CN105765081A - 一种用于预测对采用egfr抑制剂的治疗的响应性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预测患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的方法，该方法包括确定所述患者样本中的hsa?miR?31?3p(SEQ ID NO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平，其中所述hsa?miR?31?3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41 L4B。本发明还涉及用于测量DBNDD2和/或EPB41L4B的表达以及至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的其他参数的试剂盒。本发明也涉及EGFR抑制剂在经预测对所述EGFR抑制剂有响应的患者中的治疗用途。

Description

一种用于预测对采用EGFR抑制剂的治疗的响应性的方法
技术领域
本发明提供癌症治疗的个体化化疗的方法，尤其是在使用一种或者多种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂进行治疗之前，评价患者对这种药剂响应性的方法，所述方法基于确定hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)通路在人类上皮细胞癌的发生和发展中起到关键作用。在具有功能性EGFR依赖的自分泌生长通路的不同人类癌症细胞中，同EGFR抑制剂的联合治疗具有协同的生长抑制和促凋亡活性，从而更加高效和持续的抑制Akt。
EGFR抑制剂已经在多种癌症治疗中被批准或者测试，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、结肠直肠癌和Her2-阳性的乳癌，同时也更多的被引入到标准的治疗中。EGFR抑制剂可以靶向EGFR靶标的胞内酪氨酸激酶结构域或者胞外的结构域，EGFR抑制剂的普遍困扰是人群响应率低，并导致化疗在许多病例中无效或者非最佳，以及不必要的药物毒性和费用。比如，据报道，西妥昔单抗(一种靶向EGFR胞外结构域的嵌合型单克隆抗体)在治疗结肠直肠癌时的临床响应率约为11％(Cunningham等人,NEnglMed2004；351:337-45)，埃罗替尼对于NSCLC的临床响应率约为8.9％(ShepherdFA等人,NEnglJMed2005；353:123-132)。
尤其在KRAS突变的情况中，已经观察到了耐受性。
在结肠直肠癌中，由于KRAS突变与抗EGFR抗体的耐受性有明确的相关性(Lievre等人,CancerRes.200666(8):3992-5)，主要的挑战之一是在不带有KRAS突变的患者中鉴定能够预测对这种治疗缺乏响应的其它标记物。在其中，上述原癌基因的扩增或者激活突变、以及肿瘤抑制基因的失活突变作为相关候选，比如通过测量EGFR下游磷酸化蛋白的表达评价EGFR下游信号通路的激活水平。
在肺癌中有三类患者：一类患者带有EGFR突变的肿瘤，对于这类患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI)被证明是可以改善结果，第二类患者带有KRAS突变的肿瘤，对于这类患者抗EGFR的治疗很可能不是好的选择，以及第三类既没有EGFR突变也没有KRAS突变的肿瘤，对于这类患者无法预测响应。在没有突变肿瘤的患者中，至今没有药物响应相关的标记物被证明是有价值的。
因此，为了更好的对患者进行个性化治疗，在使用EGFR抑制剂治疗之前，需要预测患者对这种药剂的响应性。
在现有技术中，有很多文献涉及将微小RNA(microRNA)(miRNA)与多种抗癌症治疗的敏感性或者耐受性相联系。尤其是PCT/EP2012/073535描述了一种用于预测患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的体外方法，该方法包含确定所述患者样本中hsa-miR-31-3p(曾用名hsa-miR-31*，SEQIDNO:1)miRNA的表达水平。更尤其是，hsa-miR-31-3p的表达越低，患者越可能响应EGFR抑制剂治疗。
类似的，在现有技术中，有很多文献涉及将多种基因与多种抗癌症治疗的敏感性或者耐受性相联系。然而，在大多数情况下，研究是部分的、不完整的，并且实际上也不允许真正预测对治疗的临床响应或不响应。事实上，在很多情况下，研究只局限在体外、在对具体治疗敏感或耐受的细胞系中、或者在分离自患者肿瘤的肿瘤细胞中分析基因的表达。此外，许多研究中虽然显示出两种细胞群或患者群之间表达水平上的差异，但并没有给出阈值或者分数以允许真正在新的患者中预测响应或不响应。这与许多研究缺乏获自临床环境(setting)的数据的第一缺点部分相关。此外，即使存在一些获自临床环境的数据时，这些数据大多时候仅仅是回顾性的，而通常缺少在独立的群体中进行预测方法验证的数据。
鉴于现有研究中的多种缺点，仍有需要真正的和经验证的用于在患者中预测响应EGFR抑制剂的方法，其中针对所述患者的这种治疗只是多种选择之一。本发明针对这种需求给出了回应。
已经公开了DBNDD2(dysbindin(小肌营养蛋白结合蛋白1)结构域含2)是人酪蛋白激酶-1的结合伴侣(YinH等人.Biochemistry.2006四月25；45(16):5297-308)。此外，使用微阵列整体谱(microarrayglobalprofiling)发现，在许多其他的基因之中，其在多种肿瘤细胞(WO2010065940；WO2010059742；WO2009131710；WO2007112097)中、或者在对雷帕霉素(WO2011017106)或他莫昔芬(tamoxifen，WO2010127338)敏感或耐受的癌症细胞之间差异性表达。然而，该基因似乎不与癌症特异性相关，并且未公开该基因与预测响应EGFR抑制剂相联系。
EPB41L4B(红细胞膜蛋白区带4.1样4B)是FERM家族蛋白中的蛋白，其能够将跨膜蛋白与细胞骨架连接，或者将激酶和/或有酶活性的磷酸酶与质膜连接，并且已描述了其涉及致癌作用和转移。尤其是，EPB41L4B(也称为EHM2)与前列腺癌(WangJ,等人.Prostate.2006十一月1；66(15):1641-52；SchulzWA,等人.BMCCancer.2010九月22；10:505)和乳癌(YuH等人.MolCancerRes2010；8:1501-1512)的侵袭性增加相关。因此，该基因与至少这两种类型的癌症的侵袭性和预后差相关。此外，发现在对泰素帝敏感与耐受的癌症细胞系之间差异性表达(多西他赛，参见WO2007072225和WO2008138578)。然而，没有公开其与癌症患者是否能够响应EGFR抑制剂相关。
本发明人应用一种整合来自六种数据库信息的新数据库，该数据库可以基于miRNA名称或基于基因名称查询。在第一种情况中(基于miRNA名称查询)，基于公开的或结构信息，数据库返回被认为是查询的miRNA的候选靶标的基因名称，根据可获得的信息，候选靶标基因按照从最有可能至可能性最小进行排名。当基于基因名称查询时，数据库返回候选miRNA，对于这种情况查询的基因可能是(或不是)靶标。
发明内容
旨在理解为何hsa-miR-31-3p的表达增加与越低的EGFR抑制剂治疗的响应相关，本发明人试图鉴定该miRNA的靶标基因。为了这个目的，使用hsa-miR-31-3p的模拟物或阴性对照模拟物转染三种天然弱表达hsa-miR-31-3p的结肠直肠腺癌(CRC)细胞系，并且分析在过表达或弱表达hsa-miR-31-3p的细胞系之间差异性表达的基因。共鉴定出74种基因显著地上调或下调。由于miRNA主要通过降低其靶标基因的表达发挥功能，本发明人专注于47种下调基因。为限制候选靶标的数量，以及避免错误的直接靶标基因，本发明人基于6种数据库中可获得信息，对有关miRNA和候选靶标进行了进一步生物信息学分析。需要注意的是，在公共数据库中提供的大多数miRNA靶标基因没有被验证，而仅是基本结构或不完整的实验数据的可能的候选。在此基础上，选择25种hsa-miR-31-3p的候选靶标基因进一步分析。本发明人在使用EGFR抑制剂治疗的患者的肿瘤样本中进一步分析了这些hsa-miR-31-3p的候选靶标基因的表达，已知这些患者基于RECIST标准的治疗响应状态。
基于这些分析，本发明人惊奇的发现，DBNDD2和EPB41L4B均是hsa-miR-31-3p的靶标基因，因为通过在癌症细胞系中过表达hsa-miR-31-3p使其表达显著地下调，并且这些基因的每种独立地与癌症患者响应EGFR抑制剂治疗的能力显著相关。进一步确认这些基因的每种可以单独用于癌症患者响应EGFR抑制剂的可靠预测。其他23种hsa-miR-31-3p的候选靶标基因均未发现与癌症患者响应EGFR抑制剂治疗的能力显著相关，尽管这些基因的一些在数据库中被认为是具有较高概率的hsa-miR-31-3p的候选靶标基因(例如HAUS4)，以及已知与癌症有关，例如STAT3、FEM1A、EHBP1和SEC31A。这明确的表明，仅是基因与癌症相关不足以合理地预期该基因可以被用作响应特定癌症治疗的生物标记物。这也证明了在公共数据库中公开的一种特定miRNA的众多的靶标基因中仅仅少数是该miRNA的真正的靶标，并且该真正的靶标不一定是排名最佳的候选。
出人意料地，在不响应EGFR抑制剂治疗的患者中发现的显著地下调的两种基因不是明确已知的与癌症相关的基因(DBNDD2)，以及已知与癌症相关的基因(EPB41L4B)，但是其高表达水平与预后差相关。相反的，在本发明中，EPB41L4B的低表达与对EGFR抑制剂的响应缺失相关，因此预后差。这些结果进一步确认预后(一般的)的生物标记物不能被合理的预期为对特定治疗的响应的生物标记物。
基于本发明人获得的结果(参见实施例1)，本发明提供了一种用于预测患有癌症的患者是否可能对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂响应的体外方法，该方法包括确定所述患者样本中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B。
优选患者患有KRAS野生型的癌症。
癌症优选是结肠直肠癌，优选转移性结肠直肠癌。
在最优选的实施方案中，本发明提供了一种用于预测患有转移性结肠直肠癌的患者是否可能对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂响应(如西妥昔单抗或者帕尼单抗)的体外方法，该方法包括确定所述患者的肿瘤样本中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B。
本发明还提供了一种用于确定患有癌症的患者是否可能对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂响应的试剂盒，其包含或由以下组成：用于确定所述患者样本中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平的试剂，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B，以及确定至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的其他参数的试剂。
本发明还涉及一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中所述患者根据本发明的方法被分类为可能有响应。
本发明还涉及EGFR抑制剂用于制备预期用于在患者中治疗癌症的药物的用途，其中根据本发明的方法所述患者被分类为“响应者”。
本发明还涉及一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括(i)通过本发明的方法，确定患者是否可能对EGFR抑制剂响应，以及(ii)如果确定所述患者可能对EGFR抑制剂响应，则向所述患者施用EGFR抑制剂。
附图说明
图1：在实施例1中的20例mCRC患者中，DBNDD2(在图1A中)和EPB41L4B(在图1B中)与hsa-miR-31-3p的表达水平的log2之间的相关性。
图2：在实施例2中的20例mCRC患者中，DBNDD2与hsa-miR-31-3p的表达水平的log2之间的相关性。
图3：在A中：为了预测使用基于抗EGFR化疗治疗的mCRC患者的进展风险(即不响应的风险)，建立基于在实施例2中的20例mCRC患者中DBNDD2的表达log2的列线图工具。
图4：在实施例2中的20例mCRC患者中，使用DBNDD2表达作为协变量的多因素Cox比例风险模型。
图5：在实施例3中的42例mCRC患者中，DBNDD2(在图5A中)和EPB41L4B(在图5B中)与hsa-miR-31-3p的表达水平的log2之间的相关性。
图6：如基于hsa-miR-31-3p表达水平预测的，根据进展的风险(低或高)，在实施例3的患者中DBNDD2(在图6A中)和EPB41L4B(在图6B中)的表达。具体实施方式
定义
“患者”可以为任意哺乳动物，优选为人类，年龄或性别不限。患者患有癌症。患者可以是已经接受任意化疗剂的治疗，或者是尚未接受治疗的。
癌症优选为其中涉及EGFR信号通路的癌症。尤其，它可以是例如结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌或脑癌(CiardelloF等人.NEnglJMed.2008三月13；358(11):1160-74；WheelerDL等人.NatRevClinOncol.2010九月；7(9):493-507；ZeineldinR等人.JOncol.2010；2010:414676；AlbitarL等人.MolCancer2010；9:166；LeslieKK等人.GynecolOncol.2012十一月；127(2):345-50；MimeaultM等人.PLoSOne.2012；7(2):e31919；LiebnerDA等人.TherAdvEndocrinolMetab.2011十月；2(5):173-95；LeboulleuxS等人.LancetOncol.2012九月；13(9):897-905；PanJ等人.HeadNeck.2012九月13；ChanSL等人.ExpertOpinTherTargets.2012三月；16增刊1:S63-8；ChuH等人.Mutagenesis.2012十月15；LiY等人.OncolRep.2010十月；24(4):1019-28；ThomassonM等人.BrJCancer2003,89:1285-1289；ThomassonM等人.BMCResNotes.2012五月3；5:216)。在特定的实施方案中，肿瘤本质上为实体组织肿瘤和/或是上皮性的。例如，患者可以为结肠直肠癌患者、Her2阳性或Her2阴性的乳癌患者(尤其是三阴性，即Her2阴性、雌激素受体阴性及孕激素受体阴性)、非小细胞肺癌(NSCLC)患者、头颈癌患者(尤其是头颈部鳞状细胞癌患者)、胰腺癌患者、或子宫内膜癌患者。更尤其是，患者可以为结肠直肠癌患者、Her2阳性或者Her2阴性(尤其是三阴性)的乳癌患者、肺癌患者(尤其是NSCLC)、头颈癌患者(尤其是头颈部鳞状细胞癌患者)、或胰腺癌患者。
在优选的实施方案中，癌症是结肠直肠癌，进一步癌症优选是转移性结肠直肠癌。实际上，实施例1中显示的数据明确地表明DBNDD2或EPB41L4B的表达水平可以在结肠直肠癌治疗中用作对EGFR抑制剂(和尤其是抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗和帕尼单抗)响应的预测物。
在已知涉及EGFR信号通路的癌症中获得的这些结果明确表明，DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平可以在已知涉及EGFR信号通路的任何其他癌症中(例如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌或脑癌)用作对EGFR抑制剂(和尤其是抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗和帕尼单抗)响应的预测物。
因此，在另一优选的实施方案中，癌症是Her2阳性或者Her2阴性(尤其是三阴性)的乳癌、优选Her2阴性(尤其是三阴性)的乳癌。
在另一优选的实施方案中，癌症是肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在另一优选的实施方案中，癌症是胰腺癌。
由于该预测与EGFR抑制剂的治疗相关，因此患者的肿瘤优选为EGFR阳性。
优选地，患者有KRAS野生型肿瘤，即患者的肿瘤中KRAS基因在第12位、13位密码子(第一外显子)、或者第61位密码子(第三外显子)中没有出现突变。换句话说，KRAS基因在第12位、13位和第61位密码子上是野生型的。
野生型，即非突变的，第12位、13位密码子(第一外显子)，和第61位密码子(第三外显子)分别对应甘氨酸(Gly，第12位密码子)、甘氨酸(Gly，第13位密码子)和谷氨酰胺(Gln，第61位密码子)。野生型参考KRAS氨基酸序列可见于Genbank登陆号NP_004976.2(SEQIDNO:24)。
尤其是，患者肿瘤中的KRAS基因未呈现出以下任一突变(Bos.CancerRes1989；49:4682-4689；Edkins等人.CancerBiolTher.2006八月；5(8):928-932；Demiralay等人.SurgicalScience，2012,3,111-115)：
Gly12Ser(GGT>AGT)
Gly12Arg(GGT>CGT)
Gly12Cys(GGT>TGT)
Gly12Asp(GGT>GAT)
Gly12Ala(GGT>GCT)
Gly12Val(GGT>GTT)
Gly13Arg(GGC>CGC)
Gly13Cys(GGC>TGC)
Gly13Asp(GGC>GAC)
Gly13Ala(GGC>GCC)
Gly13Val(GGC>GTC)
优选地，患者肿瘤中的KRAS基因也未呈现出以下任一突变(Demiralay等人.SurgicalScience，2012,3,111-115)：
Gly12Phe(GGT>TTT)
Gly13Ser(GGC>AGC)
优选地，患者肿瘤中的KRAS基因也未呈现出以下任一突变(Bos.CancerRes1989；49:4682-4689；Tam等人.ClinCancerRes2006；12:1647-1653；Edkins等人.CancerBiolTher.2006八月；5(8):928-932；Demiralay等人.SurgicalScience,2012,3,111-115)：
Gln61His(CAA>CAC)
Gln61His(CAA>CAT)
Gln61Arg(CAA>CGA)
Gln61Leu(CAA>CTA)
Gln61Glu(CAA>GAA)
Gln61Lys(CAA>AAA)
Gln61Pro(CAA>CCA)
本领域内已知的任何方法均可被用来获知患者的KRAS状态。
例如，肿瘤组织被显微切割，并从石蜡包埋的组织块中提取DNA。用聚合酶链式反应(PCR)对KRAS基因中覆盖第12、13和61位密码子的区域进行扩增。突变状态可以通过用PCR探针进行的等位基因分型(Laurent-PuigP，等人,JClinOncol.2009,27(35):5924-30)或通过任何其它方法，如焦磷酸测序(OginoS,等人.JMolDiagn2008；7:413-21)来确定。
“样本”可以为源自患者的任何生物样本，其中包含核酸。这种样本的实例包含液体(包含血液、血浆、唾液、尿液、精液)、组织、细胞样本、器官、活检等。优选地，样本为肿瘤样本，优选为肿瘤组织活检或者完整或部分肿瘤外科切除。样本可以根据常规的技术进行收集，并直接用于诊断或贮存。肿瘤样本可以是新鲜的、冷冻的或者石蜡包埋的。通常地，可用的肿瘤样本是冷冻的或者石蜡包埋的，大多数时候是石蜡包埋的。本发明人已经证明冷冻的和石蜡包埋的肿瘤样本均是可用的。
“参考样本”是指对EGFR抑制剂治疗阳性或者阴性响应已知的患者的肿瘤样本(尤其是肿瘤活检或者完整或部分的肿瘤外科切除)。优选地，参考样本池包含至少一名(优选地为数名，更优选地为至少5名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9名，至少10名)响应的患者和至少一名(优选地为数名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9名，至少10名)无响应的患者。响应者(也被称为“阳性”)和无响应者(也被称为“阴性”)参考样本的数目越多，则根据本发明的预测方法的可靠性就越好。
在本发明的上下文中，患者是“可能响应的”或是“响应者”指的是患者对EGFR抑制剂的治疗有响应，即他的至少一种症状得到缓解，或者是疾病的发展被终止或减慢。依据RECIST标准(Eisenhauer等人，EuropeanJournalofCancer,2009,45:228-247)，完全响应者、部分响应者、或者稳定患者在本发明的上下文中均被认为是“可能响应的”或是“响应者”。
在实体肿瘤中，RECIST标准是基于出现至少一种可测量病变的国际标准。“完全响应”是指所有靶标病变都消失；“部分响应”是指靶标病变最长直径总和减少30％，“进展性疾病”是指靶标病变最长直径总和增加20％，“稳定的疾病”是指不符合上述标准的变化。
更优选地，“响应”患者被预测显示有良好的无进展存活(PFS)，即患者可能至少存活25周而没有疾病症状的加重，和/或该患者显示良好的总体存活(OS)，即患者可能至少存活14个月。
术语“预测”或者“预后”是指患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率或可能性。
根据本发明，肿瘤细胞生长对EGFR抑制剂抑制的灵敏度是通过该肿瘤细胞是否表达和表达何种水平的hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B来预测的。
术语“处理(treating)”或者“治疗(treatment)”是指稳定、缓解、治愈或者减轻癌症的进展。
“miRNA”或者“微小RNA(microRNA)”是约21-24个核苷酸的单链分子，优选地长度为21-23个，它们由转录自DNA的基因所编码，但不被翻译成蛋白(非编码RNA)；而是由被称为pri-miRNA的初级转录本加工成被称为pre-miRNA的短的茎环结构，并最终加工成功能性miRNA。在成熟的过程中，每一种pre-miRNA都产生两个高度互补的不同片段，一个源自编码该pri-miRNA的基因的5’臂，另一个源自3’臂。成熟的miRNA分子部分地与一种或者多种信使RNA(mRNA)分子互补，它们的主要功能是下调基因的表达。
有一种miRNA的国际命名方式(见AmbrosV等人，RNA20039(3):277-279；Griffiths-JonesS.NAR200432(数据库发布):D109-D111；Griffiths-JonesS等人.NAR200634(数据库发布):D140-D144；Griffiths-JonesS等人.NAR200836(数据库发布):D154-D158；以及KozomaraA等人.NAR201139(数据库发布):D152-D157)，可以在http://www.mirbase.org/的miRBase中获取。每一个miRNA都被以预定格式分派一个唯一名称，如下：
·针对成熟miRNA：sss-miR-X-Y，其中“
○sss是用来表明miRNA物种的三字母编码，“hsa”表示人类，
○miR中的大写“R”表示它是成熟miRNA。然而一些作者在文献中也滥用“mir”来表示成熟miRNA。在这种情况下，也可以通过“-Y”的存在来识别它是成熟miRNA，
○X是任意的唯一数字用来指定特定物种中miRNA的序列，如果已知有多个高度同源的miRNA，那么后面可以再加一个字母。如，“20a”和“20b”表示高度同源的miRNA。
○Y表示切割pre-miRNA得到的成熟miRNA是对应于编码pri-mRNA的基因的5’臂(那么Y为“5p”)或3’臂(那么Y为“3p”)。在前述的miRNA国际命名中，没有出现“-Y”。然后通过n后面“*”符号的存在或缺失来区分获自编码pri-mRNA的基因的5’臂或3’臂的两个成熟miRNA。带有“*”符号表明该序列对应着较少检测到的miRNA。由于这种分类方式已经发生改变，因此采用“3p”和“5p”编码的新命名已经得以实施。
·对于pri-miRNA：sss-mir-X，其中
○sss是用来表明miRNA物种的三字母编码，“hsa”表示人类，
○mir中的小写“r”表示它是pri-miRNA而不是成熟的miRNA，这可以通过不存在“-Y”来确认，
○n是任意唯一数字用来指定特定物种中miRNA的序列，如果已知有数个高度同源的miRNA，后面可以加上一个字母。
对每种miRNA的序列也指定一个登陆号。
本发明中所检测的两种基因(DBNDD2和EPB41L4B)靶向的miRNA为hsa-miR-31-3p(曾被命名为hsa-miR-31*)。在该命名中，“hsa”表示其涉及人miRNA，“miR”表示成熟的miRNA，“31”是指该具体的miRNA所指定的任意编号，以及“3p”表示该成熟miRNA获自编码pri-miRNA的基因的3’臂。
hsa-miR-31-3p为UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU(SEQIDNO:1)
(http://www.mirbase.org中登陆号为MIMAT0004504)。
“DBNDD2”是NCBIEntrez基因数据库中“dysbindin(小肌营养蛋白结合蛋白1)结构域含2”基因的正式符号(正式名称和符号经HUGO基因命名委员会(HGNC)批准)，其位于人第20号染色体中(20q13.12)。其对应于UniGene数据库登陆号Hs.730643。其他用于该基因的符号包括CK1BP(“酪蛋白激酶-1结合蛋白”)、HSMNP1、RP3-453C12.9、和C20orf35。其也被称为“SCF细胞凋亡响应蛋白1”。如下表1中描述的，已知该蛋白由数种mRNA变体编码的五种同种型(a至e)。
表1：DBNDD2的同种型以及在2013年7月1日由NCBIEntrez基因数据库提供的对应的mRNA和蛋白的参考序列。
“EPB41L4B”是NCBIEntrez基因数据库中“红细胞膜蛋白区带4.1样4B”基因的正式符号(正式名称和符号经HGNC批准)，其位于人第9号染色体中(9q31-q32)。其对应于UniGene数据库登陆号Hs.591901。其他用于该基因的符号包括CG1和EHM2(“高转移性细胞2中表达”)。其也被称为“含FERM蛋白CG1”。如下表2中描述的，已知该蛋白由两种mRNA变体编码的两种同种型(1和2)。
表2：EPB41L4B的同种型以及在2013年7月1日由NCBIEntrez基因数据库提供的对应的mRNA和蛋白的参考序列。
在样本中检测DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平的方法
hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何技术确定。尤其是可以在基因组和/或核酸和/或蛋白水平，起始于患者样本在体外测量每种基因的表达水平。在一个优选的实施方案中，通过在体外测量每种基因的核酸转录本的量确定表达谱。在另一个实施方案中，通过在体外测量由每种基因产生的蛋白的量确定表达谱。
起始于患者样本，尤其是肿瘤样本，在体外做出这种测量，并且必要的涉及样本的改造(transformation)。实际上，没有一些类型的样本改造，无法测量特定基因表达水平。
大多数技术依赖特异性结合于基因DNA、转录本或蛋白的试剂的使用，因此，导致改性样本中还包括检测试剂。
此外，大多数技术还涉及一些在结合特定的试剂之前，从患者的样本中初始提取DNA、mRNA或蛋白。因此，所要求的方法可能还包含从患者的样本中提取DNA、mRNA或蛋白的初始的步骤。此外，当提取mRNA时，通常反转录为比mRNA更稳定的cDNA。因此，所要求的方法可能包含将从患者样本中提取的mRNA反转录为cDNA的步骤。
通过质谱检测不一定涉及初始的特定试剂的结合。而多数时候对提取的DNA、mRNA或蛋白进行。即使当没有初始提取步骤、直接对样本进行时，其涉及通过激光束从样本中提取一些分子，提取的分子随后通过光谱仪分析。
在任何情况中，无论是用何种技术，基因表达水平测量之后的样本的状态与取自患者的初始样本相比已经改变。
核酸转录本的量可以通过本领域技术人员已知的任何技术测量。尤其是，可以对提取的信使RNA(mRNA)样本直接进行测量，或者测量通过本领域熟知的技术制备自提取的mRNA的经反转录的互补DNA(cDNA)。来自mRNA或cDNA样本，核酸转录本的量可以使用本领域技术人员已知的任何技术测量，包括核酸微阵列，定量PCR、新一代测序以及与标记探针的杂交。
尤其是，可以用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)。在一些实施方案中，qRT-PCR可以被用来对靶标RNA进行检测和定量(Bustin等人，2005，Clin.Sci.,109:365-379)。通过qRT-PCR得到的定量结果往往比定性的数据具有更大的信息量，并能简化标准分析流程和质量管理。因此，在一些实施方案中，基于qRT-PCR的分析可以被用来在基于细胞的分析中测量hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平。qRT-PCR方法也可以被用来监测患者的治疗。qRT-PCR是本领域技术人员熟知的且容易获得的技术，且不需要详细的说明。基于qRT-PCR方法的实例可以在如U.S.Pat.No.7,101,663中找到。例如可以使用商品化可获得的基于qRT-PRC的方法(如阵列)，基于在以上表1和表2中公开的DBNDD2和/或EPB41L4B的序列，很容易设计引物和/或探针。
还可以使用核酸分析或阵列，通过在体外测量患者的样本中的基因转录本的量，在体外评估样本中基因的表达水平。在一些实施方案中，可以制备或购买核酸微阵列。典型的阵列含有固相支持物和至少一种与支持物接触的核酸(cDNA或寡核苷酸)，其中寡核苷酸至少对应于基因的一部分。任何合适的分析平台能被用于确定样本中hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B的存在。例如，分析的形式可以是膜、芯片、皿、测试条、滤器、微球、多孔板等。分析系统可以具有固相支持物，在固相支持物上附着有对应于基因的核酸(cDNA或寡核苷酸)。固相支持物可以包含例如塑料、硅、金属、树脂或者玻璃。可以制备分析组成，并包装到一起构成用来检测基因的试剂盒。为了确定靶标核酸样本的表达谱，所述样本被标记，在杂交条件中与微阵列接触，导致与附着于微阵列表面的探针序列互补的靶标核酸形成复合物。随后检测标记的杂交复合物的存在。本领域技术人员可获得许多变化的微阵列杂交技术。
在另一个实施方案中，在体外测量hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平可以通过测序提取自患者样本的基因的转录本(mRNA或cDNA)进行。
在另一个实施方案中，在体外测量hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平可以通过使用蛋白质微阵列进行，其用于测量提取自患者样本的总蛋白中基因编码的蛋白的量。
患者分类
基于DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平分类
hsa-miR-31-3p的靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B的表达越高，对于患者来说就越好。因此，hsa-miR-31-3p的靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平越高，患者对EGFR抑制剂治疗响应的可能性就越大。在一个实施方案中，当hsa-miR-31-3p的靶标基因DBNDD2和/或EPB41L4B表达高于对照值时，患者就被认为是“响应者”，或可能对EGFR抑制剂的治疗有响应。
这种对照值可以基于如上所定义的参考样本池来确定。尤其是图6明确地表明，基于参考样本池，可以定义DBNDD2和EPB41L4B表达水平的对照值(DBNDD2：EPB41L4B表达水平的对数)来允许预测对EGFR抑制剂的治疗响应或者不响应。
然而，在一个优选的实施方案中，所述方法还包括基于hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的表达水平来确定预后分数或指数，其中预后分数表明患者是否可能对EGFR抑制剂响应。尤其是，所述预后分数可表明患者是否可能对EGFR抑制剂响应取决于是否预后分数高于或低于预定的阈值(二分的结果)。在另一个实施方案中，可以从预后分数得到对EGFR抑制剂响应或者不响应的离散概率。
如果对所述患者施用EGFR抑制剂的治疗，患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率与患者的存活概率相关，而无论是否有疾病进展。
因此，预后分数可以基于分析如上所定义的参考样本池的hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的表达水平与无进展存活(PFS)或总体存活(OS)的相关性来确定。于是，可以将PFS和/或OS分数作为预后分数来预测对EGFR抑制剂的响应，PFS和/或OS分数是关联PFS或OS与hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B表达水平的至少一种的函数。因为无病进展是对EGFR抑制剂治疗响应的明确指示，所以优选地采用PFS分数。
从本发明人获得的实验数据显示，患者对EGFR抑制剂治疗响应的概率与DBNDD2和EPB41L4B的每种的表达水平的对数呈现线性负相关(参见图1、2和5)。在一个优选的实施方案中，所述预后分数于是可以采用下式表示：
预后分数＝a*x+b，其中x是患者样本中所测量的DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平的对数(优选以2为底的对数，称为“log2”)，a和b是按照上述定义的预先基于参考样本池所确定的参数。
根据a是正的/负的，如果患者的预后分数大于或等于/小于或等于阈值c，那么他/她就可以被预测为对EGFR抑制剂响应，如果患者的预后分数小于/大于阈值c，则对EGFR抑制剂不响应，其中c值也基于相同的参考样本池所确定。
·如果a是正的，如果患者的预后分数大于或等于阈值c，那么他/她就可以被预测为对EGFR抑制剂响应，如果他/她的预后分数小于阈值c，则对EGFR抑制剂不响应。
·或者，如果a是负的，则如果患者的预后分数小于或等于阈值c，那么他/她就可以被预测为对EGFR抑制剂响应，如果他/她的预后分数大于阈值c，则对EGFR抑制剂不响应。
在另一实施方案中，对EGFR抑制剂响应或不响应的离散概率可以源自上面的预后分数a*x+b。预后分数与对EGFR抑制剂治疗的响应概率之间的精确相关性可以基于相同的参考样本组所确定。根据a是正的/负的，预后分数越高/越低表明对EGFR抑制剂治疗的响应概率越高：
·如果a是正的，预后分数越高，对EGFR抑制剂治疗响应的概率越高(即在PFS分数的情况中疾病进展的概率越低)。
·或者，如果a是负的，预后分数越低，对EGFR抑制剂治疗响应的概率越高(即在PFS分数的情况中疾病进展的概率越低)。
患有癌症的患者是否可能对EGFR抑制剂响应，还可以通过使用列线图做出预测。在列线图中对感兴趣的分数的每种变量建立点数(point)等级。对于指定的患者，通过从每种变量的点数等级中选取相应的点数将点数分配给每种变量。对于离散的变量(例如基因的表达水平)，归属于变量的点数目与变量的值线性相关。对于二分的变量(只有两种可能的值)，将两个不同的值归属于变量的两个可能的值中的每一个。之后将分配给每种变量的点数相加计算感兴趣的分数(总点数)。基于分数值，依据组合分数低于或高于阈值(二分的分数)，患者可被指定为良好或不良响应的预后，或者对治疗的响应或不响应的概率。
很明显，当在组合分数中结合多个不同的变量时，列线图是很有用的(参见以下使用组合分数的可能性：结合DBNDD2和EPB41L4B表达水平；DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平和hsa-miR-31-3p表达水平；或者DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平和BRAF状态)。然而，列线图也可以被用于代表仅基于一种变量的预后分数，例如DBNDD2或EPB41L4B表达水平。在这种情况中，总点数对应于分配给单变量的点数。
图3中显示了在结肠直肠癌患者中，基于DBNDD2表达水平的对数(log2)，允许确定进展的风险的(即对EGFR抑制剂不响应的风险的)列线图的实施例(还参见以下实施例2)。
因此，根据本发明，在用于预测患有癌症的患者是否可能响应EGFR抑制剂的方法的实施方案中，所述方法还包含基于列线图确定不响应的风险，所述列线图基于参考样本池校准。列线图可以根据OS或PFS数据较准。如果基于OS数据较准，不响应的风险对应于死亡的风险。如果基于PFS数据较准，不响应的风险对应于疾病进展的风险(参见图3)。
如以上所解释的，已发现DBNDD2和EPB41L4B的每种是hsa-miR-31-3p的靶标基因，并且独立地与EGFR抑制剂的响应显著地相关，从而可以仅测量DBNDD2和EPB41L4B中的一种的表达水平，并且在根据本发明的方法中用于预测。
然而，根据本发明的方法还可包含确定在患者样本中的DBNDD2和EPB41L4B的表达水平，并且基于DBNDD2和EPB41L4B的组合表达预测响应或不响应。将DBNDD2和EPB41L4B的表达水平组合起来的组合分数，尤其可以基于参考样本池产生。列线图还可以被用于将DBNDD2和EPB41L4B的表达水平进行结合，以及获得组合分数，之后该分数可以与不响应的风险相关(即PFS分数的疾病进展的风险)。
基于DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平以及与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的其他参数分类
虽然仅基于hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的表达水平能够预测EGFR抑制剂的响应(参见实施例1、2和3)，根据本发明的方法还可以包含确定至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的其他参数。
在这种情况中，结合DBNDD2和/或EPB41L4B表达水平以及其他参数的组合分数，尤其可以基于参考样本池而产生。
在列线图中，针对组合分数的每种变量建立点数等级，列线图也可以被用于结合DBNDD2和/或EPB41L4B的表达水平和其他参数，并且获得组合分数，之后该组合分数可以与不响应的风险相关(即PFS分数的疾病进展的风险)。对于指定的患者，通过从每种变量的点数等级中选取相应的点数将点数分配给每种变量。对于离散的变量(例如DBNDD2或EPB41L4B的表达水平或者年龄)，归属于变量的点数目与变量的值线性相关。对于二分的变量(只有两种可能的值，例如BRAF突变状态或者性别)，将两个不同的值归属于变量的两个可能的值中的每一个。
然后，通过将每种变量所分配的点数相加来计算组合分数(总点数)。在组合分数值的基础上，根据组合分数是否小于或大于阈值(二分的分数)，然后对患者作出良好或者不良的响应预后，或给出对治疗响应或者不响应的概率。
可以基于相同的参考样本池确定每种变量的点数等级，以及阈值或者组合分数与响应或不响应概率之间的相关性，其中在所述阈值之上/之下响应预后是良好或不良。
这种与响应EGFR抑制剂正相关或者负相关的其他参数尤其可以选自：
·年龄；
·性别；
·hsa-miR-31-3p的表达水平，其可以通过以上公开的用于测量DBNDD2和EPB41L4B的表达水平的任何方法，测量基因组和/或核酸(尤其是通过测量每种基因的核酸转录本的量)和/或以蛋白质水平；和/或
·至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的突变的存在或不存在。
这种突变可以通过本领域技术人员已知的任何方法检测，并且尤其包括以下表3中提及的那些：
表3
*突变被定义为：在蛋白质中的提及的密码子数，其前面的字母代表为野生型氨基酸，并且任选地在其后面的为取代氨基酸。当未提及取代氨基酸时，取代氨基酸可以是不同于野生型氨基酸的任何氨基酸。
EGFR抑制剂
本发明使得能够在用一种或者多种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂进行治疗之前预测患者对这种药剂的响应性。
EGFR抑制剂可以是EGFR酪氨酸激酶的抑制剂，或者可以靶向EGFR靶标的胞外结构域。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂，如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼，或者是靶向EGFR胞外结构域的分子，如西妥昔单抗或帕尼单抗。
优选的，该EGFR抑制剂是抗EGFR的抗体，优选为单克隆抗体，尤其是西妥昔单抗或帕尼单抗。
靶向EGFR胞外结构域的分子包括主要被用来治疗结肠直肠癌或乳癌治疗的抗EGFR单克隆抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗。因此，如果患者的癌症是结肠直肠癌(尤其是转移性结肠直肠癌)或者乳癌，那么根据本发明的方法优选用于预测对分子的响应，其中所述分子靶向EGFR胞外结构域，尤其是抗EGFR单克隆抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗。
相反地，酪氨酸激酶EGFR抑制剂主要被用来治疗肺癌(尤其是非小细胞肺癌，NSCLC)，因此如果患者的癌症是肺癌(尤其是非小细胞肺癌，NSCLC)，那么根据本发明的方法优选用于预测对酪氨酸激酶EGFR抑制剂(如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼)的响应。
在胰腺癌或者头颈癌(尤其是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))中，酪氨酸激酶EGFR抑制剂和抗EGFR单克隆抗体都被作为治疗进行了测试，因此，如果患者的癌症是胰腺癌或者头颈癌(尤其是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))，那么根据本发明的方法用于预测对酪氨酸激酶EGFR抑制剂(如厄洛替尼、吉非替尼、或拉帕替尼)或者抗EGFR单克隆抗体(如西妥昔单抗或帕尼单抗)的响应。
西妥昔单抗和帕尼单抗是目前临床上应用最多的抗EGFR单克隆抗体。然而，更多的抗EGFR单克隆抗体也在开发中，如Nimotuzumab(TheraCIM-h-R3)、Matuzumab(EMD72000)和Zalutumumab(HuMax-EGFr)。根据本发明的方法也可以用来预测对这些抗EGFR单克隆抗体或者对任何其它可能被进一步开发出来的抗EGFR单克隆抗体(包括其片段)的响应，尤其是如果患者患有结肠直肠癌(尤其是转移性的结肠直肠癌)、乳癌、胰腺癌或者头颈癌(尤其是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))。
类似的，厄洛替尼、吉非替尼、和拉帕替尼是目前临床上应用最多的酪氨酸激酶EGFR抑制剂。然而，更多的酪氨酸激酶EGFR抑制剂也在开发中，如卡奈替尼(CI-1033)、来那替尼(HKI-272)、阿法替尼(BIBW2992)、Dacomitinib(PF299804，PF-00299804)、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、AG-1478(TyrphostinAG-1478)、AV-412、OSI-420(脱甲基厄洛替尼)、AZD8931、AEE788(NVP-AEE788)、培利替尼(EKB-569)、CUDC-101、AG490、PD153035HCl、XL647和BMS-599626(AC480)。根据本发明的方法也可以用来预测对这些酪氨酸激酶EGFR抑制剂，或者任何其它可能被进一步开发出来的酪氨酸激酶EGFR抑制剂的响应，尤其是如果患者患有肺癌(尤其是非小细胞肺癌，NSCLC)、胰腺癌、或头颈癌(尤其是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))。
试剂盒
本发明还涉及一种用于确定患有癌症的患者是否可能对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂响应的试剂盒，其包含或由如下组成：
a)用于确定所述患者样本(优选肿瘤样本，例如肿瘤活检，或者完整或部分肿瘤外科切除)中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平的试剂，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B，以及
b)用于确定至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的其他参数的试剂。
这种试剂可能尤其包括用于以下的试剂：
i)确定至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的miRNA的表达水平，尤其是所述患者的样本中(优选肿瘤样本，例如肿瘤活检或者完整或部分的肿瘤外科切除)hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA或者尤其是hsa-miR-31-5p(SEQIDNO:34)，和/或，
ii)检测至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的突变，例如在上表3中提及的那些。
用于确定所述患者的样本中hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的表达水平的试剂，或者至少一种与EGFR抑制剂响应正相关或负相关的miRNA的表达水平的试剂(尤其是hsa-miR-31-3p本身或者hsa-miR-31-5p)，尤其可以包含以下或由以下组成：hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的特异性引物对(正向引物和反向引物)和/或探针、或包含hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的特异性序列的微阵列。基于在上表1和表2中公开的DBNDD2和/或EPB41L4B的序列，本领域技术人员很容易设计引物和/或探针。
用于检测至少一种与EGFR抑制剂的响应正相关或负相关的突变的试剂可以包括用来在测序之前扩增全部或者部分感兴趣的基因的至少一对引物对，或者用于等位基因分型(allelicdiscrimination)分析的在5’端标记有报告染料的一组特异性探针，例如ABI7900HTSequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,福斯特城,CA)(参见Laurent-PuigP,等人,JClinOncol.2009,27(35):5924-30以及Lièvre等人.JClinOncol.2008一月20；26(3):374-9用于BRAF突变的检测V600)。
本发明的试剂盒进一步包含说明书，基于hsa-miR-31-3p靶标基因DBNDD2和EPB41L4B的至少一种的表达水平和其它受试参数用于确定患者是否可能会对EGFR抑制剂有响应。尤其是包括组合分数所含全部变量的点数等级的列线图、以及组合分数(点数的总数)与预测(响应/不响应、或者响应或不响应的概率)之间的相关性，可以包括在内。
药物、治疗用途以及治疗方法
本发明方法预测出的患者对EGFR抑制剂响应性的比例与临床所报道的对EGFR抑制剂的响应比例相匹配。
因此，进一步提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向患者施用至少一种EGFR抑制剂，其中患者依据上述方法被预测(或分类)为“响应者”或“可能响应的”。
尤其地，本发明涉及到一种用于治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括(i)根据本发明的方法确定患者是否可能对EGFR抑制剂响应，以及(ii)如果患者被确定为可能对EGFR抑制剂有响应，则对所述患者施用EGFR抑制剂。
如果患者被确定为不可能对EGFR抑制剂响应，那么方法进一步包括步骤(iii)对患者施用替代性抗癌治疗。这种替代性抗癌治疗依赖于特定的癌症和之前测试的治疗，然而可以尤其选自放射疗法、其它化疗分子、或者其它生物制剂，如针对其它抗原的单克隆抗体(抗Her2、抗VEGF、抗EPCAM、抗CTLA4等)。
尤其是在结肠直肠癌中，如果患者被确定为不可能对EGFR抑制剂有响应，那么步骤(iii)中的替代性抗癌治疗可以选自：
·VEGF抑制剂，尤其是抗VEGF单克隆抗体(如贝伐单抗)，有利地与FOLFOX(甲酰四氢叶酸(叶醛酸)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂的组合)或FOLFIRI(甲酰四氢叶酸(叶醛酸)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和依立替康的组合)化疗联用。
·作为替代，如果患者对任选地与FOLFOX或者FOLFIRI化疗联用的VEGF抑制剂的治疗不成功，可施用5-FU，任选地与丝裂霉素B联用。可进一步对患者施用最好的支持性护理，即在不采用特定的抗肿瘤方案(即没有抗癌治疗)的前提下，意图最大可能提高生活质量所施用的治疗。
本发明另一主题涉及一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中按上述方法患者分类为可能有响应。本发明还涉及EGFR抑制剂用于治疗患有癌症的患者的用途，其中所述治疗包含按上述方法预测所述患者是否可能对EGFR抑制剂响应的初始步骤，并且按上述方法所述EGFR抑制剂仅被施用于已经被预测可能对EGFR抑制剂响应的患者。所述患者可能患有结肠直肠癌，更尤其是转移性结肠直肠癌。或者，所述患者可能患有乳癌，尤其是三阴性乳癌。或者，所述患者可能患有肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)。或者，所述患者可能患有头颈癌，尤其是头颈部鳞状细胞癌。或者，所述患者可能患有胰腺癌。本发明也涉及EGFR抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于在通过本发明上述方法被分类为“响应者”的患者中治疗癌症。
在优选的实施方案中，EGFR抑制剂为抗EGFR抗体，优选为西妥昔单抗或帕尼单抗。或者，EGFR抑制剂可以是酪氨酸激酶EGFR抑制剂，尤其是厄洛替尼、吉非替尼或拉帕替尼。
在优选的实施方案中：
·患者患有结肠直肠癌，尤其是转移性结肠直肠癌，并且EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，优选为西妥昔单抗或帕尼单抗；
·患者患有乳癌，尤其是三阴性乳癌，并且EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，优选为西妥昔单抗或帕尼单抗；
·患者患有肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)，并且EGFR抑制剂是酪氨酸激酶EGFR抑制剂，尤其是厄洛替尼、吉非替尼或拉帕替尼；
·患者患有头颈癌，尤其是头颈部鳞状细胞癌、或者胰腺癌，并且EGFR抑制剂是抗EGFR抗体(优选为西妥昔单抗或帕尼单抗)或者是酪氨酸激酶EGFR抑制剂(尤其是厄洛替尼、吉非替尼或拉帕替尼)。
实施例和附图用以说明本发明而不限制其范围。
实施例
实施例1：DBNDD2和EPB41L4B是hsa-miR-31-3p的靶标，并且独立地预测EGFR抑制剂的响应
患者与方法
患者
20例mCRC(转移性结肠直肠癌)患者组成患者组，14例男性，6例女性。年龄中位数66.49±11.9岁。所有患者接受依立替康和西妥昔单抗的联用。记录在西妥昔单抗的引入前的化疗药物属于几线药物(numberofchemotherapylines)。随访直至进展的中位数是20周，并且总体存活的中位数是10个月。所有的样本来自切除术，并且在福尔马林和石蜡包埋中固定(FFPE)。
细胞培养和转染
我们从美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，CA)选择了3种弱表达hsa-miR-31-3p的结肠直肠腺癌细胞系：HTB-37、CCL-222和CCL-220-1。HTB-37在Dulbecco’s改良的Eagle介质(DMEM)培养介质(含有稳定的谷氨酰胺与20％的胎牛血清和1％的青霉素/链霉素)中维持。CCL-222和CCL-220-1细胞在含有稳定的谷氨酰胺与10％的胎牛血清的RPMI1640培养介质中维持。在37℃的温度、以5％CO2孵育细胞。
所有的细胞转染miRVanamiRNA模拟物阴性对照或者hsa-miR-31-3pmiRVanamiRNA模拟物(Ambion)。对于CCL-222，在12孔板中，根据制造商的方法以反向转染方法，使用25pmol的MiRNA模拟物和60000个细胞，使用2μl的脂质体RNAiMax完成转染。对于CCL-220-1和HBT27，在12孔板中，根据制造商的方法，使用12.5pmol的miRNA模拟物和100000个细胞，使用4μl的RiboCellin(BioCellChallenge,土伦,法国)完成转染。对于所有的细胞系，在转染后24小时收集细胞，并且在使用miRNeasy提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA之前，使用Qiazol保护RNA。为评估转染的有效，按以下描述完成miRNAhsa-miR-31-3p表达水平的具体定量。
基因表达的测量
使用AffymetrixHumanGene1.0进行基因表达微阵列。根据OvationPicoSLWTASystemV2(Nugen，圣卡洛斯，CA)逆转录50ng总RNA。随后基于SPIA技术完成扩增。在根据Nugen方法纯化之后，2.5μg的单链DNA用于碎片化，并且使用EncoreBiotinModule(Nugen)标记生物素。在使用生物分析仪2100(Bioanalyzer2100)控制碎片化之后，然后在45℃持续17小时使cDNA杂交于humanGene1.0ST(Affymetrix)。杂交之后，根据具体方法(Affymetrix)在射流站(fluidicstation)FS450上洗涤芯片，并且使用GCS30007G扫描。然后使用表达控制台(ExpressionConsole)软件(Affymetrix)分析图像以获得原始数据(CELfiles)，以及质量控制度量(metrics)。
使用ABI7900HT实时PCR系统(AppliedBiosystem)，对FFPE样本的20ng总RNA或细胞培养样本的50ng总RNA进行细胞系和FFPE患者样本的靶标表达的qRT-PCR验证。所有反应以一式三份进行。通过ΔΔCt方法，使表达水平对RNA18S和GAPDH水平进行归一化。
生物信息学分析
我们整合来自六种单独的预测数据库(PITA、picTar5-way、Targetscan、microRNA.org、MicroCosm和miRDB)最新的微小RNA靶标预测，开发了数据门户。该门户允许确定可能的被一系列候选基因共同靶向的微小RNA，涉及了预测每种微小RNA/靶标关系的微小RNA预测数据库的数量，以及来自单独预测数据库的每种miRNA的预测排名。该数据库已在2012年11月更新以进行报告分析。
统计学分析
使用R程序包“生存”和“rms”进行生存统计学分析。使用Cox比例回归风险模型进行单因素和多因素分析，并且生成风险比(HR)。基于Cox比例回归风险模型开发列线图，其预测无进展生存的概率。
使用Benjamini和Hochberg程序计算调整的错误发现率(FDR)p值用于多重检验校正。使用校正检验(cor.test)函数计算表达值之间的皮尔森(Pearson)相关系数以及相匹配的p值。对于所有的分析，统计显著性被设置在p<0.05。
结果
使用hsa-miR-31-3p模拟物或使用模拟物对照转染三种弱表达hsa-miR-31-3p的CRC细胞系。hsa-miR-31-3p水平平均提高1500倍、无死亡或生长缺陷证实了转染的有效。如在以下表4中描述的，转染细胞的表达谱分析允许我们鉴定了47种被hsa-miR-31-3p显著地下调的基因(fc<0.77,p<0.05)和27种被hsa-miR-31-3p显著地上调的基因(fc<1.3,p<0.05)。
表4：在3种细胞系上进行的表达阵列中鉴定的fc<0.77或fc>1.3且p值≥0.05的基因的列表(fc:转染hsa-miR-31-3p模拟物的细胞系和转染模拟物对照的细胞系之间的表达倍数变化)
微小RNA的作用包括降解其转录靶标，我们研究包括来自6种网络可获得的信息的数据库是否预测54种下调基因是hsa-miR-31-3p推定的靶标。该数据库可以通过miRNA名称或通过基因名称查询。当查询miRNA名称时，基于数据库中包括的结构和可能的实验数据，按照基因是所查询的miRNA的真正靶标的概率等级排名(从最有可能至可能性越小)，数据库返回一系列的候选靶标基因。相反，当查询基因名称时，基于数据库中包括的结构和可能的实验数据，按照miRNA真正靶向所查询的基因的概率等级排名(从最有可能至可能性越小)，数据库返回一系列的miRNA候选。使用hsa-miR-31-3p名称查询数据库，并且使用在过表达hsa-miR-31-3p的CRC细胞系中发现下调的基因的名称(47种基因，cf表4)查询数据库。
以下表5显示表4中被鉴定为hsa-miR-31-3p推定的直接靶标的下调基因(包括DBNDD2和EPB41L4B)。如果使用基因名称查询数据库，还显示hsa-miR-31-3p的排名，并且如果使用hsa-miR-31-3p名称查询数据库，显示基因的排名。
表5：显示根据需求对于下调基因的来自生物信息学数据库的靶标预测：第2列：使用感兴趣的基因查询数据库，并且报告可能靶向该基因所有的候选微小RNA(从最可能至可能性越小排名)。显示hsa-miR-31-3p的排名和微小RNA候选的总数；第3列：使用hsa-miR-31-3p查询数据库，并且报告所有推定的靶标，对总共1620种推定的靶标基因从最可能至可能性越小排名。然后显示查询的基因排名。列于hsa-miR-31-3p的1620种推定靶标基因中，在表5中仅显示下调基因。有关DBNDD2和EPB41L4B的数据加粗。
在47种下调的基因之中，预测出25种hsa-miR-31-3p的推定的直接靶标，并且在预测数据库中显示好的排名。该基因的数量和排名是有显著性的(通过排列(permutation)检验，两种检验P<0.0001)。正如预期的，使用miR-31-3p转染的细胞中，27种上调基因中只有一种被预测为hsa-miR-31-3p的靶标，并且该唯一预测的靶标是排名最后的靶标。
以qRT-PCR验证25种推定的直接靶标基因和27种间接的靶标基因，在这47种基因中，45种显示与在阵列中获得的水平可比较的表达水平。
最后，在患者FFPE肿瘤样本中分析这些基因的表达，并且其中的两种显示与hsa-miR-31-3p表达水平显著负相关：DBNDD2和EPB41L4B(参见图1A和1B)。
此外，使用非参数差异分析，发现这两种基因与无进展生存相关(对于DBNDD2p＝0.004且对于EPB41L4Bp＝0.025)。同时，这些结果表明，DBNDD2和EPB41L4B的表达可以区分预后差和预后良好的mCRC患者，即不响应和响应的mCRC患者。
实施例2：创建使用DBNDD2和EPB41L4B表达以预测对EGFR抑制剂的响应的工具
患者与方法
患者
20例mCRC患者组成患者组(13例男性，7例女性)。年龄中位数67±11.2岁。纳入时全部患有转移性疾病。所有这些患者患有KRAS野生型转移性结肠癌。所有患者被认为是与伊立替康和奥沙利铂联用的基于5-氟尿嘧啶方案难以治疗的。他们接受基于抗EGFR的化疗，8名患者使用帕尼单抗，10名患者使用西妥昔单抗，以及2名患者接受帕尼单抗和西妥昔单抗联用。记录在西妥昔单抗和帕尼单抗引入前的化疗药物属于几线药物。随访直至进展的中位数是21周，并且总体存活中位数是8.9个月。
基因表达的测量
使用ABI7900HT实时PCR系统(AppliedBiosystem)，以20ng的总RNA进行FFPE患者样本DBNDD2和EPB41L4B的表达的qRT-PCR。所有反应以一式三份进行。通过ΔΔCt方法，使表达水平对GAPDH水平进行归一化。
统计学分析
使用R程序包“生存”和“rms”进行生存统计学分析。使用Cox比例回归风险模型进行单因素和多因素分析，并且生成风险比(HR)。基于Cox比例回归风险模型开发列线图，其预测无进展生存的概率。
在R中，使用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)与配对Wilcox检验函数，完成基因和miRNA表达值对比分析。
使用校正检验函数计算表达值之间的皮尔森(Pearson)相关系数与相匹配的p值。对于所有的分析，统计显著性被设置在p<0.05。
结果
在肿瘤样本中分析DBNDD2和EPB41L4B的表达。统计学分析显示与hsa-miR-31-3p表达水平显著负相关：(DBNDD2参见图2)。此外，使用非参数差异分析，发现这两种基因与无进展生存相关(DBNDD2，p＝0.025)。基于该结果，为获得用于预测使用抗EGFR治疗mCRC患者的响应的工具，多因素Cox比例风险模型状态以及作为协变量的基因表达的log2被用于构建基于PFS的列线图，因此允许预测进展的风险(即不响应的风险，参见图3和图4)。
实施例3：在新的且独立的群体中重复DBNDD2和EPB41L4B对EGFR抑制剂的预测值
患者和方法
患者
42例mCRC(转移性结肠直肠癌)患者组成患者组，27例男性，15例女性。年龄中位数59±12.1岁。纳入时全部患有转移性疾病。基于方案，所有患者使用奥沙利铂和伊立替康化疗进展后，通过伊立替康和帕尼单抗联用的第三线治疗进行治疗。随访直至进展的中位数是23周，并且总体存活的中位数是9.6个月。26例样本以FFPE提供，以及16例以冷冻组织提供。
基因表达的测量
使用ABI7900HT实时PCR系统(AppliedBiosystem)，以20ng的总RNA进行冷冻或FFPE患者样本的靶标表达的qRT-PCR验证。所有反应以一式三份进行。通过ΔΔCt方法，使表达水平对RNA18S或GAPDH水平进行归一化。
统计学分析
使用R程序包“生存”和“rms”进行生存统计学分析。使用Cox比例回归风险模型进行单因素和多因素分析。在R中，使用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)与配对Wilcox检验函数，完成基因和miRNA表达值对比分析。
对于所有的分析，统计显著性被设置在p<0.05。
结果
在患者肿瘤FFPE样本中分析DBNDD2和EPB41L4B的表达。显示与hsa-miR-31-3p表达水平显著负相关：(参见图5A和5B)。发现了如在专利申请PCT/EP2012/073535中描述的，基于hsa-miR-31-3p表达水平计算的这两种基因的表达与预测响应/不响应的相关性(参见图6)。
使用cox模型，发现这两种基因与无进展生存相关(对于以GAPDH归一化的DBNDD2，p＝0.004，并且对于以RNA18S归一化的EPB41L4B，p＝0.027)。
这些结果确认DBNDD2和EPB41L4B的表达可以区分预后差或预后良好的mCRC患者，即mCRC患者的不响应者和响应者。
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Claims (19)

1.一种用于预测患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的体外方法，该方法包括确定所述患者的肿瘤样本中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有KRAS野生型癌症。
3.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其中所述患者患有选自以下的癌症：结肠直肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、头颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌和脑癌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌，尤其是转移性结肠直肠癌。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述的EGFR抑制剂是抗EGFR抗体，尤其是西妥昔单抗或者帕尼单抗。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述样本是肿瘤组织活检或者完整或部分的肿瘤外科切除。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中通过体外测量所述hsa-miR-31-3p的靶标基因产生的转录本的量在核酸水平上确定所述hsa-miR-31-3p的至少一种靶标基因的表达水平，优选地，通过定量RT-PCR进行确定。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述hsa-miR-31-3p的至少一种靶标基因的表达水平越高，则患者越有可能响应EGFR抑制剂治疗。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其还包含基于所述hsa-miR-31-3p的至少一种靶标基因的表达水平确定预后分数，其中所述预后分数表明患者是否可能响应EGFR抑制剂。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述预后分数如下式：
预后分数＝a*x+b,
其中：
·x是患者样本中测量的DBNDD2表达水平的对数，
·a和b是基于参考样本池所预定的参数，以及
·如果患者的预后分数大于或小于阈值c，则预测他/她响应或不响应EGFR抑制剂，其中c值是基于相同的参考样本池所确定的：
○如果a是正的，如果患者的预后分数大于或等于阈值c，则预测他/她响应EGFR抑制剂，并且如果其预后分数小于阈值c，则不响应EGFR抑制剂，
○如果a是负的，如果患者的预后分数小于或等于阈值c，则预测他/她响应EGFR抑制剂，并且如果他/她的预后分数大于阈值c，则不响应EGFR抑制剂。
11.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述预后分数如下式：
预后分数＝a*x+b,
其中：
·x是患者样本中测量的DBNDD2表达水平的对数，
·a和b是基于参考样本池所预定的参数，以及
·根据a是正的或负的：
○如果a是正的，预后分数越高，对EGFR抑制剂治疗响应的概率越高；
○如果a是负的，预后分数越低，对EGFR抑制剂治疗响应的概率越高。
12.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其还包含基于列线图确定不响应的风险，所述列线图基于参考样本池校准。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，还包括确定至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的其他参数，并考虑所述hsa-miR-31-3p的至少一种靶标基因的表达水平和所述其他参数计算出组合分数，其中所述组合分数表明患者是否可能响应EGFR抑制剂。
14.一种用于确定患有癌症的患者是否可能响应表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的试剂盒，其包含或由以下组成：
a)用于确定所述患者样本中hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA的至少一种靶标基因的表达水平的试剂，其中所述hsa-miR-31-3p的靶标基因选自DBNDD2和EPB41L4B，以及
b)用于确定至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的其他参数的试剂，其中所述试剂选自：
i)用于确定至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的miRNA的表达水平的试剂，尤其是hsa-miR-31-3p(SEQIDNO:1)miRNA或者hsa-miR-31-5p(SEQIDNO:34)miRNA，和/或
ii)用于检测至少一种与响应EGFR抑制剂正相关或负相关的突变的试剂。
15.一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中所述患者根据权利要求1至13任一项所述的方法被分类为对EGFR抑制剂可能有响应。
16.一种EGFR抑制剂，其用于治疗患有癌症的患者，其中所述治疗包含根据权利要求1至13任一项所述的方法预测所述患者是否可能响应EGFR抑制剂的初始步骤，并且向患者施用所述EGFR抑制剂，所述患者仅是根据权利要求1至13任一项所述的方法已被预测可能响应EGFR抑制剂的患者。
17.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：
(i)通过根据本发明的方法确定患者是否可能响应EGFR抑制剂，以及
(ii)如果确定所述患者可能响应EGFR抑制剂，则向所述患者施用EGFR抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法，如果确定患者难以响应EGFR抑制剂，则所述方法还包括对患者施用替代抗癌治疗的步骤(iii)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述替代抗癌治疗选自：
a)VEGF抑制剂，
b)VEGF抑制剂与FOLFOX联用，
c)VEGF抑制剂与FOLFIRI联用
d)5-FU，以及
e)5-FU与丝裂霉素B联用。
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