KR20160089488A - Egfr 억제제를 사용한 치료에 대한 반응을 예측하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 암 환자의 샘플에서 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 암 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하는 방법에 관한 것이고, hsa-miR-31-3p의 상기 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택된다. 본 발명은 또한 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 및 EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 다른 파라미터의 발현을 측정하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 EGFR 억제제에 반응하는 것으로 예측되는 환자에서 EGFR 억제제의 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

EGFR 억제제를 사용한 치료에 대한 반응을 예측하는 방법{A METHOD FOR PREDICTING RESPONSIVENESS TO A TREATMENT WITH AN EGFR INHIBITOR}

본 발명은 암 치료를 위한 화학요법을 개별화하는 방법, 및 특히 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준의 측정에 기반하여, 이러한 제제를 사용한 치료 전에 하나 이상의 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 대한 환자의 반응을 평가하는 방법을 제공하고, 여기서 hsa-miR-31-3p의 상기 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택된다.

상피 성장 인자 수용체(EGFR) 경로는 인간 상피 암의 발달 및 진행에 중요하다. EGFR 억제제와의 조합 치료는 Akt의 보다 효율적 및 지속적 억제를 통해 기능적 EGFR-의존성 자가분비 성장 경로를 갖는 상이한 인간 암 세포에서 상승적 성장 억제 및 프로-아폽토시스 활성을 갖는다.

EGFR 억제제는 비-소세포 폐암(NSCLC), 두경부암, 결장직장암 및 Her2-포지티브 유방암을 포함하는 다양한 암의 치료를 위해 승인되었거나 시험되어 왔고, 점차 표준 치료에 추가되고 있고, EGFR 표적의 세포내 티로신 키나제 도메인 또는 세포외 도메인을 표적화할 수 있는 EGFR 억제제는 일반적으로 낮은 모집단 반응율에 의해 시달리어, 불필요한 약물 독성 및 비용 뿐만 아니라 다수의 경우에 비효과적 또는 비-최적 화학요법을 유도한다. 예를 들면, 세툭시맙(EGFR의 세포외 도메인을 표적화하는 키메라 모노클로날 항체)를 사용한 결장직장암의 치료를 위한 보고된 임상 반응율은 약 11%이고[참조: Cunningham et al, N Engl Med 2004;351: 337-45], 에를로티닙을 사용한 NSCLC의 치료를 위한 보고된 임상 반응은 약 8.9%이다[참조: Shepherd F A, et al, N Engl J Med 2005; 353:123-132].

특히, 내성이 KRAS 돌연변이의 경우에 관찰되었다.

결장직장암에서, KRAS 돌연변이는 EGFR 항체에 대한 내성과 명백하게 연관되기 때문에[참조: Lievre et al, Cancer Res. 2006 66(8):3992-5], 주요 과제 중의 하나는 이러한 요법에 대한 반응의 결여를 예측할 수 있는 다른 마커를 비돌연변이된 KRAS 환자에서 동정하는 것이다. 이들 중에서, 암유전자의 증폭 또는 활성화 돌연변이 및 상기한 종양 억제 유전자의 불활성화 돌연변이는, EGFR 하류 포스포단백질 발현의 측정에 의해 평가된 EGFR 하류 신호전달 경로의 활성화 수준과 같이 관련 후보이다.

폐암에서는 3개 환자 그룹이 부상하고 있다: 하나는 EGFR 티로신 키나제 억제제(EGFR TKI)의 사용이 결과를 개선시키는 것으로 증명된 EGFR 돌연변이된 종양을 갖는 환자를 계산하고, 둘째는 항-EGFR 요법이 아마도 양호한 대안이 아니라는 KRAS 돌연변이된 종양을 갖는 환자를 계산하고, 세번째 그룹은 반응이 예측될 수 없는 비-EGFR 및 비-KRAS 돌연변이된 종양을 계산한다. 비-돌연변이된 종양 그룹에서 약물 반응에 관련된 어떠한 마커도 이제까지 유용한 것으로 증명되지 않았다.

따라서, 환자 치료를 보다 개별화시키기 위해, 이러한 제제를 사용한 치료 전에 EGFR 억제제에 대한 환자 반응을 예측할 필요가 있다.

다양한 항암 치료에 대한 감수성 또는 내성에 있어서 마이크로 RNA(miRNA)의 관여와 관련하여 선행 기술에는 다수의 문헌이 있다. 특히, 국제특허 제PCT/EP2012/073535호는, hsa-miR-31-3p(이전에 hsa-miR-31^*로서 명명됨, 서열번호 1) miRNA의 발현 수준을 암 환자의 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, 암 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는 예측하는 시험관내 방법을 기재한다. 보다 특히, hsa-miR-31-3p의 발현이 보다 낮을수록, 환자는 EGFR 억제제 치료에 반응할 가능성이 보다 높다.

유사하게는, 다양한 항암 치료에 대한 감수성 또는 내성에서 다양한 유전자의 연루와 관련하여 선행 기술에는 다수의 문헌이 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 연구는 부분적, 불완전하고, 실제로는 치료에 대한 임상 반응 또는 비-반응의 진정한 예측을 가능하게 하지 않는다. 실제로, 다수의 경우에, 연구는 시험관 내에서, 특정 치료에 감수성 또는 내성인 세포주에서 또는 환자 종양으로부터 단리된 종양 세포에서 유전자 발현의 분석으로 제한된다. 또한, 다수의 연구에서, 세포 또는 환자의 2개 모집단 사이의 발현 수준의 차이가 나타나지만, 새로운 환자에서 반응 또는 비-반응을 실제로 예측하게 하는 어떠한 역치 또는 스코어도 제공되지 않는다. 이는 다수의 연구가 임상 설정에서 수득된 데이터를 결여하는 제1 단점과 부분적으로 관련되어 있다. 더욱이, 임상 설정에서 수득된 일부 데이터가 제시되는 경우에도, 이들 데이터는 대부분 단지 소급적이고, 독립적 코호트에서 예측된 방법을 실증하는 데이터는 종종 부족하다.

선행 기술 연구의 다양한 단점에 비추어, 이러한 요법이 다수의 옵션 중의 하나인 환자에서 EGFR 억제제에 대한 반응을 예측하는 진정한 적합한 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구에 대한 반응을 제공한다.

DBNDD2[디스빈딘(이스트로브레빈 결합 단백질 1) 도메인 함유 2]는 인간 카세인 키나제-1의 결합 파트너인 것을 개시되어 있다[참조: Yin H et al. Biochemistry. 2006 Apr 25;45(16):5297-308]. 또한, 마이크로어레이 글로벌 프로파일링을 사용하여, 이는, 다수의 다른 유전자 중에서, 다양한 종양 세포(WO2010065940; WO2010059742; WO2009131710; WO2007112097), 또는 암 세포 감수성 또는 내성 토라파마이신(WO2011017106) 또는 타목시펜(WO2010127338) 사이에서 상이하게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 유전자는 암과 구체적으로 연관되는 것으로 생각되지 않고, EGFR 억제제에 대한 반응의 예측에 있어서 이 유전자의 관여는 전혀 개시되어 있지 않다.

EPB41L4B(적혈구 막 단백질 밴드 4.1 유사 4B)는 FERM 계열 단백질의 단백질이고, 이는 막관통 단백질을 세포골격에 연결시키거나 키나제 및/또는 포스파타제 효소적 활성을 원형질 막에 연결시키고, 발암 및 전이에 연루되는 것으로 기재되어 있다. 특히, EPB41L4B(또는 EHM2로서 공지됨)은 전립선암[참조: Wang J, et al. Prostate. 2006 Nov 1; 66(15):1641-52; Schulz WA, et al. BMC Cancer. 2010 Sep 22; 10:505] 및 유방암[참조: Yu H et al. Mol Cancer Res 2010; 8: 1501-1512]의 증가된 공격성와 연관되어 있다. 따라서, 이 유전자는 적어도 2종의 암의 공격성 및 불량한 예후와 연관되어 있다. 더욱이, 이는 탁소테레에 대해 감수성 및 내성인 암 세포주 사이에서 상이하게 발현되는 것으로 밝혀졌다[참조: 도세탁셀, WO2007072225 및 WO2008138578]. 그러나, EGFR 억제제에 반응하거나 반응하지 않는 암 환자의 능력에 대한 이의 연관은 전혀 개시되어 있지 않다.

본 발명자들은 6개 데이터베이스의 정보를 도입한 새로운 데이터베이스를 실실시했고, 이는 miRNA의 명칭에 기반하거나 유전자 명칭에 기반하여 취득할 수 있다. 첫번째 경우(miRNA의 명칭에 기반한 조회)에서, 데이터베이스는 공개되거나 구조적 정보에 기반하여 조회 miRNA의 후보 표적으로 간주된 유전자 명칭을 반환하고, 후보 표적 유전자는 이용가능한 정보에 기반하여 가장 가능성이 높은 것으로부터 가장 가능성이 낮은 것까지 등급화된다. 조회가 유전자 명치에 기반하는 경우, 데이터베이스는 후보 miRNA를 반환하고, 이에 대한 조회 유전자는 표적일 수 있다(또는 아닐 수도 있다).

hsa-miR-31-3p의 증가된 발현이 EGFR 억제 치료에 대한 보다 낮은 반응과 연관되는 이유를 이해하기 위한 목적으로, 본 발명자들은 이 miRNA의 표적 유전자를 동정하려고 시도했다. 이러한 목적을 위해, 이들은 hsa-miR-31-3p를 자연적으로 약하게 발현하는 3개의 결장직장 선암(CRC) 세포주를 hsa-miR-31-3p의 모방체 또는 네가티브 대조군 모방체로 형질감염시켰고, hsa-miR-31-3p를 과발현시키거나 약하게 발현시키는 세포주 사이에서 상이하게 발현된 유전자를 분석했다. 현저히 하향- 또는 상향-조절된 총 74개 유전자가 동정되었다. miRNA는 이들의 표적 유전자의 발현을 감소시킴으로써 주로 기능하기 때문에, 본 발명자들은 47개 하향-조절된 유전자에 초점을 맞췄다. 후보 표적의 수를 제한하고 펄스 직접 표적 유전자(false direct target gene)를 방지하기 위해, 본 발명자들은 miRNA 및 후보 표적에 관한 6개 데이터베이스에서 이용가능한 정보에 기반하여 인 실리코 분석을 추가로 수행했다. 공중 데이터베이스에 제공된 대부분의 miRNA 표적 유전자가 검증되지 않지만, 구조적 또는 파괴적 실험 데이터에 기반하여 단지 보다 높거나 낮은 가능성 후보가 검증되는 것에 유의하는 것이 중요하다. hsa-miR-31-3p의 25개 후보 표적 유전자는 이러한 기준에 따라 추가 분석을 위해 선택되었다. 본 발명자들은 EGFR 억제제로 치료한 환자의 종양 샘플에서 hsa-miR-31-3p의 이들 후보 표적 유전자의 발현을 추가로 분석했고, RECIST 기준에 기반하여 이들의 치료 반응 상태는 공개되어 있었다.

이들 분석에 기초하여, 본 발명자들은 놀랍게도, DBNDD2 및 EPB41L4B는, 이들의 발현이 암 세포주에서 hsa-miR-31-3p의 과발현에 의해 현저히 하향-조절되기 때문에, 둘 다 hsa-miR-31-3p 표적 유전자이고, 이들 유전자 각각이 EGFR 억제제 치료에 반응하는 암 환자의 능력과 독립적으로 현저히 연관되는 것으로 밝혀졌다. 이들은 추가로 이들 유전자 각각이 암 환자에서 EGFR 억제제에 대한 반응을 신뢰성 있게 예측하는데 단독으로 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. hsa-miR-31-3p의 다른 23개 후보 표적 유전자 중의 어느 것도, 이들 유전자 중의 일부가 보다 높은 확률을 갖는 hsa-miR-31-3p의 후보 표적 유전자, 예를 들면, HAUS4로서 데이터베이스에서 간주되고 STAT3, FEM1A, EHBP1 및 SEC31A 등과 같이 암과 연관되는 것으로 공지되었지만, EGFR 억제제 치료에 반응하는 암 환자의 능력과 현저히 연관되는 것으로 밝혀지지 않았다. 이는 암에 대한 유전자의 단순한 관련성이, 상기 유전자가 특정한 암 치료에 대한 반응의 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 기대하기에 충분하지 않다는 것을 명백히 나타낸다. 이는 또한 공중 데이터베이스에 개시된 특정 miRNA의 다수의 후보 표적 유전자으 소수만이 이러한 miRNA의 진정한 표적이고 상기 진정한 표적이 반드시 최고 등급의 후보인 것은 아니라는 것을 설명한다.

놀랍게도, EGFR 억제제 치료에 반응하지 않는 환자에서 현저히 하향-조절되는 것으로 밝혀진 2개 유전자는 암과 연관되는 것으로 구체적으로 공지되지 않은 유전자(DBNDD2) 및 암과 연관되는 것으로 공지된 유전자(EPB41L4B)이지만, 이들에 대한 고도의 발현 수준은 불량한 예후와 연관되어 있다. 대조적으로, 본 발명에서는, EGFR 억제제에 대한 반응의 부재와 연관되는 EPB41L4B의 낮은 발현, 및 따라서 불량한 예후이다. 이들 결과는 예후의 바이오마커(일반적으로)가 또한 특정 치료에 대한 반응의 바이오마커인 것으로 상당히 기대될 수 없음을 추가로 확인한다.

본 발명자들에 의해 수득된 결과(실시예 1 참조)에 기반하여, 본 발명은, 암 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자의 종양 샘플에서 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, hsa-miR-31-3p의 상기 표전 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택되는, 방법을 제공한다.

바람직하게는, 환자는 KRAS 야생형 암을 갖는다.

암은 바람직하게는 결장직장암, 바람직하게는 전이성 결장직장암이다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 전이성 결장직장암을 갖는 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, 예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙에 반응할 가능성이 있는지를 예측하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자의 종양 샘플에서 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, hsa-miR-31-3p의 상기 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41 L4B로부터 선택되는, 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 암 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 측정하는 키트로서, 암 환자의 샘플에서 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 시약으로서, hsa-miR-31-3p의 상기 표적 유전자가 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택되는 시약, 및 EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관되는 적어도 하나의 다른 파라미터를 측정하기 위한 시약을 포함하는, 키트를 제공한다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따르는 방법에 의해, 반응할 가능성이 있는 것으로 분류된 암이 발병된 환자의 치료에 사용하기 위한 EGFR 억제제에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해, "반응자"로서 분류된 환자에서 암의 치료에 사용하기 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 EGFR 억제제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 암이 발병된 환자를 치료하는 방법으로서, (i) 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 본 발명의 방법에 의해 측정하는 단계 및 (ii) 상기 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 것으로 측정되는 경우에 상기 환자에게 EGFR 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

도 1: 실시예 1의 20 mCRC 환자에서 DBNDD2(도 1A) 및 EPB41L4B(도 1B) 및 hsa-miR-31-3p의 log₂ 발현 수준 사이의 상관.
도 2: 실시예 2의 20 mCRC 환자에서 DBNDD2 및 hsa-miR-31-3p의 log₂ 발현 수준 사이의 상관.
도 3: A에서, 항-EGFR 기반 화학요법으로 치료한 mCRC 환자의 진행 위험(즉, 비-반응 위험)을 예측하기 위해, 실시예 2의 20 mCRC 환자에서 DBNDD2의 log₂ 발현에 기반하여 확립한 노모그램 툴.
도 4: 실시예 2의 20 mCRC 환자에서 공변량으로서 DBNDD2 발현을 갖는 다변량 Cox 비례 위험 모델.
도 5: 실시예 3의 42 mCRC 환자에서 DBNDD2(도 5A) 및 EPB41L4B(도 5B) 및 hsa-miR-31-3p의 log₂ 발현 수준의 상관.
도 6: hsa-miR-31-3p 발현 수준에 기반하여 예측된 바와 같이, 이들의 진행 위험(낮거나 높음)에 따라 실시예 3의 환자에서 DBNDD2(도 6A) 및 EPB41L4B(도 6B)의 발현.

정의

"환자"는 임의의 포유동물, 바람직하게는, 이의 연령 및 성별에 상관 없이, 인간일 수 있다. 환자는 암이 발병될 수 있다. 환자는 임의의 화학요법제에 의해 이미 치료를 받았거나, 아직 치료되지 않을 수 있다.

암은 바람직하게는 EGFR을 통한 신호전달 경로가 관여하는 암이다. 특히, 예를 들면, 직장결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 비인두암, 전립선암, 두경부암, 신장암, 췌장암, 방광암 또는 뇌암일 수 있다[참조: Ciardello F et al. N Engl J Med. 2008 Mar 13;358(11):1160-74; Wheeler DL et al. Nat Rev Clin Oncol. 2010 September , 7(9): 493-507; Zeineldin R et al. J Oncol.2010;2010:414676;Albitar L et al. Mol Cancer 2010;9:166; Leslie KK et al. Gynecol Oncol. 2012 Nov;127(2):345-50; Mimeault M et al. PLoS One.2012;7(2):e31919; Liebner DA et al. Ther Adv Endocrinol Metab. 2011 Oct;2(5): 173-95; Leboulleux S et al. Lancet Oncol. 2012 Sep; 13(9):897 -905; Pan J et al. Head Neck. 2012 Sep 13; Chan SL et al. Expert OpinTher Targets. 2012 Mar;16 Suppl 1:S63-8; Chu H et al. Mutagenesis.2012 Oct 15; Li Y et al. Oncol Rep. 2010 Oct;24(4):1019-28; Thomasson M et al. Br J Cancer 2003, 89:1285-1289; Thomasson M et al. BMC Res Notes.2012 May 3;5:216]. 특정 실시형태에서, 종양은 고형 조직 종양이고/이거나 성질상 상피이다. 예를 들면, 환자는 결장직장암 환자, Her2-포지티브 또는 Her2-네가티브(특히 트리플 네가티브, 즉 Her2-네가티브, 에스트로겐 수용체 네가티브 및 프로게스테론 수용체 네가티브) 유방암 환자, 비소세포 폐암(NSCLC) 환자, 두경부암 환자(특히, 두경부 환자의 편평 세포암), 췌장암 환자, 또는 자궁내막암 환자일 수 있다. 보다 특히, 환자는 결장직장암 환자, Her2-포지티브 또는 Her2-네가티브(특히, 트리플 네가티브) 유방암 환자, 폐암(특히 NSCLC) 환자, 두경부암 환자(특히, 두경부 환자의 편평 세포암) 또는 췌장암 환자일 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 암은 결장직장암이고, 여전히 바람직하게는 암은 전이성 결장직장암이다. 실제로, 실시예 1에 제시된 데이터는, DBNDD2 또는 EPB41L4B 발현 수준이 결장직장암의 EGFR 억제제(및 특히 항-EGFR 모노클로날 항체, 예를 들면, 세툭시맙 및 파니투무맙) 치료에 대한 반응의 예측인자로서 사용될 수 있음을 명백히 나타낸다.

EGFR 신호전달 경로가 관여하는 것으로 공지된 암에서 수득한 이들 결과는 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준이, EGFR 신호전달 경로가 관여하는 것으로 공지되어 있는 임의의 다른 암, 예를 들면, 폐암, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 비인두암, 전립선암, 두경부암, 신장암, 췌장암, 방광암 또는 뇌암에서 EGFR 억제제(및 특히 항-EGFR 모노클로날 항체, 예를 들면, 세툭시맙 및 파니투무맙)에 대한 반응의 예측인자로서 사용될 수 있음을 명백하게 시사한다.

따라서, 또 다른 바람직한 실시형태에서, 암은 Her2-포지티브 또는 Her2-네가티브(특히 트리플 네가티브) 유방암, 바람직하게는 Her2-네가티브(특히 트리플 네가티브) 유방암이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 암은 폐암, 특히 비-소세포 폐암(NSCLC)이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 암은 췌장암이다.

예측은 EGFR 억제제 치료와 관련되기 때문에, 환자의 종양은 바람직하게는 EGFR 포지티브이다.

바람직하게는, 환자는 KRAS 야생형 종양을 갖고, 즉 환자 종양 중의 KRAS 유전자는 코돈 12, 13(엑손 1) 또는 61(엑손 3)에서 돌연변이되지 않는다. 달리 말하면, KRAS 유전자는 코돈 12, 13 및 61 상에서 야생형이다.

야생형, 즉 비돌연변이된 코돈 12, 13(엑손 1) 및 61(엑손 3)은 각각 글리신(Gly, 코돈 12), 글리신(Gly, 코돈 13) 및 글루타민(Gln, 코돈 61)에 상응한다. 야생형 기준 KRAS 아미노산 서열은 진뱅크(Genbank) 수탁번호 NP 004976.2(서열번호 24)에서 발견할 수 있다.

특히, 환자 종양의 KRAS 유전자는 하기 돌연변이 중의 어느 하나를 나타내지 않는다[참조: Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Oemiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115]:

Gly12Ser (GGT>AGT)

Gly12Arg (GGT>CGT)

Gly12Cys (GGT>TGT)

Gly12Asp (GGT>GAT)

Gly12Ala (GGT>GCT)

Gly12Val (GGT>GTT)

Gly13Arg (GGC>CGC)

Gly13Cys (GGC>TGC)

Gly13Asp (GGC>GAC)

Gly13Ala (GGC>GCC)

Gly13Val (GGC>GTC)

바람직하게는, 환자 종양의 KRAS 유전자는 하기 돌연변이 중의 어느 하나를 또한 나타내지 않는다[참조: Oemiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115]:

Gly12Phe (GGT>TTT)

Gly13Ser (GGC>AGC)

바람직하게는, 환자 종양의 KRAS 유전자는 하기 돌연변이 중의 어느 하나를 또한 나타내지 않는다[참조: Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Tam et al. Clin Cancer Res 2006;12:1647-1653; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August , 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115]:

Gln61 His (CAA>CAC)

Gln61 His (CAA>CAT)

Gln61Arg (CAA>CGA)

Gln61 Leu (CAA>CTA)

Gln61 Glu (CAA>GAA)

Gln61 Lys (CAA>AAA)

Gln61 Pro (CAA>CCA)

당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 환자의 KRAS 상태를 알 수 있다. 예를 들면, 종양 조직을 미세해부하고, DNA를 파라핀-매립된 조직 블록으로부터 추출했다. KRAS 유전자의 코돈 12, 13 및 61을 덮는 영역은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭시켰다. 돌연변이 상태는 PCR 프로브를 사용한 대립인자 식별[참조: Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30] 또는 파이로시퀀싱 등의 임의의 다른 방법[참조: Ogino S, et al. J Mol Diagn 2008;7:413-21]에 의해 측정한다.

"샘플"은, 핵산을 함유하는, 환자로부터 유래하는 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 이러한 샘플의 예는 유체(혈액, 혈장, 타액, 뇨, 정액을 포함), 조직, 세포 샘플, 기관, 생검 등을 포함한다. 바람직하게는, 샘플은 종양 샘플, 바람직하게는 종양 조직 생검 또는 종양 외과적 절제의 전부 또는 일부이다. 샘플은 종래 기술에 따라 수집될 수 있고, 진단을 위해 직접 사용되거나 저장될 수 있다. 종양 샘플은 신선하거나, 냉동 또는 파라핀-매립될 수 있다. 일반적으로, 이용가능한 종양 샘플은 냉동 또는 파라핀-매립되고, 대부분의 시간은 파라핀-매립된다. 본 발명자들은 냉동 및 파라핀-매립된 종양 샘플을 둘 다 사용할 수 있다는 것을 보여 주었다.

"기준 샘플"이란, EGFR 억제제 치료에 대한 포지티브 또는 네가티브 반응이 공지되어 있는 환자의 종양 샘플(특히 종양 생검 또는 종양 외과적 절제의 전부 또는 일부)을 의미한다. 바람직하게는, 기준 샘플의 풀은 적어도 하나(바람직하게는 몇명, 보다 바람직하게는 적어도 5명, 보다 바람직하게는 적어도 6명, 적어도 7명, 적어도 8명, 적어도 9명, 적어도 10명)의 반응자 환자 및 적어도 하나(바람직하게는 몇명, 보다 바람직하게는 적어도 6명, 적어도 7명, 적어도 8명, 적어도 9명, 적어도 10명)의 비반응자 환자를 포함한다. 기준 샘플의 반응자(또한 "포지티브"로서 지칭됨) 및 비반응자(또한 "네가티브"로 지칭됨)의 수가 높을수록, 본 발명에 따르는 예측 방법의 신뢰성은 보다 양호하다.

본 발명의 문맥 내에서, 환자는 "반응 가능성"이 있거나 "반응자"이고, EGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 수 있는 환자를 지칭하고, 즉 적어도 하나의 이의 증상은 완화될 것으로 예상되거나, 상기 질환의 발달이 정지되거나 지연된다. RECIST 기준[참조: Eisenhauer et al, European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247]에 따르는 완전 반응자, 부분 반응자 또는 안정한 환자는 본 발명의 문맥에서 "반응할 가능성" 또는 "반응자"로서 간주된다.

고형 종양에서, RECIST 기준은 적어도 하나의 측정가능한 병변의 존재에 기초하는 국제 표준이다. "완전 반응"은 모든 표적 병변의 소멸을 의미하고; "부분 반응"은 표적 병변의 최장 직경의 합계의 30% 감소를 의미하고, "진행성 질환"은 표적 병변의 최장 직경의 합계의 20% 증가를 의미하고, "안정한 질환"은 상기 기준에 부합하지 않는 변화를 의미한다.

보다 바람직하게는, "반응자" 환자는 양호한 진행 무생존(PFS)을 나타내는 것으로 예측되고, 즉 환자는 상기 질환의 증상의 악화 없이 적어도 25주 생존할 가능성이 있고/있거나 이러한 환자는 우수한 전체 생존율(OS)를 나타내고, 즉 환자는 적어도 14개월 생존할 가능성이 있다.

용어 "예측" 또는 "예후"는 환자가 EGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 확률 또는 가능성을 지칭한다.

본 발명에 따라서, EGFR 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성은 이러한 종양 세포가 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B를 발현하는지 및 발현하는 수준에 의해 예측된다.

용어 "치료하다" 또는 "치료"는 암 진행의 안정화, 완화, 치유 또는 감소를 의미한다.

"miRNA" 또는 "마이크로RNA"는, DNA로부터 전사되지만 단백질로 해독되지 않는(비코딩 RNA) 유전자에 의해 코딩된 약 21 내지 24개 뉴클레오티드, 바람직하게는 21 내지 23개 길이의 단일 가닥 분자이고; 대신에 이들은 pri- miRNA로서 공지된 1차 전사체로부터 pre- miRNA로 불리우는 짧은 줄기-루프 구조 및 최종적으로 작용성 miRNA로 처리된다. 돌연변이 동안, 각각의 pre-miRNA는 높은 상보성을 갖는 2개의 독특한 단편, 5' 암으로부터 기원하는 하나 및 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 3' 암으로부터 기원하는 다른 하나를 제공한다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA)에 부분적으로 상보성이고, 이들의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다.

miRNA의 국제적 명명법이 있고[참조: Ambros V et al, RNA 2003 9(3 ):277-279; Griffiths-Jones S. NAR 2004 32(Database Issue): D 1 09-D 111; GriffithsJones S et al. NAR 2006 34(Database Issue):D140-D144; Griffiths-Jones S et al. NAR 2008 36(Database Issue):D154-D158; and Kozomara A et al. NAR 2011 39(Database Issue):D152-D157], 이는 http://www.mirbase.org/에서 miRBase로부터 이용가능하다. 각각의 miRNA는 소정의 포맷을 갖는 독특한 명칭이 다음과 같이 할당되어 있다:

· 성숙한 miRNA의 경우: sss-miR-X-Y, 여기서

ο sss는 miRNA의 종류를 나타내는 3문자 코드이고, "hsa"는 인간을 상징하고,

ο miR에서 대문자 "R"은 성숙 miRNA을 지칭하는 것을 나타낸다. 그러나, 문헌에서 일부 저자는 성숙 miRNA에 대해 또한 "mir"를 남용적으로 사용한다. 이 경우에, "-Y"의 존재에 의해 성숙 miRNA를 지칭하는 것으로 인지될 수 있다.

ο X는 특정 종에서 miRNA의 서열로 할당된 고유한 임의 번호이고, 이는 몇몇 고도 상동성 miRNA가 공지되어 있는 문자가 수속된다. 예를 들면, "20a" 및 "20b"는 고도 상동성 miRNA를 지칭한다.

ο Y는, pre-miRNA의 절단에 의해 수득된 성숙 miRNA가 pri-mRNA를 코딩하는 유전자의 5' 암(Y는 "5p"이다) 또는 3' 암(Y는 "3p"이다)에 상응하는지를 나타낸다. miRNA의 이전 국제 명명법에서, "-Y"는 존재하지 않는다. 이어서, pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 5' 또는 3' 암으로부터 수득된 2개의 성숙 miRNA는 n 다음에 "*" 기호의 존재 또는 부재에 의해 구별된다. "*" 기호의 존재는 당해 서열이 덜 자주 검출된 miRNA에 상응하다는 것을 나타낸다. 이러한 분류는 변화에 제공되기 때문에, "3p" 및 "5p" 코드를 사용한 신규 명명법이 시행되었다.

· pri-miRNA:sss-mir-X의 경우, 여기서

ο sss는 miRNA의 종을 나타내는 3문자 코드이고, "hsa"는 인간을 상징하고,

ο mir에서 소문자 "r"은 pri-miRNA을 지칭하고 성숙 miRNA를 지칭하지 않는 것을 나타내고, 이는 "-Y"의 부재에 의해 확인되고,

ο n은 특정 종에서 miRNA의 서열에 할당된 고유한 임의 번호이고, 이는 몇몇 고도 상동성 miRNA가 공지되어 있는 문자가 후속된다.

각각의 miRNA는 이의 서열에 대한 수탁번호가 또한 할당되어 있다.

본 발명에 의해 검출된 2개 유전자(BNDD2 및 EPB41L4B)에 의해 표적화된 miRNA는 hsa-miR-31-3이다(이전 명칭 hsa-miR-31*). 이 명칭에서, "hsa"는 그것이 인간 miRNA에 관한 것임을 의미하고, "miR"은 성숙 miRNA를 지칭하고, "31"은 이러한 특정 miRNA에 할당된 고유한 번호를 지칭하고, "3p"는 성숙 miRNA가 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 3' 암으로부터 수득되었음을 의미한다.

hsa-miR-31-3p는 UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU(서열번호 1)이다.

(http://www.mirbase.org에서 수탁번호 MIMAT0004504)

"DBNDD2"는 인간 염색체 20(20q13.12)에 위치하는 2" 유전자를 함유하는 "디스빈딘(디스트로브레빈 결합 단백질 1) 도메인에 대한 NCBI 엔트레즈 유전자 데이터베이스의 공식 기호이다[HUGO 유전자 명명법 위원회(HUGO 유전자 명명법 위원회(HGNC)에 의해 승인된 공식명 및 기호]. 이는 유니진(UniGene) 데이터베이스 수탁번호 Hs.730643에 상응한다. 이러한 유전자에 사용된 추가의 기호는 CK1 BP("카세인 키나제-1 결합 단백질"에 대해), HSMNP1 , RP3-453C12.9 및 C20orf35를 포함한다. 이는 또한 "SCF 아폽토시스 반응 단백질 1"로서 공지되어 있다. 이러한 단백질의 5개 이소형(a 내지 e)가 공지되어 있고, 하기 표 1에 상세된 바와 같이 몇몇 mRNA 변이체에 의해 코딩되어 있다.

DBNDD2 이소형	mRNA RefSeq	단백질 RefSEq
이소형 a	NM_001048221.2(서열번호 2) NM_001048223.2(서열번호 3) NM_001197139.1(서열번호 4) NM_001197140.1(서열번호 5)	NP_001041686.1(서열번호 1) NP_001041688.1(서열번호 12) NP_001184068.1(서열번호 13) NP_001184069.1(서열번호 14)
이소형 b	NM_001048222.2(서열번호 6) NM_001048224.2(서열번호 7)	NP_001041687.1(서열번호 15) NP_001041689.1(서열번호 16)
이소형 c	NM_001048225.2(서열번호 8)	NP_001041690.2(서열번호 17)
이소형 d	NM_001048226.2(서열번호 9)	NP_001041691.2(서열번호 18)
이소형 e	NM_018478.3(서열번호 10)	NP_060948.3(서열번호 19)

　2013년 7월 1일자로 NCBI 엔트레즈진 데이터베이스에 의해 제공된 DBNDD2의 이소형 및 상응하는 mRNA 및 단백질 기준 서열

"EPB41L4B"는 인간 염색체 9(9q31-q32)에 위치하는 "적혈구 막 단백질 밴드 4.1 유사 4B" 유전자에 대한 NCBI 엔트레즈 유전자 데이터베이스의 공식 기호이다(HGNC에 의해 승인된 공식 명칭 및 기호). 이는 유니진 데이터베이스 수탁 번호 Hs.591901에 상응한다. 이러한 유전자에 사용된 추가의 기호는 CG1 및 EHM2("고도 전이성 세포 2에서 발현된" 것에 대해)이다. 이는 또한 "FERM-함유 단백질 CG1"으로 공지되어 있다. 이러한 단백질의 2개 이소형(1 및 2)가 공지되어 있고, 하기 표 2에 상세된 바와 같이 2개의 mRNA 변이체에 의해 코딩되어 있다.

EPB41L4B 이소형	mRNA RefSeq	단백질 RefSEq
이소형 1	NM_018424.2(서열번호 20)	NP_060894.2(서열번호 22)
이소형 2	NM_019114.3(서열번호 21)	NP_061987.3(서열번호 23)

2013년 7월 1일자로 업데이트된 NCBI 엔트레즈진 데이터베이스에 의해 제공된 EPB41L4 밴드의 이소형 및 상응하는 mRNA 및 단백질 기준 서열

샘플에서 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준을 검출하는 방법

hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현 수준은 당해 기술분야의 숙련가에 의해 공지된 임의의 기술로 측정할 수 있다. 특히, 각각의 유전자 발현 수준은, 환자의 샘플로부터 개시하여, 게놈 및/또는 핵산 및/또는 단백질 수준에서 시험관 내에서 측정할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 발현 프로파일은 각 유전자의 핵산 전사물의 양을 시험관 내에서 측정함으로써 결정된다. 또 다른 실시형태에서, 발현 프로파일은 각각의 유전자에 의해 생성된 단백질의 양을 시험관 내에서 측정함으로써 결정된다.

이러한 측정은, 환자의 샘플, 특히 종양 샘플로부터 출발하여, 시험관 내에서 이루어지며, 샘플의 형질전환을 반드시 수반한다. 실제로, 특이적 유전자 발현 수준의 측정은 몇몇 유형의 샘플의 형질전환 없이 이루어질 수 없다.

대부분의 기술은 유전자 DNA, 전사체 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 시약의 사용에 의존하고, 따라서 검출 시약을 추가로 포함하는 변형된 샘플을 제공한다.

또한, 대부분의 기술들은 특정한 시약에 대한 결합 전에 환자 샘플로부터 DNA, mRNA 또는 단백질의 일부 예비 추출을 수반한다. 따라서, 특허청구된 방법은 또한 환자의 샘플로부터 DNA, mRNA 또는 단백질을 추출하는 예비 단계를 포함할 수 있다. 또한, mRNA가 추출되는 경우, 이들은 일반적으로 cDNA로 역전사되고, 이는 mRNA보다 더욱 안정하다. 따라서, 특허청구된 방법은 환자 샘플로부터 추출된 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 포함할 수 있다.

질량 스펙트럼에 의한 검출은 특정 시약에 대한 예비 결합을 반드시 수반하는 것은 아니다. 그러나, 이는 추출된 DNA, mRNA 또는 단백질에 대해 수행되는 시간의 대부분이다. 예비 추출 단계 없이 샘플에 대해 직접 수행되는 경우에도, 이는 레이저 빔에 의해 샘플로부터 분자의 일부 추출을 수반하고, 이어서 추출된 분자는 분석계에 의해 분석된다.

어느 경우에도, 사용되는 기술에 관계 없이, 유전자 발현 수준의 측정 후에 샘플의 상태는 환자로부터 채취한 초기 샘플과 비교하여 형질전환되었다.

핵산 전사물의 양은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술에 의해 측정할 수 있다. 특히, 측정은 추출된 메신저 RNA(mRNA) 샘플에 대해 직접 수행하거나, 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 추출된 mRNA로부터 제조된 역전사된 상보성 DNA(cDNA)에 대해 직접 수행할 수 있다. mRNA 또는 cDNA 샘플로부터, 핵산 전사물의 양은 핵산 마이크로어레이, 정량적 PCR, 후대 서열분석 및 표지된 프로브를 사용한 하이브리드화를 포함하여 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 특히, 실시간 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)이 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, qRT-PCR은 RNA 표적의 검출 및 정량화 둘 다에 사용될 수 있다[참조: Bustin et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379]. qRT-PCR에 의해 수득된 정량적 결과는 종종 정성 데이터보다 더욱 많은 정보를 제공할 수 있고, 검정 표준화 및 품질 관리를 단순화시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, qRT-PCR-기반 검정은 세포 기반 검정 동안 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준을 측정하는데 유용할 수 있다. 또한, qRT-PCR 방법은 환자 치료의 모니터링에 유용할 수 있다. qRT-PCR은 당해 기술분야의 숙련가를 위한 공지되고 용이하게 이용가능한 기술이고, 상세한 기재를 필요로 하지 않는다. qRT-PCR-기반 방법의 예는, 예를 들면, 미국 특허 제7,101,663호에서 발견할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 입수가능한 qRT-PCR 기반 방법(예: Taqman^® Array)이 사용될 수 있고, 프라이머 및/또는 프로브의 설계는 상기 표 1 및 2에 개시된 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 서열에 기반하여 용이하게 이루어질 수 있다.

또한, 핵산 검정 또는 어레이를 사용하여, 환자 샘플 중의 유전자 전사물의 양을 시험관 내에서 측정함으로써 샘플 중의 유전자의 발현 수준을 시험관 내에서 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 마이크로어레이를 제조하거나 구매할 수 있다. 어레이는 통상 고체 지지체 및 당해 지지체를 접촉하는 적어도 하나의 핵산(cDNA 또는 올리고뉴클레오티드)를 함유하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 유전자의 적어도 일부에 상응한다. 임의의 적합한 분석 플랫폼을 사용하여, 샘플에서 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 존재를 측정할 수 있다. 예를 들면, 검정은 막, 칩, 디스크, 시험 스트립, 필터, 미소구, 다중웰 플레이트 등의 형태로 존재할 수 있다. 검정 시스템은 유전자에 상응하는 핵산(cDNA 또는 올리고뉴클레오티드)이 부착되어 있는 고체 지지체를 가질 수 있다. 고체 지지체는, 예를 들면, 플라스틱, 실리콘, 금속, 수지 또는 유리를 포함할 수 있다. 검정 성분을 제조하고, 유전자를 검출하는 키트로서 함께 팩키징할 수 있다. 표적 핵산 샘플의 발현 프로파일을 측정하기 위해, 상기 샘플을 표지하고, 하이브리드화 조건에서 마이크로어레이와 접촉시켜, 마이크로어레이 표면에 부착된 프로브 서열과 상보성인 표적 핵산 사이에서 복합체의 형성을 유도한다. 이어서, 표지된 하이브리드화된 복합체의 존재를 검출한다. 마이크로어레이 하이브리드화 기술의 다수의 변형태는 당해 기술분야의 숙련가에게 이용가능하다.

또 다른 실시형태에서, hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 시험관내 측정은 환자 샘플로부터 추출된 유전자의 전사물(mRNA 또는 cDNA)의 서열분석에 의해 수행할 수 있다.

여전히 추가의 실시형태에서, hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 시험관내 측정은 환자 샘플로부터 추출된 전체 단백질 중의 유전자 코딩된 단백질의 양을 측정하기 위해 단백질 마이크로 어레이의 사용에 의해 수행할 수 있다.

환자의 분류

DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준에 기반한 분류

hsa-miR-21-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현이 보다 높을수록, 환자에게는 보다 양호하다. 따라서, hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현 수준이 보다 높을수록, 환자는 EGFR 억제제 치료에 반응할 가능성이 보다 많다. 한 가지 실시형태에서, 환자는, hsa-miR-21-3p 표적 유전자 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현이 대조군 값보다 높을 경우, "반응자" 또는 EGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 것으로 고려된다.

이러한 대조군 값은 상기 정의된 바와 같이 기준 샘플의 풀에 기반하여 측정할 수 있다. 특히, 도 6은, 기준 샘플의 풀에 기반하여, EGFR 억제제 치료에 대한 반응 또는 비반응을 예측하게 하는 DBNDD2 및 EPB41L4B 발현 수준(로그 DBNDD2:EPB41L4B 발현 수준)에 대한 대조군 값이 정의될 수 있음을 명백하게 나타낸다.

그러나, 바람직한 실시형태에서, 당해 방법은 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나의 발현 수준에 기반하여 예후 스코어 또는 지수를 측정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 예후 스코어는 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 나타낸다. 특히, 상기 예후 스코어는 환자가, 소정의 역치(이분 결과)보다 높거나 낮은지에 따라, EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 나타낼 수 있다. 또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제에 반응 또는 비반응의 이산 확률이 예후 스코어로부터 유도될 수 있다.

환자가 EGFR 억제제 치료에 반응할 확률은, EGFR 억제제 치료가 상기 환자에게 투여되는 경우, 질환 진행의 존재 또는 부재하에, 당해 환자가 생존할 확률과 관련된다.

결과적으로, 예후 스코어는, 상기 정의된 바와 같이, hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나의 발현 수준 및 기준 샘플 풀의 진행 무생존(PFS) 또는 전체 생존(OS) 사이의 상관 분석에 기반하여 측정될 수 있다. 따라서, hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나의 발현 수준에 대한 PFS 또는 OS의 상관 함수인 PFS 및/또는 OS 스코어는 EGFR 억제제에 대한 반응 예측을 위한 예후 스코어로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, PFS 스코어가 사용되는데, 이는 질환 진행의 부재가 EGFR 억제제 치료에 대한 명백한 반응 지표이기 때문이다.

본 발명자들에 의해 수득된 실험 데이터는 환자가 EGFR 억제제 치료에 반응할 확률은 각각의 DBNDD2 및 EPB41L4B(도 1, 2 및 5 참조)의 로그 발현 수준과 선형 및 네가티브로 상관되는 것을 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 상기 예후 스코어는 따라서 하기 수학식에 의해 나타내어진다:

예후 스코어 =

여기서, x는 환자의 샘플에서 측정된 DBNDD2(바람직하게는 log 진수 2, "log₂"라 함) 및/또는 EPB41L4B의 로그 발현 수준이고, a 및 b는 상기 정의한 바와 같이 기준 샘플의 풀에 기반하여 미리 측정한 파라미터이다.

a가 포지티브/네가티브인지에 따라, 환자는 예후 스코어가 역치 c 이상/이하이면, EGFR 억제제에 반응하는 것으로 예측되고, 예후 스코어가 역치 c 미만/초과이면, EGFR 억제제에 반응하지 않는 것으로 예측될 수 있고, 여기서 c의 값은 기준 샘플과 동일한 풀에 기반하여 측정되었다:

· a가 포지티브인 경우, 예후 스코어가 역치 c 이상이면, 환자는 EGFR 억제제제에 반응하는 것으로 예측되고, 예후 스코어가 역치 c보다 낮으면, EGFR 억제제에 반응하지 않는 것으로 예측될 수 있다.

· 또는, a가 네가티브인 경우, 예후 스코어가 역치 c 이하이면, 환자는 EGFR 억제제에 반응하는 것으로 예측되고, 예후 스코어가 역치 c보다 크면, EGFR 억제제에 반응하지 않는 것으로 예측될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, EGFR 억제제에 대한 반응 또는 비-반응의 이분 확률은 상기

예후 스코어로부터 유래될 수 있다. 예후 스코어와 EGFR 억제제 치료에 대한 반응 확률 사이의 정확한 상관은 기준 샘플의 동일한 세트에 기반하여 측정될 수 있다. a가 포지티브/네가티브인지에 따라, 보다 높은/보다 낮은 예후 스코어는 EGFR 억제제 치료에 대한 보다 높은 반응 확률을 나타낸다:

· a가 포지티브인 경우, 예후 스코어가 보다 높을수록, EGFR 억제제 처리에 대한 반응 확률이 보다 높다(즉, PFS 스코어의 경우에 질환 진행의 확률이 보다 낮다).

· 또는, a가 네가티브인 경우, 예후 스코어가 보다 낮을수록, EGFR 억제제 처리에 대한 반응 확률이 보다 높다(즉, PFS 스코어의 경우에 질환 진행의 확률이 보다 낮다).

암 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지에 대한 이러한 예측은 또한 노모그램을 사용하여 이루어질 수 있다. 노모그램에서, 포인트 스케일은 목적하는 스코어의 각각의 변수에 대해 확립한다. 소정 환자에 있어서, 포인트는 각 변수의 포인트 스케일로부터 상응하는 포인트를 선택함으로써 각각의 변수에 할당한다. 이산 변수(예를 들면, 유전자 발현 수준)에 있어서, 변수에 할당된 포인트의 수는 변수의 값에 선형으로 상관한다. 이분 변수(단지 2개의 값이 가능)에 있어서, 2개의 상이한 값은 2개의 가능성 변수 각각 또는 변수에 기인한다. 이어서, 목적하는 스코어는 각 변수(전체 포인트)에 할당된 포인트들 부가함으로써 계산된다. 스코어의 값에 기반하여, 이어서 환자는 복합 스코어가 역치(이분 스코어)보다 열등 또는 우수한지에 따라 양호한 또는 나쁜 반응 예후, 또는 처리에 대한 반응 또는 비-반응의 확률을 제공할 수 있다.

노모그램은 몇몇 별개의 변수가 복합 스코어와 조합되는 경우에 주로 유용하다(하기 참조: DBNDD2 및 EPB41L4B 발현 수준; DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준 및 hsa-miR-31-3p 발현 수준; 또는 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준 및 BRAF 상태를 조합하는 복합 스코어를 사용할 가능성). 그러나, 노모그램은 또한 단지 하나의 변수, 예를 들면, DBNDD2 또는 EPB41L4B 발현 수준에 기반하여 예후 스코어를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 전체 포인트는 단일 변수에 할당된 포인트에 상응한다.

DBNDD2 로그(log₂) 발현 수준에 기반하여 결장직장암 환자에서 진행 위험(즉, EGFR 억제제에 대한 비-반응 위험의) 측정을 가능하게 하는 노모그램의 예는 도 3에 제시되어 있다(하기 실시예 2 참조).

따라서, 암 환자가 본 발명에 따르는 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하는 방법의 실시형태에서, 상기 방법은 기준 샘플의 풀에 기초하여 보정된 노모그램에 기반하여 비-반응 위험을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 노모그램은 OS 또는 PFS 데이터에 기반하여 보정될 수 있다. OS에 기반하여 보정되는 경우, 비-반응의 위험은 사망 위험에 상응한다. PFS에 기반하여 보정되는 경우, 비-반응의 위험은 질환 진행의 위험에 상응한다(도 3 참조).

상기 설명한 바와 같이, 각각의 DBNDD2 및 EPB41L4B는 hsa-miR-31-3p의 표적 유전자이고 EGFR 억제제와의 반응에 독립적으로 현저히 연관되는 것으로 밝혀졌고, 따라서 단지 하나의 DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현 수준을 측정하여 본 발명에 따르는 방법에서 예측에 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명에 따르는 방법은 또한 환자의 샘플에서 DBNDD2 및 EPB41L4B 둘 다의 발현 수준을 측정하고 DBNDD2 및 EPB41L4B의 조합된 발현에 기반하여 반응 또는 비-반응을 예측하는 것을 또한 포함할 수 있다. DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현 수준을 조합하는 복합 스코어는 특히 기준 샘플의 풀에 기반하여 작성할 수 있다. 또한, 노모그램을 사용하여, DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현 수준을 조합하고 복합 스코어를 수득할 수 있으며, 이어서 비-반응 위험(즉 PFS 스코어에 있어서 질환 진행의 위험)과 상관시킬 수 있다.

DBNDD2 및/또는 EPB41L4B 발현 수준 및 EGFR 억제제에 반응하는 것과 포지티브 또는 네가티브 상관된 추가 파라미터에 기반한 분류

EGFR 억제제에 대한 반응은 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나의 발현 수준에 단지 기반하여 예측할 수 있지만(실시예 1, 2 및 3 참조), 본 발명에 따르는 방법은 또한 EGFR 억제제에 반응하는 것과 포지티브 또는 네가티브 상관되는 적어도 하나의 다른 파라미터를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

이 경우에, DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현 수준 및 다른 파라미터를 조합하는 복합 스코어는 특히 기준 샘플의 풀에 기반하여 작성될 수 있다.

포인트 스케일이 복합 스코어의 각 변수에 대해 확립되는 노모그램을 또한 사용하여, DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 발현 수준 및 다른 파라미터를 조합하고 복합 스코어를 수득할 수 있고, 이어서 비-반응의 위험(즉, PFS 스코어에 있어서 질환 진행의 위험)에 상관시킬 수 있다. 소정 환자에 있어서, 포인트는 각 변수의 포인트 스케일로부터 상응하는 포인트를 선택함으로써 변수 각각에 할당한다. 이산 변수(예: DBNDD2 또는 EPB41L4B 발현 수준 또는 연령)에 있어서, 변수에 기인하는 포인트의 수는 변수의 값에 선형으로 상관된다. 이분 변수(단지 2개의 값이 가능, 예를 들면, BRAF 돌연변이 상태 또는 성별), 2개의 상이한 값이 2개의 가능한 값 또는 변수 각각에 귀속한다.

이어서, 복합 스코어는 각각의 변수(전체 포인트)에 할당된 포인트를 부가함으로써 계산된다. 복합 스코어의 값에 기반하여, 이어서 환자는 복합 스코어가 역치(이분 스코어)보다 열등 또는 우수한지에 따라 양호한 또는 나쁜 반응 예후, 또는 처리에 대한 반응 또는 비-반응의 확률을 제공할 수 있다.

각 변수의 포인트, 또한 반응 예후가 양호하거나 나쁜 역치 또는 복합 스코어와 반응 또는 비-반응의 확률은 기준 샘플의 동일한 풀에 기반하여 측정할 수 있다.

EGFR 억제제에 반응하는 것과 포지티브 또는 네가티브 상관되는 이러한 다른 파라미터는 특히 다음으로부터 선택될 수 있다:

· 연령;

· 성별;

· DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현을 측정하기 위한 상기 개시된 임의의 방법에 의해, 게놈 및/또는 핵산(특히 각 유전자의 핵산 전사물의 양을 측정함으로써) 및/또는 단백질 수준에서 측정될 수 있는 hsa-miR-31-3p의 발현 수준; 및/또는

· EGFR 억제제와 반응하는 것과 포지티브 또는 네가티브 상관되는 적어도 하나의 돌연변의 존재 또는 부재.

이러한 돌연변이는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 방법에 의해 검출할 수 있고, 특히 하기 표 3에 언급된 것들을 포함한다:

유전자 기호	유니진 번호	염색체	진뱅크 기준 야생형 단백질 서열(들	돌연변이*
Kras	Hs.505033	12	NP_004976.2 (서열번호 24)	G12
				G13
				Q61
				K117N
				A146
BRAF	Hs.550061	7	NP_004324.2 (서열번호 25)	V600
NRAS	Hs.486502	1	NP_002515.1 (서열번호 26)	G12
				G13
				Q61
				K117
				A146T
PIK3CA	Hs.553498	3	NP_006209.2 (서열번호 27)	E545
				H1047
EGFR	Hs.488293	7	NP_005219.2 (서열번호 28); NP_958441.1 (서열번호 29); NP_958439.1 (서열번호 30);	S492R
AKT1	Hs.525622	14	NP_001014431.1 (서열번호 31); NP_001014432.1 (서열번호 32); NP_005154.2 (서열번호 33)	E17K

* 돌연변이는 야생형 아미노산에 대한 1문자 코드에 의해 선행하는 단백질 중의 코돈 번호의 언급에 의해 정의되고, 임의로 치환 아미노산이 후속된다. 치환 아미노산이 언급되지 않는 경우, 치환 아미노산은 야생형 아미노산과 상이한 임의의 아미노산일 수 있다.

EGFR 억제제

본 발명은, 이러한 제제를 사용한 치료 전에, 하나 이상의 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 대한 환자의 반응성을 예측할 수 있게 한다.

EGFR 억제제는 EGFR 티로신 키나제 억제제일 수 있거나, 대안적으로 EGFR 표적의 세포외 도메인을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, EGFR 억제제는 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙, 또는 EGFR 세포외 도메인을 표적화하는 분자, 예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙이다.

바람직하게는, EGFR 억제제는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체, 특히 세툭시맙 또는 파니투무맙이다.

세툭시맙 또는 파니투무맙 등의 항-EGFR 모노클로날 항체를 포함하여 EGFR 세포외 도메인을 표적화하는 분자는 주로 결장직장암 치료 또는 유방암 치료에 사용된다. 결과적으로, 환자의 암이 결장직장암(특히 전이성 결장직장암) 또는 유방암인 경우, 본 발명에 따르는 방법은 바람직하게는 EGFR 세포외 도메인을 표적화하는 분자 및 특히 항-EGFR 모노클로날 항체, 예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

역으로, 티로신 키나제 EGFR 억제제는 폐암(특히 비소세포 폐암, NSCLC)의 치료에 주로 사용되고, 따라서 환자의 암이 폐암(특히 비소세포 폐암, NSCLC)인 경우, 본 발명에 따르는 방법은 바람직하게는 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙 등의 티로신 키나제 EGFR 억제제에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

췌장암 또는 두경부암[특히 두경부의 편평 세포암(SCCHN)]에서, 티로신 키나제 EGFR 억제제 및 항-EGFR 모노클로날 항체 둘 다는 치료제로서 시험되고 있고, 따라서 환자의 암이 췌장암 또는 두경부암[특히 두경부의 편평 세포암(SCCHN)]인 경우, 본 발명에 따르는 방법은 티로신 키나제 EGFR 억제제(예를 들면, 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙) 또는 항-EGFR 모노클로날 항체(예: 세툭시맙 또는 파니투무맙)에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

세툭시맙 및 파니투무맙은 현재 임상적으로 주로 사용되는 항-EGFR 모노클로날 항체이다. 그러나, 추가의 항-EGFR 모노클로날 항체, 예를 들면, 니모투주맙(TheraCIM-h-R3), 마투주맙(EMD 72000) 및 잘루투무맙(HuMax-EGFr)은 개발 중에 있다. 본 발명에 따르는 방법은 또한, 특히 환자가 결장직장암(특히 전이성 결장직장암), 유방암, 췌장암 또는 두경부암[특히 두경부의 편평 세포암(SCCHN)]을 앓고 있는 경우, 이들 항-EGFR 모노클로날 항체 또는 추가로 개발될 수 있는 임의의 다른 항-EGFR 모노클로날 항체(단편 포함)에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

유사하게는, 에를로티닙, 게피티닙 및 라파티닙은 현재 임상적으로 주로 사용되는 티로신 키나제 EGFR 억제제이다. 그러나, 추가의 티로신 키나제 EGFR 억제제, 예를 들면, 카네르티닙(CI-1033), 네라티닙(HKI-272), 아파티닙(BIBW2992), 다코미티닙(PF29980.4,PF-00299804), TAK-285, AST-1306, ARRY334543, AG-1478(Tyrphostin AG-1478), AV-412, OSI-420(OesmethyIErlotinib), AZ08931, AEE788(NVPAEE788), 펠리티닙(EKB-569), CUOC-101, AG 490, PD153035 HCI, XL647 및 BMS-599626(AC48)이 개발 중에 있다. 본 발명에 따르는 방법은 또한, 특히 환자가 폐암(특히 비소세포 폐암, NSCLC), 췌장암 또는 두경부암(특히 두경부의 편평 세포암(SCCHN))을 앓고 있는 경우, 이들 티로신 키나제 EGFR 억제제 또는 추가로 개발될 수 있는 임의의 다른 티로신 키나제 EGFR 억제제에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

키트

본 발명은 또한, a) hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 암 환자의 샘플(바람직하게는 종양 샘플, 예를 들면, 종양 생검 또는 종양 외과적 절제의 전부 또는 일부)에서 측정하기 위한 시약으로서, hsa-miR-31-3p의 상기 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택되는, 시약 및

b) EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 다른 파라미터를 측정하기 위한 시약을 포함하거나 이들로 이루어지는, 암이 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 측정하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 시약은 주로 i) 상기 환자의 샘플(바람직하게는 종양 샘플, 예를 들면, 종양 샘검 또는 종양 외과적 절제의 전부 또는 일부)에서 EGFR 억제제, 특히 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA 또는 hsa-miR-31-5p(서열번호 34)에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및/또는

ii) 하기 표 3에 언급된 것들과 같이 EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 돌연변이를 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다.

상기 환자의 샘플에서 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나 또는 EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 miRNA, 특히 hsa-miR-31-3P 자체 또는 hsa-miR-31-5p의 발현 수준을 측정하는 시약은 특히 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나에 특이적인 프라이머 쌍(전방 또는 역방 프라이머) 및/또는 프로브 또는 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나에 특이적인 서열을 포함하는 마이크로어레이를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 프라이머 및/또는 프로브의 설계는 상기 표 1 및 2에 개시된 DBNDD2 및/또는 EPB41L4B의 서열에 기반하여 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 돌연변이를 검출하는 시약은, 예를 들면, ABI 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서 대립인자 식별 검정에 사용하기 위한, 서열분석 전에 목적하는 유전자의 전부 또는 일부를 증폭시키는 적어도 하나의 프라이머 쌍 또는 이들의 5' 말단에 리포터 염료로 표지된 특정 프로브 세트를 포함할 수 있다[참조: Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30 and Lievre et al. J Clin Oncol. 2008 Jan 20;26(3):374-9, BRAF 돌연변이 V600의 검출을 위해].

본 발명의 키트는 hsa-miR-31-3p 표적 유전자 DBNDD2 및 EPB41L4B 중의 적어도 하나의 발현 수준 및 다른 시험된 파라미터에 기반하여 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 측정하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 복합 스코어, 및 복합 스코어(포인트의 전체 수)와 예측(반응/비반응 또는 반응 또는 비반응의 확률) 사이의 상관에 포함된 모든 변수의 포인트 스케일을 포함하는 노모그램이 포함될 수 있다.

의약, 치료학적 용도 및 치료 방법

본 발명의 방법은 EGFR 억제제에 대한 보고된 임상 반응 속도에 일치하는 속도로 EGFR 억제제에 대한 환자 반응성을 예측한다.

따라서, 암을 갖는 환자의 치료 방법이 추가로 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 EGFR 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 환자는 상기한 바와 같은 방법에 의해 "반응자" 또는 "반응 가능자"로서 예측(또는 분류)되었다.

특히, 본 발명은, (i) 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 본 발명에 따르는 방법에 의해 측정하는 단계 및 (ii) 상기 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 것으로 측정되는 경우에 EGFR 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암이 발병된 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은, 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 없는 것으로 측정되는 경우, 대체 함암 치료를 상기 환자에게 투여하는 단계(iii)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 대체 항암 치료는 특정한 암 및 이전 시험된 치료에 의존하지만, 특히 방사선요법, 다른 화학요법 분자 또는 다른 생물학, 예를 들면, 다른 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체(항-Her2, 항-VEGF, 항-EPCAM, 항-CTLA4 ...)로부터 선택될 수 있다. 특히, 결장직장암의 경우에, 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 없는 것으로 측정되는 경우, 단계(iii)에서 투여된 대체 항암 치료는

· 유리하게는 FOLFOX(류코보린(엽산), 5-플루오로우라실(5-FU) 및 옥살리플라틴의 조합) 또는 FOLFIRI(류코보린(엽산), 5-플루오로우라실(5-FU) 및 이리노테칸의 조합) 화학요법과 조합된 VEGF 억제제, 특히 항-VEGF 모노클로날 항체(예를 들면, 베바시주맙)

· 대안적으로, 환자가, 임의로 FOLFOX 또는 FOLFIRI 화학요법과 조합하여, VEGF 억제제로 성공적으로 치료되지 않는 경우, 임의로 미토마이신 B와 조합하여 5-FU를 투여할 수 있다. 특정한 항신생물 섭생(즉, 항암 치료가 아님)의 부재하에 삶의 질을 최대화할 목적으로 투여된 치료로서 정의되는 최고의 지지 치료가 환자에게 추가로 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 대상은 암 발병 환자의 치료에 사용하기 위한 EGFR 억제제이고, 여기서 환자는 상기 정의된 방법에 의해 반응할 가능성이 있는 것으로 분류된다. 본 발명은 또한 암 발병 환자의 치료에 사용하기 위한 EGFR 억제제에 관한 것이고, 여기서 상기 치료는 상기 환자가 상기 정의된 방법에 의해 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지 또는 없는지를 예측하는 예비 단계를 포함하고, 상기 EGFR 억제제는 항기 환자가 상기 정의된 방법에 의해 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 경우에만 상기 환자에게 투여된다. 상기 환자는 결장직장암, 보다 특히 전이성 결장직장암이 발병될 수 있다. 또는, 상기 환자는 유방암, 특히 트리플 네가티브 유방암이 발병될 수 있다. 또는, 상기 환자는 폐암, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)이 발병될 수 있다. 또는, 상기 환자는 두경부암, 특히 두경부의 편평 세포암이 발병될 수 있다. 또는, 상기 환자는 췌장암이 발병될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 "반응자"로서 분류되는 환자에서 암의 치료에 사용하기 위해 의도된 의약을 제조하기 위한 EGFR 억제제의 용도에 관한 것이다.

바람직한 실시형태에서, EGFR 억제제는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시맙 또는 파니투무맙이다. 또는, EGFR 억제제는 티로신 키나제 EGFR 억제제, 특히 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙일 수 있다.

바람직한 실시형태에서:

· 환자는 결장직장암, 특히 전이성 결장직장암이 발병되고, EGFR 억제제는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시맙 또는 파니투무맙이고;

· 환자는 유방암, 특히 트리플 네가티브 유방암이 발병되고, EGFR 억제제는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시맙 또는 파니투무맙이고;

· 환자는 폐암, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)이 발병되고, EGFR 억제제는 티로신 키나제 EGFR 억제제, 특히 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙이고;

· 환자는 두경부암, 특히 두경부의 편평 세포암 또는 췌장암이 발병되고, EGFR 억제제는 항-EGFR 항체(바람직하게는 세툭시맙 또는 파니투무맙) 또는 티로신 키나제 EGFR 억제제(특히 에를로티닙, 게피티닙 또는 라파티닙)이다.

실시예 및 도면은 본 발명의 범위를 제한하지 않고서 본 발명을 설명한다.

실시예

실시예 1: DBNDD2 및 EPB41L4B는 hsa-miR-31-3p의 표적이고, EGFR 억제제에 대한 반응을 독립적으로 예측한다.

환자 및 방법

환자

환자의 세트는 20mCRC(전이성 결장직장암) 환자, 남성 14명 및 여성 6명으로 구성되었다. 연령의 중앙값은 66.49±11.9세였다. 모든 환자는 이리노테칸 및 세툭시맙의 조합을 제공받았다. 세툭시맙의 도입 전에 화학요법 라인의 수를 기록했다. 후속 진행까지의 중앙값은 20주였고, 중앙 전체 생존은 10개월이었다. 모든 종양 샘플은 절제물로부터 유래하고, 포르말린 및 파라핀 매립(FFPE)으로 고정되었다.

세포 배양물 및 형질감염

본 발명자들은 hsa-miR-31-3p: HTB-37, CCL-222 및 CCL-220-1을 약하게 발현하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassa, CA)으로부터 3개의 결장직장 선암 세포주를 선택했다. HTB-37 세포는 20% 태소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신과 함께 안정한 글루타민을 갖는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM) 배양 배지에서 유지시켰다. CCL-222 및 CCL-220-1 세포는 10% 태소 혈청과 함께 안정한 글루타민을 갖는 RPMI 1640 배양물 배지에 유지시켰다. 세포는 5% CO₂로 37℃의 온도에서 인큐베이션했다.

모든 세포는 miRVana miRNA 유사 네가티브 대조군 또는 hsa-miR-31-3p miRVana miRNA 모방체(Ambion)로 형질감염시켰다. CCL-222의 경우, 형질감염은 12웰 플레이트에서 25pmol의 MiRNA 모방체 및 60000 세포를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 역전사 프로토콜에 의해 2㎕의 리포펙타민 RNAiMax로 수행했다. CCL-220-1 및 HBT27의 경우, 형질감염은 12웰 플레이트에서 12.5pmol의 miRNA 모방체 및 100000 세포를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 4㎕의 리보셀린(BioCellChallenge, Toulon, France)을 사용하여 수행했다. 모든 세포주에 있어서, 세포는 형질감염후 24시간에서 수거했고, 퀴아졸(Qiazol)을 사용하여, miRNeasy 추출 키트(Qiagen)을 사용한 전체 RNA의 추출 때까지 RNA를 보호했다. 형질감염의 유효성을 평가하기 위해, miRNA hsa-miR-31-3p 발현 수준의 특정한 정량화를 하기 기재된 바와 같이 수행했다.

유전자 발현의 측정

유전자 발현 마이크로어레이는 아피메트릭스 휴먼 진(Affymetrix Human Gene) 1.0을 사용하여 수행했다. 50ng의 전체 RNA는 Ovation PicoSL STA 시스템 V2(Nugen, San Carlos, CA)에 따라 역전사시켰다. 이어서, 증폭은 SPIA 기술에 기반하여 수행했다. 누겐(Nugen) 프로토콜에 따르는 정제 후, 2.5㎍의 단일 가닥 DNA는 엔코어 비오틴 모듈(Encore Biotin Module)(Nugen)을 사용하여 단편화 및 비오틴 표지화를 위해 사용했다. 바이오분석기(Bioanalyzer) 2100을 사용한 단편화의 조절 후, 이어서 cDNA를 45℃에서 17시간 동안 GeneChip^® 인간 유전자 1.0 ST(Affymetrix)와 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 칩을 특정한 프로토콜(Affymetrix)에 따라 유체 스테이션 FS450 상에서 세척하고, GCS3000 7G를 사용하여 스캐닝했다. 이어서, 이미지를 발현 콘솔 소프트웨어(Affymetrix)로 분석하여, 생 데이터(CELfiles) 및 품질 조절용 메트릭을 수득했다.

세포주 및 FFPE 환자 상에서 표적 발현의 qRT-PCR 검증은 ABI7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem)을 사용하여 FFPE 샘플용의 20ng의 전체 RNA 또는 50ng의 전체 RNA 세포 배양물 샘플 상에서 수행했다. 모든 반응은 삼중으로 수행했다. 발현 수준은 △△Ct 방법을 통해 RNA18S 및 GAPDH 수준에 대해 표준화했다.

인 실리코 분석

본 발명자들은 6개의 개별 예측 데이터베이스(PITA, picTar 5-way, Targetscan, microRNA.org, MicroCosm 및 mi^'RDB)로부터 현재 마이크로RNA 표적 예측을 통합하는 데이터 포탈을 개발했다. 이러한 포탈은, 각 마이크로RNA/표적 관계를 예측하는 마이크로RNA 예측 데이터베이스의 수 및 개개 예측 데이터베이스로부터 각 miRNA의 예측 등급을 고려하여, 후보 유전자의 목록에 의해 잠재적으로 공-표적화된 마이크로RNA의 측정을 가능하게 한다. 이러한 데이터베이스는 보고된 분석을 수행하기 위해 2012년 11월에 업데이트되었다.

통계학적 분석

생존율 통계학적 분석은 R 팩키지 "생존" 및 "rms"을 사용하여 수행했다. 단변량 및 다변량 분석은 Cox 비례 회귀 위험 모델을 사용했고, 위험 비율(HR)을 생성했다. 노모그램은 자유-진행 생존의 확률을 예측하는 Cox 비례 회귀 위험 모델에 기반하여 개발되었다.

허위-발견율(FDR)-조절된 p-값은 다중 시험 보정을 위해 벤자미니 및 호치버그(Benjamini and Hochberg) 절차를 사용하여 계산했다. cor. 시험 함수를 사용하여 일치하는 p-값과 함께 발현 값 사이의 피어슨 상관을 계산했다. 통계학적 유의성은 모든 분석을 위해 p<0.05로 설정했다.

결과

hsa-miR-31-3p를 약하게 발현하는 3개의 CRC 세포주는 hsa-miR-31-3p 모방체 또는 모방 대조군으로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 사멸 또는 성장 결함 없이 1500배의 hsa-miR-31-3p 수준의 평균 상승에 의해 증명되었다. 형질감염된 세포의 발현 프로파일 분석은 하기 표 4에 기재된 바와 같이 hsa-miR-31-3p에 의해 유의적으로 하향-조절되는 47개 유전자(fc<0.77, p<0.05), 및 유의적으로 상향 조절되는 27개 유전자(fc<1 .3, p<0.05)를 동정하게 했다.

마이크로RNA의 역할은 이의 전사 표적의 분해(degradation)를 포함하기 때문에, 본 발명자들은 이용가능한 6개 웹으로부터의 정보를 포함하는 데이터베이스가 hsa-miR-31-3p 추정 표적으로서 하향-조절된 54개를 예측하는지를 연구했다. 데이터베이스는 miRNA 명칭 또는 유전자 명칭에 의해 조회할 수 있다. miRNA 명칭이 조회되는 경우, 데이터베이스는, 당해 데이터베이스에 포함된 구조적 및 잠재적 실험 데이터에 기반하여, 유전자가 조회된 miRNA의 진정하 표적이라는 확률 순서(가장 가능성이 있는 것으로부터 가장 가능성이 없는 것까지)에 의해 등급화된 후보 표적 유전자의 목록을 반환한다. 역으로, 유전자 명칭이 조회되는 경우, 데이터베이스는, 당해 데이터베이스에 포함된 구조적 및 잠재적 실험 데이터에 기반하여, miRNA가 조회된 유전자를 진정하게 표적화하는 확률의 순서(가장 가능성이 있는 것으로부터 가장 가능성이 없는 것까지)에 의해 등급화된 miRNA 후보의 목록을 반환한다. 데이터베이스는 hsa-miR-31-3p 명칭, 및 hsa-miR-31-3p를 과발현하는 CRC 세포주에서 하향-조절되는 것으로 밝혀진 유전자의 명칭(47개 유전자, 표 4 참조)로 조회했다.

하기 표 5는 DBNDD2 및 EPB41L4B를 포함하여 표 4의 하향-조절된 유전자를 나타내고, 이는 hsa-miR-31-3p의 추정 직접 표적으로 동정되었다. 또한, 이는, 데이터베이스가 유전자 명칭을 이용하여 조회되는 경우에 hsa-miR-31-3p의 등급, 및 데이터베이스가 hsa-miR-31-3p 명칭을 사용하여 조회되는 경우에 유전자의 등급을 나타낸다.

인 실리코 데이터베이스로부터 표적 예측은 요구에 따라 하향-조절된 유전자를 위해 제시되어 있다: 컬럼 2: 데이터베이스는 목적하는 유전자로 조회하고, 이러한 유전자를 잠재적으로 표적화하는 모든 후보 마이크로RNA를 보고하고, 가장 가능성이 있는 것으로부터 가장 가능성이 없는 것까지 등급화했다. hsa-miR-31-3p의 등급 및 마이크로RNA 후보의 전체 수가 제시되어 있다; 컬럼 3: 데이터베이스는 hsa-miR-31-3p로 조회하고, 모든 추정 표적을 보고하고, 1620개 추정 표적화된 유전자의 전체에 대해 가장 가능성이 있는 것으로부터 가장 가능성이 없는 것까지 등급화했다. 이어서, 조회된 유전자의 등급을 제시한다. hsa-miR-31-3p 1620개 추정 표적화된 유전자에 수록된 하향-조절된 유전자만이 표 5에 제시되어 있다. DBNDD2 및 EPB41L4B에 관한 데이터는 볼드체로 제시되어 있다.

47개의 하향-조절된 유전자 중에서, 25개는 hsa-miR-31-3p의 추정 직접 표적인 것으로 예측되고, 예측 데이터베이스에서 양호한 등급을 나타냈다. 유전자의 이러한 수 및 등급화는 유의적이다(잠재적 시험에 의한 두 시험에 대해 P<0.0001). 예상된 바와 같이, miR-31-3p로 형질감염된 세포에서 27개 상향-조절된 유전자 중의 어떤 것도, 그러나 하나는 hsa-miR-31-3p의 표적인 것으로 예측되었고, 유일하게 예측된 하나는 등급화된 최후 표적이었다.

25개의 추정 직접 표적 유전자 및 27개의 간접 표적 유전자는 qRT-PCR로 확인되었고, 이들 47개 유전자 중에서, 45개는 어레이에서 수득된 수준에 필적하는 발현 수준을 나타냈다.

마지막으로, 이들 유전자의 발현은 환자 FFPE 종양 샘플에서 분석했고, 이들 중의 2개는 hsa-miR-31-3p 발현 수준: DBNDD2 및 EPB41L4B와 유의한 네가티브 상관을 나타냈다(도 1A 및 1B 참조).

또한, 비-파라미터 차등 분석(differential analysis)을 사용하여, 이들 2개 유전자는 진행 유리 생존과 연관되는 것으로 밝혀졌다(DBNDD2의 경우 p=0.004, 및 EPB41L4B의 경우 p=0.025). 이와 함께, 이들 결과는 DBNDD2 및 EPB41L4B가 불량한 또는 양호한 예후를 갖는 mCRC 환자, 즉 비-반응자 및 반응자 mCRC 환자 사이에서 구별할 수 있음을 시사한다.

실시예 2: EGFR 억제제에 대한 반응을 예측하기 위해 DBNDD2 및 EPB41L4B를 사용한 툴의 작성

환자 및 방법

환자

환자의 세트는 20mCRC 환자, 남성 13명 및 여성 7명으로 구성되었다. 연령의 중앙값은 67±11.2세였다. 모두는 포함 시점에서 전이성 질환을 가졌다. 이들 모든 환자는 KRAS 야생형 전이성 결장암을 발증했다. 모든 환자는 이리노테칸 및 옥살리플라틴과 조합된 5-플루오로우라실계 섭생에 대해 불응성인 것으로 간주되었다. 이들은 항-EGFR-계 화학요법을 제공받았고, 파니투무맙으로 8명 환자, 세툭시맙으로 10명 환자 및 2명 환자는 파니투무맙 및 세툭시맙의 조합을 제공받았다. 세툭시맙 및 파니투무맙의 도입 전에 화학요법 라인의 수를 기록했다. 후속 진행 때까지의 중앙값은 21주였고, 중앙 전체 생존은 8.9개월이었다.

유전자 발현의 측정

FFPE 환자 샘플 상에서 DBNDD2 및 FPB41L4B 발현의 qRT-PCR은 ABI7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem)을 사용하여 20ng의 전체 RNA에 대해 수행했다. 모든 반응은 삼중으로 수행했다. 발현 수준은 △△Ct 방법을 통해 GAPDH 수준에 대해 표준화했다.

통계학적 분석

생존 통계 분석은 R 팩키지 "생존" 및 "rms"를 사용하여 수행했다. 단변량 및 다변량 분석은 Cox 비례 회귀 위험 모델을 사용했고, 위험 비율(HR)을 작성했다. 노모그램은 유리-진행 생존의 확률을 예측하는 Cox 비례 회귀 위험 모델에 기반하여 개발되었다.

유전자 및 miRNA 발현 값 비교 분석은 R에서 쌍방향 윌콕스(Wilcox) 시험 함수를 갖는 비-파라미터 시험(Kruskal-Wallis 시험)을 사용하여 수행했다.

cor.시험 함수를 사용하여, 일치하는 p-값과 함께 발현 값 사이의 피어슨 상관을 계산했다. 통계학적 유의성은 모든 분석을 위해 p<0.05로 설정했다.

결과

DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현은 종양 샘플에서 분석했다. 통계학적 분석은 hsa-miR-31-3p 발현 수준과의 유의한 네가티브 상관을 나타냈다: (DBNDD2의 경우 도 2 참조). 또한, 비-파라미터 차등 분석을 사용하여, 이들 2개 유전자는 진행 유리 생존과 연관되는 것으로 밝혀졌다(DBNDD2의 경우 p=0.025). 이러한 결과에 기초하여, 항-EGFR로 치료한 mCRC 환자의 반응을 예측하는 툴을 수득하기 위해, 공변량으로서 다변량 Cox 비례 위험 모델 상태 및 유잔자 발현의 log₂를 사용하여 PFS에 기반한 노모그램을 작성하고, 이에 의해 진행의 위험을 예측하게 했다(즉, 비-반응의 위험, 도 3 및 4 참조).

실시예 3: 새로운 및 독립적 코호트에서 EGFR 억제제에 대한 DBNDD2 및 EPB41L4B의 예측 값의 응답

환자 및 방법

환자

환자의 세트는 42mCRC(전이성 결장직장암) 환자, 남성 27명 및 여성 15명으로 구성되었다. 연령의 중앙값은 59±12.1세였다. 모두는 포함 시점에서 전이성 질환을 가졌다. 모든 환자는 옥살리플라틴 및 이리노테칸 화학요법 기반 섭생으로 진행 후에 이리노테칸 및 파니투무맙의 조합에 의해 제3차 요법으로 치료했다. 후속 진행 까지의 중앙값은 23주였고, 중앙 전체 생존은 9.6개월이었다. 26개 샘플은 FFPE로 이용가능하고, 16개 샘플은 동결 조직으로 이용가능했다.

유전자 발현의 측정

동결된 또는 FFPE 환자 샘플 상에서 표적 발현의 qRT-PCR 검증은 ABI7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem)을 사용하여 20ng의 전체 RNA에 대해 수행했다. 모든 반응은 삼중으로 수행했다. 발현 수준은 △△Ct 방법을 통해 RNA18S 또는 GAPDH 수준으로 표준화했다.

통계학적 분석

생존 통계학적 분석은 R 팩키지 "생존" 및 "rms"를 사용하여 수행했다. 단변량 및 다변량 분석은 Cox 비례 회귀 위험 모델을 사용했다. 유전자 및 miRNA 발현 값 비교 분석은 R에서 쌍방향 윌콕스 시험 함수로 비-파라미터 시험(Kruskal-Wallis 시험)을 사용하여 수행했다.

통계학적 유의성은 모든 분석을 위해 p<0.05로 설정했다.

결과

DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현은 환자 종양 FFPE 샘플에서 분석했다. 이들은 hsa-miR-31-3p 발현 수준과 유의한 네가티브 상관을 나타냈다: (도 5A 및 5B 참조). 국제특허출원 제PCT/EP2012/073535호에 기재된 바와 같이 hsa-miR-31-3p의 발현 수준에 기반하여 계산된 이들 2개 유전자의 발현과 반응/비-반응 사이의 상관이 발견되었다(도 6 참조).

cox 모델을 사용하여, 이들 2개 유전자는 진행 유리 생존과 연관되는 것으로 밝혀졌다(GAPDH 표준화로 DBNDD2의 경우에 p=0.004 및 RNA 18S 표준화로 EPB41L4B의 경우에 p=0.027).

이들 결과는 DBNDD2 및 EPB41L4B의 발현이 불량한 또는 우수한 예후, 즉 비-반응자 및 반응자 mCRC 환자 사이에서 mCRC 환자를 구별할 수 있는 것을 확인한다.

참고 문헌

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tcaggggaag 1140 agatggctgt gaatattctc ttggactgac cccgacaggc atattaatct ttgaaggagc 1200 taacaaaata ggcttattct tttggcctaa aattaccaaa atggatttta aaaagagcaa 1260 attgacactc gtggtggtcg aggatgatga tcagggacgt gagcaagagc acacgtttgt 1320 gttccggtta gacagtgcca ggacctgcaa acacctttgg aagtgtgcag ttgagcacca 1380 cgcattcttc cgactgcgga cgccaggaaa cagcaaatcc aatagatccg actttatcag 1440 gctgggctct cgcttcagat tcagtgggcg gacagaatat caagctacac atggctccag 1500 gttacgaaga accagcacct ttgagaggaa gcctagtaaa cgttatccat cccggagaca 1560 ttcaacgttc aaagcaagca acccagtgat agcagcccag ctctgctcta aaacaaatcc 1620 agaagtccat aattaccagc ctcaatatca tcctaatatc catcccagcc agccccggtg 1680 gcatcctcac tctccaaatg tcagctaccc gctcccttcc ccagtgctta gcagctcgga 1740 ccggttgcct tttggcattg aggagaatgg gggcacaccg ttcctcaccg cagcttcagg 1800 aaggcatcac caccagcacc agcatcagca tcagcaccag caccactcaa actacagcct 1860 ctcactgacc ctggagaaca aagaggggcc tctgaggtcc ccaaactcca gcagcaagtc 1920 ccttacaaaa ctgagtccag gaacacctgc cttgttcagt gaagccgctg cccatctaaa 1980 gaagctggaa ctggaaactg tgaaggctgc tggaccctgg cctcctctgc acatcaacat 2040 aaacaaggct gaagaaaaga aagtctcgga gaaaactctt cagactccac ttttgccttc 2100 ccctgttgcg gatcatgtga agtgtaacat tctgaaagcc cagttggaaa atgcttcccg 2160 agtgaacatc cagggtggaa aggaggaatc accgtttgta aatatcaata agaaatccag 2220 tcttcaggac gctagtgtaa gaagtcctat tcctattcgt gtggaaactg cccagccagc 2280 tgtggaaaag ccggaaatca agcctccccg agtgaggaag ttaacaagac agtatagttt 2340 tgatgaagac gacctccctc cagacctggc cgaggcagtg ggagtgacca catctacaac 2400 cacaaacacc acaacggccg ccacacaagt ctccgtgccg ctgccgtccc ccaaggtcca 2460 gaatgtcagc tcgcctcaca agtcagaagg caaaggcctg ctgtcccctg gggccaagag 2520 cccctctgac cgaggaggtg cctttaccct ggagccgggt gatcttctga tggatttcac 2580 agaagccact cctctggcag agcccgccag caacccccac tgtgcccact ctcgctgttc 2640 tcctccactc tctctcccca tgaaggaaga gaccactgga gtttgcatgt accctccaat 2700 caaaacgagg ctgataaaaa cattcccggt tgatacaatg aacccgtttc ctgatacttt 2760 caccacaggg ccacagttta ctgcagactt cagagacagt aaattacagt 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Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 32 <211> 480 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 32 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val 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465 470 475 480 <210> 33 <211> 480 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 33 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480

Claims (19)

1. 암 환자가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하기 위한 시험관내 방법으로서,
   상기 방법은 상기 환자의 종양 샘플에서 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고,
   hsa-miR-31-3p의 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택되는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 환자가 KRAS 야생형 암을 갖는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 환자가 결장직장, 폐, 유방, 난소, 자궁내막, 갑상선, 비인두, 전립선, 두경부, 간, 신장, 췌장, 방광 및 뇌로부터 선택된 암을 앓고 있는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 암이 결장직장암, 특히 전이성 결장직장암인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR 억제제가 항-EGFR 항체, 특히 세툭시맙 또는 파니투무맙인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 종양 조직 생검, 또는 종양 외과적 절제의 전부 또는 일부인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, hsa-miR-31-3p의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준이, hsa-miR-31-3p의 표적 유전자에 의해 생성된 전사물의 양을 바람직하게는 정량적 RT-PCR에 의해 시험관내에서 측정함으로써 핵산 수준에서 측정되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, hsa-miR-31-3pis의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준이 높을수록, 상기 환자가 EGFR 억제제 치료에 반응할 가능성이 보다 높은, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, hsa-miR-31-3p의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준에 기초하여 예후 스코어를 측정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 예후 스코어는 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 나타내는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 예후 스코어가 하기 수학식인, 방법.
    예후 스코어 =

    

    ,
    여기서, x는 환자의 샘플에서 측정된 DBNDD2의 로그 발현 수준이고,
    a 및 b는 기준 샘플의 풀에 기초하여 미리 측정한 파라미터이고,
    환자는, 예후 스코어가 역치 c보다 높거나 낮은 경우에 EGFR 억제제에 반응하거나 반응하지 않는 것으로 예측되고, 여기서 c 값은 기준 샘플의 동일한 풀에 기초하여 측정되고,
    ο a가 포지티브인 경우, 예후 스코어가 역치 c 이상이면, 환자는 EGFR 억제제에 반응하는 것으로 예측되고, 예후 스코어가 역치 c보다 낮으면, EGFR 억제제에 반응하지 않는 것으로 예측되며,
    ο a가 네가티브인 경우, 예후 스코어가 역치 c 이하이면, 환자는 EGFR 억제제에 반응하는 것으로 예측되고, 예후 스코어가 역치 c보다 크면, EGFR 억제제에 반응하지 않는 것으로 예측될 수 있다.
11. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 예후 스코어가 하기 수학식인, 방법.
    예후 스코어 =

    

    ,
    여기서, x는 환자의 샘플에서 측정된 DBNDD2의 로그 발현 수준이고,
    a 및 b는 기준 샘플의 풀에 기초하여 미리 측정한 파라미터이고,
    a가 포지티브 또는 네가티브인지에 따라,
    ο a가 포지티브인 경우, 예후 스코어가 높을수록, EGFR 억제제 치료에 대한 반응 확률이 보다 높고,
    ο a가 네가티브인 경우, 예후 스코어가 낮을수록, EGFR 억제제 치료에 대한 반응 확률이 보다 높다.
12. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 기준 샘플의 풀에 기초하여 보정된 노모그램에 기초한 비-반응의 위험을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 다른 파라미터를 측정하고, hsa-miR-31-3p의 적어도 하나의 표적 유전자 및 상기 다른 파라미터의 발현 수준을 고려하여 복합 스코어를 계산하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 복합 스코어는 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 나타내는, 방법.
14. a) hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현 수준을 암 환자의 샘플에서 측정하기 위한 시약으로서, hsa-miR-31-3p의 표적 유전자는 DBNDD2 및 EPB41L4B로부터 선택되는, 시약 및
    b) EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 다른 파라미터를 측정하기 위한 시약으로서, 상기 시약은 i) EGFR 억제제, 특히 hsa-miR-31-3p(서열번호 1) miRNA 또는 hsa-miR-31-5p(서열번호 34) miRNA에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및/또는 ii) EGFR 억제제에 대한 반응에 포지티브 또는 네가티브로 상관된 적어도 하나의 돌연변이를 검출하기 위한 시약 중에서 선택되는 시약
    을 포함하거나 이들로 이루어지는, 암이 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 측정하기 위한 키트.
15. 암 발병 환자의 치료에 사용하기 위한 EGFR 억제제로서,
    상기 환자는 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 것으로 분류되는, EGFR 억제제.
16. 암 발병 환자의 치료에 사용하기 위한 EGFR 억제제로서,
    상기 치료는, 상기 환자가 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하는 예비 단계를 포함하고, 상기 EGFR 억제제는, 상기 환자가 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 것으로 예측되는 경우에만 상기 환자에게 투여되는, EGFR 억제제.
17. 암 발병 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 상기 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는지를 본 발명에 따르는 방법에 의해 측정하는 단계 및
    ii) 상기 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 있는 것으로 측정되는 경우에 EGFR 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 발병 환자를 치료하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 환자가 EGFR 억제제에 반응할 가능성이 없는 것으로 측정되는 경우에, 대체 항암 치료를 상기 환자에게 투여하는 단계 iii)를 추가로 포함하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 대체 항암 치료가
    a) VEGF 억제제,
    b) FOLFOX와 조합된 VEGF 억제제,
    c) FOLFIRI와 조합된 VEGF 억제제,
    d) 5-FU 및
    e) 미토마이신 B와 조합된 5-FU로부터 선택되는, 방법.
    

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