KR101507656B1

KR101507656B1 - 폐암 환자의 생존 예측용 gnb2l1 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법

Info

Publication number: KR101507656B1
Application number: KR1020130099330A
Authority: KR
Inventors: 박재용; 전효성; 최진은; 최의영
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-03-31
Also published as: KR20150021862A

Abstract

본 발명은 GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein [G protein], beta polypeptide 2-like 1) 유전자의 프로모터 내 단일염기다형성 (singlenucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 폐암 예후 마커, 이를 이용한 폐암 생존 예후 예측용 조성물, 폐암 생존 예후 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Description

폐암 환자의 생존 예측용 GNB2L1 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법{GNB2L1 gene polymorphisms marker for predicting survival in patients with lung cancer and method for predicting survival using the same}

본 발명은 GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein [G protein], beta polypeptide 2-like 1) 유전자의 프로모터 내에 존재하는 단일염기다형성 (singlenucleotide polymorphism; SNP)의 폐암 예후 마커 용도에 관한 것으로서, 폐암 환자의 생존 예측용 GNB2L1 다형성 마커, 이를 이용한 폐암 생존 예후 예측용 조성물, 폐암 생존 예후 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 이 중 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다. 폐암의 높은 사망률은 일부 절제 불가능한 종양을 가진 환자의 높은 비율과 관련되어 있으며, 또한 절제 가능한 병기의 비소세포폐암 환자 중에서도 외과적으로 절제한 환자의 상당수가 암의 재발로 사망하고 있다. 현재 폐암의 경우 병리학적 병기로 진단하고 있지만, 같은 병기에서도 재발과 생존의 상당한 차이를 보이고 있기 때문에, 폐암의 진단과 치료의 방법이 발달했음에도 불구하고 여전히 생존율이 좋지 않다. 이러한 결과는 조기 진단방법과 알맞은 선별검사의 부족으로 인한 낮은 치료율에 기인하며, 따라서 폐암 사망률을 낮추기 위하여 효과적인 조기 진단 및 맞춤진단방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 유전적 변이나 후성학적 변화의 축적으로 인해 발생되는 암은 발달과정 동안 획득하게 되는 능력들은 다음과 같이 6가지로 제시될 수 있다(Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-74.). 1. 성장 신호의 자급자족 (Self-sufficiency in growth signals), 2. 성장 억제 신호에 둔감 (Insensitivity to anti-growth signals), 3. 세포사 회피 (Evading Apoptosis), 4. 무한 증식력 (Limitless Replicative Potential), 5. 지속적인 혈관생성 (Sustained Angiogenesis), 6. 침윤과 전이 (Tissue Invasion and Metastasis)이가 그것이다. 이러한 특징을 가지는 암에 중요한 역할을 할 수 있는 후보유전자로서 현재 다형성 연구가 집중되고 있다.

단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, 이하, "SNP" 라 함)은 인간 유전자 변이의 가장 일반적인 형태로, 유전체(genome) 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C와 T 간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한, SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에, 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로도 사용될 수 있다. 나아가 SNP는 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료 전략을 구사하는 맞춤의학 (personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP의 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.

최근 들어, 유전자의 다형성을 이용한 질병들에 대한 감수성을 예측하고 진단하는 방법들이 개발되고 있으며, 특히 암과 관련된 유전자의 다형성과 암과의 연관성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이와 관련, 여러 유전학적 연관성 연구에서는 일부의 단일염기다형성이 발현 또는 효소활성과 같은 유전자의 기능을 조절하여 폐암을 포함한 종양형성 및 다양한 암의 위험인자로 보고된 바 있다(Zhang X, Miao X, Sun T, Tan W, Qu S, Xiong P, Zhou Y, Lin D. Functional polymorphisms in cell death pathway genes FAS and FASL contribute to risk of lung cancer. J Med Genet 2005;42:479-484.; MacPherson G, Healey CS, Teare MD, Balasubramanian SP, Reed MW, Pharoah PD, Ponder BA, Meuth M, Bhattacharyya NP, Cox A. Association of a common variant of the CASP8 gene with reduced risk of breast cancer. J Natl Cancer Inst 2004;24:1866-1869.; Park JY, Park JM, Jang JS, Choi JE, Kim KM, Cha SI, Kim CH, Kang YM, Lee WK, Kam S, Park RW, Kim IS, Lee JT, Jung TH. Caspase 9 promoter polymorphisms and risk of primary lung cancer. Human Mol Genet 2006;15:1963-1971.).

따라서 이러한 질병과 연관된 감수성 유전적 변이를 폐암 환자들에 대한 예후 인자로 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화할 수 있어 폐암 환자의 맞춤 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다.

이에 본 발명자들은 암화과정에 관여하는 유전자들의 다형성이 폐암의 예후에 영향이 있을 것으로 착안하여, 암 관련 유전자들의 잠재적으로 기능성 다형성들과 초기 비소세포폐암 수술 후 예후와의 연관성을 조사한 결과, GNB2L1 유전자의 프로모터 내 존재하는 특정 염기의 다형성이 폐암 환자, 특히 외과적 수술로 폐암을 절제한 환자의 생존 예후를 예측할 수 있는 마커로 이용될 수 있음을 최초로 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2011-0009609호 한국등록특허 제10-0894322호

따라서 본 발명의 목적은 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)할 수 있는 다형성 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 다형성 마커를 이용하여 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)가 T 또는 G이고, 상기 172번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 GG인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

도 1은 카프란-마이어 (Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 분석한 GNB2L1 rs3756585T>G 유전자형에 따른 전체 생존 및 무병 생존의 곡선을 나타낸 것이다. 다변량 콕스 위험 모델에서의 상호우성 모델의 P-값.
도 2는 GNB2L1 rs1279736C>A 및 GNB2L1 rs3756585T>G의 일배체형의 프로모터 활성 정도를 나타낸 그래프이다. 유전자 발현정도는 Dual-Luciferase Reporter Assay System을 이용 전사활성 측정을 통해 이루어졌다.
도 3은 H1299 세포의 핵 추출물을 이용한 GNB2L1 rs3756585T>G SNP 에 대한 전기 이동성 교대 분석 실험(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 GNB2L1의 프로모터 내 존재하는 다형성 부위를 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마커에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)가 T 또는 G이고, 상기 172번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측/진단용 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 상기 GNB2L1의 프로모터 내 다형성 부위는 GNB2L1 유전자(진뱅크 번호: NT_023133)의 전사시작부위를 기준으로 -123번째에 존재하는 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 서열번호 1은 GNB2L1(Genebank accession No. NT_023133) 서열 중에서 234061-234600번째 서열을 나타낸 것이다. 한편, 본 발명에서는 상기 다형성 부위를 “GNB2L1 rs3756585T>G”로 표시한다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

본 발명의 상기 GNB2L1 유전자는 G 단백질의 β subunit을 포함한 단백질로 활성화된 PKC isoform βII의 결합하여, 세포성장에 신호 전달함으로써, 이는 암을 진행시키는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 아직까지 GNB2L1 유전자의 다형성과 폐암 발병 위험성 및 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)에 관한 연구는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 암화과정에 관여하는 유전자들의 다형성이 폐암의 예후에 영향이 있을 것으로 착안하여, 암 관련 유전자들의 잠재적으로 기능성 다형성들과 초기 비소세포폐암 수술 후 예후와의 연관성을 조사하던 중, 상기 GNB2L1 유전자의 프로모터 내 다형성 부위가 폐암 환자의 생존 예후 예측에 유용함을 확인하였다.

본 발명자들은 비소세포폐암을 외과적으로 절제한 814명의 환자를 대상으로, GNB2L1 rs3756585T>G 다형성을 조사하여, 유전형과 전체 생존 (overall survival, OS) 및 무병 생존 (disease-free survival, DFS)과의 관계를 분석하였다. 상기 전체 생존(OS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막으로 추적 조사한 날까지를 말하며, 상기 무병생존(DFS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지를 말한다. 분석 결과, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 유전자형이 적어도 하나의 T 대립유전자를 가진 TG 또는 TT일 경우 GG에 비하여 더 나은 전체 생존 및 무병생존을 나타내었으므로(전체생존 위험비=1.68, P=0.02), 비소세포암 환자에서 GNB2L1 rs3756585T>G 다형성이 폐암 생존 예후와 관련성이 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 용어, “예후”는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암의 발병 위험성 및 폐암 발병 후의 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암을 수술로 절제한 환자, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자의 예후를 의미한다.

폐암의 이상적인 치료법은 조기 발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단 시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 폐암 발병 위험성을 손쉽게 예측할 수 있으며, 폐암 발병 위험성을 관리함으로써 폐암을 조기 발견하여 수술로 암을 완전히 제거하여 완치시킬 수 있다. 또한, 폐암 발병 후의 경우, 특히 비소세포암은 외과적 수술을 할 수 있을 만큼 진행되지 않은 경우라면 우선 수술을 시행하는데, 근치절제술을 시행할 수 있는 경우는 30%에 불과하다. 수술 후 완치 여부를 판정하는 5년 생존율은 암의 진행 정도에 따라 다르나, 근치절제술을 시행한 전체 환자를 대상으로 보면 편평상피암 37%, 선암 27%, 대세포암 27% 정도가 완치되었다. 따라서 본 발명의 상기 다형성 마커를 이용하면 폐암의 이러한 예후를 손쉽게 판단할 수 있으며, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어, "폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미한다. 상기 폐암을 수술로 절제한 환자는 바람직하게는 비소세포암, 편평상피암, 선암, 대세포암 등의 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미하며, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자를 의미한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에 포함되는, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 10개 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 10개 이상, 보다 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 더 바람직하게는 10 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific) 이다.

대립형질 특이적(allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 폐암 생존 예후의 예측용 마커인, GNB2L1 유전자의 프로모터 내 GNB2L1 rs3756585T>G 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 폐암 생존 예후를 예측하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 폐암 생존 예후의 예측용 키트에는 GNB2L1 rs3756585T>G의 SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 생존 예후 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

자세하게는, a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; b) 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하거나 프로브(probe)와 혼성화하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 폐암 환자의 핵산으로부터 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP의 유전자형이 GG인 경우 생존 예후가 나쁘다고 예측될 수 있다.

바람직하게, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

또한, 상기에서 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암이 발병한 환자를 의미한다. 바람직하게, 상기 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암을 수술로 절제한 환자를 포함한다.

폐암 환자의 핵산은 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다. 상기 폐암 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명의 SNP 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan- PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

연구 대상의 선정

본 실험에서는 암과 관련된 유전자의 다형성과 비소세포암 수술 후 예후와의 관계를 다기관 임상코호트를 통해 평가하였다. 경북대학교 병원에서 334례, 서울대 병원 307 례, 그리고 서울대분당병원에서 173 례를 합하여 전체 814명의 환자를 대상으로 하였다. 상기 환자들은 모두 한국인으로, 수술 전에 화학요법 또는 방사선요법을 받은 환자는 제외하였다. 폐암 환자의 조직학적 유형은 세계보건기구 분류에 따라 분류하였으며, 환자들은 369명(45.3%)의 편평상피암(squamous cell carcinomas, SQs) 환자, 414명(50.9%)의 선암(adenocarcinomas, ACs) 환자 및 31명(3.8%)의 대세포암(large cell carcinomas)으로 구성되었다. 종양의 병리학적 병기는 폐암 병기에 대한 국제 시스템(International System for Staging Lung Cancer)에 따라 결정하였으며, 환자들은 489명(60.1%)의 병기 제I기, 325명(39.9%)의 병기 제II기 및 제IIIA기(마이크로-침윤 N2)로 구성되었다. 수술 전 모든 환자들로부터 서면 동의서를 받았으며, 경북대학교 병원 및 서울대학교 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았다.

< 실시예 2>

연구 대상의 선정 다형성 선택과 유전형

암과 관련된 경로에 관여하는 유전자들을 SABiobioscience(http:// sabiobiosciences.com) 및 DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)을 통해 1,794 후보유전자들을 선정하였다. 선정한 후보 유전자들은 세포사멸 96개, 신생혈관생성 86개, 발암물질대사 38개, 유전체 안정성에 관여하는 유전자 34개, DNA손상신호와 회복에 관여하는 유전자 74개, 세포주기 관련유전자 65개, 성장인자 신호경로에 관여하는 유전자 69개 그리고 종양전이에 관여하는 유전자 42개 등을 포함하고 있는 것으로 조사되었다.

데이터베이스를 통해 선정한 1,794개의 후보유전자들의 분류

Pathway	후보유전자	Pathway	후보유전자
Apoptosis	96	Carcinogen metabolism	38
Angiogenesis	86	p53 signaling pathway	38
Cancer pathway	42	Signal transduction pathway	67
Cell cycle	65	Stem cell	142
DNA damage signaling and repair	74	Tumor metastasis	42
Drug Xeno genes	73	Wnt signal genes	13
Estrogen receptor signaling	77	XME genes	263
Genome stability	34	Cancer related gene	575
Growth factor	69

이렇게 선정한 유전자에서 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ SNP) 를 이용하여 유전자기능에 영향을 줄 것으로 생각되는 프로모터 부위(~1.0kb), 엑손을 포함하여 엑손 주위 20 bp 내외 부위 그리고 5’비 번역부위 및 3’비 번역부위에 존재하는 잠재적 기능성을 가지는 다형성들을 선정하였다. 그리고 엑손 부위에 존재하는 다형성들 가운데 아미노산 변화가 있는 다형성만을 선정하였다.

위의 기준으로 선정한 다형성들을 HapMap의 일본인 유전자형 데이터(JPT)에서 소수 대립유전자의 빈도(MAF)가 5% 이상인 다형성만 선별하여 전체 4,226개의 다형성을 선정하였다. 이들 가운데 플랫폼에 제작된 1,980개의 다형성들을 유전자칩(GeneChip)을 이용하여 다형성을 분석하였으며, 그 결과 6개의 다형성을 발굴하였다.

본 발명자들은 이후, 유전자칩(genechip)을 이용하여 발굴한 6개의 다형성과 폐암 위험도와 연관 있는 11개의 다형성을 폐암 수술 후 환자 814명을 대상으로 로지스틱회귀분석을 통해 예후와의 연관성을 조사하였다. 총 17개의 다형성에서 전체생존(Overall Survival, OS) 및 무병생존(Disease-free Survival, DFS)에 대한 통계적으로 유의하게 의미 있는 8개의 다형성을 로그-순위 검정법을(log-rank test)통해 선택(발굴)하였으며, 이를 하기 표 2에 나타내었다.

최종 선별된 8개의 다형성

유전자	다형성
ASE-1	rs967591
TNFRSF10B	rs1047266
AKT1	rs3803300
C3	rs2287845
HOMER2	rs1256428
GNB2L1	rs3756585
FANCD2	rs7647987
ADAMTSL3	rs11259927

< 실시예 3>

통계학적 분석

유전자형 및 병기 전체에 걸쳐 카테고리별 변수에 대한 χ2 테스트를 사용하여 인구통계학 및 임상학적 정보를 비교하였다. 적합도 검정(goodness-of-fit) χ2 테스트를 사용하여 1 자유도(one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 테스트하였다. 전체생존(Overall Survival, OS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막 추적 조사 날까지로 추정하였다. 무병생존(Disease-free Survival, DFS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지로 계산하였다. 생존 분석은 카프란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 계산하였다. 전체 다른 유전자형에서 전체생존 또는 무병생존의 차이를 로그-순위 검정법(log-rank test)을 사용하여 비교하였다. 위험비(Hazard ratio, HR) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 다변량 콕스의 비례위험모형(multivariate Cox proportional hazards models)을 사용하여 계산하였고, 이를 연령(≤64세 대 >64세), 성별(남자 대 여자), 흡연 상태(비흡연자 대 흡연경험자), 및 병리학적 병기(제I기 대 제II IIIA기)로 보정하였다. 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 통계 분석 시스템 9.2 버전(Statistical Analysis System for Windows, version 9.2)[SAS Institute, 미국])을 사용하여 수행하였다.

< 실시예 4>

환자의 특성 및 임상 예견

환자들의 임상학적 특징 및 병리학적 특징 및 그들의 전체 생존(OS) 및 무병생존(DFS)과의 연관을 조사하였다.

그 결과 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 단일변량 분석에 의해 병리학적 병기가 두 코호트에서 전체생존(OS) 및 무병생존(DFS)과 유의적으로 연관되어 있다는 것을 알 수 있었고, (각각 log-rank P [PL-R] for OS = 1×10^-3 and 4×10^-5; and PL-R for DFS = 2×10^-6 and 1×10^-9) 나이는 validation cohort에서 전체생존(OS) 및 무병생존(DFS)과 유의적으로 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다(PL-R for OS = 3ⅹ10^-3 and PL-R for DFS = 0.03). 그리고 성별과 흡연상태는 validation cohort에서 전체생존(OS)과 유의적으로 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다(PL-R for OS = 0.02 and 0.01).

임상병리학적 특성에 의한 전체생존 및 무병생존에 대한 단변량 분석

		전체 생존(Overall survival)			무병생존(Disease-free survival)
변수	환자군 (No.)	사망 수 (%)^*	5Y- OSR (%) ^≠	로그-순위 P	발생 수 (%)^*	5Y- DFSR (%) ^≠	로그-순위 P
전체	814	245(30.1)	64		402(49.4)	46
연령(years)
= 64	433	109(25.2)	71	2.8×10^-5	203(46.9)	50	0.01
> 64	381	136(35.7)	55		199(52.2)	40
성별
남성	598	196(32.8)	61	0.005	299(50.0)	46	0.61
여성	216	49(22.7)	72		103(47.7)	46
흡연상태
비흡연	252	66(26.2)	69	0.04	131(52.0)	42	0.63
흡연경험	562	179(31.9)	62		271(33.3)	48
Pack-years^＃
< 40	260	78(30.0)	64	0.17	122(46.9)	48	0.35
= 40	302	101(33.4)	60		149(49.3)	48
조직학적 유형
편평상피암	369	109(29.5)	64	0.16	162(43.9)	52	0.04
선암종	414	122(29.5)	64		221(53.4)	41
대세포암	31	14(45.2)	54		19(61.3)	44
병리학적 병기
제I기	489	115(23.5)	70	6.8x10^-7	196(40.1)	53	4.4x10^-12
제II-IIIA기	325	130(40.0)	55		206(63.4)	34

약어: OSR, overall survival rate; DFSR, disease-free survival rate

^* Row percentage.

^≠ Five-year OSR and five-year DFSR, proportion of survival derived from Kaplan-Meier analysis.

^＃ In ever-smokers.

< 실시예 5>

GNB2L1 유전자의 rs3756585 다형성에 따른 전체생존 및 무병생존에 대한 연관성 분석

GNB2L1은 G 단백질의 β subunit을 포함한 단백질로 활성화된 PKC isoform βII와 결합하여 세포성장과 관련된 신호를 전달하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 GNB2L1 유전자에 존재하는 SNP가 발암 위험성과도 관련이 있는지, 특히 GNB2L1 유전자의 rs3756585T>G 다형성에 따른 전체생존 및 무병생존에 대한 연관성을 자세히 살펴보았다.

조사된 다형성에 관한 기술적 정보를 하기 표 4에 나타내었으며, 다형성의 유전자형에 따라 전체생존 및 무병생존에 대한 연관성을 분석한 결과 하기 표 5 및 도 1에서 나타낸 바와 같이, GNB2L1 유전자에 존재하는 rs3756585 다형성의 경우 GG유전자형을 가진 환자군이 TT유전자형을 갖는 환자군에 비해서 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(전체생존 위험비=1.68, P=0.02).

GNB2L1 rs3756585T>G 다형성에 대한 유전자형 빈도 및 로그-순위 P값

다형성		유전자형		전체생존에 대한 로그-순위 P			무병생존에 대한 로그-순위 P
ID No.	염기변화	MAF	HWE P	대조군	우성	열성	대조군	우성	열성
rs3756585	T/G	0.31	0.20	0.020	0.010	0.075	0.139	0.088	0.144

약어: MAF, minor allele frequency; HWE P, P for Hardy-Weinberg equilibrium test

유전자형에 따른 전체생존 및 무병생존

다형성 /ID No^a	유전자형^a	전체 생존(Overall survival)		무병생존(Disease-free survival)
다형성 /ID No^a	유전자형^a	HR (95%CI)^b	P^b	HR (95%CI)^b	P^b
GNB2L1-123T>G
rs3756585	TT	1.00	-	1.00	-
	TG	1.35 (1.03-1.77)	0.03	1.16 (0.94-1.42)	0.174
	GG	1.68 (1.09-2.57)	0.02	1.37 (0.97-1.93)	0.073
	공동우성	1.31 (1.08-1.59)	0.005	1.16 (1.00-1.36)	0.049

^a NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)로부터 다형성 및 ID에 대한 정보를 얻음

참조 서열에서 전사개시부위는 +1로서 계산됨

^b 위험비(HRs), 95% 신뢰구간(CIs) 및 상응하는 P-값을 다변량 콕스의 비례위험 모델로 계산하였으며, 연령, 성별, 흡연상태 및 병리학적 병기로 보정됨

< 실시예 6>

GNB2L1 유전자의 rs3756585 다형성을 이용한 폐암 예후 위험지수 설정

본 발명자들은 상기와 같은 실험결과들을 토대로, GNB2L1 유전자의 rs3756585 다형성을 이용하여 폐암 예후 위험도 지수를 설정하였다.

rs3756585 다형성은 공동우성 모델을 이용하여 예후 평가를 위한 위험지수를 설정하였는데, rs3756585 유전자형이 TT형인 경우에는 1점의 위험지수를 주었으며, rs3756585 TG형은 2점의 위험지수를 설정했고, 폐암환자의 낮은 생존율과 유의한 연관이 있는 rs3756585 GG형은 3점의 위험지수를 설정하였다.

GNB2L1 rs3756585T>G 다형성의 유전자형(genotype)에 따른 위험도 지수

유전자	다형성	위험도 지수
유전자	다형성	1점	2점	3점
GNB2L1	rs3756585	TT	TG	GG

< 실시예 7>

GNB2L1 유전자 rs3756585 다형성의 기능 분석

GNB2L1은 G 단백질의 β subunit을 포함한 단백질로 활성화된 PKC isoform βII의 결합하여, 세포성장에 신호 전달함으로써, 이는 암을 진행시키는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 발암 위험성과 관련이 있다고 보고된 상기 GNB2L1 rs3756585T>G 다형성의 기능을 분석하기 위하여 루시퍼라아제(luciferase) 프로모터 에세이 및 전기 이동성 교대 분석 실험을 실시하였다.

<7-1> Promoter - luciferase constructs 제작

먼저, GNB2L1 유전자 전사조절부위에서 rs1279736C>A 와 rs3756585T>G 의 유전적 변이가 유전자발현에 영향을 미치는지를 분석하기 위하여 상기 다형성을 포함하는 전사조절부위를 루시퍼라아제 유전자를 가지고 있는 pGL3-basic 플라스미드에 클로닝하였다. 우선 앞 프라이머 말단에 KpnI 제한 효소의 절단부위를 포함할 수 있도록 프라이머(5’GGGGTACCAATTAAGCTC CCCTGGGGTTG-3’) 와 HindIII 제한 효소의 절단부위를 포함할 수 있도록 뒤쪽 프라이머(5’-CCCAAGCTTCCGCCTTGCAGTGAAAGAGA-3’)를 제작한 다음, 유전자 전사조절부위인 378∼21 부위를 PCR을 이용하여 증폭시켰다. 클로닝한 염기서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

<7-2> 세포배양, 형질주입 및 루시퍼라아제 에세이

HEK293T(인체배아신장세포)세포에 상기 실시예<7-1>을 통해 준비한 promoter luciferase construct를 도입시킨 후 형광의 활성도를 측정함으로써 rs1279736C>A 와 rs3756585T>G 유전자 변이의 유전형에 따른 유전자 발현정도를 비교하였다. 자세하게는, HEK293T(인체배아신장세포)세포를 6웰 플레이트에 각 웰(well) 당 1×10⁵개의 농도로 분주한 다음 세포에 DMEM 배지로 대략 60%정도로 confluent 상태까지 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예<7-1>을 통해 준비한 promoter luciferase construct(GNB2L1 전사조절부위를 클로닝한 pGL3-basic 플라스미드)를 이펙틴(Effectene)을 사용하여 형질주입하였다. 이후, 유전자 발현정도는 Dual-Luciferase Reporter Assay System을 이용 전사활성 측정을 통해 이루어졌다. 이때 대조군으로는 pRL-SV40를 co-transfected 하여, Lumat LB953 luminometer로 luciferase Renilla luciferase 의 활성을 측정하였다. 각 투여군에 3개의 웰(well)을 배정하였고 각 실험은 3회 반복 실험하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, rs1279736C-rs3756585T 일배체형에 비해 rs1279736A-rs3756585G 일배체형의 프로모터 활성도가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<7-3> 전기 이동성 교대 분석 실험( Electrophoretic Mobility Shift Assay , EMSA )

상기 실시예<7-2>를 통해 GNB2L1 유전자 rs3756585T에서 G로 변화에 따라 프로모터 활성도가 유의하게 증가된 것을 확인하였는바, 본 실험에서는 GNB2L1 유전자의 프로모터 지역에 존재하는 rs3756585T>G 단일염기다형성이 전사인자의 결합을 조절하여 GNB2L1 유전자 발현에 영향을 주는지 여부를 살펴보기 위하여 비소세포폐암 세포주인 H1299로부터 세포 핵 추출물을 획득한 후 DNA-단백질 결합 분석을 전기 이동성 교대 분석 실험을 실시하였다.

자세하게는, H1299세포에서 핵 추출하여, LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL, USA)로 본 발명의 다형성(GNB2L1 rs3756585T>G)에 따른 전사인자의 결합능력의 차이를 보기위해 EMSA로 확인하였다. 이를 위해 본 발명의 다형성(GNB2L1 rs3756585T>G)에 특이적인 프로브(rs3756585T: 5’-CTGTGATGCC T TGCAATTTCCC-3’, rs3756585G: 5’-CTGTGATGCC G TGCAATTTCC-3’)를 각각 합성한 다음, 상기 프로브의 5’ 끝부분에 방사선 표지(biotin)를 붙인 후, 10ug의 핵 추출물과 상온에서 20분간 반응시켰다. 저해 실험은 방사선 표지가 되지 않은 DNA 탐침(프로브)의 농도를 5× 와 50×로 사용하여 수행하였다. 제조된 반응액은 native 6% 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하고 0.5×TBE 버퍼에서 전기영동 시킨 후 positively charged nylon membrane에 이동시켜, UV cross-linked 하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, rs3756585G 탐침이 rs3756585T 탐침보다 더욱 강하게 핵(nuclear) 단백질과 결합함을 보여주었다. 또한, 3번, 4번 레인에서 볼 수 있는 바와 같이, 방사능 표지된 rs3756585T 프로브 상의 DNA-단백질 복합체의 형성이 방사능 표지되지 않은 rs3756585T 프로브와의 경쟁으로 특이적으로 저해된 사실(방사선 표지되지 않은 프로브의 처리 농도에 의존적으로 경쟁적 저해)을 근거로, 상기 결합이 특이적 결합이라는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해, rs3756585의 T에서 G로의 변화는 GNB2L1 프로모터에 전사인자를 결합을 증가시킴으로써, GNB2L1 유전자 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

GNB2L1: guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> GNB2L1 gene polymorphisms marker for predicting survival in patients with lung cancer and method for predicting survival using the same <130> PN1308-260 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> DNA <213> GNB2L1 SNP containing polynucleotide <400> 1 gggaagcagc ccggcggtcc tcatgggaat gtgccgtaca cttcacctct ttcgcttctc 60 gctctacatc atccctgaga agccttttta aacacttgaa tgtgcttgtt tcagagtgta 120 tttgtaaagt gcagtcagat tttgttgtac ggaagacggg actgtgatgc cttgcaattt 180 ccctctgcct tttgcattac atggcgccgc catcttgagc agaaatgtat catggggctc 240 gccattttgc atggtcgagc gggtatttcc ggttccggcg gggggctttt ctctctctct 300 ttcactgcaa ggcggcggca ggagaggttg tggtgctagt ttctctaagc catccagtgc 360 catcctcgtc gctgcagcga cacacgctct cgccgccgcc atgactgagc agatgaccct 420 tcgtggcacc ctcaagggcc acaacggctg ggtaacccag atcgctacta ccccgcagtt 480 cccggacatg atcctctccg cctctcgagg tacggactaa ggtagatttc aggacccgag 540 540 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNB2L1 rs3756585T specific probe <400> 2 ctgtgatgcc ttgcaatttc cc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNB2L1 rs3756585G specific probe <400> 3 ctgtgatgcc gtgcaatttc c 21

Claims

서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)가 T 또는 G이고, 상기 172번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커.
제1항에 있어서,
상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커.
서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 프로브는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이.
검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 172번째 염기(GNB2L1 유전자의 전사시작부위를 기준으로 -123번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 SNP의 유전자형이 GG인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정하는 것을 특징으로 하는 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 것을 특징으로 하는 방법.