CN101784674A - Egfr抑制剂治疗的预测性标记物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物标记物，其预测癌症患者中针对使用EGFR抑制剂的治疗的反应。所述标记物是基因GBAS，APOH，SCYL3，PMS2CL，PRODH，SERF1A，URG4A和LRRC 31。

Description

EGFR抑制剂治疗的预测性标记物

本发明提供一种生物标记物，其预测对癌症患者中使用EGFR抑制剂的治疗的反应。

许多人恶性肿瘤与表皮生长因子受体(EGFR)的异常或过表达有关。EGF，转化生长因子α(TGF-α)，和许多其他配体结合EGFR，从而刺激该受体胞内酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化。随后激活多种胞内途径，且这些下游事件导致肿瘤细胞体外增殖。已经假定通过EGFR刺激肿瘤细胞可能对体内肿瘤生长和肿瘤存活非常重要。

关于Tarceva^TM(厄洛替尼)，即EGFR酪氨酸激酶的抑制剂的早期临床数据显示该化合物是安全的且通常在提供靶有效浓度的剂量时良好耐受(如通过临床前数据确定地)。患有晚期疾病的患者中的临床I和II期试验证明Tarceva^TM在一定范围的上皮肿瘤中具有有前景的临床活性。事实上，已经显示出Tarceva^TM能够在先前受治疗的患有头颈癌和NSCLC(非小细胞肺癌)的患者中诱导与确定的第二线化学疗法相似级别的持久部分好转，但是具有比化学疗法更好的安全特性和改进的方便性(片剂代替静脉内[i.v.]施用)的额外益处。近期完成的随机双盲安慰剂对照试验(BR.21)显示单试剂Tarceva^TM显著延长和改善NSCLC患者的存活，对于所述NSCLC患者，标准的晚期疾病疗法未能成功。

厄洛替尼(Tarceva^TM)是小化学分子；其是EGFR酪氨酸激酶(EGFR-TKI)的口服活性有效选择性抑制剂。

肺癌是北美和欧洲中癌症相关死亡的主要原因。在美国，由肺癌继发的死亡数量超过由第二(结肠癌)、第三(乳腺癌)、和第四(前列腺癌)主要癌症死亡原因组合的总死亡。全部肺癌的约75％-80％是NSCLC，其约40％的患者表现出局部晚期和/或不可切除的疾病。该组典型地包括患有大量IIIA和IIIB期疾病的那些，不包括恶性胸膜渗漏。

肺癌在欧洲联盟中的粗略发生率是52.5，死亡率是48.7病例/100000/年。分别地，在男性中，所述比率是79.3和78.3，在女性中，是21.6和20.5。NSCLC占所有肺癌病例的80％。男性中约90％的肺癌死亡率和女性中的80％可归因于吸烟。

在美国，根据美国癌症协会，在2004年，存在约173,800件新肺癌病例(男性中93,100和女性中80,700)并占全部新癌症的约13％。大多数患者在诊断两年内由于他们的疾病后果而死亡。对于许多NSCLC患者，成功的治疗仍然难以捉摸。晚期肿瘤经常不能通过手术处理并且还可能对可耐受剂量的放射疗法和化学疗法具有抗性。在随机试验中，当前最具活性的组合化学疗法获得约30％-40％的反应率，和35％-40％的1年存活率。这确实是超过单独使用支持性医护所观察到的10％的1年存活率的进步。

直到最近，患者复发后的治疗选择仅限于最佳支持性医护或减轻。近期比较多西他赛

和最佳支持性医护的试验显示患有NSCLC的患者在基于顺铂的第一线方案失败后，可以受益于第二线化学疗法。所有年龄和具有0，1，或2ECOG性能状态的患者证明了使用多西他赛的提高的存活，先前用基于铂的治疗难治的患者也如此。不受益于疗法的患者包括体重减轻＞10％、高乳酸脱氢酶水平、多器官累及、或肝累及的那些。另外，多西他赛单一疗法的益处不扩展超过第二线设置。接受多西他赛作为第三线治疗或以上的患者没显示出存活的延长。单试剂多西他赛成为NSCLC的标准第二线疗法。近期，第二线NSCLC疗法中的另一个随机III期试验比较了培美曲塞

和多西他赛。使用培美曲塞的治疗导致临床等价功效但与多西他赛相比具有显著更小的副作用。

长期以来公认存在开发个性化癌症治疗的方法的需要。伴随着靶向癌治疗的发展，存在可以提供肿瘤靶标分子特征的方法学的特别目的，(即预测临床益处的那些)。关于癌症中基因表达模式原则的证据已经利用肿瘤类型分子分类建立了，所述肿瘤类型基于目前的形态学和免疫组织化学测试是不明显的。

因此，本发明的目的是提供预测癌症患者中对EGFR抑制剂治疗的反应的表达生物标记物。

在第一个目标中，本发明提供预测癌症患者对EGFR抑制剂治疗的反应的体外方法，其包括以下步骤：确定患者肿瘤样品中至少一种选自由GBAS，APOH，SCYL3，PMS2CL，PRODH，SERF1A，URG4A和LRR 31组成的组中的基因的表达水平和对所述至少一种的基因表达水平和代表不反应患者群的肿瘤中所述至少一种基因表达水平的值进行比较，其中患者的肿瘤样品中所述至少一种基因的较高表达水平指示将对该治疗有反应的患者。

术语“代表不反应患者群的肿瘤中至少一种基因表达水平的值”指不反应的患者群的肿瘤中标记物基因平均表达水平的估值。

在优选的实施方案中，至少一种基因的表达水平通过微阵列技术或其他评估RNA表达水平的技术如定量RT-PCR或通过任何着眼于各自蛋白表达水平的方法，例如免疫组织化学法(IHC)来确定。基因芯片的构建和用途是本领域中众所周知的。参见，美国专利号5,202,231；5,445,934；5,525,464；5,695,940；5,744,305；5,795,716和1 5,800,992。还参见，Johnston，M.Curr.Biol.(当前生物学)8：R171-174(1998)；Iyer VR等，Science(科学)283：83-87(1999)。当然，基因表达水平可以通过本领域中技术人员已知的其他方法，诸如例如RNA印迹、RT-PCR、实时定量PCR、引物延伸、RNA酶保护、RNA表达模式来确定。

在另一个优选的实施方案中，确定至少两种基因，优选至少三种基因的表达水平。

本发明的基因可以组合为生物标记物组。生物标记物组可以由表3中列出的生物标记物的任何组合构成，从而预测EGFR抑制剂治疗在癌症患者中的作用。本文中所述的多种生物标记物和生物标记物组可以用于，例如，预测患有癌症的患者将如何对使用EGFR抑制剂的治疗干预进行反应。

在优选的实施方案中，反应患者肿瘤样品中的标记物基因典型地表现出与代表不反应患者群的肿瘤中至少一种基因表达水平的值相比，1.1-2.7或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因GBAS并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中基因GBAS表达水平的值相比，1.4-2.7或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因APOH并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中APOH基因表达水平的值相比，1.4-2.6或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因SCYL3并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中SCYL3基因表达水平的值相比，1.3-1.8或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因PMS2CL并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中PMS2CL基因表达水平的值相比，1.2-1.5或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因PRODH并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中PRODH基因表达水平的值相比，1.5-3.0或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因SERF1A并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中SERF1A基因表达水平的值相比，1.2-1.6或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因URG4并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中URG4基因表达水平的值相比，1.1-1.3或更多倍的更高表达。

在优选的实施方案中，所述标记物是基因LRRC31并典型地在反应的患者的肿瘤样品中表现出与代表不反应患者群的肿瘤中LRRC31基因表达水平的值相比，1.3-1.8或更多倍的更高表达。

本发明的基因可以组合为生物标记物组。生物标记物组可以由表3中列出生物标记物的任何组合构成，从而预测EGFR抑制剂治疗在癌症患者中的作用。本文中所述的多种生物标记物和生物标记物组可以用于，例如，预测患有癌症的患者将如何对使用EGFR抑制剂的治疗干预进行反应。

术语“基因”用于本文中时，包括基因的变体。术语“变体”涉及与GenBank登记号提供的核酸序列基本相似的核酸序列。术语“基本相似”被本领域中技术人员充分理解。具体地，基因变体可以是这样的等位基因，所述等位基因与人群中最普遍的等位基因的核酸序列相比表现出核苷酸交换。优选地，这样的基本相似的核酸序列与最普遍的等位基因具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列相似性。术语“变体”还意指涉及剪接变体。

EGFR抑制剂可以选自由吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼，PKI-166，EKB-569，GW2016，CI-1033和抗erbB抗体，诸如曲妥珠单抗和西妥昔单抗组成的组。

在另一个实施方案中，EGFR抑制剂是厄洛替尼。

在再一个实施方案中，癌症是NSCLC。

用于检测和量化本发明所述基因的基因表达的技术包括，但不限于，RNA印迹、RT-PCR、实时定量PCR、引物延伸、RNA酶保护、RNA表达模式和相关技术。这些技术是本领域中技术人员公知的。参见例如，Sambrook J等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版(Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社)，Cold SpringHarbor(冷泉港)，2000)。

用于检测本发明所述各种基因的蛋白表达的技术包括，但不限于，免疫组织化学法(IHC)。

根据本发明，可以评估来自患者组织样品，例如肿瘤或癌活组织检查的细胞，以确定一种或多种生物标记物的表达模式。癌症治疗的成功或失败可以基于来自测试组织(测试细胞)，例如肿瘤或癌活组织检查的细胞的生物标记物的表达模式来确定，如与一种或多种生物标记物的对照组的表达模式相对相似或不同。在本发明的上下文中，发现表3中列出的基因受到上调，即与不对EGFR抑制剂治疗反应的患者的肿瘤相比，在对EGFR抑制剂治疗反应的患者的肿瘤中表现出更高的表达水平。因此，如果测试细胞表现出对应于对癌症治疗有反应的患者的生物标记物表达模式，则该个体的癌症或肿瘤应该有利地对使用EGFR抑制剂的治疗有反应，这是高度可能的或被预测的。相反，如果测试细胞表现出对应于不对癌症治疗有反应的患者的生物标记物表达模式，则该个体的癌症或肿瘤不应该对使用EGFR抑制剂的治疗有反应，这是高度可能的或被预测的。

本发明的生物标记物，即表3中列出的基因，是对于患有癌症，特别是患有难治NSCLC的患者的个性化疗法的第一步。该个性化疗法应该容许治疗医师从用于癌症疗法，特别是NSCLC的现存药物中选择最合适的药剂。个性化疗法对于每名将来的患者的益处是反应率/获益患者数量将增加且归因于无效治疗的有害副作用的风险将降低。

在另一个目标中，本发明提供治疗通过本发明的体外方法鉴定的癌症患者的治疗法。所述治疗法包括将EGFR抑制剂施用于患者，所述患者已经基于至少一个表3中列出的基因的预测性表达模式被选择进行处理。优选的EGFR抑制剂是厄洛替尼且优选的待治疗癌症是NSCLC。

附图简述

图1显示研究设计；和

图2显示样品处理方案。

实验部分

关于研究和研究设计的基本原理

近期，描述了NSCLC患者子集的肿瘤组织中EGFR基因内的突变和这些突变与针对厄洛替尼和吉非替尼的灵敏性的联系(Pao W，等2004；Lynch等2004；Paez等2004)。对于由两项研究组合的患者，在14名对吉非替尼有反应的患者中的13名中观察到突变的EGFR和在11名吉非替尼-治疗的不反应患者中没有观察到突变的EGFR。这些突变的报告的普遍性在未选择的NSCLC患者中是8％(25名中2名)。发现这些突变在腺癌中(21％)，在来自雌性的肿瘤中(20％)，和在来自日本患者的肿瘤中(26％)更频繁。这些突变导致增加的EGFR体外活性和增加的针对吉非替尼的灵敏性。没有预期评估突变与延长的稳定性疾病或存活期限的关系。

基于来自BR.21研究的探究性分析，观察到的存活益处似乎未必仅归因于EGFR突变，因为即使在将具有目标反应的患者排除在分析之外时，显著的存活益处仍保持。其他的分子机制必定也对该效果作出功效。

基于这样的假设，即存在预测对Tarceva^TM治疗反应/益处的基因表达水平变化，使用微阵列分析检测这些变化。

这需要明确定义的在第一线疗法失败后使用Tarceva^TM单一疗法治疗的研究群体。基于来自BR.21研究的经验，将获益群体定义为具有目标反应，或≥12周的疾病稳定性。按照预定义的统计学设计，分析临床和微阵列数据组。

该技术的应用需要新鲜冷冻的组织(FFT)。因此，在开始治疗前，必须进行强制性活组织检查。将收集的材料冷冻在液氮(N₂)中。

同时收集第二肿瘤样品并保存在石蜡(福尔马林固定的石蜡包埋的，FFPE)中。分析该样品，以获得EGFR信号传导途径中的变化。

通过支气管镜检进行肿瘤活组织检查的能力是该研究的先决条件。支气管镜检是验证肺癌诊断的标准程序。尽管通常安全，但是保留并发症，例如出血的风险。

关于剂量选择的基本原理

Tarceva^TM以150mg剂量每日口服给药一次，直到疾病发展，无法耐受的毒性或死亡。该剂量的选择基于药物动力学参数，以及在重度预处理的晚期癌症患者的I，II和III期试验中观察到的该剂量的安全性和耐受能力模式。在接受150mg/日剂量的癌症患者血浆中观察到的药物水平一致地高于临床功效作为目标的平均血浆浓度500ng/ml。BR.21显示使用该剂量的存活益处。

研究的目标

第一个目标是鉴定预测Tarceva^TM治疗益处(CR，PR或SD≥12周)的差异表达基因。鉴定预测对Tarceva^TM治疗“反应”(CR，PR)的差异表达基因是一个重要的额外目标。

第二个目标是评估EGFR信号传导途径关于来自治疗的益处的变化。

研究设计

研究设计和给药方案综述

这是一个开放-标记、预测性标记物鉴定II期研究。该研究在约12个国家中的约26个地点进行。264名经历过至少一次以前化学疗法方案失败的晚期NSCLC患者在12个月的期间内参与。连续口服Tarceva^TM以150mg/日的剂量给药。基于对药物疗法的耐受能力允许剂量的减少。评估临床和实验室参数，以评价疾病控制和毒性。治疗持续直到疾病发展，不能接受的毒性或死亡。

获得肿瘤组织和血液样品进行分子分析，从而评价Tarceva^TM的作用和鉴定受益于疗法的患者子群。研究设计描述在图1中。

预测性标记物评估

肿瘤的活组织检查在开始治疗前2周内进行。收集2种不同的样品：

第一样品通常立即冷冻在液N₂中

第二样品在福尔马林中固定并包埋在石蜡中

快速冷冻的组织在该研究中具有最高的优先级。

图2显示样品处理方案。

微阵列分析

快速冷冻的样品用于肿瘤细胞的激光捕获显微切割(LCM)，从而提取肿瘤RNA和来自肿瘤周围组织的RNA。将RNA在Affymetrix微阵列芯片(HG-U133A)上分析，以构建患者肿瘤基因表达模式。使用Affymetrix芯片的质量控制选择具有足够质量以进行统计学比较的那些样品。

关于福尔马林固定的石蜡包埋的组织的单生物标记物分析

将第二肿瘤活组织检查FFPE样品用于进行DNA突变，IHC和ISH分析，如下所述。类似的分析对在最初诊断时收集的组织进行。

编码EGFR和参与EGFR信号传导途径的其他分子的基因的DNA突变状态通过DNA测序分析。EGFR和相关基因的基因扩增通过FISH来研究。

蛋白表达分析包括EGFR或EGFR信号传导途径中的其他蛋白的免疫组织化学[IHC]分析。

反应评估

使用RECIST(一维肿瘤测量)标准来评价反应。可以在以下链接中发现这些标准：http://www.eortc.be/recist/。

注意：为了对CR或PR状态赋值，肿瘤测量的改变必须通过在治疗期间内任意时刻时彼此相隔至少4周的重复评估来验证。

在SD的情形中，后继测量必须在研究以6周的最小间隔进入后，达到了SD标准至少一次。

在维持的SD的情形中，后继测量必须在研究以至少12周的维持期间进入后，达到了SD标准至少一次。

存活评估

每3个月的定时状态检查通过患者就诊(visit to the clinic)或通过电话进行。记录所有的死亡。在研究结束时，需要对每名患者进行存活的明确确认。

方法

RNA样品制备和RNA样品的质量控制

所有的活组织检查样品处理通过病理学参考实验室来操作；新鲜冷冻的组织样品由研究者地点运到Roche Basel(巴塞尔罗氏)中的临床样品操作机构(Clinical Sample Operations facility)，并由那里运到病理学实验室以进行进一步的处理。使用激光捕获显微切割来从周围组织中选择肿瘤细胞。LCM后，由富集的肿瘤材料中纯化RNA。病理学实验室然后进行许多步骤，以评价RNA的浓度和质量。

RNA酶是RNA降解酶且到处存在，并且因此所述所有使用RNA的程序必须严格受控，以最小化RNA降解。大部分mRNA种类自身具有相当短的半衰期并且因此被认为非常不稳定。因此，在任何测定前进行RNA完整性检查和量化非常重要。

RNA浓度和质量模式可以使用来自Agilent(Agilent Technologies，Inc.(安捷伦技术公司)，Palo Alto，CA)的仪器，称为2100

(2100生物分析仪)评估。该仪器软件产生RNA完整性指数(RIN)，一种量化评价(Schroeder，A.，等，The RIN：an RNA integrity number for assigning integrityvalues to RNA measurements(RIN：用于对RNA测定赋予完整性数值的RNA完整性指数).BMC Mol Biol(BMC分子生物学)，2006.7：第3页)，并计算总RNA样品的核糖体比率。RIN由RNA样品的全部电泳痕迹确定，并且因此包括降解产物的存在或缺乏。

RNA质量通过2100

(2100生物分析仪

)分析。只选择具有至少一个高于加入的聚I噪音的rRNA峰和充足RNA的样品来进一步在Affymetrix

平台上进行分析。将纯化的RNA运送到Roche Centre for MedicalGenomics(罗氏医学基因组中心)(RCMG；巴塞尔，瑞士)，以通过微阵列进行分析。从病理学实验室收到122份RNA样品以进一步处理。

靶标记组织RNA样品

靶标记根据来自Affymetrix(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚)的两循环靶标记扩增流程进行，按照制造商的说明。

该方法基于标准Eberwine线性扩增程序，但是使用2个循环的该程序，以产生足够的标记的cRNA，从而与微阵列杂交。

该标记反应中使用的总RNA输入，对于可获得多于10ng RNA的那些样品是10ng；如果可获得小于该量或如果不存在可用的数量数据(由于非常低的RNA浓度)，则将总样品的一半用于该反应。来自标记反应的产量在20-180μg cRNA的范围内。在杂交水平上引入标准化步骤，其中关于每份样品使用15μg cRNA。

人参考RNA(Stratagene，卡尔斯巴德，CA，美国)用作每批样品工作流程的对照样品。将10ng的该RNA作为输入用在测试样品的旁边，以检验标记和杂交试剂如预期地工作。

微阵列杂交

Affymetrix HG-U133A微阵列含有超过22,000个探针组，其靶向约18,400个转录物和变体，其代表约14,500个充分表征的基因。

对于所有样品的杂交根据Affymetrix说明书(Affymetrix Inc.(Affymetrix公司)，Expression Analysis Technical Manual(表达分析技术手册)，2004)进行。简言之，对于每份样品，将15μg生物素标记的cRNA在存在二价阳离子和加热的条件下断裂，并与Affymetrix HG-U133A全基因组寡核苷酸阵列杂交过夜。第二天，按照制造商的说明，用链霉抗生物素-藻红蛋白(Molecular Probes(分子探针)；Eugene，OR)染色阵列。然后用GeneChip Scanner(基因芯片扫描仪)3000(Affymetrix)扫描阵列，并通过GeneChip Operating Software(基因芯片操作软件)(GCOS)版本1.4(Affymetrix)自动计算信号强度。

统计学分析

Affymetrix^TM数据分析由四个主要步骤组成。

步骤1是质量控制。目的是从分析阵列中识别和排除具有不合标准的质量模式的数据。

步骤2是预处理和标准化。目的是形成标准化的和成比例的“分析数据组”，其可用于芯片间比较。其包括背景噪音评估和扣除，探针总计和定比例。

步骤3是探究和描述。目的是识别潜在偏差和可变性来源。其由应用多变量和单变量描述性分析技术来识别影响相关变量(covariates)组成。

步骤4是建模和测试。目的是基于“反应者”(具有“部分反应”或“完全反应”作为最佳反应的患者)和“不反应者”(具有“稳定性疾病”或“进行性疾病”作为最佳反应的患者)之间平均表达水平差异的统计学评估来鉴定一系列候选标记物。其由使合适的统计学模型拟合每个探针组和获得统计学显著性测量组成。

全部分析均利用R软件包进行。

步骤1：质量控制

数据质量的评估基于检查若干参数。这些包括标准AffymetrixGeneChip^TM质量参数，具体地：比例因子、Present Call百分比和平均背景。该步骤还包括视觉化检查虚拟芯片图像(virtual chip image)以检测局部化杂交问题，和比较每个芯片和虚拟中值芯片(virtual median chip)以检测由中值行为的任何不寻常偏离。还进行芯片间相关性分析，以检测异常值样品。另外，考虑获自使用安捷伦生物分析仪^TM(Agilent Bioanalyzer^TM)2100的RNA样品分析的RNA质量的辅助测量。

基于这些参数，从分析中排除来自20个阵列的数据。因此该分析中包括来自代表102名患者的总共102个阵列的数据。这102名患者组的临床说明报告在表1中。

表1：该分析中包括的患者的临床特征说明

步骤2：数据预处理和标准化

使用rma运算法则(Irizarry，R.A.，等，Summaries of Affymetrix GeneChipprobe level data(Affymetrix基因芯片探针水平数据总结).Nucl.Acids Res.(核酸研究)，2003.31(4)：第e15页)进行预处理和标准化。使用mas5运算法则(AFFYMETRIX，

Expression：Data  AnalysisFundamentals(Gene

表达：数据分析基础).2004，AFFYMETRIX)检测关于各个探针组的调用(call)。在所有样品中称为“缺乏的”或“最低限度的”探针组由进一步分析去除；由基于该标准的分析去除5930个探针组。分析数据组因此由具有在102名患者中测量的16353个(在22283个范围内)探针组矩阵组成。

步骤3：数据描述和探究

进行描述性探究分析，以确定潜在的偏差和主要可变性来源。筛选了一组对基因表达模式具有潜在影响的相关变量。其包括技术和临床变量。技术相关变量包括：RNA处理日期(以后称为批次)，RIN(作为RNA质量/完整性的测量)，操作者和样品收集中心。临床相关变量包括：组织学类型，吸烟状态，肿瘤等级，表现评分，人口统计数据，反应者状态和临床受益状态。

分析工具包括单变量ANOVA和主要成分分析。对于这些相关变量中的每个，将单变量ANOVA独立应用于每个探针组。

确定批次变量的显著作用。在实践上，批次变量捕获样品处理和Affymetrix芯片组日期之间的差异。在检查批次变量几乎与目的变量无关后，批次影响利用Johnson等Biostat(生物统计学)，2007.8(1)：第118-127页中所述的方法校正。

批次影响校正后，标准化数据组在随后的分析中起分析数据组的作用。

组织学和RIN是通过描述性分析突出的2种另外的重要变量。

步骤4：数据建模和测试

将线性模型对每个探针组进行独立拟合。该模型中包括的变量报告在表2中。将线性模型对每个探针组进行独立拟合。该模型中包括的变量报告在表2中。通过最大似然技术评估模型参数。使用对应于“反应”变量(X1)的参数评估“反应”和“不反应”患者组之间的表达水平的差异。

表2：线性模型中包括的变量的描述。

变量	类型	值
			基因表达	依赖性(Yip)	患者p中探针组i的标准化log2强度
截距	总平均值(μ)
			反应	目的预测因子(X1)	是/否
组织学	调节相关变量(X2)	腺癌/鳞状/其他
			种族	调节相关变量(X3)	东方人/白种人
性别	调节相关变量(X4)	女性/男性
			RIN	调节相关变量(X5)	[2，...，7.9]

在该模型中，将反应变量定义如下：

·反应＝是具有部分反应作为其最佳反应患者的患者(n＝6)

·反应＝否：具有进行性疾病(PD)或稳定性疾病(SD)作为其最佳反应的患者以及还有不可获得的肿瘤评估的患者(n＝96)

对于每个探针组i，统计学测试的目的是为了否定这样的假说，即对治疗有反应的患者和对治疗不反应的患者中平均表达水平相等，其中考虑了表2中列出的其他调节相关变量。在形式上，等同性的虚假设针对两面性选择对象来测试。在形式上，等同性的虚假设针对两面性选择对象来测试。在该虚假设下，关于该测试的t-统计学分布遵从具有96自由度的斯氏t分布。相应的p值报告在表3中。

线性模型的选择由两个原因促成。第一，线性建模是通用的、充分表征和有效的方法，其容许在评价目的变量作用时调节混同的变量。第二，假定样品尺寸102，和数据组的标准化和定比例，正态分布假设是合理的和正当的。

多重测试的问题通过使用用于确定差异表达基因列表的假发现率(False Discovery Rate(FDR))(Benjamini等，Journal of the Royal StatisticalSociety Series B-Methodological(皇室统计学协会杂志系列B-方法学)，1995.57(1)：第289-300页)标准来处理。宣称具有低于0.3阈值的FDR的探针组为显著的。将0.3截取值选为对严格控制假阳性风险的多重测试的严格校正和错过真正区别性标记物风险之间的合理折衷。标记物系列报告在表3中。

表3：基于比较“反应者”和“不反应者”的标记物。

反应者定义为具有与“部分反应”(PR)相等的最佳反应的患者。不反应者定义为具有“稳定性疾病”(SD)、“进行性疾病”(PD)或无可获得的评估的患者。无肿瘤评估的患者包括在“不反应者”组中，因为在大多数情形中，由于早期退出而错过评估，这归因于疾病进展或死亡。

栏1是探针组的Affymetrix识别物。栏2是相应基因序列的GenBank登记号。栏3是相应的正式基因名称。栏4是“反应者”和“不反应者”之间表达水平的相应调节的平均倍数变化。栏5是“反应者”和“不反应者”之间表达水平差别测试的p值。栏6是调节的表达水平平均倍数变化的95％可靠区间。

Affymetrix探针ID	GenBank	基因	调节的平均倍数变化	P值	CI 95％
						201816_s_at	NM_001483	GBAS	1.9	1.70E-04	1.4，2.7
205216_s_at	NM_000042	APOH	1.9	5.10E-05	1.4，2.6
						205607_s_at	NM_020423NM_181093	SCYL3	1.5	4.90E-05	1.3，1.8
209805_at	NM_000535NR_002217NR_003085XM_001126008XR_017703	PMS2CL	1.3	1.60E-04	1.2，1.5
						214203_s_at	NM_016335	PRODH	2.2	4.20E-05	1.5，3.0

Affymetrix探针ID	GenBank	基因	调节的平均倍数变化	P值	CI 95％
						215470_at	XM_001130621XM_001130639XM_001130651XM_001130662XM_001130670XM_001130682	DKFZP686M0199SERF1A	1.4	1.00E-05	1.2-1.6
216173_at	AK025360NM_017920	URG4	1.2	1.50E-04	1.1，1.3
						220622_at	NM_024727XM_001133921XM_001133922XM_001133923	LRRC31	1.5	1.50E-05	1.3，1.8

对于每个探针组，方差的同质性假定利用基于模型剩余(modelresiduals)的Fligner-Killeen检验来评价。该分析由以下三步组成：

测试所有分类变量以获得它们水平之间的剩余方差的等同性

注意具有最小p值的变量V

如果最小p值小于0.001，则重拟合该模型，以容许不同水平的变量V具有不同的方差。

进一步统计学分析

对于候选标记物GBAS，SCYL3和SERF1A，由独立的统计人员，在生效环境中进行以下另外的分析：

·关于来自初步Affymetrix分析的PFS(无进展存活)的单变量Cox回归，

·关于来自初步Affymetrix分析的反应的单变量逻辑回归，并且

将这些分析的结果显示在下文中。它们与初步分析的结果相一致并确认所选标记物的选择。

结果：关于来自初步Affymetrix分析的PFS(无进展存活)的单变量Cox回归：

基因       患者数目    风险比    风险比的95％      p-值

                                 CI

GBAS       102         0.67      0.47；0.95        0.0258

SCYL3      102         0.36      0.19；0.68        0.0016

SERF1A     102         0.32      0.12；0.83        0.0191

结果：关于来自初步Affymetrix分析的反应的单变量Cox回归：

基因    患者数目    比值比    比值比的95％     p-值

                              CI

GBAS     102        15.02    2.68；84.23       0.0021

SCYL3    102        ＞100    7.03；＞1000      0.0011

SERF1A  102         56.04    4.79；656.22      0.0013

对厄洛替尼治疗的反应

总共264名来自12个国家和26个中心的患者在该研究中登记。26％患有IIIB期且24％患有IV期NSCLC。13.6％(n＝36)的患者获得目标反应，而31.4％(n＝83)具有临床益处(定义为具有目标反应或稳定的疾病12周或更长)。中值总存活是7.6(CI 7-9)个月且中值无进展存活是11.3(CI8-12)周。关于临床数据的全部详细信息显示在表1中。

新鲜冷冻的支气管镜检活组织切片由所述受试者中收集，但是不是全部样品在显微切割(LCM)前都具有足够的肿瘤含量，或LCM后不具有足够的RNA产量以进行微阵列分析，因此肿瘤材料仅可用于125名患者；这些中的122名具有可评估的RNA。另一组20份样品没有通过我们的微阵列数据质量控制评估。在适合于统计学分析的102个微阵列数据组中，临床特征显示在表1中。当总研究中的36名患者获得目标反应时，其中仅6名具有微阵列数据；与获得临床益处的那些相类似，当与全数据组中的83名相比时，具有微阵列数据的受试者数目仅为21名。6名被判断为部分反应者(PR)，31名具有SD且49名具有PD；在具有PR的6名患者中，5名具有腺癌且1名具有鳞状细胞癌。数据组中没有患者获得CR。

鉴定与对厄洛替尼的反应有关的基因

将反应者定义为其最佳反应是部分反应的患者，而“不反应者”定义为具有稳定性疾病、进行性疾病或对其不进行评估的患者(在大部分情形中是由于疾病进展或死亡引起的早期退出的结果)。因此，在该模型中，6名“反应者”与96名“不反应者”进行比较。

在除去来自HG-U133A微阵列上的总共22283个的任何样品中不存在的那些探针组后，使线性模型对该分析中使用的16353个剩余的探针组中的每一个独立拟合。计算关于每个探针组的反应和不反应之间表达差异的p值。将0.3的假发现率(FDR)应用于校正多重测试。由该分析鉴定的8个标记物系列显示在表3中。

讨论

靶向表皮生长因子受体(EGFR)作为癌症治疗方法是基于其在若干上皮癌中普遍存在的异常表达来提议。作为激活酪氨酸激酶结构域中的突变和/或其扩增的结果，EGFR涉及许多肿瘤包括40-80％的NSCLC肿瘤的发病机理和进展。当激活时，受体经历二聚化作用，由此导致在细胞增殖、转移、凋亡抑制和新血管发生(neoangiogenesis)中具有作用的下游靶标的磷酸化。

已经开发了两种主要的EGFR抑制剂类型，即靶向受体胞外结构域的单克隆抗体，和靶向受体催化结构域的小分子酪氨酸激酶抑制剂。后者包括与ATP竞争胞内结合位点的厄洛替尼。

近年来发现若干因子在对厄洛替尼的灵敏性中起作用，包括女性性别、非吸烟者状态、亚洲血统和腺癌组织学；假定提高的反应率在这样的临床患者子集中明显，正在进行大量努力以说明关于患者成层现象的预测性分子标记物。EGFR中的突变，EGFR基因座的扩增和EGFR在蛋白水平的过表达，都与不同程度的反应相关，尽管这些不是反应的唯一分子决定因素。

通过使用高密度寡核苷酸微阵列技术分析组织样品，和对数据应用统计学建模，我们已经能够鉴定其表达水平预测针对厄洛替尼的反应的一系列基因(PR对比PD加SD的比较)(表3)。在染色体上位于与EGFR相同区域的转录物，包括GBAS(1.9倍上调，p＝0.00017)在反应者中表现出强上调倾向(PR对比PD+SD的比较)。该变化提示在EGFR基因座7p11.2周围存在染色体扩增，这可能指示针对厄洛替尼的良好反应。扩增是探究肿瘤细胞用于增加蛋白质表达的公知机制，所述蛋白质的活性促进细胞增殖。

成胶质细胞瘤扩增的序列或GBAS(位于7p11.2)是候选标记物，在我们的分析中发现与PD+SD相比，其在PR中上调(1.9倍上调，p＝0.00017)。以前的工作发现GBAS在12个成胶质细胞瘤中的2个中以及在3个细胞系中的2个中与EGFR一起共扩增；该基因在缺少EGFR扩增的成胶质细胞瘤组织中不扩增，这提示较大区域的共扩增。来自相同小组的另外的工作提示EGFR扩增子可以在长度上超过1Mb，且可以充分更长以达到5Mb。因此这应该支持在7p11.2周围的更大段染色体区段(cytoband)共扩增的概念。

载脂蛋白H(APOH)，其与PD相比在PR中1.9倍更高表达(p＝0.000051)，已经与入侵性非霍奇金淋巴瘤连接，其中该蛋白的抗体和其他磷脂可以是预后标记物。

SCY1-样3(SCYL3)编码已知与埃兹蛋白相互作用的遍在表达蛋白，所述埃兹蛋白是一种参与调节细胞形状、粘附、运动和对胞外环境的反应的粘附受体分子(Sullivan等，2003)。

表4：本发明标记物基因列表

栏1是人基因序列的GenBank登记号；栏2是相应的正式基因名称且栏3是如本申请中所用的人核苷酸序列的序列识别号。对于某些基因，表4包括多于一个序列识别号，因为该基因的若干变体登记在GenBank中。

GenBank登记号	基因	序列识别号
			NM_001483	GBAS	Seq.Id.No.1
NM_000042	APOH	Seq.Id.No.2
			NM_020423NM_181093	SCYL3	Seq.Id.No.3Seq.Id.No.4
NM_000535NR_002217NR_003085XM_001126008XR_017703	PMS2CL	Seq.Id.No.5Seq.Id.No.6Seq.Id.No.7Seq.Id.No.8Seq.Id.No.9
			NM_016335	PRODH	Seq.Id.No.10

GenBank登记号	基因	序列识别号
			XM_001130621XM_001130639XM_001130651XM_001130662XM_001130670XM_001130682	DKFZP686M0199SERF1A	Seq.Id.No.11Seq.Id.No.12Seq.Id.No.13Seq.Id.No.14Seq.Id.No.15Seq.Id.No.16
AK025360NM_017920	URG4	Seq.Id.No.17Seq.Id.No.18
			NM_024727	LRRC31	Seq.Id.No.19

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

 

<120>EGFR抑制剂治疗的预测性标记物

 

<130>24384WO

 

<150>EP07114336.6

<151>2007-08-14

 

<160>19

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>1975

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>1

ggagcaagat ggcggcgcga gtgctgcgcg cccgcggagc ggcctgggcc ggcggcctcc  60

tgcagcgggc ggccccctgc agcctcctgc ccaggctccg gacatggaca tcttccagca  120

acagatctcg agaagacagc tggctaaaat ccttatttgt ccggaaagtt gatccaagaa  180

aagatgccca ctccaatctc ctagccaaaa aggaaacaag caatctatac aaattacagt  240

ttcacaatgt taaaccggaa tgcctagaag catacaacaa aatttgtcaa gaggtgttgc  300

caaagattca cgaagataaa cactaccctt gtactttggt ggggacttgg aacacgtggt  360

atggcgagca ggaccaagct gtccacctct ggaggtatga aggaggctat ccagccctca  420

cagaagtcat gaataaactc agagaaaata aggaattttt ggaatttcgt aaggcaagaa  480

gtgacatgct tctctccagg aagaatcagc tcctgttgga gttcagtttc tggaatgagc  540

ctgtgccaag atccggacct aatatatatg aactcaggtc ttaccaactc cgaccaggaa  600

ccatgattga atggggcaat tactgggctc gtgcaatccg cttcagacag gatggtaacg  660

aagccgtcgg aggattcttc tctcagattg ggcagctgta catggtgcac catctttggg  720

cttacaggga tcttcagacc agggaagaca tacggaatgc agcatggcac aaacatggct  780

gggaggaatt ggtatattac acagttccac ttattcagga aatggaatcc agaatcatga  840

tcccactgaa gacctcgccc ctccagtaaa gctgtagagt ttctatgtgc ctacatacat  900

ttctgtgaca agtatttgtc gtaaattaat tttaattgtg tatcaagtga aaaagaaaca  960

ctgaggtttt aagctgctgt atatagcttg tgagaaacct cttttcttta aaatttacat  1020

aatcacaaga aaggaaagaa ttacagttgg actgattgtg acagtgcctt gtcgtcctct  1080

ttgaaacacc ccgtgttgtc cagtatacct tataacactt agccacttct ccccaccctc  1140

cagaaggggt ccacgttgaa ttctgaatca tcttgaaaat aagattccaa ccacaaaaaa  1200

aatttagcca tttctttact aaaaaaaacc aaaaaacaaa tctgttttat aatcacagat  1260

ttttagacaa atttcttgta tcaggaagaa atacaaattt tgtcatgttt ctcaagcagt  1320

ttttctgagt agtttctgag gaggaacaaa ttacaagtgt acccaataac tgaaaatgtt  1380

ttaactcact ctcatttgta agcagtccac atagtagaca atgggttttc caagctgggc 1440

aaggtacatt taatcagtaa atcagtttca catcatgtat tgtgatgttt caatgtgaga    1500

cacaaaaaca atggcttgaa acttgtgtat catatgtgat tttgaaatga acaccttgaa    1560

tagcactaat ttttatttgt ggtatttttc tataacaaaa caagtagctc taggaaaaga    1620

ggttttattt tgtaaacgat catttgtgac ctcagacact ctctggctaa tattttaata    1680

agctcacagc agataattct gagatcatgg gtgaggggtg gtgcatgttg agatttaaat    1740

tggcataaag ctgcatactt tttgtctagc tgtttgattt cattttttaa tatagtatgc    1800

caattttgtg actgttacca tgtgaaagtc ctgttgaaat gaacaattgt ctgccccaca    1860

atcaagaatg tatgtgtaaa gtgtgaataa atctcatatc aaatgtcaaa cttttacatg    1920

tgaatgattt tctcaaagaa catagaaaag gcaataaaat cctcttaatt tccac         1975

 

<210>2

<211>1182

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>2

ccactttggt agtgccagtg tgactcatcc acaatgattt ctccagtgct catcttgttc    60

tcgagttttc tctgccatgt tgctattgca ggacggacct gtcccaagcc agatgattta    120

ccattttcca cagtggtccc gttaaaaaca ttctatgagc caggagaaga gattacgtat    180

tcctgcaagc cgggctatgt gtcccgagga gggatgagaa agtttatctg ccctctcaca    240

ggactgtggc ccatcaacac tctgaaatgt acacccagag tatgtccttt tgctggaatc    300

ttagaaaatg gagccgtacg ctatacgact tttgaatatc ccaacacgat cagtttttct    360

tgtaacactg ggttttatct gaatggcgct gattctgcca agtgcactga ggaaggaaaa    420

tggagcccgg agcttcctgt ctgtgctccc atcatctgcc ctccaccatc catacctacg    480

tttgcaacac ttcgtgttta taagccatca gctggaaaca attccctcta tcgggacaca    540

gcagtttttg aatgtttgcc acaacatgcg atgtttggaa atgatacaat tacctgcacg    600

acacatggaa attggactaa attaccagaa tgcagggaag taaaatgccc attcccatca    660

agaccagaca atggatttgt gaactatcct gcaaaaccaa cactttatta caaggataaa    720

gccacatttg gctgccatga tggatattct ctggatggcc cggaagaaat agaatgtacc    780

aaactgggaa actggtctgc catgccaagt tgtaaagcat cttgtaaatt acctgtgaaa    840

aaagccactg tggtgtacca aggagagaga gtaaagattc aggaaaaatt taagaatgga    900

atgctacatg gtgataaagt ttctttcttc tgcaaaaata aggaaaagaa gtgtagctat    960

acagaggatg ctcagtgtat agatggcact atcgaagtcc ccaaatgctt caaggaacac    1020

agttctctgg ctttttggaa aactgatgca tccgatgtaa agccatgcta aggtggtttt    1080

cagattccac ataaaatgtc acacttgttt cttgttcatc caaggaacct aattgaaatt    1140

taaaaataaa gctactgaat ttattgccgc aaaaaaaaaa aa                       1182

 

<210>3

<211>2874

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>3

gtagtggcca cagccttaca ggcaggcagg ggtggttggt gtcaacaggg gggccaacag    60

ggtaccagag ccaagaccct cggcctcctc ccccgccgcc ttcctgcaga tctgcttggc    120

tttgaggaag agtggcagta ctgcctcact gcataaggga tgggatcaga gaacagtgct    180

ttaaagagct atacactgag agaaccacca tttaccttac cctctggact tgctgtttat    240

cccgctgtac tgcaagatgg caaatttgct tcagtttttg tgtataagag agaaaatgaa    300

gacaaggtta ataaagctgc caagcatttg aagacacttc gtcacccttg cttgctaaga    360

tttttatctt gtactgtgga agcggatggc attcatcttg tcactgagcg agtacagccc    420

ctggaagtgg ctttggaaac attgtcttct gcagaggtct gtgctgggat ctatgacata    480

ttgctggctc ttatcttcct tcatgacaga ggacacctaa cacacaataa tgtctgttta    540

tcatctgtgt ttgtgagtga agatggacac tggaagctag gaggaatgga aactgtttgt    600

aaagtttctc aggccacacc agagtttctg aggagtattc agtcaataag agacccagca    660

tctatccctc ctgaagagat gtctccagaa ttcacaactc tcccagagtg tcatggacat    720

gcccgggatg ccttttcatt tggaacattg gtggaaagtt tgctcacaat cttaaatgaa    780

caggtttcag cggatgttct ctccagcttt caacagacct tgcactcaac tttgctgaat    840

cccattccaa aatgtcggcc agcgctctgc accttactat ctcatgactt cttcagaaat    900

gattttctgg aagttgtgaa tttcttgaaa agtttaacat tgaagagtga agaggagaaa    960

acggaattct ttaaatttct gctggacaga gtcagctgct tgtcagagga attgatagct    1020

tcaaggttgg tgcctcttct gcttaatcag ttggtgtttg cagagccagt ggctgttaag    1080

agttttcttc cttatctgct tggccccaaa aaagatcatg cgcagggaga aactccttgc    1140

ttgctctcac cagccctgtt ccagtcacgg gtgatccccg tgcttctcca gttgtttgaa    1200

gttcatgaag agcatgtgcg gatggtgctg ctgtctcaca tcgaggccta cgtggagcac    1260

ttcactcagg agcagctgaa gaaagtcatc ttgccacagg ttttgctggg cctgcgtgat    1320

actagtgatt ccattgtggc aattactctg catagcctag cagtgctggt ctctctgctt    1380

ggaccagagg tggttgtggg aggagaacga accaagatct tcaaacgcac tgccccaagt    1440

tttactaaaa atactgacct ttctctagaa ggtgatccat tttctcagcc tattaaattt    1500

cccataaacg gactctcaga tgtaaaaaat acttcggagg acagtgaaaa cttcccatca    1560

agttctaaaa agtctgagga gtggcctgac tggagtgaac ctgaggagcc tgaaaatcaa    1620

actgtcaaca tacagatttg gcctagagaa ccttgtgatg atgtcaagtc ccagtgcact    1680

accttggatg tggaagagtc atcttgggat gactgcgagc ccagcagctt agatactaaa    1740

gtaaacccag gaggtggaat cactgctaca aaacctgtta cctcagcgga gcagaagcct    1800

attcctgctt tgctttcact cactgaagag tctatgcctt ggaaatcaag cttaccccaa    1860

aagattagcc ttgtacaaag gggggatgac gcagaccaaa tcgagccgcc aaaagtgtca    1920

tcacaagaaa ggccccttaa ggttccatca gaacttggtt taggagagga attcaccatt  1980

caagtaaaaa agaagccagt aaaagatcct gagatggatt ggtttgctga tatgatccca  2040

gaaattaagc cttctgctgc ttttcttata ttacctgaac tgaggacaga aatggtccca  2100

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tggtgacaat agatgtgagt taaactttag gaaaaaggtt tccctttttt taaaaaaaat  2280

caatacctca aaagcaggct ttgggacaag aaaaccccaa agtggcctgc ttttcccatc  2340

ccaggagctc attatccagt ctgtgccaac tgaagtagga gactgactgt gagtgctggc  2400

taaaagccct gggtggtgag gctcacagta ctggtttcca ggaggaagag cctttgtgca  2460

tttgactgag gccagtttct atgaagagca agtagctgag gagaggtcga atttactgct  2520

ttttccagga caattccgga agtaaagaaa atgtaattca agctggttag cttaattttg  2580

tgccattctt ttctttaaca taagagtaag ctctattatg aaatacaact ttaaaaaatt  2640

ttagctataa attatataaa tgattttaaa ttgctgaggt ttccttaggc agcttattta  2700

tttgtttaca gttagactat ctgagtaaat ggttctttgt ggacctaggc agttcctgac  2760

tgttccacat gtagtacatt gtaccaaagt tcttaataag aatattcccc acaatcctgt  2820

tctctaaatg tcaaataaag attattttca ctagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa        2874

 

<210>4

<211>2794

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>4

agatctgctt ggctttgagg aagagtggca gtactgcctc actgcataag ggatgggatc    60

agagaacagt gctttaaaga gctatacact gagagaacca ccatttacct taccctctgg    120

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gagagaaaat gaagacaagg ttaataaagc tgccaagcat ttgaagacac ttcgtcaccc    240

ttgcttgcta agatttttat cttgtactgt ggaagcggat ggcattcatc ttgtcactga    300

gcgagtacag cccctggaag tggctttgga aacattgtct tctgcagagg tctgtgctgg    360

gatctatgac atattgctgg ctcttatctt ccttcatgac agaggacacc taacacacaa    420

taatgtctgt ttatcatctg tgtttgtgag tgaagatgga cactggaagc taggaggaat    480

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gtgtcatgga catgcccggg atgccttttc atttggaaca ttggtggaaa gtttgctcac    660

aatcttaaat gaacaggttt cagcggatgt tctctccagc tttcaacaga ccttgcactc    720

aactttgctg aatcccattc caaaatgtcg gccagcgctc tgcaccttac tatctcatga    780

cttcttcaga aatgattttc tggaagttgt gaatttcttg aaaagtttaa cattgaagag    840

tgaagaggag aaaacggaat tctttaaatt tctgctggac agagtcagct gcttgtcaga    900

ggaattgata gcttcaaggt tggtgcctct tctgcttaat cagttggtgt ttgcagagcc    960

agtggctgtt aagagttttc ttccttatct gcttggcccc aaaaaagatc atgcgcaggg    1020

agaaactcct tgcttgctct caccagccct gttccagtca cgggtgatcc ccgtgcttct    1080

ccagttgttt gaagttcatg aagagcatgt gcggatggtg ctgctgtctc acatcgaggc    1140

ctacgtggag cacttcactc aggagcagct gaagaaagtc atcttgccac aggttttgct    1200

gggcctgcgt gatactagcg attccattgt ggcaattact ctgcatagcc tagcagtgct    1260

ggtctctctg cttggaccag aggtggttgt gggaggagaa cgaaccaaga tcttcaaacg    1320

cactgcccca agttttacta aaaatactga cctttctcta gaagattctc ctatgtgtgt    1380

cgtctgcagc catcacagtc agatctcgcc aatcttggag aaccccttct ctagcatatt    1440

ccctaaatgt ttcttttctg gcagcacgcc catcaacagc aagaagcaca tacagcgaga    1500

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taaaaagtct gaggagtggc ctgactggag tgaacctgag gagcctgaaa atcaaactgt    1680

caacatacag atttggccta gagaaccttg tgatgatgtc aagtcccagt gcactacctt    1740

ggatgtggaa gagtcatctt gggatgactg cgagcccagc agcttagata ctaaagtaaa    1800

cccaggaggt ggaatcactg ctacaaaacc tgttacctca ggggagcaga agcctattcc    1860

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tagccttgta caaagggggg atgacgcaga ccaaatcgag ccgccaaaag tgtcatcaca    1980

agaaaggccc cttaaggttc catcagaact tggtttagga gaggaattca ccattcaagt    2040

aaaaaagaag ccagtaaaag atcctgagat ggattggttt gctgatatga tcccagaaat    2100

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<210>5

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<212>DNA

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<210>6

<211>1738

<212>DNA

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<400>6

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<210>7

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gaaaaaaggg acgtgtccat ttccagactg cgagaggcct tttctcttcg tcacacaaca    420

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cagaaagagg cagtgagttc cagtcaggga cccagtgacc ctacggacag agcggaggtg    600

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agcctgctgg tgctgcgctt gtgcgcctgg cccgcgctgc tggcgcgcca cgagcagctg    480

ctgtatgttt ccaggaaact tctaggacag aggctattca acaagctcat gaagatgacc    540

ttctatgggc attttgtagc cggggaggac caggagtcca tccagcccct gcttcggcac    600

tacagggcct tcggtgtcag cgccatcctg gactatggag tggaggagga cctgagcccc    660

gaggaggcag agcacaagga gatggagtcc tgcacctcag ctgcggagag ggatggcagt    720

ggcacgaata agcgggacaa gcaataccag gcccaccggg ccttcgggga ccgcaggaat    780

ggtgtcatca gtgcccgcac ctacttctac gccaatgagg ccaagtgcga cagccacatg    840

gagacattct tgcgctgcat cgaagcctca ggtagagtca gcgatgacgg cttcatagcc    900

attaagctca cagcactggg gagaccccag tttctgctgc agttctcaga ggtgctggcc    960

aagtggaggt gcttctttca ccaaatggct gtggagcaag ggcaggcggg cctggctgcc    1020

atggacacca agctggaggt ggcggtgctg caggaaagtg tcgcaaagtt gggcatcgca    1080

tccagggctg agattgagga ctggttcacg gcagagaccc tgggagtgtc tggcaccatg    1140

gacctgctgg actggagcag cctcatcgac agcaggacca agctgtccaa gcacttggta    1200

gtccccaacg cacagacagg acagctggag cccctgctgt cccggttcac tgaggaggag    1260

gagctacaga tgaccaggat gctacagcgg atggatgtcc tggccaagaa agccacagag    1320

atgggcgtgc ggctgatggt ggatgccgag cagacctact tccagccggc catcagccgc    1380

ctgacgctgg agatgcagcg gaagttcaat gtggagaagc cgctcatctt caacacatac    1440

cagtgctacc tcaaggatgc ctatgacaat gtgaccctgg acgtggagct ggctcgccgt    1500

gagggctggt gttttggggc caagctggtg cggggcgcat acctggccca ggagcgagcc    1560

cgtgcggcag agatcggcta tgaggacccc atcaacccca cgtacgaggc caccaacgcc    1620

atgtaccaca ggtgcctgga ctacgtgttg gaggagctga agcacaacgc caaggccaag    1680

gtgatggtgg cctcccacaa tgaggacaca gtgcgctttg cactgcgcag gatggaggag    1740

ctgggcctgc atcctgctga ccaccgggtg tactttggac agctgctagg catgtgtgac    1800

cagatcagct tcccgctggg ccaggccggc taccccgtgt acaagtacgt gccctatggc    1860

cccgtgatgg aggtgctgcc ctacttgtcc cgccgtgccc tggagaacag cagcctcatg    1920

aagggcaccc atcgggagcg gcagctgctg tggctggagc tcttgaggcg gctccgaact    1980

ggcaacctct tccatcgccc tgcctagcac ccgccagcac acccttagcc tccagcaccc    2040

cccgcccccg cccaggccat caccacagct gcagccaacc ccatcctcac acagattcac    2100

cttttttcac cccacacttg cagagctgct ggaggtgagg tcaggtgcct cccagccctg    2160

cccagagtat gggcactcag gtgtgggccg aacctgatac ctgcctggga cagccactgg    2220

aaacttttgg gaactctcct cgaatgtgtg ggcccaaggc ccccacctct gtgaccccca    2280

tgtccttgga cctagaggat tgtccacctt ctgccaaggc cagcccacac agcccgagcc    2340

ccttggggag cagtggccgg gctggggagg cctgcctggt caataaacca ctgttcctgc    2400

 

<210>11

<211>1970

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>11

gagtttccgg ctgagagtcc ttctagcggc gccggctgga gtgcagtggc acaaccttgg    60

ctcgctccag tgtctacctg ccaggttcaa gtgattctcc tgcctcagcc tcccgagtag    120

ctgggattac agattattga ataataaaat acagttttga aaaaaatgga tgaagaacct    180

gaaagaacta agcgatggga aggaggctat gaaagaacat gggagattct taaagaagat    240

gaatctggat cacttaaagc tacaatagaa gacattctat tcaaggcaaa gagaaaaaga    300

tgcgccacct ttatgtggta gtagatggat caagaacaat ggaagaccaa gatttaaagc    360

ctaatagact gacgtgtact ttaaagattg gaataattgt aactaagagt aaaagagctg    420

aaaaattgac tgaactttca ggaaacccaa gaaaacatat aacgtctttg aagaaagctg    480

tggatatgac ctgccatgga gagccatctc tttataattc cctaagcatg gctatgcaga    540

ctctaaaaca catgcctgga catacaagtc gagaagtact aatcatcttt agcagcctta    600

caacttgcga tccatctaat atttatgatc taatcaagac cctaaaggca gctaaaatta    660

gagtatctgt tactggattg tctgcagaag ttcgcgtttg cactgtactt gctcgtgaaa    720

ctggtggcac gtaccatgtt attttagatg aaagccatta caaagagttg ctcacacatc    780

atgttagtcc tcctcctgct agctcaagtt ctgaatgctc acttattcgt atgggatttc    840

ctcagcacac cattgcttct ttatctgacc aggatgcaaa accctctttc agcatggcgc    900

atttggatgg caatactgag ccagggctta cattaggagg ctatttctgc ccacagtgtc    960

gggcaaagta ctgtgagcta cctgttgaat gtaaaatctg tggtcttact ttggtgtctg    1020

ctccccactt ggcacggtct taccatcatt tgtttccttt ggatgctttt caagaaattc    1080

ccctagaaga atataatgga gaaagatttt gttatggatg tcagggggaa ttgaaagacc    1140

aacatgttta tgtttgtgct gtgtgccaaa atgttttctg tgtggactgt gatgtttttg    1200

ttcatgattc tctacactgt tgccctggct gtattcataa gattccagct ccttcaggtg    1260

tttgattcca gcatgtagta tacattgtat gtgttaaaaa gaaatttgca actgtgaata    1320

aaaggacttc tttagaagaa gcttcattta aaacatgaaa ggataatctg acttaagaaa    1380

ctttttgcta agaaaaggta atattttatt aaattttaaa tttgtgttgt cacagaaata  1440

cctgaaattc agtagtactt cattcaatta attttgtttt ctattatttt gagttatact  1500

gttttcaaag tcattatgca gtatgtataa acttataaga attaaattga tgtgataatt  1560

ttatgttttt ataattaaat atagaatctt tatgatttat gttaattcat taatttagtg  1620

taagaagaaa gttaagtctg aatgtaaatt cagtgtaaga tgaaaattta tcaatactta  1680

tgaaattagg ctgggcgctg tggctcacac ctgtaatccc aacactttgg gaggctgagg  1740

tgggcagatc acttgaggtc aggagttcga gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg  1800

tcactactaa aaatacaaaa aataattagc cgggcatggt ggttcacgcc tggagtccca  1860

gctacttggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaaccca ggaggcggag gttgcaggga  1920

gccgagattg tgccactgca ctccacccta gagtgagact ccctctcaaa             1970

 

<210>12

<211>1990

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>12

ggcggctggg agcgttttcg tggcggggaa cggaggttga attgccctgc ctgggctcat    60

agggaaggag gatgtgaagg agcttgtgaa ggcagaggaa gattattgaa taataaaata    120

cagttttgaa aaaaatggat gaagaacctg aaagaactaa gcgatgggaa ggaggctatg    180

aaagaacatg ggagattctt aaagaagatg aatctggatc acttaaagct acaatagaag    240

acattctatt caaggcaaag agaaaaagat gcgccacctt tatgtggtag tagatggatc    300

aagaacaatg gaagaccaag atttaaagcc taatagactg acgtgtactt taaagttgtt    360

ggaatacttt gtagaggaat attttgatca aaatcctatt agtcagattg gaataattgt    420

aactaagagt aaaagagctg aaaaattgac tgaactttca ggaaacccaa gaaaacatat    480

aacgtctttg aagaaagctg tggatatgac ctgccatgga gagccatctc tttataattc    540

cctaagcatg gctatgcaga ctctaaaaca catgcctgga catacaagtc gagaagtact    600

aatcatcttt agcagcctta caacttgcga tccatctaat atttatgatc taatcaagac    660

cctaaaggca gctaaaatta gagtatctgt tactggattg tctgcagaag ttcgcgtttg    720

cactgtactt gctcgtgaaa ctggtggcac gtaccatgtt attttagatg aaagccatta    780

caaagagttg ctcacacatc atgttagtcc tcctcctgct agctcaagtt ctgaatgctc    840

acttattcgt atgggatttc ctcagcacac cattgcttct ttatctgacc aggatgcaaa    900

accctctttc agcatggcgc atttggatgg caatactgag ccagggctta cattaggagg    960

ctatttctgc ccacagtgtc gggcaaagta ctgtgagcta cctgttgaat gtaaaatctg    1020

tggtcttact ttggtgtctg ctccccactt ggcacggtct taccatcatt tgtttccttt    1080

ggatgctttt caagaaattc ccctagaaga atataatgga gaaagatttt gttatggatg    1140

tcagggggaa ttgaaagacc aacatgttta tgtttgtgct gtgtgccaaa atgttttctg    1200

tgtggactgt gatgtttttg ttcatgattc tctacactgt tgccctggct gtattcataa  1260

gattccagct ccttcaggtg tttgattcca gcatgtagta tacattgtat gtgttaaaaa  1320

gaaatttgca actgtgaata aaaggacttc tttagaagaa gcttcattta aaacatgaaa  1380

ggataatctg acttaagaaa ctttttgcta agaaaaggta atattttatt aaattttaaa  1440

tttgtgttgt cacagaaata cctgaaattc agtagtactt cattcaatta attttgtttt  1500

ctattatttt gagttatact gttttcaaag tcattatgca gtatgtataa acttataaga  1560

attaaattga tgtgataatt ttatgttttt ataattaaat atagaatctt tatgatttat  1620

gttaattcat taatttagtg taagaagaaa gttaagtctg aatgtaaatt cagtgtaaga  1680

tgaaaattta tcaatactta tgaaattagg ctgggcgctg tggctcacac ctgtaatccc  1740

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gccaacatgg tgaaaccccg tcactactaa aaatacaaaa aataattagc cgggcatggt  1860

ggttcacgcc tggagtccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaaccca  1920

ggaggcggag gttgcaggga gccgagattg tgccactgca ctccacccta gagtgagact  1980

ccctctcaaa                                                         1990

 

<210>13

<211>2181

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>13

gtccgcgtgt ggaagtctgt gaggcgcaga ggtggggcag gccgtctggc tagctaggcg    60

gctgggagcg ttttcgtggc ggggaacgga ggttgaattg ccctgcctgg gctcataggg    120

aaggaggatg tgaaggagct tgtgaaggca gaggaaggct ggagtgcagt ggcacaacct    180

tggctcgctc cagtgtctac ctgccaggtt caagtgattc tcctgcctca gcctcccgag    240

tagctgggat tacagattat tgaataataa aatacagttt tgaaaaaaat ggatgaagaa    300

cctgaaagaa ctaagcgatg ggaaggaggc tatgaaagaa catgggagat tcttaaagaa    360

gatgaatctg gatcacttaa agctacaata gaagacattc tattcaaggc aaagagaaaa    420

agagtatttg agcaccatgg acaagttcga cttggaatga tgcgccacct ttatgtggta    480

gtagatggat caagaacaat ggaagaccaa gatttaaagc ctaatagact gacgtgtact    540

ttaaagttgt tggaatactt tgtagaggaa tattttgatc aaaatcctat tagtcagatt    600

ggaataattg taactaagag taaaagagct gaaaaattga ctgaactttc aggaaaccca    660

agaaaacata taacgtcttt gaagaaagct gtggatatga cctgccatgg agagccatct    720

ctttataatt ccctaagcat ggctatgcag actctaaaac acatgcctgg acatacaagt    780

cgagaagtac taatcatctt tagcagcctt acaacttgcg atccatctaa tatttatgat    840

ctaatcaaga ccctaaaggc agctaaaatt agagtatctg ttactggatt gtctgcagaa    900

gttcgcgttt gcactgtact tgctcgtgaa actggtggca cgtaccatgt tattttagat    960

gaaagccatt acaaagagtt gctcacacat catgttagtc ctcctcctgc tagctcaagt    1020

tctgaatgct cacttattcg tatgggattt cctcagcaca ccattgcttc tttatctgac    1080

caggatgcaa aaccctcttt cagcatggcg catttggatg gcaatactga gccagggctt    1140

acattaggag gctatttctg cccacagtgt cgggcaaagt actgtgagct acctgttgaa    1200

tgtaaaatct gtggtcttac tttggtgtct gctccccact tggcacggtc ttaccatcat    1260

ttgtttcctt tggatgcttt tcaagaaatt cccctagaag aatataatgg agaaagattt    1320

tgttatggat gtcaggggga attgaaagac caacatgttt atgtttgtgc tgtgtgccaa    1380

aatgttttct gtgtggactg tgatgttttt gttcatgatt ctctacactg ttgccctggc    1440

tgtattcata agattccagc tccttcaggt gtttgattcc agcatgtagt atacattgta    1500

tgtgttaaaa agaaatttgc aactgtgaat aaaaggactt ctttagaaga agcttcattt    1560

aaaacatgaa aggataatct gacttaagaa actttttgct aagaaaaggt aatattttat    1620

taaattttaa atttgtgttg tcacagaaat acctgaaatt cagtagtact tcattcaatt    1680

aattttgttt tctattattt tgagttatac tgttttcaaa gtcattatgc agtatgtata    1740

aacttataag aattaaattg atgtgataat tttatgtttt tataattaaa tatagaatct    1800

ttatgattta tgttaattca ttaatttagt gtaagaagaa agttaagtct gaatgtaaat    1860

tcagtgtaag atgaaaattt atcaatactt atgaaattag gctgggcgct gtggctcaca    1920

cctgtaatcc caacactttg ggaggctgag gtgggcagat cacttgaggt caggagttcg    1980

agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc gtcactacta aaaatacaaa aaataattag    2040

ccgggcatgg tggttcacgc ctggagtccc agctacttgg gaggctgagg caggagaatc    2100

gcttgaaccc aggaggcgga ggttgcaggg agccgagatt gtgccactgc actccaccct    2160

agagtgagac tccctctcaa a                                              2181

 

<210>14

<211>1964

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>14

ggcggagttt ccggctgaga gtccttctag cggcgccgat tattgaataa taaaatacag    60

ttttgaaaaa aatggatgaa gaacctgaaa gaactaagcg atgggaagga ggctatgaaa    120

gaacatggga gattcttaaa gaagatgaat ctggatcact taaagctaca atagaagaca    180

ttctattcaa ggcaaagaga aaaagagtat ttgagcacca tggacaagtt cgacttggaa    240

tgatgcgcca cctttatgtg gtagtagatg gatcaagaac aatggaagac caagatttaa    300

agcctaatag actgacgtgt actttaaagt tgttggaata ctttgtagag gaatattttg    360

atcaaaatcc tattagtcag attggaataa ttgtaactaa gagtaaaaga gctgaaaaat    420

tgactgaact ttcaggaaac ccaagaaaac atataacgtc tttgaagaaa gctgtggata    480

tgacctgcca tggagagcca tctctttata attccctaag catggctatg cagactctaa    540

aacacatgcc tggacataca agtcgagaag tactaatcat ctttagcagc cttacaactt    600

gcgatccatc taatatttat gatctaatca agaccctaaa ggcagctaaa attagagtat    660

ctgttactgg attgtctgca gaagttcgcg tttgcactgt acttgctcgt gaaactggtg    720

gcacgtacca tgttatttta gatgaaagcc attacaaaga gttgctcaca catcatgtta    780

gtcctcctcc tgctagctca agttctgaat gctcacttat tcgtatggga tttcctcagc    840

acaccattgc ttctttatct gaccaggatg caaaaccctc tttcagcatg gcgcatttgg    900

atggcaatac tgagccaggg cttacattag gaggctattt ctgcccacag tgtcgggcaa    960

agtactgtga gctacctgtt gaatgtaaaa tctgtggtct tactttggtg tctgctcccc    1020

acttggcacg gtcttaccat catttgtttc ctttggatgc ttttcaagaa attcccctag    1080

aagaatataa tggagaaaga ttttgttatg gatgtcaggg ggaattgaaa gaccaacatg    1140

tttatgtttg tgctgtgtgc caaaatgttt tctgtgtgga ctgtgatgtt tttgttcatg    1200

attctctaca ctgttgccct ggctgtattc ataagattcc agctccttca ggtgtttgat    1260

tccagcatgt agtatacatt gtatgtgtta aaaagaaatt tgcaactgtg aataaaagga    1320

cttctttaga agaagcttca tttaaaacat gaaaggataa tctgacttaa gaaacttttt    1380

gctaagaaaa ggtaatattt tattaaattt taaatttgtg ttgtcacaga aatacctgaa    1440

attcagtagt acttcattca attaattttg ttttctatta ttttgagtta tactgttttc    1500

aaagtcatta tgcagtatgt ataaacttat aagaattaaa ttgatgtgat aattttatgt    1560

ttttataatt aaatatagaa tctttatgat ttatgttaat tcattaattt agtgtaagaa    1620

gaaagttaag tctgaatgta aattcagtgt aagatgaaaa tttatcaata cttatgaaat    1680

taggctgggc gctgtggctc acacctgtaa tcccaacact ttgggaggct gaggtgggca    1740

gatcacttga ggtcaggagt tcgagaccag cctggccaac atggtgaaac cccgtcacta    1800

ctaaaaatac aaaaaataat tagccgggca tggtggttca cgcctggagt cccagctact    1860

tgggaggctg aggcaggaga atcgcttgaa cccaggaggc ggaggttgca gggagccgag    1920

attgtgccac tgcactccac cctagagtga gactccctct  caaa                    1964

 

<210>15

<211>1908

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>15

atggatgaag aacctgaaag aactaagcga tgggaaggag gctatgaaag aacatgggag    60

attcttaaag aagatgaatc tggatcactt aaagctacaa tagaagacat tctattcaag    120

gcaaagagaa aaaggtatgt aaccttccta ttatttgagc accatggaca agttcgactt    180

ggaatgatgc gccaccttta tgtggtagta gatggatcaa gaacaatgga agaccaagat    240

ttaaagccta atagactgac gtgtacttta aagttgttgg aatactttgt agaggaatat    300

tttgatcaaa atcctattag tcagattgga ataattgtaa ctaagagtaa aagagctgaa    360

aaattgactg aactttcagg aaacccaaga aaacatataa cgtctttgaa gaaagctgtg    420

gatatgacct gccatggaga gccatctctt tataattccc taagcatggc tatgcagact    480

ctaaaacaca tgcctggaca tacaagtcga gaagtactaa tcatctttag cagccttaca    540

acttgcgatc catctaatat ttatgatcta atcaagaccc taaaggcagc taaaattaga    600

gtatctgtta ctggattgtc tgcagaagtt cgcgtttgca ctgtacttgc tcgtgaaact    660

ggtggcacgt accatgttat tttagatgaa agccattaca aagagttgct cacacatcat    720

gttagtcctc ctcctgctag ctcaagttct gaatgctcac ttattcgtat gggatttcct    780

cagcacacca ttgcttcttt atctgaccag gatgcaaaac cctctttcag catggcgcat    840

ttggatggca atactgagcc agggcttaca ttaggaggct atttctgccc acagtgtcgg    900

gcaaagtact gtgagctacc tgttgaatgt aaaatctgtg gtcttacttt ggtgtctgct    960

ccccacttgg cacggtctta ccatcatttg tttcctttgg atgcttttca agaaattccc    1020

ctagaagaat ataatggaga aagattttgt tatggatgtc agggggaatt gaaagaccaa    1080

catgtttatg tttgtgctgt gtgccaaaat gttttctgtg tggactgtga tgtttttgtt    1140

catgattctc tacactgttg ccctggctgt attcataaga ttccagctcc ttcaggtgtt    1200

tgattccagc atgtagtata cattgtatgt gttaaaaaga aatttgcaac tgtgaataaa    1260

aggacttctt tagaagaagc ttcatttaaa acatgaaagg ataatctgac ttaagaaact    1320

ttttgctaag aaaaggtaat attttattaa attttaaatt tgtgttgtca cagaaatacc    1380

tgaaattcag tagtacttca ttcaattaat tttgttttct attattttga gttatactgt    1440

tttcaaagtc attatgcagt atgtataaac ttataagaat taaattgatg tgataatttt    1500

atgtttttat aattaaatat agaatcttta tgatttatgt taattcatta atttagtgta    1560

agaagaaagt taagtctgaa tgtaaattca gtgtaagatg aaaatttatc aatacttatg    1620

aaattaggct gggcgctgtg gctcacacct gtaatcccaa cactttggga ggctgaggtg    1680

ggcagatcac ttgaggtcag gagttcgaga ccagcctggc caacatggtg aaaccccgtc    1740

actactaaaa atacaaaaaa taattagccg ggcatggtgg ttcacgcctg gagtcccagc    1800

tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgaacccagg aggcggaggt tgcagggagc    1860

cgagattgtg  ccactgcact  ccaccctaga gtgagactcc  ctctcaaa              1908

 

<210>16

<211>2088

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>16

ggtgagtccg cgtgtggaag tctgtgaggc gcagaggtgg ggcaggccgt ctggctagct    60

aggcggctgg gagcgttttc gtggcgggga acggaggttg aattgccctg cctgggctca    120

tagggaagga ggatgtgaag gagcttgtga aggcagagga agattattga ataataaaat    180

acagttttga aaaaaatgga tgaagaacct gaaagaacta agcgatggga aggaggctat    240

gaaagaacat gggagattct taaagaagat gaatctggat cacttaaagc tacaatagaa    300

gacattctat tcaaggcaaa gagaaaaaga gtatttgagc accatggaca agttcgactt    360

ggaatgatgc gccaccttta tgtggtagta gatggatcaa gaacaatgga agaccaagat  420

ttaaagccta atagactgac gtgtacttta aagttgttgg aatactttgt agaggaatat  480

tttgatcaaa atcctattag tcagattgga ataattgtaa ctaagagtaa aagagctgaa  540

aaattgactg aactttcagg aaacccaaga aaacatataa cgtctttgaa gaaagctgtg  600

gatatgacct gccatggaga gccatctctt tataattccc taagcatggc tatgcagact  660

ctaaaacaca tgcctggaca tacaagtcga gaagtactaa tcatctttag cagccttaca  720

acttgcgatc catctaatat ttatgatcta atcaagaccc taaaggcagc taaaattaga  780

gtatctgtta ctggattgtc tgcagaagtt cgcgtttgca ctgtacttgc tcgtgaaact  840

ggtggcacgt accatgttat tttagatgaa agccattaca aagagttgct cacacatcat  900

gttagtcctc ctcctgctag ctcaagttct gaatgctcac ttattcgtat gggatttcct  960

cagcacacca ttgcttcttt atctgaccag gatgcaaaac cctctttcag catggcgcat  1020

ttggatggca atactgagcc agggcttaca ttaggaggct atttctgccc acagtgtcgg  1080

gcaaagtact gtgagctacc tgttgaatgt aaaatctgtg gtcttacttt ggtgtctgct  1140

ccccacttgg cacggtctta ccatcatttg tttcctttgg atgcttttca agaaattccc  1200

ctagaagaat ataatggaga aagattttgt tatggatgtc agggggaatt gaaagaccaa  1260

catgtttatg tttgtgctgt gtgccaaaat gttttctgtg tggactgtga tgtttttgtt  1320

catgattctc tacactgttg ccctggctgt attcataaga ttccagctcc ttcaggtgtt  1380

tgattccagc atgtagtata cattgtatgt gttaaaaaga aatttgcaac tgtgaataaa  1440

aggacttctt tagaagaagc ttcatttaaa acatgaaagg ataatctgac ttaagaaact  1500

ttttgctaag aaaaggtaat attttattaa attttaaatt tgtgttgtca cagaaatacc  1560

tgaaattcag tagtacttca ttcaattaat tttgttttct attattttga gttatactgt  1620

tttcaaagtc attatgcagt atgtataaac ttataagaat taaattgatg tgataatttt  1680

atgtttttat aattaaatat agaatcttta tgatttatgt taattcatta atttagtgta  1740

agaagaaagt taagtctgaa tgtaaattca gtgtaagatg aaaatttatc aatacttatg  1800

aaattaggct gggcgctgtg gctcacacct gtaatcccaa cactttggga ggctgaggtg  1860

ggcagatcac ttgaggtcag gagttcgaga ccagcctggc caacatggtg aaaccccgtc  1920

actactaaaa atacaaaaaa taattagccg ggcatggtgg ttcacgcctg gagtcccagc  1980

tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgaacccagg aggcggaggt tgcagggagc  2040

cgagattgtg ccactg cact ccaccctaga gtgagactcc ctctcaaa              2088

 

<210>17

<211>3609

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>17

gagccgcggc cgcgcggagg aagcgaagga ggcgggagcg gagacctcgc tgcgctcatg    60

gcgtcgcccg ggcattcaga tttgggagaa gtagccccag aaataaaagc atcagagaga    120

cgaacagctg tggccattgc agatttggaa tggagagaaa tggaaggaga tgattgcgag    180

ttccgttatg gagatggtac aaatgaggct caggacaatg attttccaac agtggagaga    240

agcaggcttc aagaaatgct gtcacttttg ggcctagaga cgtaccaggt ccagaaactc    300

agcctccagg actctctgca gatcagtttt gacagtatga agaactgggc ccctcaggtt    360

cccaaagact tgccctggaa tttcctcagg aagttgcagg ccctcaatgc tgatgccagg    420

aataccacta tggtgctgga cgtgctccca gacgccaggc ctgtggagaa ggagagccag    480

atggaagagg agatcatcta ctgggaccca gctgatgacc ttgctgccga catttattcc    540

ttttctgagc tgcccacccc tgatacgcca gtgaacccct tagaccttct ctgtgccctg    600

ctgctctcct cagacagttt cctgcaacaa gaaatagcgt tgaaaatggc cctctgccag    660

tttgcactcc cactcgtgtt gcctgactcg gagaaccact accatacatt tctgctgtgg    720

gccatgcggg gcattgtgag gacatggtgg tcccagcccc caaggggcat ggggagcttc    780

cgggaagaca gcgtggtctt gtccagggcg cccgccttcg ccttcgtgcg catggacgtc    840

agtagcaact ccaagtccca gcttctcaac gccgtcctca gcccgggcca caggcagtgg    900

gactgcttct ggcatcggga cctcaacttg ggcaccaatg cccgggagat ttcggatggg    960

ttggtagaaa tttcctggtt ttttcccagc ggaagggagg acttggacat tttcccagaa    1020

cctgtggcct ttctgaacct gagaggtgac atcgggtctc actggctgca gtttaagctc    1080

ttgacagaaa tctcctccgc tgtgtttata ttgactgaca atatcagtaa gaaggaatac    1140

aaattgctgt actccatgaa ggagtcaacc acaaaatact acttcatcct gagtccctac    1200

cgtgggaagc gcaacacaaa cctgagattt ctgaataagt taattcctgt gctgaaaata    1260

gaccactcac atgtcctggt aaaggtcagc agcactgaca gcgacagctt cgtgaagagg    1320

atccgggcca tcgttgggaa tgtgctgcgg gcaccctgca ggcgggtatc tgtggaggac    1380

atggcgcacg cagcccgcaa actgggccta aaggtcgacg aggactgtga ggagtgtcag    1440

aaagcgaaag accggatgga gaggattacc aggaaaatca aagactcgga tgcctacaga    1500

agggacgagc tgaggctgca gggggacccc tggagaaagg cagcccaagt ggagaaggag    1560

ttctgccagc tccagtgggc cgtggacccc cctgagaagc acagggctga gctgaggcgg    1620

cggctgctag aacttcgaat gcagcagaac ggccatgatc cctcctcggg ggtgcaggag    1680

ttcatctcgg ggatcagcag cccctccttg agtgagaagc agtacttcct gaggtggatg    1740

gagtggggcc tggcacgggt ggcccagccg cgactgagac agcctccgga gacgcttctc    1800

accctgagac caaagcatgg gggcaccaca gacgtggggg agccgctctg gcctgagccc    1860

ctaggggtgg aacacttctt gcgggagatg ggacagtttt atgaggctga gagctgtctt    1920

gtggaggcag ggaggctgcc ggcaggccag aggcgttttg cccacttccc aggcttggcc    1980

tcggagctgc tgctgacagg gctgcctctg gagctaatcg atgggagcac gctgagcatg    2040

cccgtccgct gggtcacagg gctcctgaag gagctgcacg tccgactgga gagacggtca    2100

aggctggtgg ttctgtcaac cgtcggggtg ccaggcacgg gcaagtccac actcctcaac    2160

accatgtttg ggctgcggtt tgccacaggg aagagctgcg gtcctcgagg ggccttcatg    2220

cagctcatca cagtggctga gggcttcagc caggacctgg gctgtgacca catcctggtg    2280

atagactccg ggggcttgat aggtggggcc ttgacgtcag ctggggacag atttgagctg    2340

gaggcttcct tggccactct gctcatggga ctgagcaatg tcaccgtgat cagtctagct    2400

gaaaccaagg acattccagc agctattctg catgcatttc tgaggttaga aaaaacgggg    2460

cacatgccca actaccagtt tgtataccag aaccttcatg atgtatctgt tcccggccct    2520

aggcccagag acaagagaca gctcctggat ccacctggtg acctgagcag ggctgcagcc    2580

cagatggaga aacagggcga cggcttccgg gcactggcag gcctggcctt ctgcgaccct    2640

gagaagcagc acatctggca catcccaggc ctgtggcacg gagcacctcc catggccgca    2700

gtgagcttgg cctacagtga agccatattt gaattgaaga gatgcctact cgaaaacatc    2760

aggaacggct tgtcgaacca aaacaaaaac atccagcagc tcattgagct ggtgagacgg    2820

ctgtgagtgt gcagagaaac ccagttcagg tgtaggaggc tgctgtgggc agccctgtct    2880

gatggggcac ccgtgtgggg ctgtgctctg gtgcctgaga atggctggtg cccaatcgac    2940

atgagaagac gaggaaaaga cagggtttgg agtctcctca acagtgttaa aagaggaagt    3000

gacctcacag accagctcag agatgttacc aagaatatca cagcccccag ggtagggaga    3060

caagcagcag tttgttctgt ctcagctcct gtcaaggatc ctgcggggtg ggccctctgt    3120

atagctgctc tctgtcactg gcccctggag tgggagcagc gtccttagtc actgcaggcc    3180

caggcgggca ggtggtccca ggacagaggt ggggaagttg tcctgaggaa gcagaagtag    3240

gccttgctcc cgcccaaccc aagggcctcc agtggaccag cattcaagat gtgagtgccc    3300

gtggtgtgca aggcactccc atggcaccgt atttattgac tgatctgtga aggcttccct    3360

gacccctgcc caggaagagt tcactggtcg ctctgttgtg ccccacagca ctttgttata    3420

cctctgccac acacttcacg cagcgcgttg taactcatgt gtttacatgt ctgtcccccc    3480

agactgtgag ctccttgagg gcagggactg tacattctcc agctctgtgt ccccagggcc    3540

tggcacattg tagacgctta ataaatgtct gttaaatgaa tgagtgcaca aaaaaaaaaa    3600

aaaaaaaaa                                                            3609

 

<210>18

<211>1819

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>18

tattcaataa ggactgttat ttctagtata gagaggaggg ctcctaggcc tggctaagca    60

gtttaagata aaatgcaaaa tgacccaatt caggatgatt atagttggtt taaatttggt    120

tgctgaggca caaacaaaag tgttggattc tgtagttttt gttgtgatta cagaacacat    180

gcagtatctt ccagaaccct ttgataaagc tgaagtaagg atgggctcac atggcccatg    240

tgagtaagaa gctgtgttga cagagtggac gataccttca attatggctt aacaaaaaat    300

gcctgaaaat ggaataactt agaaggaact cttcctttaa aggatttaat ggcaggtgca    360

gtggcttacg cctgtaatcc cagcactttg ggagcctgag gcagaagatg gcttgagccc    420

aggagtttga ggcagcggtg agccataatc ataccactgc acttaagcct gggcaacaca    480

atgagaccct gtctcctgtc tttaaaaaaa agagacagag acctacctgt atgctaggag    540

catccttctc actgtaggtc ggatgtggtg gttctgtttt aaatttgctg aattgtgact    600

ttttttcttt ttcttttttt tttttttttt tttgtttttt tttgaggcag ggtctcactc    660

tgtcgcccag gctggagtgc agtggtgtga tctcggctca cttcaacctc cacctcctgg    720

gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gattacaggc gtgcaccacc    780

atgcctggct aatttttgta tttttagtag agatggggtt tcacaatgtt gcccaggttg    840

gtctcgaacc gctgacctta agcgatccgc ctgccttggc ctccccaagg tgctggaatt    900

acaggcatga gccaccgcgc ccggctgact tttttttttt ctttctttct ttttgagaca    960

gagttttgct cagtctccca ggctggagtg caatggcaac aacatggctc gctgcagcct    1020

caatctgctg tgctcaggta ttcctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggactacagg    1080

cgcatgccac cacacctggc tattgtggat tttaagaaat tttttttgta gagacagggt    1140

cttactatgt tgcccaggtt gttcttgaac tcttgggctc cagagagcct cccatctcag    1200

cctcccaaag tgctgagatt ataggcgtga gccaccacac ttagcctatt gtgacttttt    1260

agagtctcta atactttctt ttagggcact aaaaacttaa tcttagatcc agttggtatt    1320

catttgggtg aatgaagtgg tagggaccta ccttaatttt ttttccaggt ttttgtgatt    1380

gaataagttc cagatactca aagcgaccta gatcagtgat gaaatttttg actgcatttg    1440

gacctatttc tgggatctcc ttttactgat ttctctgtat attcatgagc aaccttaaat    1500

tattttagac tatttaatta ttatgttcta ttttctggaa agttttgtcc ttcactcttc    1560

tttttcaaaa ttttcctgat tgttatttca taaatatttt ttcacagaat caactggttt    1620

tgaacctcaa tttacttata ggttaattta gagagaattg acttttaaaa ttatattaaa    1680

ggccaggcat ggtagctcat gcttataatc ctggcatttt ggggggctga ggcagatgga    1740

tcacatgatc ccaggatttg agactggcct gggcaacata gtgagatctc atctcttaaa    1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                                                 1819

 

<210>19

<211>2520

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>19

agaaaaagaa agaaatccta gaaaacagaa agcaacagga agatgtctta ttgggaacta    60

cccccatcaa cttcaccatg agtcaaacaa ggaagaaaac ttcctcagaa ggagaaacta    120

agccccagac ttcaactgtc aacaaatttc tcaggggctc caatgctgaa agcagaaaag    180

aggacaatga ccttaaaaca agtgattccc aacccagcga ctggatacag aagacagcca    240

cctcagagac tgctaagcct ctcagttcag aaatggaatg gagatccagt atggagaaaa    300

atgagcattt cctgcagaag ctgggcaaaa aggctgtcaa caagtgtcta gatttgaata    360

actgtggatt aacaacagcg gacatgaaag aaatggttgc cttgctgcct tttctcccag    420

acttggaaga actggatatc tcctggaatg gttttgtagg tggaaccctc ctttccatca    480

ctcagcaaat gcatctggtc agcaagttaa aaatcttgag gctgggtagc tgcagactca    540

ccactgacga tgttcaagca ctgggagaag catttgagat gattcctgaa cttgaagagc    600

taaatttgtc ttggaacagt aaagtgggag gaaatttgcc tctgatcctt cagaagttcc    660

aaaaagggag caagatacaa atgattgagc ttgtggattg ctccctcacg tcagaagatg    720

ggacatttct gggtcaactg ctacctatgc tgcaaagtct cgaagtactt gatctttcca    780

ttaacagaga cattgttggc agtctgaaca gtattgctca gggattaaaa agcacctcaa    840

atctgaaagt actgaagtta cattcatgtg gattatcaca aaagagtgtc aaaatattgg    900

atgctgcttt taggtatttg ggtgagctga ggaaattaga tctttcctgc aataaggatc    960

taggtggagg ttttgaagac tcgccggctc agttggtcat gctaaagcat ctacaagtcc    1020

tagatcttca ccagtgctca ctaacagcag atgacgtgat gtcactgacc caggtcattc    1080

ctttactttc aaatcttcaa gaattggatt tatcagccaa caaaaagatg ggcagttctt    1140

ctgaaaactt actcagcagg ctccgatttt taccagcatt gaagtcatta gttatcaaca    1200

actgtgcttt ggagagtgag acttttacag ctcttgctga agcctctgtt cacctctctg    1260

ctctggaagt attcaacctt tcttggaaca agtgtgttgg tggcaacttg aagctgcttc    1320

tggaaacact aaagctttcc atgtctcttc aagtgctgag gctgagcagc tgttccctgg    1380

tgacagagga tgtggctctc ctggcatcgg tcatacagac gggtcatctg gccaaactgc    1440

aaaagctgga cctgagctac aatgacagca tctgtgatgc ggggtggacc atgttctgcc    1500

aaaacgtgcg gttcctcaaa gagctaatcg agctggatat tagccttcga ccatcaaatt    1560

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tcactgagat aggaatgaaa agatggattc tcccagcttc acaggaggaa gaactagaat    1680

gctttgacca agataaaaaa agaagcattc actttgacca tggtgggttt cagtaaactg    1740

atttcccatg tcctactaag ctacaaacca ttctccaaag gaaaagaaca tgaacgaatt    1800

ccagagtcat gaactgaatt tcaacttctg ggccatttaa tgggacttat attacaagag    1860

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atataattag ttcatttgct gtttagaagc cttgccaaaa gtgtttagat tttggtactg    2100

caactgcttt cctcttgccc agaaatgttt tgcctcttct tttcctacaa gttaaatgtt    2160

ctaaatataa aggggtatgt gtgtgtgtgt gtaattctaa tgtgaaaggc actagctgtc    2220

taatagtttc atgtatcatt actattacta tatgtatctt aatgtagtct atgtaggttt    2280

ttatcagaaa gtgtaccttt ctatggttta ttattttata ttctggtgcc ttttatctca    2340

gatataaacc atgaacagta atgatagtca ctgacatata aatcttagta aaaagtgatt    2400

aaaaatctaa aactcagtat gaaaaacata tcttgttaga ataaattaaa accttttatt    2460

gtttaaaaaa ttgttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    2520

Claims (12)

1.预测癌症患者对使用EGFR抑制剂的治疗的反应的体外方法，其包括：确定患者肿瘤样品中至少一种选自由GBAS，APOH，SCYL3，PMS2CL，PRODH，SERF1A，URG4A和LRRC 31组成的组中的基因的表达水平和对所述至少一种的基因的表达水平和代表不反应患者群中所述至少一种基因表达水平的值进行比较，其中患者的肿瘤样品中所述至少一种基因的较高表达水平指示将对该治疗有反应的患者。

2.权利要求1的方法，其中所述表达水平通过微阵列技术确定。

3.权利要求1或2的方法，其中确定至少2种基因的表达水平。

4.权利要求1-3的方法，其中确定至少3种基因的表达水平。

5.权利要求1-4的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼。

6.权利要求1-5的方法，其中所述癌症是NSCLC。

7.选自由GBAS，APOH，SCYL3，PMS2CL，PRODH，SERF 1A，URG4A和LRR 31组成的组中的基因用于预测癌症患者对EGFR抑制剂治疗的反应的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述癌症是NSCLC。

9.权利要求7或8的用途，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼。

10.治疗通过权利要求1-7的方法鉴定的癌症患者的方法，其包括将EGFR抑制剂施用于所述患者。

11.权利要求10的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼。

12.权利要求10或11的方法，其中所述癌症是NSCLC。

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