KR101957028B1 - Bub3, aurkb, pttg1 및 rad21의 다형성을 이용한 비소세포폐암의 예후 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)의 예후 예측을 위한 BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자 단일염기 다형성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 BUB3 유전자는 rs7897156의 SNP를 이용하고, AURKB 유전자는 rs1059476의 SNP를 이용하며, PTTG1 유전자는 rs1895320의 SNP를 이용하고, RAD21 유전자는 rs1374297의 SNP를 이용하여 초기 단계 비소세포폐암의 생존 결과에 영향을 미치는 예후를 진단 및 예측할 수 있는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비소세포폐암 생존 예후의 예측 기술은 비소세포폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 비소세포폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Description

BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21의 다형성을 이용한 비소세포폐암의 예후 진단 방법{DIAGNOSTIC METHODS FOR PROGNOSIS OF NON-SMALL-CELL LUNG CANCER USING BUB3, AURKB, PTTG1 AND RAD21 SNPs}

본 발명은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)의 예후 예측을 위한 BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자 단일염기 다형성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 BUB3 유전자는 rs7897156의 SNP를 이용하고, AURKB 유전자는 rs1059476의 SNP를 이용하며, PTTG1 유전자는 rs1895320의 SNP를 이용하고, RAD21 유전자는 rs1374297의 SNP를 이용하여 초기 단계 비소세포폐암의 생존 결과에 영향을 미치는 예후를 진단 및 예측할 수 있는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 폐암은 매년 1,600,000명에 이르는 새로운 환자가 발생하고, 이 중 1,400,000명이 사망한다. 이는 전체 암 발생의 13%를 차지하고, 암 관련 사망의 18%를 차지하는 수치이다. 2010년에는 폐암으로 인한 사망이 1,500,000건으로 증가하여, 전체 암 관련 사망의 19%를 차지했다.

조직학적으로는 80% 정도가 비소세포폐암(non-small-cell lung cancer)이고, 이 중 32-40%는 기관지 폐포암(bronchoalveolar carcinoma, BAC)을 포함한 선암(adenocarcinoma), 25-30%는 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 그리고 8-16%는 대세포암(large cell carcinoma)이 차지한다. 전체 비소세포폐암의 65% 이상은 진단 당시부터 완전 절제가 불가능한 상태로 발견된다

NSCLC의 진단은 생검 샘플과 같은 의심된 조직의 병리학자의 조사에 의해 수행된다. NSCLC 진단 후, 환자의 질환은 환자의 전체 건강 상태 및 연령, 기침 및 호흡 곤란과 같은 증상의 중증도, 특정 유형의 NSCLC 및 암의 진행 단계(staging)를 사용한 예후 (회복 기회)로 할당된다. 진행 단계는 종양의 크기 및 종양이 단지 폐에만 존재하는지 또는 신체의 다른 곳으로 확산되었는지를 고려한다. NSCLC 환자에 대한 특정 치료 옵션은 상기 고려사항을 기준으로 선택하고, 암 진행 단계는 치료 선택을 위해 중요한 요소이다. 조기 NSCLC를 갖는 환자들은 잠재적으로 종양을 제거하기 위한 수술 절제에 의해 치유될 수 있지만, 현재 진단 양상으로는 어느 환자가 수술 후 재발할 것인지를 예측할 수 없다.

또한, 암은 흔히 국소적으로 재발하거나 본래의 암 조직으로부터 원거리의 조직 및 기관으로 전이하기 때문에, 조기 암을 갖는 환자 중 어느 환자가 이들의 원발성 종양의 수술적 제거 후 약물 치료를 받을 필요가 있는지를 밝히는 것은 중요하다. 이것은 특히 조기 NSCLC를 갖는 환자들에서 중요한 문제이다.

폐암의 이상적인 치료법은 조기 발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단 시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 또한, 폐암 발병 후의 경우, 특히 비소세포암은 외과적 수술을 할 수 있을 만큼 진행되지 않은 경우라면 우선 수술을 시행하는데, 근치절제술을 시행할 수 있는 경우는 30%에 불과하다. 수술 후 완치 여부를 판정하는 5년 생존율은 암의 진행 정도에 따라 다르나, 근치절제술을 시행한 전체 환자를 대상으로 보면 편평상피암 37%, 선암 27%, 대세포암 27% 정도가 완치되었다. 이들 환자의 대다수는 수술 절제 후에 보다 공격적인 질환으로 재발하여 사망한다. 현재 임상적 진단 방법으로는 재발할 가능성이 높은 환자에 대해 보다 공격적인 치료요법을 지시하기에 충분한 정확도로 조기 NSCLC 예후를 확인할 수 없다.

따라서, 화학치료요법을 받아야만 하거나 일반적으로 재평가된 치료 소견을 가져야만 하는 높은 위험성의 조기 NSCLC 환자를 확인할 필요가 있고, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있도록 NSCLC의 예후를 판단할 수 있으면 생존율을 현저히 높일 수 있다.

이에 본 발명자들은 유사 분열 체크포인트 관련 유전자의 단일 염기 다형성 (SNPs)과 외과적 절제술을 받은 비소세포폐암환자의 예후와의 관련성을 확인하기 위하여 근치적 절제술을 받은 766명의 환자를 대상으로 유전자형을 분석하여, 생존결과와 연관이 있는 유전적 다형성을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0009609호 한국등록특허 제10-0894322호 한국등록특허 제10-1307660호 한국등록특허 제10-1219794호

따라서 본 발명의 목적은 BUB3 (budding uninhibited by benzimidazole 3), AURKB (Aurora kinase B), PTTG1 (Pituitary tumor-transforming 1) 및/또는 RAD21 (RAD21 cohesin complex component) 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BUB3 (budding uninhibited by benzimidazole 3), AURKB (Aurora kinase B), PTTG1 (Pituitary tumor-transforming 1) 및/또는 RAD21 (RAD21 cohesin complex component) 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BUB3 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 rs7897156 C>T 다형성이고, AURKB 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 rs1059476G>A 다형성이며, PTTG1 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 중 rs1895320 T>C 다형성이고, RAD21 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 4로 표시되는 염기서열 중 rs1374297 C>G 다형성일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BUB3 유전자의 rs7897156 C>T 다형성, AURKB 유전자의 rs1059476G>A 다형성, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C 다형성 및 RAD21 유전자의 rs1374297 C>G 다형성은, 각각 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열 중 501번째 염기에 해당하는 부위일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BUB3 rs7897156 C>T 및 AURKB rs1059476G>A는 전체생존율(OS)과 관계가 있고, PTTG1 rs1895320 T>C 및 RAD21 rs1374297 C>G는 무병생존율(DFS)과 관계가 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비소세포폐암은 수술로 절제된 경우일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

나아가 본 발명은 비소세포폐암 환자에서 추출한 핵산으로부터, BUB3 유전자의 rs7897156 C>T 다형성, AURKB 유전자의 rs1059476G>A 다형성, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C 다형성 및/또는 RAD21 유전자의 rs1374297 C>G 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BUB3 유전자의 rs7897156 다형성의 유전자형이 TT인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 AURKB 유전자의 rs1059476 다형성의 유전자형이 AA인 경우 생존 예후가 높은 군으로 판단할 수 있다.

본 발명에 따른 비소세포폐암 생존 예후의 예측 기술은 비소세포폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 비소세포폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

도 1A는 BUB3 rs7897156C> T에 따른 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(Disease-free survival; DFS) 결과이다.
도 1B는 AURKB rs1059476G>A에 따른 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(Disease-free survival; DFS) 결과이다.
도 1C는 PTTG1 rs1895320T>C에 따른 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(Disease-free survival; DFS) 결과이다.
도 1D는 RAD21 rs1374297C>G에 따른 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(Disease-free survival; DFS) 결과이다.
도 2A는 루시퍼라제 리포터 분석에 의한 BUB3 rs7897156C> T의 기능을 분석한 결과이다.
도 2B는 종양 및 비 악성 폐 조직에서 BUB3의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2C는 비 악성 폐 조직에서 rs7897156C> T 유전자형에 의한 BUB3 mRNA 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 3A는 오로라키나아제 (PDB ID : 4AF3) 야생형 (T298) 및 변형형 (M298)의 구조 모델을 나타낸 것이다. 여기서, 키나아제 도메인 (노란색)과 기질 선택 영역 (녹색)은 키나제 억제제 VX680 (마젠타)과 함께 표시되며, 단일 뉴클레오티드 다형성 잔기는 적색으로 강조 표시하였다.
도 3B는 야생형과 변형형의 표면 정전 전위를 DelPhi 계산을 사용하여 계산하였으며, 모든 수치는 Pymol을 사용하여 구조화하였다.
도 3C는 293T 세포로 형질 감염된 인산화된 AKT (p-AKT), 총 AKT, 인산화된 mTOR (p-mTOR) 및 총 mTOR에 대한 DDK Western의 Western blot으로 AURKB 야생형 (T298)과 변형 형 (M298) β-actin은 내부 통제로 사용되었다.
AURKB 변이형 (M²⁹⁸)의 기능적 중요성을 평가하기 위해, DDK로 표지된 야생형 (T²⁹⁸)과 변형형 (M²⁹⁸)을 293T 세포에 형질 감염시킨 후 웨스턴블롯한 결과이다.
도 4A는 NCBI Reference Sequence: NG_033794.1 서열 중 4737번- 5737번 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이며, 이 중 501번째 염기가 BUB3 rs7897156 C>T 부위이다.
도 4B는 NCBI Reference Sequence: NT_010718.17 서열 중 7715526번- 7716526번 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이며, 이 중 501번째 염기가 AURKB rs1059476 G>A 부위이다.
도 4C는 NCBI Reference Sequence: NT_023133.14 서열 중 4660755번- 4661755번 서열(서열번호 3)을 나타낸 것이며, 이 중 501번째 염기가 PTTG1 rs1895320 T>C 부위이다.
도 4D는 NCBI Reference Sequence: NG_032862.1 서열 중 6910번- 7910번 서열(서열번호 4)을 나타낸 것이며, 이 중 501번째 염기가 RAD21 rs1374297 C>G 부위이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"예후"는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암의 발병 위험성 및 발병 후의 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암을 수술로 절제한 환자, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자의 예후를 의미한다.

"예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다.

본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.

"유전적 다형성(genetic polymorphism)"은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.

"다형성"이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다.

"단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG,AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

"유전자형(genotype)"이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.

"대립 인자" 또는 '대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다.

"대립유전자 빈도"는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 특히 췌장의 고형 가유두상 종양 진단에 유용하다. 본 발명에서는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 재발(Recurrence) 진행(progression), 전이(metastasis)를 예측하는 것을 포함한다. 이에, 비소세포폐암의 재발 및 진행을 정확히 예측할 수 있는 지표가 매우 중요하며 조직의 분화도와 병기와 같은 임상적 지표를 보완하면서 치료의 반응을 예측할 수 있는 인자가 필요한데, 본 발명의 BUB3(budding uninhibited by benzimidazole 3), AURKB(Aurora kinase B), PTTG1(Pituitary tumor-transforming 1) 및 RAD21(RAD21 cohesin complex component) SNP가 이러한 지표 기능을 하므로 비소세포폐암 진단 인자로 이용할 수 있다. 즉, 이러한 유전자들의 다형성 특성 측정은 비소세포폐암의 분화도 및 병기, 진행을 예측하는데 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

"진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 비소세포폐암을 가진 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 비소세포폐암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

"폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미한다. 상기 폐암을 수술로 절제한 환자는 바람직하게는 비소세포암, 편평상피암, 선암, 대세포암 등의 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미하며, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자를 의미한다.

"위험"은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 진단하고자 하는 질병은 폐암과 관련된 질병이다.

상기 폐암은 바람직하게는 비소세포폐암(NSCLC)일 수 있으며, 상기 비소세포폐암은 편평상피암, 선암, 대세포암, 또는 선편평상피암을 포함한다. 더욱 바람직하게는 편평상피암일 수 있다.

환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암이 발병한 환자를 의미한다. 바람직하게, 상기 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암을 수술로 절제한 환자를 포함한다.

비소세포폐암은 전체 폐암의 75% 이상을 차지하며 평균 5년 생존율이 15% 에 해당한다. 비소세포폐암의 높은 사망률은 일부 절제 불가능한 종양을 가진 환자의 높은 비율과 관련되어 있다 (Parkin DM, et al., Global cancer statistics, 2002; CA Cancer J Clin 55:74-108, 2005). 또한 절제 가능한 병기의 비소세포폐암 환자 중에서 좋은 예후를 가질지라도, 외과적으로 절제한 환자의 상당수가 암의 재발로 사망하고 있음이 보고되고 있다 (Arriagada R, et al., N Engl J Med 350:351-60, 2004). 따라서 비소세포폐암 환자들에 대한 예후 인자를 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화 할 수 있어 비소세포폐암 환자의 맞춤 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다. 이에 비소세포폐암 환자의 예후 예측에 관한 집중적인 연구가국내외적으로 현재 실시되고 있으나, 아직까지 뚜렷한 연구 결과가 없는 실정이다.

본 발명은 BUB3(budding uninhibited by benzimidazole 3), AURKB(Aurora kinase B), PTTG1(Pituitary tumor-transforming 1) 및 RAD21(RAD21 cohesin complex component) 유전자의 다형성을 이용한, 비소세포폐암(NSCLC) 예후 진단 및 예측 마커로서의 용도에 관한 것으로, BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자의 특정 SNP가 비소세포폐암의 초기 단계에서의 나쁜 예후와 관련되어 있음을 처음으로 규명하였다. 상기 예후는 비소세포폐암의 진행(progression), 재발(Recurrence) 및 전이(metastasis)를 포함한다.

[BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 예후 마커]

그러므로, 본 발명은 일 관점에서 BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자의 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 예후의 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.

구체적으로, BUB3 유전자의 단일염기다형성(SNP) rs7897156 C>T, AURKB 유전자의 단일염기다형성(SNP) rs1059476G>A, PTTG1 유전자의 단일염기다형성(SNP) rs1895320 T>C 및 RAD21 유전자의 단일염기다형성(SNP) rs1374297 C>G의 비소세포폐암 예후 진단 및 예측 용도 및 이의 이용에 관한 것이다.

상기 BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 단백질은 공지된 것, 예를 들면 공지된 인간 유래의 서열을 공지된 DB로부터 수득할 수 있는데, 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 비소세포폐암 예후 진단 마커는, 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 변화하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명자들은 비소세포폐암 근치적 절제술을 받은 환자를 대상으로, BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자의 다형성을 조사하여, 유전형과 전체 생존 (overall survival, OS) 및 무병 생존 (disease-free survival, DFS)과의 관계를 분석하였다.

상기 전체 생존(OS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막으로 추적 조사한 날까지를 말하며, 상기 무병생존(DFS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지를 말한다. 분석 결과, 비소세포암 환자에서 BUB3 유전자는 rs7897156 C>T, AURKB 유전자는 rs1059476G>A 다형성이 전체 생존과 유의적으로 관련성이 있음을 알 수 있었다.

또한, PTTG1 유전자는 rs1895320 T>C, RAD21 유전자는 rs1374297 C>G 다형성이 무병 생존과 유의적으로 관련성이 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 BUB3 유전자의 rs7897156 C>T SNP, AURKB 유전자의 rs1059476G>A SNP, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C SNP 및 RAD21 유전자의 rs1374297 C>G SNP는 외과적 절제술을 받은 비소세포폐암 환자에 대하여 독립적인 예후 마커로 볼 수 있으므로. 이에 대한 분석은 나쁜 질병 비소세포폐암 예후에 대한 고위험을 가진 환자 그룹을 판별하는데 도움을 주어, 비소세포폐암의 치료적 결정에 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 일 구체예로서, BUB3, AURKB, PTTG1 및 RAD21 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 rs7897156 C>T SNP, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 rs1059476G>A SNP, 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 rs1895320 T>C SNP 및 서열번호 4로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 rs1374297 C>G SNP를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 20개 이상, 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 50개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

본 발명은 BUB3 rs7897156 C>T, AURKB rs1059476G>A, PTTG1 rs1895320 T>C 및 RAD21 rs1374297 C>G에 대한 유전적 접근까지 확장한다.

[수행 방법]

본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism),PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 생존 예후 예측(진단)용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 포함되는, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs7897156 C>T SNP, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs1059476G>A SNP, 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs1895320 T>C SNP 및 서열번호 4로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs1374297 C>G SNP를 포함하는 20~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 SNP들을 포함하는 20~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific) 이다.

대립형질 특이적 (allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지될 수 있으며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르,포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 다른 구체예로서 상기 조성물을 포함하는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 마이크로어레이(Microarray) 방법은 종양 내의 수천 또는 심지어 수만 개의 유전자의 RNA 발현을 동시에 연구할 수 있어, 인간 질병의 분자적 기초에 대한 포괄적 통찰력을 보다 효과적으로 얻을 수 있게 해준다. 또한, 이를 이용하여 종양 분류에서의 유전자 발현 패턴, 임상학적 결과 및 화학적 치료요법에 대한 반응의 평가가 가능하다.

유사한 관점에서 본 발명은 또 하나의 예로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 폐암 생존 예후의 예측용 마커인, BUB3 rs7897156 C>T 다형성 부위(SNP), AURKB rs1059476G>A 다형성 부위(SNP), PTTG1 rs1895320 T>C 다형성 부위(SNP) 및 RAD21 rs1374297 C>G 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 폐암 생존 예후를 예측하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 폐암 생존 예후의 예측용 키트에는 상기 SNP들을 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

[진단 및 정보제공 방법]

한편, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 발견에 기초하여 BUB3 유전자의 rs7897156 C>T SNP, AURKB 유전자의 rs1059476G>A SNP, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C SNP 및 RAD21 유전자의 rs1374297 C>G SNP 발현수준 변이, 바람직하게는 프레임 시프트 변이를 측정하는 것을 포함하는, 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 예후 진단 및 예측 방법 또는 이를 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기 방법은 또한, 폐암 수술 후 재발 또는 전이 방지를 위한 항암제 등을 탑재한 생분해성 고분자 패치 등의 개발에도 유용한 정보를 제공한다.

일 구체예로서, 본 발명의 방법은

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BUB3 유전자의 rs7897156 C>T SNP, AURKB 유전자의 rs1059476G>A SNP, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C SNP 및 RAD21 유전자의 rs1374297 C>G SNP 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 SNP들의 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현과 비교하는 단계를 포함하는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

이 때, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 BUB3 rs7897156 C>T 다형성의 경우 TT 유전형을 갖는 환자군의 전체생존 및 무병생존의 위험비가 다른 유전자형보다 매우 높은 것으로 판별하는 것을 특징으로 한다.

또한, AURKB rs1059476G>A 다형성의 경우 AA 유전형을 갖는 환자군의 전체생존 및 무병생존의 위험비가 다른 유전자형보다 매우 낮은 것으로 판별하는 것을 특징으로 한다.

상기 진단방법은, 특히 비소세포폐암에 따른 특정 마커의 발현 특징을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 비소세포폐암 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.

폐암 환자의 핵산은 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.

상기 폐암 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명은, 또한, 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 수술 후 재발 또는 전이 방지를 위해 필요한 항암제 투여량 및 투여방법 결정을 위한 정보도 제공할 수 있다.

즉, 본 발명은 비소세포폐암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BUB3 유전자의 rs7897156 C>T 다형성, AURKB 유전자의 rs1059476G>A 다형성, PTTG1 유전자의 rs1895320 T>C 다형성 및 RAD21 rs1374297 C>G 다형성을 확인하여 예후가 나쁜 경우와 그렇지 않은 경우에 따라 폐암 수술 후 투여할 항암제의 종류, 양 및 농도 등 항암제 투여 방법을, 해당 폐암의 종류에 따라 적합하도록 서로 상이하게 적용할 수 있다.

이처럼, 본 발명에서는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 환자에게서 BUB3 rs7897156 C>T, AURKB rs1059476G>A, PTTG1 rs1895320 T>C 및 RAD21 rs1374297 C>G발현 프로파일을 이용하는, 폐암 예후 진단 및 예측 마커로서의 모든 용도를 포함한다.

그러므로 본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

< 실시예 1>

실험 재료 및 방법

1. 연구대상(Study populations)

경북대학교 병원(338 명)과 분당 서울대학교 병원(428 명)에서 수술적 절제를 시행한 병리학적 병기 I, II, IIIA(미세 침윤성 N2)의 비소 세포 폐암 환자 766 명을 대상으로 하였다. 서면 동의서는 수술 전 모든 환자로부터 얻었으며, 이 연구에 참여한 모든 환자는 한국인이었다. 이 연구는 경북대학교 병원 및 분당 서울대학교 병원의 기관 검토위원회의 승인을 받았다.

2. 다형성 선별 및 지노타이핑( genotyping )

발표된 리뷰 기사를 검색하여 32 개의 유사 분열 체크포인트 관련 유전자를 선택했다. HapMap 데이터베이스를 이용하여 32 개의 체크포인트 관련 유전자에서 2035 개의 SNP를 수집하였다. 2035 개의 SNP 중에서 HapMap JPT 데이터에서 대립 유전자 빈도가 <0.05인 968 개의 SNP가 제외되었다. 잠재적으로 기능적인 SNP를 확인하기 위해 SNP 정보 웹 서버 (http://snpinfo.niehs.nih.gov)의 FuncPred를 사용하여 나머지 1067 개의 SNP 중에서 116 개의 가능성 있는 기능적 SNP를 선택했다. 이 중 43 개 SNP가 HaploView (http://broad.mit.edu/mpg/haploview)에 근거한 연쇄 불균형 (r²> 0.8)으로 인해 제외되었다. MassARRAY^® iPLEX 분석법 (SEQUENOM Inc., San Diego, CA, USA)에 의해 25 개의 유사 분열 체크포인트 관련 유전자에서 총 73 개의 SNP가 유전형화되었다. 약 5 %의 샘플을 무작위로 선택하여 다른 연구자에 의한 제한 단편 길이 다형성 분석으로 다시 유전자형을 결정하였으며 그 결과는 100 % 일치했다.

3. 프로모터- 루시퍼라제 구조물(promoter- luciferase constructs) 및 루시퍼라제 분석

본 발명자들은 BUB3 rs7897156C> T가 루시퍼라제 분석에서 BUB3 유전자 프로모터의 활성을 조절하는지 여부를 조사하였다. rs7897156을 포함하는 BUB3의 프로모터 단편을 하기 프라이머를 사용하여 PCR 분석하였다: BUB3 forward, 5'-GGGGTACCCCGTAGTTTCCACGCGTCCAGC-3'; BUB3 reverse, 5'-CCGCTCGAGCGGGAAACGGGATCCCCTGCGAA-3'.

PCR 산물을 pGL3-basic plasmid 기본벡터(Promega, Madison, WI, USA)의 KpnI / XhoI 부위에 클로닝하였다. 모든 클론의 정확한 서열은 DNA 염기 서열 분석에 의해 확인되었다.

NSCLC 세포주 H1299 및 A549를 Effectene transfection reagent (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 각 보고된 구조물 및 pRL-SV40 벡터 (Promega)로 형질 감염시켰다. 세포는 형질 감염 후 48 시간에 수집 하였다. 루시퍼라제 활성은 Dual-Luciferase^® Reporter Assay System (Promega)을 사용하여 측정하였으며 결과는 Renilla 루시퍼라제의 활성을 기준으로 표준화하였다. 모든 실험은 3번 수행되었다.

4. RNA 준비 및 qRT - PCR

BUB3 mRNA 발현을 qRT-PCR로 검사하였다. 종양 및 비 악성 폐 조직 (n = 114)의 총 RNA를 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 분리하였다. Real-time PCR은 QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)가 포함된 LightCycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)을 사용하여 수행하였다. BUB3와 β-actin 유전자에 대한 real-time PCR 프라이머의 서열은 하기와 같다.

BUB3 forward, 5'-AGTGTTGGTGTGGGACTTAC-3'; BUB3 reverse, 5'-AATACTCAACTGCCACTCGG-3'; β-actin forward, 5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'; β-actin reverse, 5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3'.

각 샘플은 두 번씩 실행하였으며, Relative BUB3 mRNA 발현은 β-actin 발현 후 2^{-ΔΔ Ct} 방법을 사용하여 평가한 다음 표준화하였다.

5. Aurora kinase 의 3차원 모델 구축

코돈 298에서 트레오닌을 메티오닌으로 치환한 AURKB rs1059476G> A의 잠재적 효과를 평가하기 위해, 오로라 키나아제(PDB ID : 4AF3) SNP 변이형의 3차원 모델은 Thr298을 Met에 의한 in silico 치환으로 변경하지 않고, Pymol program (http://pymol.org)을 사용하여 수득하였다

표면 정전기 전위는 DelPhi 계산을 사용하여 계산하고 Pymol을 사용하여 표시하였다.

6. AURKB wild ( T298 ) 및 variant-type ( M298 )에 대한 발현 플라스미드의 구축

AURKB의 야생형 (T298)과 변형형 (M298)의 잠재적 효과를 조사하기 위해 야생형 및 변형형 플라스미드를 만들었다. Origene Tech (Rockville, MD, USA)의 AURKB (Myc-DDKtagged) Human cDNA ORF 클론을 야생형 (T298)으로 사용하였다.

변형형 타입(M298) 구조물은 제조자의 프로토콜에 따라 Quick-change II Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA)를 사용하여 pCMV6-AURKB- 야생형 (T298)으로부터 생성되었다. 돌연변이 유발 실험은 5'- CCC GCT TCC GTG CCC ATG GGA GCC CAG GAC CTC -3'(forward) 및 5'- GAG GTC CTG GGC TCC CAT GGG CAC GGA AGC GGG -3'(reverse) 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 두 가지 구조는 시퀀싱 분석에 의해 확인되었다.

7. 세포 배양 및 형질감염 방법

293T 세포를 10% 열-불활성화 소태아혈청을 보충한 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 배양하였다. 세포를 약 80 ~ 90 % 정도로 confluent하게 6 개의 웰 플레이트에 분주하였다. 다음날, 제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 pCMV6-AURKB-야생형(T298), pCMV6-AURKB-변형형 (M298) 또는 pCMV6 빈 벡터로 세포를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 이틀 후에 세포를 수득하였다.

8. 웨스턴블롯팅

세포 단백질은 프로테아제 억제제와 포스파타아제 억제제(Sigma, St. Louis, MO, USA)가 보충된 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 추출하였다.

anti-DDK (Origene Tech, Rockville, MD, USA), anti-actin (Santa Cruz, CA,USA), anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-mTOR, 및 anti-phospho-mTOR (Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA)을 사용하여 표준 절차에 의해 웨스턴 블롯을 제조하였다. 면역 반응은 Immunobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA, USA)에 의해 검출되었다.

9. 통계분석

OS는 수술 당일부터 사망 또는 마지막 추적 관찰까지 측정되었다. DFS는 수술 당일부터 재발 또는 사망일로부터 계산되었다. OS와 DFS를 평가하기 위해 유전자형에 따라 KaplanMeier 테스트를 수행하였다.

aHR과 95 % CI는 연령 (65 세 이상 대 65 세 이하), 성별 (여성 대 남성), 흡연 상태 (유무), 조직학적유형 (편평상피암 대 선암), 병리학적 병기(stage I vs. stage II or IIIA), 보조 요법(유무)로 계산하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계 데이터는 Windows용 통계 분석 시스템 버전 9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수득하였다.

< 실시예 2>

환자 특성 및 임상적 예측 인자

환자들의 임상학적, 병리학적 특성과 전체 생존율(OS) 및 무병생존율(DFS)과의 관련성을 표 1에 나타내었다.

그 결과, 단변량 분석에서 병리학적 병기는 OS 및 DFS와 유의하게 관련되어 있음을 알 수 있었다(log-rank P = 9 × 10^-13 and 4 × 10^-18, respectively). 연령, 성별, 흡연 상태 또한 OS와 관련이 있었다(log-rank P = 0.01, 7 × 10^-4 and 8 × 10^-4, respectively).

< 실시예 3>

SNPs 및 생존 결과 사이의 관련성

평가된 73 개의 SNP와 다변량 분석(multivariate analyses)의 결과를 표 2에 나타내었다.

분석된 73개의 SNP들 중 4개의 SNP(rs7897156, rs1059476, rs1895320, rs1374297)가 생존 결과(survival outcomes)와 관련이 있는 것으로 나타났다.

BUB3 rs7897156C>T 는 recessive model 하에서 전체 생존율의 악화와 관련이 있음을 알 수 있었다(CC+CT (88.2%) vs. TT (11.8%), adjusted hazard ratio [aHR] = 1.58, 95% confidence interval [CI] = 1.07 - 2.33, P = 0.02; 표 3 및 도 1 참조).

Aurora kinase B (AURKB) rs1059476G> A는 recessive model 하에서 전체 생존율의 향상과 관련이 있음을 알 수 있었다(GG + GA (84.6 %) vs. AA (15.4 %), aHR = 0.64, 95 % CI = 0.41-0.99, P = 0.05; 표 3 및 도 1 참조).

유의한 P 값에 도달하지는 않았지만, 전체 생존율(OS)과 동일한 경향이 BUB3 rs7897156 및 AURKB rs1059476에 대해 무병생존율(DFS)에서 관찰되었다(표 3 참조).

Pituitary tumor-transforming 1 (PTTG1) rs1895320과 RAD21 cohesin complex component (RAD21) rs1374297은 무병생존율(DFS)의 악화와 관련이 있음을 알 수 있었다(under a recessive model, TT+TC (97.6) vs. CC (2.4%), HR = 2.46, 95% CI = 1.43-4.23, P = 0.001 and under a codominant model, CC (34.8%) vs. CG (48.0%) vs. GG (17.2%), HR = 1.18, 95% CI = 1.01-1.38, P = 0.04, respectively; 표 3 및 도 1 참조).

또한, 4 개의 SNP와 EGFR, ALK 및 RET 사이에는 연관성이 없는 것으로 나타났다(표 4 참조).

< 실시예 4>

rs7897156C > T가 BUB3 의 프로모터 활성에 미치는 영향

rs7897156C> T는 BUB3의 5' 비 번역 영역에 위치하고 BUB3의 프로모터 활성을 변경할 수 있다. 본 발명자들은 H1299 및 A549 NSCLC 세포주에서 루시퍼라제 분석을 사용하여 BUB3의 프로모터 활성에 대한 rs7897156C> T의 영향을 조사하였다.

그 결과, rs7897156T 대립 유전자는 두 세포주의 7897156C 대립 유전자와 비교하여 BUB3 프로모터의 루시퍼라제 활성이 유의하게 높음을 알 수 있었다(P = 0.02 and 0.003, respectively; 도 2A 참조).

< 실시예 5>

rs7897156C > T가 BUB3 mRNA 발현에 미치는 영향

증가된 BUB3 발현은 비 악성 폐 조직과 비교하여 종양 조직에서 관찰되었다 (P = 2.8 × 10^-8; 도 2B 참조). BUB3 rs7897156C> T의 기능적 효과를 확인하기 위해 rs7897156 유전자형에 따라 mRNA 발현을 평가하였다.

그 결과, BUB3 mRNA 발현은 비 악성 폐 조직에서 rs7897156CC 유전자형 (43.2 %)보다 rs7897156CT 또는 TT 유전자형 (56.8 %)에서 더 높음을 알 수 있었다(P = 0.04, 도 2C 참조).

< 실시예 6>

AURKB rs1059476G >A의 기능 예측

AURKB rs1059476G> A는 non-synonymous SNP이다. rs1059476G를 A로 변경하면 codon 298에서 트레오닌의 아미노산 변화가 메티오닌으로 바뀐다. 본 발명자들은 DelPhi 계산과 Pymol (http://pymol.org)을 사용하여 이 아미노산 변화가 단백질 기능에 영향을 주는지 평가하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 코돈 298에서의 Thr-Met 변화는 오로라 키나아제 B의 증가된 소수성을 제공함을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

rs1059476G >A의 인비트로 (in vitro)상 효과

본 발명에서 확인된 AURKB 변이형 (M²⁹⁸)의 기능적 중요성을 평가하기 위해, AURKB에 대한 변이형(M²⁹⁸)의 영향을 시험관 내에서 조사하였다. DDK로 표지된 야생형 (T²⁹⁸)과 변형형 (M²⁹⁸)을 293T 세포에 형질 감염시켰다.

그 결과, 변형형 (M²⁹⁸)의 AKT 및 mTOR의 인산화에 대한 웨스턴 블롯은 야생형 (T²⁹⁸)과 비교하여 유의하게 낮음을 알 수 있었다(도 3C 참조). AKT와 mTOR의 총 단백질 수준은 변경되지 않았다. 이러한 결과는 AURKB 변이형(M²⁹⁸)이 AKT 및 mTOR의 인산화를 감소시킨다는 것을 의미한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DIAGNOSTIC METHODS FOR PROGNOSIS OF NON-SMALL-CELL LUNG CANCER USING BUB3, AURKB, PTTG1 AND RAD21 SNPs <130> 2017-0165 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI Reference Sequence: NG_033794.1 <400> 1 tgggattctt gtgtttcaga gactaacttc aaggggaggg cgccatggac agagctgtaa 60 agatctttcc cgctttctat gaagagggcg ggcagagcgt cagcccctag aaaactacat 120 ttcccagaat gccatacgca ggcgggagag ggcatgaaca gagccttggc gcgatgctcc 180 ttgggaggtg tagtttccac gcgtccagct cgaacgctga tgccccagcg cggtggtaaa 240 atgagcccac gtgatcggaa aagcagcggt ttccctttga gccggaacag gatgactggg 300 ttgaccgatg ctgggcagct gagcggacca atcggccccc tagactgaga cgttggcgtt 360 tgaaatcagc caatggcagg tctacactgg agcttcctct ccgcctcctt cgcctagcct 420 gcgagtgttc tgagggaagc aaggaggcgg cggcggccgc agcgagtggc gagtagtgga 480 aacgttgctt ctgaggggag cccaaggtag ggaggcgagg cgacggtgtg cgggagcggg 540 ctctccaggg acttcccggg 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ctgcttgcta acctctattt cccttctact cagagggaag aaagctacgt aggatgatgc 120 caatagtcat tttaagagtc aaaagtgctt aagtgtttaa acagtgtctt tatagccaac 180 acttaccttt ttggcagaaa agcttggctg tttttgtttg aggggtccct tggtctttac 240 agacttttct gtagctctgt tgacagttcc caaagccttt ctagtagctt taggtaaggc 300 tggtggggca tcgaacgttt tgccaaaacg tggtgttgaa acttgagatc tcccatctaa 360 ggctttgatt gctgaagaaa aagtcttacc ataagaatat tccagcagca aaatacctgt 420 acaacttaaa tactgtgtat ataaacttga cctctcaccc ccaaacccac cccccacttt 480 tggtagtggc atggctatga taggcctaat agcagagatt cagtaacttc cttaaatcat 540 ctcattaaga tattaaaaat gaaaaaggac caataacaaa cgactccaat tgcccaaaaa 600 gtacactaaa tgtctcgtcc agctccaggc cacgtccaca ataccagtgt atccgactgc 660 agccttgtat acttacaagg tccagacccc agcttcagcc catccttagc aaccacacgg 720 gtgcctggtt ctccattttc cttatcaaca tagatcagag tagccattct ggattattct 780 aagaatgaga aatacatatt agatattggg gaaggtggga gaagcaaagg tatagcaaca 840 taccaaactt tctatcctag gagtgtccac acaaaaaaca agagctaaac agcggaacag 900 tcacgggcgt 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Claims (9)

1. 삭제
2. 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 501번째 염기에 해당하는 rs1059476G>A 다형성인 AURKB(Aurora kinase B) 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 AURKB rs1059476G>A는 전체생존율(OS)과 관계가 있는 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 비소세포폐암은 수술로 절제된 경우인 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물.
5. 제2항에 따른 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트.
6. 제2항에 따른 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이.
7. 비소세포폐암 환자에서 추출한 핵산으로부터, AURKB 유전자의 rs1059476G>A 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서,
   상기 AURKB 유전자의 rs1059476 다형성의 유전자형이 AA인 경우 생존 예후가 높은 군으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.

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