등이 될 수 있고, 상기 유전자로부터 발현된 단백질과 결합하여 돌연변이를 검출할 수 있는 수단으로는 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 결합단백질 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 프라이머는 AR-MDs를 유발시키는 상기 각 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 또는 iPLEX용 프라이머가 될 수 있는데, 바람직하게는 G6PC 유전자의 G122D를 검출할 수 있는 서열번호 15 및 16의 PCR 프라이머, G6PC 유전자의 c.648G>T를 검출할 수 있는 서열번호 17 및 18의 PCR 프라이머, TSHR 유전자의 R450H를 검출할 수 있는 서열번호 19 및 20의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 R778L를 검출할 수 있는 서열번호 21 및 22의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 A874V를 검출할 수 있는 서열번호 23 및 24의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 T1029I를 검출할 수 있는 서열번호 25 및 26의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 G1035V를 검출할 수 있는 서열번호 27 및 28의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 L1083F를 검출할 수 있는 서열번호 29 및 30의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 G1186S를 검출할 수 있는 서열번호 31 및 32의 PCR 프라이머, ATP7B 유전자의 N1270S를 검출할 수 있는 서열번호 33 및 34의 PCR 프라이머, GJB2 유전자의 V37I를 검출할 수 있는 서열번호 35 및 36의 PCR 프라이머, GJB2 유전자의 c.235delC를 검출할 수 있는 서열번호 37 및 38의 PCR 프라이머, SLC26A4 유전자의 H723R를 검출할 수 있는 서열번호 39 및 40의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 IVS4-1G>A를 검출할 수 있는 서열번호 41 및 42의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 Y204C를 검출할 수 있는 서열번호 43 및 44의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 R241C를 검출할 수 있는 서열번호 45 및 46의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 R243Q를 검출할 수 있는 서열번호 47 및 48의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 T278I를 검출할 수 있는 서열번호 49 및 50의 PCR 프라이머, PAH 유전자의 Y356X를 검출할 수 있는 서열번호 51 및 52의 PCR 프라이머, StAR 유전자의 Q258X를 검출할 수 있는 서열번호 53 및 54의 PCR 프라이머, G6PC 유전자의 G122D를 검출할 수 있는 서열번호 55의 iPLEX용 프라이머, G6PC 유전자의 c.648G>T를 검출할 수 있는 서열번호 56의 iPLEX용 프라이머, TSHR 유전자의 R450H를 검출할 수 있는 서열번호 57의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 R778L를 검출할 수 있는 서열번호 58의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 A874V를 검출할 수 있는 서열번호 59의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 T1029I를 검출할 수 있는 서열번호 60의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 G1035V를 검출할 수 있는 서열번호 61의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 L1083F를 검출할 수 있는 서열번호 62의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 G1186S를 검출할 수 있는 서열번호 63의 iPLEX용 프라이머, ATP7B 유전자의 N1270S를 검출할 수 있는 서열번호 64의 iPLEX용 프라이머, GJB2 유전자의 V37I를 검출할 수 있는 서열번호 65의 iPLEX용 프라이머, GJB2 유전자의 c.235delC를 검출할 수 있는 서열번호 66의 iPLEX용 프라이머, SLC26A4 유전자의 H723R를 검출할 수 있는 서열번호 67의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 IVS4-1G>A를 검출할 수 있는 서열번호 68의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 Y204C를 검출할 수 있는 서열번호 69의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 R241C를 검출할 수 있는 서열번호 70의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 R243Q를 검출할 수 있는 서열번호 71의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 T278I를 검출할 수 있는 서열번호 72의 iPLEX용 프라이머, PAH 유전자의 Y356X를 검출할 수 있는 서열번호 73의 iPLEX용 프라이머, StAR 유전자의 Q258X를 검출할 수 있는 서열번호 74의 iPLEX용 프라이머 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 진단마커인 돌연변이된 G6PC 유전자, TSHR 유전자, ATP7B 유전자, GJB2 유전자, SLC26A4 유전자, PAH 유전자 또는 StAR 유전자로부터 발현된 돌연변이 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 AR-MDs이 의심되는 환자의 시료로부터 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하는 AR-MDs의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "환자의 시료"란, 돌연변이된 G6PC 유전자, TSHR 유전자, ATP7B 유전자, GJB2 유전자, SLC26A4 유전자, PAH 유전자 또는 StAR 유전자가 발현되는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

보다 효과적으로 AR-MDs를 진단하기 위하여 ATP7B, GJB2, SLC26A4, PAH 및 StAR로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 이때, 상기 각 유전자의 돌연변이는 앞서 기술한 바와 동일하다.

본 발명의 진단용 키트를 사용하면, 종래에 진단이 어려웠던 상염색체 열성질환을 보다 간단하고 정확하게 진단할 수 있으므로, 상염색체 열성질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

한국인에서 다수의 질환 발생이 보고 된 질환(발생률 1:3,000 이상) 또는 발생률은 낮지만 보인자 확인이 진단의 추적 관찰 및 적절한 시기의 치료에 도움이 되는 질환 6가지와 각 질환의 주요 돌연변이 20개를 문헌 고찰과 한국인 환자 분석을 통해 선정하였다. 선정된 질환은 윌슨병, 비증후군성 감각신경성 난청, Ia형 당원축적병, 페닐케톤뇨증, 선천성 갑상선 기능 저하증, 선천성 부신 증식증 이다. 건강한 한국인 성인 3,057명에서 MALDI-TOF 질량분석기(Sequenom)를 이용한 고효율 다중 분석으로 61,140개의 유전자형을 분석하였다

실시예 1-1: 연구 집단

연구집단은, 2007년 4월부터 2010년 8월까지 단일 기관의 건강증진센터로부터 고용된 15-69세의 3,057명의 관련성 없는 한국인으로 구성되었다. 고지에 입각한 동의 후에, 모든 대상자로부터 말초혈액을 수집하고, 상기 기관의 심의위원회에 의하여 본 연구가 승인되었다.

실시예 1-2: 연구 질환 및 표적 돌연변이의 선별

한국인 집단에서 문헌검토에 의한 연구 및 환자 분석을 위하여, WD(Wilson disease), NSHL(non-syndromic hearing loss), GSD Ia(glycogen storage disease type Ia), PKU(phenylketonuria), CH(congenital hypothyroidism), 및 CLAH(congenital lipoid adrenal hyperplasia)를 포함하는 6개의 서로 다른 질환과 상기 각 질환의 20개의 일반적인 돌연변이를 임의로 선별하였다.

연구할 질환의 선별기준은 다음과 같다; 1) 한국인 집단에서 상대적으로 일반적이거나(3만명 중의 1인 이상); 또는 2) 발병율이 낮더라도, 보인자 검출이 질환의 감시 및 환자를 위한 적절한 치료적 중재의 장점을 갖고; 및 3) 돌연변이 영역 자료가 한국인 환자에게 유용할 것(표 1).

실시예 1-3: DNA 준비 및 질량분석법

QIAamp DNA Blood Maxi kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여, 게놈 DNA를 말초혈액의 백혈구에서 분리하였다. 1-4년동안 -80°C에서 보관한 후, 10 ng의 게놈 DNA를 PCR 증폭시에 주형으로 사용하였다. 표적 서열을 MassArray Assay Design software v3.1.2.5(Sequenom)를 사용하여 업로드하고, 표적 돌연변이를 감싸는 약 80-120bp의 서열을 선택하였다. 선택된 돌연변이 서열을 검출하기 위한 프라이머는 표적 돌연변이의 근처 염기에서 종결되도록 설계되었다(서열번호 15 내지 54). 질량분석법은 각 유전형에 특이적인 구별되는 질량의 단일 프라이머(서열번호 55 내지 74)를 사용한 iPLEX 반응에 이어지는 multiplex primary PCR 방법에 응용되었다. 상기 반응을 통해서 확장되지 않은 것으로 확인된 프라이머는 목적하는 돌연변이가 없다는 것을 나타내지만, 특이적으로 확장된 것으로 확인된 프라이머는 돌연변이가 존재함을 입증하고, 특이적인 유전형의 확인을 허용하는 것으로 분석되었다.

실시예 1-4: 1차 PCR

384개의 PCR 반응을 위하여 1820.2㎕의 PCR 칵테일을 준비하였다. 상기 PCR 칵테일은 물 875.5㎕, PCR 완충액 230.4㎕, 25 mM MgCl₂ 184.3㎕, dNTP mix(각각 25 mM) 23.1㎕, primer mix(각각 500 nM) 460.8㎕ 및 PCR 효소(5 U/μL) 46.1㎕를 포함하도록 하였다. 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 게놈 DNA(5-10ng/㎕) 1㎕를 가하고, 4㎕의 PCR 칵테일을 분주하였다. 그런 다음, 상기 플레이트를 5㎕ 부피의 384-웰 포맷의 열 교환기(Model T1 plus; Biometra, Goetingen, Germany)에 적용하였다(denaturation 94℃ 4분, 45 cycles(denaturation 94℃ 20초, annealing 56℃ 30초, extension 72℃ 1분), final extension 72℃ 3분).

실시예 1-5: iPLEX 반응

iPLEX 반응혼합액 2㎕를 탈인산화된 PCR 반응혼합액에 가하였다. 단일염기 신장반응은 Biometra T1 plus를 사용하여 수행하였다(denaturation 94℃ 30초, 40 cycles(denaturation 94℃ 5초, annealing 52℃ 5초, extension 80℃ 5초), extension 72℃ 3분). 상기 반응이 종료된 후에, 반응산물을 MassARRAY Nanodispenser(Sequenom)를 이용하여 384-spot SpectroCHIP 상에 정렬시켰다.

실시예 1-6: MALDI - TOF MS 분석

시료를 약 30분동안 각각의 384-웰 chip에서 MassARRAY Analyzer Compact (Sequenom)로 분석하였다. 각 분석용 피크 높이 및 신호-대-잡음비와 피크의 확률통계에 기초한 각 신호용 확률값에 대한 자세한 정보는 각 시료별로 검토되었다. 상기 분석법을 사용하여, 각 신호용 확률값을 자동적으로 계산하고, 보수적, 중간적 및 적극적 호출의 결과를 세단계의 수준으로 자동적으로 분석하였다. 보수적 호출이 호출되지 않은 유전자형의 가장 낮은 비율을 나타내는 반면, 적극적 호출은 더욱 심한 오류율(<1%)을 나타내었다. 클러스터 플롯 소프트웨어 모듈은 비정형 이형접합 및 동형접합 상태를 시각화 하는 데 사용되었다.

실시예 1-7: Sanger 의 서열결정법에 의한 MALDI - TOF MS 방법의 검증

본 발명자들은 본 발명을 위하여 디자인한 프라이머 염기쌍을 이용한 Sanger 서열결정법을 이용하여, 각 유전자 시료의 선택적 세트를 검증하였다. MALDI-TOF MS 분석에서 이형접합 변이를 나타내는 총 209개의 시료를 대상으로 하여 Sanger 서열결정법을 수행하였다. Sanger 서열결정법은 ABI Prism 3100xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었고, 서열은 서열결정 프로그램을 이용하여 야생형 서열을 참조로 사용하여 분석되었다. 본 발명자들은 Human Genome Variation Society(www.hgvs.org/mutnomen)에 서열변이를 기록하고, cDNA 수준에서 번역시작코돈 ATG의 뉴클레오티드 A를 +1로서 지정하며, 단백질 수준에서 이에 상응하는 메티오닌을 +1로서 지정하였다.

실시예 1-8: 통계 분석

본 발명자들은 상기 6개 질환의 각각에 대한 보인자 빈도를 산출하기 위하여 충분한 수의 환자를 포함하도록 하였다. 보인자 빈도는 연구집단에서 총 인원수에 대한 이형접합자의 수로서 정의되었는데, 이는 형질빈도의 약 두배였다. 보인자 빈도는 직접적으로 계수함에 의하여 산출되었고, 본 발명에서 발견된 보인자 빈도를 95% 신뢰구간을 사용하여 다른 집단을 위해 보고된 것과 비교하였다. 산출된 총 보인자 빈도는 유전자형 빈도에서 추론 되었다. 모든 통계 분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

실시예 2: 결과

본 발명자들은 멘델 유전성 질환을 갖는 한국인 환자에서 상대적으로 높은 빈도로 발생하는 질병유발 돌연변이의 보인자를 식별하기 위하여, 총 3,057명의 관련없는 한국인을 조사하였다. 그 중에서 201명은 한가지 돌연변이의 보인자이고, 8명은 멘델 유전성 질환의 발병과 관련된 서로 다른 유전자에서 2가지 돌연변이의 보인자임을 확인하였다. 따라서, 총 보인자 빈도는 15분의 1(6.7 %)임을 확인하였다.

실시예 2-1: WD 의 분석결과

ATP7B 유전자(NM_000053.2)에서 7개의 돌연변이 p.R778L, p.A874V, p.T1029I, p.G1035V, p.L1083F, p.G1186S 및 p.N1270S가 발견되었다. 표 2는 3,057명의 한국인에서 발견된 WD 돌연변이된 대립 유전자의 빈도를 나타낸다.

상기 표 2에서 보듯이, 36명은 WD에 관련된 ATP7B 유전자의 7개의 돌연변이 중 하나의 보인자로 확인되었다. 따라서, WD 관련 돌연변이의 보인자 빈도는 85분의 1임을 확인하였다. 가장 일반적인 돌연변이는 191분의 1의 빈도로 나타나고, 보인자의 44.4%에 존재하는 p.R778L이다. p.N1270S와 p.A874V 돌연변이는 각각 보인자의 22.2%와 19.4%에서 발견되었다.

실시예 2-2: NSH 의 분석결과

3,057명의 한국인에서 GJB2 유전자(NM_004004.5)에서 발견된 두개의 돌연변이(c.235delC 및 p.V37I)와 SLC26A4 유전자(NM_000441.1)에서 발견된 하나의 돌연변이(p.H723R)가 확인되었다. 75명은 GJB2 유전자에 존재하는 두개의 돌연변이 중의 하나의 보인자로 확인되었고(표 3), 41명은 SLC26A4 유전자에 존재하는 p.H723R 돌연변이의 보인자로 확인되었다(표 4). GJB2 유전자에서 돌연변이의 총 보인자는 41분의 1이고, SLC26A4 유전자에서 돌연변이의 총 보인자는 75분의 1이었다.

SLC26A4 유전자에서 H723R 돌연변이의 보인자 빈도

연구그룹	연구집단	검사수	검출된 수	보인자 빈도(%)	95% 신뢰구간
본 발명 Park et al. (2003) Koji et al. (2003)	한국인 한국인 일본인	3057 120 96	41 2 1	1:75 (1.34) 1:60 (1.67) 1:96 (1.04)	0.93-1.75 0-3.96 0-3.07

실시예 2-3: GSD Ia 의 분석결과

17명이 G6PC 유전자(NM_000151)에서 공지된 두개의 돌연변이 중의 하나의 보인자로 확인되었다(11명은 c.648G>T의 보인자이고, 6명은 p.G122D의 보인자이다). 보인자 빈도는 180분의 1로 추정되었다(표 5). 한국인에서 발견된 가장 일반적인 돌연변이는 278분의 1의 보인자 빈도로서 보인자들의 64.7%에서 발견되는 c.648G>T로 확인되었다.

본 발명의 질환발생율 및 검출된 보인자 빈도

질환	발생율	보인자의 수(n=3057)	돌연변이의 보인자 빈도(%)	95% 신뢰구간(%)	각 장애의 예상 총 보인자 빈도	95% 신뢰구간(%)
WD NSHL GJB2-관련 SLC26A4-관련 GSD Ia PKU CH CLAH	1:30,000 1:1000 1:100,000 1:41,000 1:3,500 1:300,000	36 116 75 41 17 11 20 18	1:85 (1.18) 1:27 (3.80) 1:41 (2.45) 1:75 (1.34) 1:180 (0.56) 1:278 (0.36) 1:153 (0.65) 1:170 (0.59)	0.71-1.65 3.12-4.48 1.91-3.00 0.94-1.74 0.28-0.82 0.15-0.57 0.37-0.93 0.32-0.86	1:51 (1.95) - 1:161 (0.62) 1:118 (0.85) - 1:135 (0.74)	1.46-2.44 - 0.48-0.76 0.53-1.17 - 0.44-1.04

실시예 2-4: PKU 의 분석결과

본 발명자들은 3,057명의 한국인의 PAH 유전자(NM_000277.1)에서 다음과 같은 6개의 돌연변이를 검출하고, 11명이 상기 6개 돌연변이 중의 하나의 보인자임을 확인하였다: c.442-1G>A( IVS4-1G>A), p.Y204C, p.R241C, p.R243Q, p.T278I 및 p.Y356X. 이로부터 보인자의 빈도가 278분의 1임을 확인하였다(표 5). 가장 일반적인 돌연변이는 437분의 1의 보인자 빈도로서 보인자들의 63.6%에서 발견되는 p.R243Q로 확인되었다. p.Y204C 또는 p.Y356X 돌연변이는 확인되지 않았다.

실시예 2-5: CH 의 분석결과

본 발명자들은 한국인의 모든 돌연변이 TSHR 대립형질의 50%를 차지하는 TSHR 유전자(NM_000369)의 p.R450H 돌연변이를 검출한 결과, 20명이 상기 p.R450H 돌연변이의 보인자임을 확인하였다. 이는 153분의 1의 보인자 빈도에 해당하였다.

실시예 2-6: CLAH 의 분석결과

3,057명의 개인에서 StAR 유전자(NM_000349.2)에서 p.Q258X 돌연변이가 발견되었고, 18명이 상기 돌연변이의 보인자임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 연구집단에서 CLAH에 대한 보인자 빈도는 170분의 1로 확인되었다(표 5).

상기 실시예 2-1 내지 2-6의 결과를 종합하면, 본 발명의 AR-MDs를 유발시킬 수 있는 G6PC 유전자, TSHR 유전자, ATP7B 유전자, GJB2 유전자, SLC26A4 유전자, PAH 유전자 및 StAR 유전자의 돌연변이를 검출함으로써 AR-MDs를 진단할 수 있는 키트를 사용하면, AR-MDs의 보인자 여부를 확인할 수 있으므로, 보다 효과적인 AR-MDs의 산전진단에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> A diagnostic kit for autosomal-recessive Mendelian disorders <130> PA110946/KR <160> 74 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3096 <212> DNA <213> G6PC <400> 1 tagcagagca atcaccacca agcctggaat aactgcaagg gctctgctga catcttcctg 60 aggtgccaag gaaatgagga tggaggaagg aatgaatgtt ctccatgact ttgggatcca 120 gtcaacacat tacctccagg tgaattacca agactcccag gactggttca tcttggtgtc 180 cgtgatcgca gacctcagga atgccttcta cgtcctcttc cccatctggt tccatcttca 240 ggaagctgtg ggcattaaac tcctttgggt agctgtgatt ggagactggc tcaacctcgt 300 ctttaagtgg attctctttg gacagcgtcc atactggtgg gttttggata ctgactacta 360 cagcaacact tccgtgcccc tgataaagca gttccctgta acctgtgaga ctggaccagg 420 gagcccctct ggccatgcca tgggcacagc aggtgtatac tacgtgatgg tcacatctac 480 tctttccatc tttcagggaa agataaagcc gacctacaga tttcggtgct tgaatgtcat 540 tttgtggttg ggattctggg ctgtgcagct gaatgtctgt ctgtcacgaa tctaccttgc 600 tgctcatttt cctcatcaag ttgttgctgg agtcctgtca ggcattgctg ttacagaaac 660 tttcagccac atccacagca tctataatgc cagcctcaag aaatattttc tcattacctt 720 cttcctgttc agcttcgcca tcggatttta tctgctgctc aagggactgg gtgtagacct 780 cctgtggact ctggagaaag cccagaggtg gtgcgagcag ccagaatggg tccacattga 840 caccacaccc tttgccagcc tcctcaagaa cctgggcacg ctctttggcc tggggctggc 900 tctcaactcc agcatgtaca gggagagctg caaggggaaa ctcagcaagt ggctcccatt 960 ccgcctcagc tctattgtag cctccctcgt cctcctgcac gtctttgact ccttgaaacc 1020 cccatcccaa gtcgagctgg tcttctacgt cttgtccttc tgcaagagtg cggtagtgcc 1080 cctggcatcc gtcagtgtca tcccctactg cctcgcccag gtcctgggcc agccgcacaa 1140 gaagtcgttg taagagatgt ggagtcttcg gtgtttaaag tcaacaacca tgccagggat 1200 tgaggaggac tactatttga agcaatgggc actggtattt ggagcaagtg acatgccatc 1260 cattctgccg tcgtggaatt aaatcacgga tggcagattg gagggtcgcc tggcttattc 1320 ccatgtgtga ctccagcctg ccctcagcac agactctttc agatggaggt gccatatcac 1380 gtacaccata tgcaagtttc ccgccaggag gtcctcctct ctctacttga atactctcac 1440 aagtagggag ctcactccca ctggaacagc ccattttatc tttgaatggt cttctgccag 1500 cccattttga ggccagaggt gctgtcagct caggtggtcc tcttttacaa tcctaatcat 1560 attgggtaat gtttttgaaa agctaatgaa gctattgaga aagacctgtt gctagaagtt 1620 gggttgttct ggattttccc ctgaagactt acttattctt ccgtcacata tacaaaagca 1680 agacttccag gtagggccag ctcacaagcc caggctggag atcctaactg agaattttct 1740 acctgtgttc attcttaccg agaaaaggag aaaggagctc tgaatctgat aggaaaagaa 1800 ggctgcctaa ggaggagttt ttagtatgtg gcgtatcatg caagtgctat gccaagccat 1860 gtctaaatgg ctttaattat atagtaatgc actctcagta atgggggacc agcttaagta 1920 taattaatag atggttagtg gggtaattct gcttctagta ttttttttac tgtgcataca 1980 tgttcatcgt atttccttgg atttctgaat ggctgcagtg acccagatat tgcactaggt 2040 caaaacattc aggtatagct gacatctcct ctatcacatt acatcatcct ccttataagc 2100 ccagctctgc tttttccaga ttcttccact ggctccacat ccaccccact ggatcttcag 2160 aaggctagag ggcgactctg gtggtgcttt tgtatgtttc aattaggctc tgaaatcttg 2220 ggcaaaatga caaggggagg gccaggattc ctctctcagg tcactccagt gttactttta 2280 attcctagag ggtaaatatg actcctttct ctatcccaag ccaaccaaga gcacattctt 2340 aaaggaaaag tcaacatctt ctctcttttt tttttttttt gagacagggt ctcactatgt 2400 tgcccaggct gctcttgaat tcctgggctc aagcagtcct cccaccctac cacagcgtcc 2460 cgcgtagctg ggactacagg tgcaagccac tatgtccagc tagccaactc ctccttgcct 2520 gcttttcttt ttttttcttt ttttgagacg gcgcacctat cacccaggct ggagtggagt 2580 ggcacgatct tggctcactg caacctcttc ctcctggttc aagcgattct catgtctcag 2640 cctcctcagt agctaggact accggcgtgc accaccatgc caggctaatt tttatatttt 2700 tagaatttta gaagagatgg gatttcatca tgttggccag gctggtctcg aactcctgac 2760 ctcaagtgat ccacctgcct tggcctccca aggtgctagg attacaggca tgagccaccg 2820 caccgggccc tccttgcctg tttttcaatc tcatctgata tgcagagtat ttctgcccca 2880 cccacctacc ccccaaaaaa agctgaagcc tatttatttg aaagtccttg tttttgctac 2940 taattatata gtataccata cattatcatt caaaacaacc atcctgctca taacatcttt 3000 gaaaagaaaa atatatatgt gcagtatttt attaaagcaa cattttattt aagaataaag 3060 tcttgttaat tactatattt tagatgcaat gtgatc 3096 <210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> G6PC <400> 2 Met Glu Glu Gly Met Asn Val Leu His Asp Phe Gly Ile Gln Ser Thr 1 5 10 15 His Tyr Leu Gln Val Asn Tyr Gln Asp Ser Gln Asp Trp Phe Ile Leu 20 25 30 Val Ser Val Ile Ala Asp Leu Arg Asn Ala Phe Tyr Val Leu Phe Pro 35 40 45 Ile Trp Phe His Leu Gln Glu Ala Val Gly Ile Lys Leu Leu Trp Val 50 55 60 Ala Val Ile Gly Asp Trp Leu Asn Leu Val Phe Lys Trp Ile Leu Phe 65 70 75 80 Gly Gln Arg Pro Tyr Trp Trp Val Leu Asp Thr Asp Tyr Tyr Ser Asn 85 90 95 Thr Ser Val Pro Leu Ile Lys Gln Phe Pro Val Thr Cys Glu Thr Gly 100 105 110 Pro Gly Ser Pro Ser Gly His Ala Met Gly Thr Ala Gly Val Tyr Tyr 115 120 125 Val Met Val Thr Ser Thr Leu Ser Ile Phe Gln Gly Lys Ile Lys Pro 130 135 140 Thr Tyr Arg Phe Arg Cys Leu Asn Val Ile Leu Trp Leu Gly Phe Trp 145 150 155 160 Ala Val Gln Leu Asn Val Cys Leu Ser Arg Ile Tyr Leu Ala Ala His 165 170 175 Phe Pro His Gln Val Val Ala Gly Val Leu Ser Gly Ile Ala Val Thr 180 185 190 Glu Thr Phe Ser His Ile His Ser Ile Tyr Asn Ala Ser Leu Lys Lys 195 200 205 Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Phe Leu Phe Ser Phe Ala Ile Gly Phe Tyr 210 215 220 Leu Leu Leu Lys Gly Leu Gly Val Asp Leu Leu Trp Thr Leu Glu Lys 225 230 235 240 Ala Gln Arg Trp Cys Glu Gln Pro Glu Trp Val His Ile Asp Thr Thr 245 250 255 Pro Phe Ala Ser Leu Leu Lys Asn Leu Gly Thr Leu Phe Gly Leu Gly 260 265 270 Leu Ala Leu Asn Ser Ser Met Tyr Arg Glu Ser Cys Lys Gly Lys Leu 275 280 285 Ser Lys Trp Leu Pro Phe Arg Leu Ser Ser Ile Val Ala Ser Leu Val 290 295 300 Leu Leu His Val Phe Asp Ser Leu Lys Pro Pro Ser Gln Val Glu Leu 305 310 315 320 Val Phe Tyr Val Leu Ser Phe Cys Lys Ser Ala Val Val Pro Leu Ala 325 330 335 Ser Val Ser Val Ile Pro Tyr Cys Leu Ala Gln Val Leu Gly Gln Pro 340 345 350 His Lys Lys Ser Leu 355 <210> 3 <211> 4410 <212> DNA <213> TSHR <400> 3 cctcctccac agtggtgagg tcacagcccc ttggagccct ccctcttccc acccctcccg 60 ctcccgggtc tcctttggcc tggggtaacc cgaggtgcag agctgagaat gaggcgattt 120 cggaggatgg agaaatagcc ccgagtcccg tggaaaatga ggccggcgga cttgctgcag 180 ctggtgctgc tgctcgacct gcccagggac ctgggcggaa tggggtgttc gtctccaccc 240 tgcgagtgcc atcaggagga ggacttcaga gtcacctgca aggatattca acgcatcccc 300 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ctaaagcctc aaaacaaagg cctaattcta tgcctgtctt aattttcttt cacttaagtt 1140 agttccactg agaccccagg ctgttagggg ttattggtgt aaggtacttt catattttaa 1200 acagaggata tcggcatttg tttctttctc tgaggacaag agaaaaaagc caggttccac 1260 agaggacaca gagaaggttt gggtgtcctc ctggggttct ttttgccaac tttccccacg 1320 ttaaaggtga acattggttc tttcatttgc tttggaagtt ttaatctcta acagtggaca 1380 aagttaccag tgccttaaac tctgttacac tttttggaag tgaaaacttt gtagtatgat 1440 aggttatttt gatgtaaaga tgttctggat accattatat gttccccctg tttcagaggc 1500 tcagattgta atatgtaaat ggtatgtcat tcgctactat gatttaattt gaaatatggt 1560 cttttggtta tgaatacttt gcagcacagc tgagaggctg tctgttgtat tcattgtggt 1620 catagcacct aacaacattg tagcctcaat cgagtgagac agactagaag ttcctagtga 1680 tggcttatga tagcaaatgg cctcatgtca aatatttaga tgtaattttg tgtaagaaat 1740 acagactgga tgtaccacca actactacct gtaatgacag gcctgtccaa cacatctccc 1800 ttttccatga ctgtggtagc cagcatcgga aagaacgctg atttaaagag gtcgcttggg 1860 aattttattg acacagtacc atttaatggg gaggacaaaa tggggcaggg gagggagaag 1920 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atcaaaatgg tgccatatca ctgatcttct cactcaaaga 600 agaagttggt gcattggcca aagtattgcg cttatttgag gagaatgatg taaacctgac 660 ccacattgaa tctagacctt ctcgtttaaa gaaagatgag tatgaatttt tcacccattt 720 ggataaacgt agcctgcctg ctctgacaaa catcatcaag atcttgaggc atgacattgg 780 tgccactgtc catgagcttt cacgagataa gaagaaagac acagtgccct ggttcccaag 840 aaccattcaa gagctggaca gatttgccaa tcagattctc agctatggag cggaactgga 900 tgctgaccac cctggtttta aagatcctgt gtaccgtgca agacggaagc agtttgctga 960 cattgcctac aactaccgcc atgggcagcc catccctcga gtggaataca tggaggaaga 1020 aaagaaaaca tggggcacag tgttcaagac tctgaagtcc ttgtataaaa cccatgcttg 1080 ctatgagtac aatcacattt ttccacttct tgaaaagtac tgtggcttcc atgaagataa 1140 cattccccag ctggaagacg tttctcaatt cctgcagact tgcactggtt tccgcctccg 1200 acctgtggct ggcctgcttt cctctcggga tttcttgggt ggcctggcct tccgagtctt 1260 ccactgcaca cagtacatca gacatggatc caagcccatg tatacccccg aacctgacat 1320 ctgccatgag ctgttgggac atgtgccctt gttttcagat cgcagctttg cccagttttc 1380 ccaggaaatt ggccttgcct ctctgggtgc 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acgttggatg cttttcatcc cagcttgcac 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgaaaggaga gccctaaaga gtaggttgca 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 acgttggatg cttttcatcc cagcttgcac 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 cgaaaggaga gccctaaaga gtaggttgca 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 acgttggatg ggaaaagatg gcgctcattg 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ccgaacctag gtacagacta gtaggttgca 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 acgttggatg gagaagcttt ggcttctctg 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cataagggac gacgtagggt gtaggttgca 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 acgttggatg attctcctac ctcctactgc 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtccacctaa aacggttggt gtaggttgca 30 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ttttctcatt accttcttcc t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 acgtagtata cacctgctgt g 21 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 aggttgcaca tgagaaag 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tccaagtgtt ccagccac 18 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ccgcaatgtg catttataga cccc 24 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gcgacatggg taatggtgcc a 21 <210> 61 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tggcaccatt acccatg 17 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gaagtatccc aaggtctctg ttccaa 26 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ggcagaagca gaagatac 18 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 ccaaggccgg ggagtca 17 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ccgttttcgc attatgatcc tc 22 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aacacgaaga tcagctgcag g 21 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gctgtagata gagtatagca tca 23 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 caacatcagg tgtctctttt ctccta 26 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gggaaaaatg tgattgtact ca 22 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 ttcatcccag cttgcactgg tttc 24 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 cactggtttc cgcctcc 17 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 cagtactcac ggttcgggg 19 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggcttctctg ataagca 17 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gggccaagag catcatcaac 20

Claims (19)

1. G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs) 진단용 키트.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 G6PC 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 G6PC 유전자의 돌연변이는 G122D 또는 c.648G>T인 것인 키트
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 TSHR 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 TSHR 유전자의 돌연변이는 R450H인 것인 키트.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 수단은 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머인 것인 키트.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 프라이머는 서열번호 15 내지 20 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 PCR 프라이머 또는 서열번호 55 내지 57 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 iPLEX용 프라이머인 것인 키트.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 수단은 돌연변이된 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인 것인 키트.
   
9. 제1항에 있어서,
   ATP7B, GJB2, SLC26A4, PAH 및 StAR로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 수단을 추가로 포함하는 것인 키트.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 ATP7B 유전자는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 GJB2 유전자는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 8의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 SLC26A4 유전자는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 10의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 PAH 유전자는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 12의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 StAR 유전자는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 14의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 R778L, A874V, T1029I, G1035V, L1083F, G1186S 및 N1270S로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 키트.
    
12. 제9항에 있어서,
    상기 GJB2 유전자의 돌연변이는 V37I 또는 c.235delC인 것인 키트.
    
13. 제9항에 있어서,
    상기 SLC26A4 유전자의 돌연변이는 H723R인 것인 키트.
    
14. 제9항에 있어서,
    상기 PAH 유전자의 돌연변이는 IVS4-1G>A, Y204C, R241C, R243Q, T278I 및 Y356X로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 키트.
    
15. 제9항에 있어서,
    상기 StAR 유전자의 돌연변이는 Q258X인 것인 키트.
    
16. 제9항에 있어서,
    상기 수단은 ATP7B, GJB2, SLC26A4, PAH 및 StAR로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머인 것인 키트.
    
17. 제16항에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 21 내지 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 PCR 프라이머 또는 서열번호 58 내지 74 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 iPLEX용 프라이머인 것인 키트.
    
18. 상염색체 열성질환이 의심되는 환자의 시료로부터 G6PC 유전자 또는 TSHR 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하는, 상염색체 열성질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
    
19. 제18항에 있어서,
    ATP7B, GJB2, SLC26A4, PAH 및 StAR로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.