KR101109062B1

KR101109062B1 - 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실에기초하여 화학치료 요법을 결정하는 방법

Info

Publication number: KR101109062B1
Application number: KR1020057015973A
Authority: KR
Inventors: 캐틀린 디 다넨베르그
Original assignee: 리스판스 지네틱스, 인크.
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2012-01-31
Also published as: TWI346701B; IL170217A; AU2004216231B2; NZ542500A; EP1597393A2; WO2004075833A3; AR043398A1; TW200510546A; ATE535617T1; ES2377062T3; KR20050105498A; CA2517384C; EP1597393B1; CA2517384A1; MXPA05009162A; CN1777685A; WO2004075833A2; JP2006520197A; US20040170983A1; AU2004216231A1

Abstract

본 발명은 암 조직 내 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 환자의 티미딜레이트 신타제에 대한 정상 조직 유전자형을 결정하는 단계; 상기 환자의 티미딜레이트 신타제에 대한 종양 조직 유전자형을 결정하는 단계; 정상 조직 유전자형과 종양 조직 유전자형을 비교하는 단계; 유전자형의 비교 결과에 기초하여 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실이 종양 조직 내에서 발생하였는지를 결정하는 단계; 및 종양 샘플에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 단계를 포함한다.

Description

티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법을 결정하는 방법{METHODS OF DETERMINING A CHEMOTHERAPEUTIC REGIMEN BASED ON LOSS OF HETEROZYGOSITY AT THE THYMIDYLATE SYNTHASE LOCUS}

티미딜레이트 신타제(TS)는 2'-데옥시우리딜레이트 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트의 환원성 메틸화를 촉진하여 2'-티미딜레이트 및 디히드로폴레이트를 형성한다. 이는 DNA 생합성의 필수 단계이다. TS는 티민 염기의 유일한 데 노보(de novo) 공급원으로, 이의 반응이 DNA 합성의 속도 제어 단계 중 하나이기 때문에, TS 억제는 암 화학치료에 있어서 효과적인 접근법이었다(Danenberg, P.V., Biochim. Biophys. Acta, 473: 73-92, 1977). TS는 5-플루오로우라실(5-FU)에 대한 표적 효소로서, 약 50년간 다수의 암 치료를 위한 주요 약물 중의 하나였다. 5-FU는 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트, TS 및 5-플루오로-2'데옥시우리딜레이트 간의 안정한 삼성분 복합체, 즉 5-FU의 활성 대사산물을 형성하여 TS 억제를 통한 세포독성 효과를 나타낸다. 5-FU의 등장 이후, 다른 플루오로피리미딘계 치료(예, FUdR, UFT, S-1 및 카페시타빈) 뿐 아니라 폴레이트계 TS 억제제(예, 라티트렉시드, 페메트렉시드 및 놀라트렉시드)가 개발되었다. TS 발현의 상향 조절 및 세포내 TS 수준의 증가로 인해 세포가 TS 억제제에 대해 내성이 된다는 것이 시험관내 연구에서 나타났으며(Wang, W., et al., Cancer Res., 61: 55055510, 2001), 이는 종 양 중 TS의 양이 TS를 표적으로 한 치료에 대한 반응의 예측자일 수 있다는 가능성을 준다. 실제로, 최근 연구에서 TS 발현이 종양 중에서 상당히 다양하며, 5-FU계 화학치료에 대한 다양한 종양의 감수성이 TS의 종양내 수준과 서로 관련이 있음을 밝혀냈다(Huang, C.L., et al., Irait. J. Oncol., 17: 47-54, 2000; Nishimura, R., et al., Anticancer Res., 19: 5621-5626, 1999; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res., 6: 1322-1327, 2000; Shirota, Y., et al., J. Clin. Oncol., 19: 4298-4304, 2001; Yeh, K. H., et al., Cancer, 82: 1626-1631, 1998). 또한, 종양 중 높은 TS 수준은 나쁜 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다(Kralovanszky, J., et al., Oncology, 62: 167174, 2002; Nakagawa, T., et al., Lung Cancer, 35: 165-70, 2002).

생체내에서 TS 발현을 조절하는 기작은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 그러나, TS 프로모터에서 발생하는 다형성이 하나의 조절 인자를 구성할 수 있음이 제안되었다. TS 유전자는 5'-비번역 영역(5'-UTR)에서 연쇄 반복된(tandemly repeated) 독특한 28개의 염기쌍을 가지는 것으로 알려져 있고, 이 반복 횟수는 다양하다(Horie, N., et al., Cell Struct. Funct., 20: 191-197, 1995). 대부분의 개체는 이중 연쇄 반복(2R/2R), 삼중 반복(3R/3R) 또는 이종접합성(2R/3R) 유전자를 갖고 있지만, 일부 경우에서 고차 반복이 발견된다(Marsh, S., et al., Genomics, 58: 310-312, 1999). TS 인핸서 영역(TSER) 다형성은 인간 위장암에서의 TS 단백질 발현에 대한 부분적 결정자이다(Kawakami, K., et al., Anticancer Res., 19: 3249-3252, 1999, 본원에 그 전문이 참고 인용됨).

3R/3R 유전자형을 가진 암 조직은 2R/3R 유전자형에 비해 유의적으로 높은 TS 단백질 발현을 나타내며, 이는 시험관내 실험으로 확인되었다(Kawakami, K., et al., Clin. Cancer Res., 7: 4096-4101, 2001, 본원에 그 전문이 참고 인용됨). 5-FU-계 화학치료에서 TS 발현의 역할과 함께, TS 유전자형과 TS 발현 간의 관련성은, 연쇄 반복 횟수에 대한 TS 유전자형이 5-FU계 화학치료에 대한 적어도 부분적인 예측자일 수 있음을 제안한다. 실제, 다양한 최근의 임상 상관성 연구에서 상기 TSER의 TS 유전자형이 5-FU계 요법으로 치료받은 결장직장암 환자의 반응 및 생존율과 관련이 있다는 예비 증거를 얻었다(Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Marsh, S., et al., Int. J. Oncol., 19: 383-386, 2001; Pullarkat, S. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et ql., J. Clin. Oncol., 19; 1779-1786, 2001).

TSER 중 다양한 28개 염기쌍 연쇄 반복 서열의 존재가 최근 상당한 관심을 끌고 있는데, 이는 5-FU계 요법으로 치료받은 환자의 임상 결과를 어느 정도 예측할 수 있는 p53 돌연변이 외의 유일한 게놈 손상이기 때문이다. 최근에 행해진 모든 연구는 2R/2R 유전자형의 보유가 5-FU로 치료받은 환자의 3R/3R 유전자형보다 임상적으로 더 유리하다는 것을 꾸준하게 보여주고 있다(Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Pullarkat, S. T. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19; 1779-1786, 2001; Etienne MC, et al., J. Clin. Oncol. 20: 2832-43, 2002). 종양 반응 결정자일 수 있는 TS 다형성의 발견은 상당한 관심거리인데, 그 이유는 종양 반응의 예 측이 쉽게 입수할 수 있는 정상 조직(예, 말초 혈액 세포)의 분석으로 수행될 수 있는 가능성 때문이다. 이러한 예측은 정상 조직의 유전자형이 암 조직의 유전자형과 동일할 것이라는 추측을 기반으로 한다. 그러나, 최근 이러한 추측이 TS 유전자형의 경우 항상 옳지 않다는 증거가 나왔다. 정상 조직에서 이종접합성일 경우 종양의 TS 유전자형의 변형을 유도하는 LOH가 높은 빈도로 암 조직의 TS 유전자좌에서 발견되었다(Kawakami K, et al., Jpn J Cancer Res. 93: 1221-1228, 2002; Zinzindohoue F, et al., J. Clin. Oncol. 19 : 3442, 2001). 즉, 정상 조직에서 이종접합성 2R/3R 유전자형을 가진 개체에서의 LOH 발생은 2R/소실(loss) 또는 3R/소실 TSER 유전자형을 가진 종양을 발생시킬 것이다. 따라서, 이종접합성이고 종양 조직의 TS 유전자좌에서 LOH를 가진 환자는 LOH 발생 도중 어떤 대립유전자가 결실되는지에 따라 화학치료로부터 상당히 다른 결과를 겪을 수 있다.

따라서, 치료를 시작하기 전, 다양한 화학치료 요법에 대한 반응을 예측할 방법에 대한 요구가 있다. 정확한 예측은 의사가 소정의 화학치료 요법으로 진행할지 또는 대안 화학치료 요법을 시도할지를 결정할 수 있게 해 줄 것이다. 역 부작용은 대부분의 화학치료 요법에서 일반적이기 때문에, 불필요하거나 성공적이지 않은 임의의 치료를 피하기 위해 화학치료제에 대한 종양 반응을 예측할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 의사가 치료에 대한 반응을 예측할 수 있다면, 실패할 수도 있는 치료로 인한 시간 낭비를 막을 수 있고, 대신 의사가 가능성 있는 치료에 더 집중할 수 있게 할 것이다. 치료에 대한 반응의 예측 방법은 단순한 시행착오 접근이 아니라 요법을 선택하는 가이드라인을 의사에게 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 암 조직 내 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실(loss of heterozygosity)에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 환자의 티미딜레이트 신타제에 대한 정상 조직 유전자형을 결정하는 단계; 상기 환자의 티미딜레이트 신타제에 대한 종양 조직 유전자형을 결정하는 단계; 정상 조직 유전자형과 종양 조직 유전자형을 비교하는 단계; 상기 유전자형의 비교 결과에 기초하여 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실이 종양 조직 내에서 발생하였는지를 결정하는 단계; 및 종양 샘플에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 화학치료 요법에 대한 환자의 반응(약물 독성 반응에서와 같은 반응)을 예측하기 위해 정상 조직의 유전자형을 사용하는 것을 포함한다.

반응의 예측을 돕기 위해, 본 발명은 환자 데이터(예, 데이터베이스)의 수집을 포함하는데, 이는 비제한적으로 정상 조직 및 암 조직 유전자형, 치료 중인 암, 투여된 화학치료 요법, 환자의 반응, 즉 종양 크기 감소, 존재할 경우, 종양 성장, 전이 증가, 환자 생존율, 화학치료 투여량, 독성 데이터, 환자 수명 등과 같은 환자 데이터를 참조한다. 이 데이터베이스는 환자의 인자와, 이 환자와 유사한 인자를 가진 이전의 환자를 비교(예, 정상 조직 및 암 조직 유전자형, 화학치료 요법 및 치료 결과)함으로써 이 환자의 반응을 예측하는 것을 도울 것이다.

반응의 예측 뿐 아니라 데이터베이스 구축 모두에서, 조직 유전자형을 결정 하기 위해 새롭거나 보존된 조직을 사용할 수 있다.

도 1A은 3회 반복 서열을 가진 TS 5' 측접 영역의 구조를 나타낸다. 번역된 영역은 고딕 막대선(solid bar)으로 나타나 있다. 화살표가 있는 흰색 막대(open bar)는 TSER을 나타낸다. 화살표는 연속 반복된 서열 및 상보성 역 서열을 나타낸다. 숫자는 개시 코돈의 제1 뉴클레오티드를 +1로 정할 때의 뉴클레오티드의 위치이다. PCR 프라이머는 연쇄 반복의 영역에 측접하도록 고안되어, 3회 반복의 존재가 2회 반복 TSER보다 더 긴 PCR 산물을 제공할 것이다.

도 1B은 결장직장암 환자로부터 유래한 일치하는 정상(N) 및 종양(T) DNA에서의 TS 유전자형 분석의 예를 보여준다. 상위 및 하위 밴드는 각각 3R 및 2R을 함유하는, TSER 분절의 증폭으로 얻은 PCR 산물을 나타낸다. 숫자는 다른 환자의 경우를 의미한다. 각 환자는 2개 밴드가 존재하는 것으로 나타난 이종접합성 2R/3R 유전자형을 정상 조직 중에 가진다. 사례 1: LOH는 2R/소실 유전자형을 가진 종양을 발생시킨다. 사례 2: LOH가 발생하지 않는다. 사례 3: LOH는 소실/3R 유전자형을 가진 종양을 발생시킨다.

도 2는 별도로 각각의 다양한 종양 가능성 TSER 유전자형을 가진 환자에 대한 생존 가능성을 나타내는 생존(Kaplan-Meier) 도표를 도시한다.

도 3은 2R 유전자형만(2R/소실 + 2R/2R), 3R 유전자형만(3R/3R + 3R/소실) 및 이종접합체(2R/3R)에 따라 그룹화한 환자의 생존 가능성을 나타내는 생존(Kaplan-Meier) 도표를 도시한다.

도 4는 TS mRNA 정량화를 위한 증폭 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다(표 1).

도 5는 CRC 환자의 연구에서 정상 조직의 TS 유전자형을 나타내는 표(표 2)이다.

도 6은 CRC 환자 연구에서 종양 조직의 이종접합성 소실(LOH) 빈도를 나타내는 표(표 3)이다.

도 7은 LOH에 의해 조절되는 TS 유전자형과 임상병리학적 변수 간의 관련성을 나타내는 표(표 4)이다.

도 8은 TS 유전자형으로 분리한 환자의 임상 결과를 나타내는 표(표 5)이다.

도 9는 TS 유전자형으로 분리한 TS 발현을 나타내는 표(표 6)이다.

본 발명은 암 조직 내 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. TS 유전자는 염색체 밴드 18p11.32에서 염색체 18의 짧은 암(arm)의 텔로미어 영역에 국재화되어 있는데(Hori, T., et al., Human Genetics, 85(6): 576-80, 1990), 이의 게놈 영역은 높은 비율의 결장직장암에서 결실이 일어난다고 알려져 있다(Vogelstein B., et al., Science, 244: 207-211, 1989). 이러한 결실 사건에 대한 주요 표적 중 하나는 잘 알려져 있는 종양 억제 유전자 DCC(결장직장암에서 결실됨(deleted-in-colorectal cancer))일 수 있다(Klingelhutz AJ, et al., Oncogene 10: 1581-1586, 1995). 염색체 18 결실체의 표적 유전자(들)에 대한 접근성으로 인해, 몇몇 경우 TS 유전자는 결실된 DNA 분절 내에 함유될 수 있다. 실제, LOH 시 이종접합성 2R/3R 유전자형이 2R/소실 또는 3R/소실 유전자형으로 전환된다는 사실로 인해, 2R/3R 개체로부터의 TS 유전자형의 겔 전기영동 분석에서 정상 조직에서보다 종양 조직 샘플 중에서 2R과 3R 밴드 간의 상이한 비(즉, 대립유전자 불균형)가 나타나는 경우, 이종접합성 소실(LOH)이 종양 DNA 내 TS 유전자좌에서 빈번하게 일어난다는 것을 본 발명자들이 초기 연구에서 확인하였다(Kawakami K, et al., Jpn J Cancer Res., 93: 1221-1228, 2002). 이러한 이전의 연구에서(상기 인용 문헌) (본원에 그 전문에 참고 인용됨), 관찰된 LOH 빈도는 TS 프로모터에 대해 이종접합성인 환자 중에서 62%(50명 중 31명)였는데, 이는 Zinzindohue et al.에 의해 보고된, 결장직장암(CRC) 환자 그룹에서의 결과(30명 중 19명, 63%)와 거의 동일한 것이다(Zinzindohoue F, et al., J. Clin. Oncol., 19: 3442, 2001). 본 연구의 환자 그룹에서 관찰된 LOH 빈도는 다소 높았는데(77%), 이는 가능한 한 임의의 기질 조직이 없는 종양 세포 영역을 분리하기 위해 모든 표본에 대해 레이저 캡쳐 미세해부(LCM)를 이용했기 때문일 수 있다. 종양 조직을 정제하기 위한 상기 기법을 이용하여, 도 2에 나타나 있듯이, 하나 또는 다른 TS 대립유전자의 소실을 상당히 명백하게 관찰하여 TS 유전자좌에서의 LOH 발생의 존재 또는 부재를 명백하게 보여줄 수 있다.

본 발명은 TS 유전자좌에서 암 조직 내 이종접합성 소실(LOH)이 상대적으로 흔하여, 정상 조직에서 이종접합성일 경우 종양 내 TS 유전자형의 변형을 유도한다는 관찰에 부분적으로 기초한 것이다. 즉, 정상 조직 내 이종접합성 2R/3R 유전자형을 가지는 개체에서의 LOH는, LOH 발생 도중 어떤 대립유전자가 결실되느냐에 따라, 2R/소실 또는 3R/소실 유전자형을 가진 종양을 발생시킬 것이다. 따라서, 3R 대립유전자가 소실되는 경우, 종양은 2R/소실 유전자형을 가진다. 2R 대립유전자가 소실되는 경우, 종양은 3R/소실 유전자형을 가진다.

본 발명은 이종접합성 2R/3R의 종양 내 TS 유전자좌의 LOH가 2R/소실 또는 3R/소실 유전자형을 생성하는 경우, 종양이 2R/2R 및 3R/3R 종양 각각의 화학 감수성 특징을 얻는다는 발견에 일부분 기초하는 것이다. 본 연구의 두드러진 발견은 종양 유전자형이 치료의 결과를 결정한다는 것이다: 종양 중 2R/소실 유전자형을 가진 2R/3R 환자는 2R 유전자형만 가진 환자와 동일한 생존성을 보이고, 2R/소실 유전자형을 가진 환자가 3R/소실 유전자형을 가진 환자보다 반응률(80% 대 14%) 및 생존성(333일 대 203일) 관점에서 치료 결과가 현저하게 좋았다. 이 결과는 종양 조직 내 TSER 다형성 상태와 TS 억제제(예, 비제한적으로, 5-FU, FUdR, UFT, S-1 및 카페시타빈)에 기초한 요법에 대한 반응 간의 직접적인 연관성을 나타낸다. 데이터는 또한 양성 효과를 보이는 2R과는 대조적으로 삼중 TSER 반복(3R)은 종양 반응에 대해 직접적인 부정적 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 2에 나타난 것과 같이, 종양 2R/3R 유전자형을 가진 환자의 생존 시간은 3R만을 가진 환자와 유사하게 짧지만, LOH 도중 3R 대립유전자가 소실될 경우 생성된 2R/소실 종양은 높은 반응률와 긴 생존성을 보인다.

TSER 다형성 반복이 종양 반응에 영향을 미치는 기작은 여전히 불명확하다. 이중 반복을 가진 TS 유전자에 연결된 리포터 유전자의 발현 활성이 삼중 반복을 가진 TS 유전자에 비해 낮다라고 하는 Horie et al.(Cell Struct. Funct., 20: 191-197, 1995)에 의한 발견은 TSER 다형성이 TS 유전자 발현을 조절하여 5-FU에 대한 종양 감수성에 영향을 줄 가능성을 제안한다. 이 가설은, 결장직장암 환자에서 TS 유전자 발현의 유의적인 TSER-의존적 차이(약 3.6배)를 보고하고, 이 차이가 2R/2R 유전자형에 비해 3R/3R 암 환자에서 반응률이 더 낮은 것을 설명해 준다는 것을 제안한, Pullarkat et al.(Pullarkat, S.T., et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001)의 결과에 의해 확인되는 것 같다. 그러나, 다른 데이터를 고려했을 때, TSER 다형성 수와 TS 유전자 발현 간의 관계는 간단하게 보이지 않는다. 예를 들어, 130개의 결장직장암 표본 분석에서, 2R/2R과 3R/3R 유전자형 간의 유의적인 TS 유전자 발현차를 발견하지 못하였다. 대신, 3R/3R 종양에서 TS 단백질 수준이 유의적으로 높았으며(Pullarkat, S.T., et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001), 이는 3R/3R 환자에서의 낮은 반응률 또한 설명해 준다. 이 발견은 mRNA로부터 TS 단백질을 생산하는 번역 활성이 TSER 다형성에 의해 영향을 받는다는 것을 제안하며, 실제로도 3R 프로모터가 번역 활성 증가를 야기한다는 것을 보여주는 시험관내 실험이 이를 뒷받침한다(상기 인용 문헌). Etienne et al.은 5-FU/폴린산으로 처리한 103개의 CRC 종양을 분석했는데, 흥미롭게도 2R/3R 종양이 2R/2R 또는 3R/3R 종양보다 더 높은 TS 효소 활성을 가질 뿐 아니라 환자 생존 기간이 가장 짧다는 것이 밝혀졌다.

본 발명에 이르는 연구에서, 3R 유전자형만을 가진 종양(3R/3R + 3R/소실)은 2R 유전자형만을 가진 종양에 비해 평균 TS 유전자 발현이 더 높았다(～1.5배). 3R/소실 유전자형의 발현이 유사한 양의 2R/소실 유전자형에 비해 더 높다는 발견(표 6)은 3R이 크지는 않지만 TS 유전자 발현의 직접적인 상향 조절에 영향을 준다는 것을 제안한다. 그러나 2R 또는 3R 유전자형만을 가진 종양 간의 평균 TS 유전자 발현차가 작으면 S-1 치료에 대한 다소 현저한 반응차를 설명하기에 불충분할 것 같으며, 이는 TS 조절 외의 (또는 이에 더한) 기작이 관련될 수 있음을 제안한다.

예를 들어, 최근 다수의 연구에서 TSER 반복이 폴레이트 대사 물질 수준을 조절하는 역할을 한다는 것이 제안되었는데, 이는 환자에 대한 약물 독성 및 폴레이트를 사용하는 효소와 상호작용하는 약물의 항종양 활성에 영향을 미칠 수 있다. 유의적으로 낮은 수준의 혈장 폴레이트 및 호모시스테인이 3R/3R 유전자형 개체에서 관찰되었다(Trinh, B.N., et al., Hum. Genet., 111: 299-302, 2002). 이 관찰로 3R/3R 환자를 5-FU 치료하면 낮은 독성이 얻어지는 것을 설명할 수 있는데(Pullarkat, S.T., et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001), 그 이유는 상승된 혈장 호모시스테인의 수준이 높은 약물 독성 위험과 관련있음이 밝혀졌기 때문이다(Niyikiza, C., et al., Molecular Cancer Therapeutics, 1: 545-52, 2002). TSER 반복 상태는 폴레이트 수준에 의해서도 영향 받을 수 있는 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제인 메토트렉세이트에 대한 성인 급성 림프모세포성 백혈병(ALL)의 반응과 관련있다(Krajinovic, M., et al., Lancet, 359: 1033-1034, 2002). TSER 다형성, 폴레이트 흡수 및 결장직장암의 위험(Ulrich, C.M., et al., Cancer Res., 62: 3361-3364, 2002) 뿐 아니라 성인 ALL의 발병 위험 등의 전체적인 위험성(Skibola, C.F., et al., Blood, 99: 3786-91, 2002) 간의 관계가 주목되어 왔다.

따라서, 본 발명은 높은 비율의 암 환자가 종양 내 TS 유전자좌에서의 LOH를 겪고, 2R/3R 정상 조직 유전자형을 가진 환자를 상이한 종양 TS 유전자형을 가진 두 그룹으로 분리하고, 플루오로피리미딘 치료로 다른 3R/소실 환자에서보다 2R/소실 환자에서 훨씬 더 나은 임상 결과를 기대할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 특정 개체가 2R/소실 또는 3R/소실 종양을 획득할 지 여부는 둘 중 하나로 끝날 동일한 가능성을 가질 기회의 문제이다. 따라서, TS 유전자 발현 측정과 병행한 종양 조직 내 TS 유전자형의 분석으로 TS로 유도된 요법을 이용한 화학치료에 대해 우수한 후보로 간주되는 환자 및 낮은 반응 가능성으로 인해 다른 치료 형태를 고려해야 하는 환자의 확인을 도울 수 있다.

따라서, 본 발명은 반응 예측 및 치료법 선택을 위한 도구로서의 상기 TS 유전자 다형성의 용도에 관한 것이다. 따라서, 정상 조직만의 분석으로 불충분하고 종양 조직도 분석하여 종양 내 TS 다형성 상태를 확정해야 하는 것은 명백하다. 또한, 본 발명은 정상 조직 유전자형의 분석도 포함하는데, 그 이유는 이러한 분석이 화학치료 요법에 대한 반응의 예측, 특히 약물 독성 수준의 예측에 대한 통찰력을 또한 제공하기 때문이다.

따라서, 화학치료 요법에 대한 반응의 예측에서, 종양 조직의 유전자형은 종양이 화학치료 요법에 반응할 것인지의 여부를 예측하는 것과 관련있다. 또한 비종양 조직의 유전자형은 약물 독성을 일으킬 위험성의 예측과 관련이 있을 수 있다. 따라서, 종양의 제거에 대해서는 더 높은 성공률을 보이지만 약물 독성에 대한 위험성은 감소시키는 적절한 화학치료 요법을 개발하기 위해 조직 유전자형 둘 다에 대한 지식이 의사에게 도움이 될 것이다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 암 조직 내 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실에 기초하여 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 이 방법은 정상 조직 및 암성 조직에서 환자의 티미딜레이트 신타제에 대한 유전자형을 결정하는 것을 포함한다. 티미딜레이트 신타제 유전자좌에서의 이종접합성 소실이 종양 조직에서 일어나는 지를 결정하기 위해 상기 두 유전자형을 비교한다. 종양 샘플에서의 이종접합성 소실을 기초로, 화학치료 요법에 대한 반응을 예측할 수 있다. 상기 나타낸 것과 같이, 종양 샘플 내 2R/소실 유전자형을 가진 환자는 화학치료 요법에 대해 2R/2R 종양 샘플 유전자형을 가진 환자와 유사한 반응을 보일 것이다. 예를 들어, 2R/2R 종양 샘플을 가진 환자가 화학치료 요법에 대해 양성 반응을 보일 경우, 2R/소실 종양 유전자형을 가진 환자 또한 동일한 화학치료 요법에 대한 양성 반응을 보일 것이라고 예측할 수 있다. 유사하게, 3R/3R 종양 샘플을 가진 환자가 화학치료 요법에 대해 음성 반응 또는 무반응을 보일 경우, 3R/소실 종양 유전자형을 가진 환자 또한 동일한 화학치료 요법에 대해 음성 반응 또는 무반응을 보일 것이라고 예측할 수 있다.

또한, 정상 조직의 유전자형은 약물 독성이 나타날 환자 위험성을 예측하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급했듯이, 3R/3R 환자가 2R/2R 환자에 비해 약물 독성에 대한 위험성이 더 낮다는 것이 경험상 밝혀졌다. 따라서, 2R/3R 정상 조직 환자는 3R/3R 환자보다 다소 낮은 투여량에서 약물 독성을 보이지만, 2R/2R 환자보다는 더 높은 투여량을 견딜 수 있을 것이다.

용어 "반응"이 의미하는 것은 종양 조직 또는 세포에 대한 화학치료 요법의 효과를 말한다. 상기 반응의 측정 방법은 적절하게 다양한 기준으로, 대개 화학치료 요법과 치료 중인 암의 형태에 따라 정의된다. 일반적으로, 기준은 종양 크기 감소, 원거리 전이(예, 결장직장암의 경우 림프절과 폐 전이), 및 암 조직 형태, 암과 전이 단계 및 화학치료 요법에 따른 다른 것들을 포함한다. 당업자는 종양 형태 및 화학치료 요법을 둘러싼 조건에 대한 적절한 기준을 인식하고 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명을 이끄는 연구 중 하나에서, 화학치료 요법에 대해 "반응자"로 구분되기 위해서는, 종양은 다른 질환의 발병 또는 새로운 병변의 발생 없이 지표 병변의 수직 직경 산출값의 합의 50% 감소를 나타내야 한다. 따라서, 이 경우의 양성 반응은 종양이 감소하고 새로운 병변이 형성되지 않음을 의미할 것이다. 역으로, 음성 반응은 종양이 감소하지 않거나 심지어 종양이 계속 성장하고/하거나 새로운 병변이 발생하는 것을 의미할 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, 잠재적인 약물 독성을 예측하기 위해 환자 정상 조직의 유전자형을 또한 사용한다. 예를 들어, 상기 언급한 바와 같이, 연구 결과 3R/3R 환자는 2R/2R 환자보다 5-FU에 대해 더 낮은 약물 독성 위험을 경험하는 것으로 나타났다. 따라서, 2R/3R 정상 조직 환자는 3R/3R 환자에 비해 다소 낮은 투여량에서 약물 독성을 나타낼 것이지만, 2R/2R 환자보다는 더 높은 투여량을 견딜 것이다. 따라서, 화학치료 요법에 대한 반응을 예측하기 위해 본 발명의 방법 중 하나를 사용하여, 5-FU 치료에 대해 양성으로 반응(즉, 종양 크기 감소)하지만, 3R/3R 정상 조직 유전자형을 가진 환자보다 약물 독성에 대해 감수성이 더 높은 2R/3R 정상 조직 유전자형 및 2R/소실 종양 조직 유전자형을 가지는 환자를 예측한다. 따라서 다른 유사한 개체에 대해 수집한 데이터와 함께 상기 예측법을 사용하여, 의사는 종양 반응 및 약물 독성과 관련한 환자의 사전 데이터를 기초로 화학치료 요법 및 투여량을 정할 수 있다.

종양 샘플의 유전자형 결정 시, 새롭거나 보존된 종양 조직/세포를 사용할 수 있다. 보존된 것일 경우, 포르말린 고정후 파라핀 포매된(FPE) 샘플이 바람직하다. 그 후 FPE 종양 샘플을 레이저 캡쳐 미세해부(LCM)에 적용하는 것이 바람직하다. LCM은 비종양 세포로부터 종양 세포를 분리하는 데 유용하며, 따라서 종양 조직 유전자형을 더 정확하게 분석하게 해 준다.

또한 종양 조직 내 TS 유전자 발현 수준을 측정할 수 있다. TS 발현을 상향조절하고 세포내 TS 수준을 높임으로써 세포가 TS 억제제에 대한 내성을 갖게 된다는 것이 시험관내 연구에서 입증되었기 때문에, 상기한 측정은 화학치료 요법에 대한 반응의 예측을 보조할 수 있다. TS 발현은 종양 간에 상당히 다양하며, 5-FU계 화학치료에 대한 다양한 종양의 감수성이 종양내 TS 수준과 상호관련이 있다는 것이 연구에서 밝혀졌다. 따라서, 종양 유전자형을 결정하는 것 외에, 종양 내 TS 유전자 발현의 측정으로 화학치료 결과에 대한 반응을 예측하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

반응의 예측을 돕기 위해, 본 발명은 또한 환자의 종양 및 정상 조직 유전자형, 및 화학치료 요법 및/또는 종양 세포 내 TS 유전자 발현 수준에 대한 상기 유전자들의 반응에 관한 데이터를 수집하는 것을 포함한다. 예를 들어, 종양이 화학치료 요법에 대해 반응하는 환자는 "반응자"로 분류될 수 있다. 이들 종양의 유전자형 뿐 아니라 이들 종양 내 TS 유전자 발현 수준을 측정하고 기록한다. 이와 유사하게, 종양이 화학치료 요법에 대해 우호적으로 반응하지 않은 환자는 "무반응자"로 분류될 수 있다. 이들 종양의 유전자형 뿐 아니라 이들 종양의 TS 유전자 발현 수준도 측정하고 기록한다. 이어서, 환자가 암으로 진단받은 경우, 종양 내 TS 유전자 발현 수준으로서 종양의 유전자형을 시험하고 수집한 데이터와 비교한다. 환자의 종양 유전자형 및 TS 유전자 발현 수준이 반응자 그룹과 상관관계가 있는 경우, 이 환자에 대한 양성 반응을 예측할 수 있다. 반대로, 환자의 종양 유전자형 및 TS 유전자 발현 수준이 무반응자 그룹과 상관관계가 있는 경우, 이 환자에 대해 화학치료 요법의 음성 반응을 예측할 수 있다.

예를 들어, 환자 "A"가 2R/3R의 정상 조직 유전자형을 가지고 종양 조직 유전자형은 2R/소실인 경우, 본 발명의 방법을 사용하여, 환자 "A"에서의 화학치료 요법에 대한 반응이 2R/2R 종양 또는 2R/2R 정상 조직 유전자형을 가진 환자에서의 동일한 화학치료 요법에 대한 반응과 유사할 것이라 예측할 것이다. 다른 예로, 환자 "B"가 2R/3R의 정상 조직 유전자형을 가지고 종양 조직 유전자형은 3R/소실인 경우, 본 발명의 방법을 사용하여, 환자 "B"에서의 화학치료 요법에 대한 반응이 3R/3R 암 또는 정상 조직 유전자형을 가진 환자에서의 동일한 화학치료 요법에 대한 반응과 유사할 것이라 예측할 것이다.

유사하게, 약물 독성의 예측 시, 본 발명은 환자의 정상 조직 및 종양 조직 유전자형과 함께, 환자의 약물 독성 수준에 대한 데이터를 수집하는 것을 포함한다. 따라서, (치명적인 약물 독성 유발 전) 투여된 약물의 "안전한" 수준은 환자의 정상 조직 유전자형과 동일한 정상 조직 유전자형을 가진 다른 환자를 비교한 것과 이의 안전한 약물 투여 수준에 기초하여 예측할 수 있다.

화학치료 요법은 해결되지 않은 암/종양을 치료하는 데 유용한 임의의 요법일 수 있다. 당업자는 선택된 적절한 화학치료 요법에 대해 잘 알 것이다. 다양한 인자는 암의 형태, 환자 상태/건강, 암의 정도, 종양 크기 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 방사선 요법 또는 화학치료 약물 조합과 같은 다른 요법을 동시에 사용할 수 있다. 또한 화학치료 요법은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 암 항원에 대한 항체, 조인자(co-factor), 방사선 치료 등을 사용하는 유전자 요법의 사용을 포함하는 다른 요법과 병용할 수 있다.

인간 위장암(예, 결장직장암)의 경우, 플루오로피리미딘과 폴레이트계 억제제를 비롯한 TS 억제제가 오늘날 유행하는 화학치료인 듯 하다. 따라서, 본 발명은 비제한적으로 TS 억제제에 대한 반응 예측을 포함한다. TS 억제제는 5'-FU, FUdR, UFT, S-1, 카페시타빈, 라티트렉시드, 페메트렉시드 및 놀라트렉시드, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이제 제한되는 것은 아니다. 종종 CRC를 치료하는 경우, 다중 요법이 관련된다. 이는 추가 화학치료 성분, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴, 탁산의 투여 뿐 아니라 방사선 치료를 포함한다.

실시예 1:

환자 집단

(a) 외과 수술 후 산발성 또는 재발성 결장직장암 진단을 받았고; (b) 적절한 혈액, 간 및 신장 기능을 가진, Eastern Cooperative Oncology Group 수행 상태가 0～2이고; (c) 사전 4주 동안 치료받지 않았으며; (d) 방사선 검사로 측정할 수 있는 병변을 가진 환자가 적합하다.

치료

환자는 28일간 1일 2회 S-1으로 치료받은 뒤 2주간 휴약기를 가졌다. S-1은 아침 및 저녁 식사 후 경구 투여하였다. 이전의 Ⅱ기 연구에서와 같이(Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001; Zinzindohoue, F., et al., J. Clin. Oncol., 19: 3442, 2001), S-1 투여량의 결정 시 체표면적(BSA)을 사용하였으며, 이는 다음과 같다; BSA < 1.25 m², 40 mg; 1.25～1.5 m², 50 mg; ≥ 1.5 m², 60 mg. 질병이 담당 의사에 의해, 또는 의사의 재량으로 결정한 것만큼 진행될 때까지, 상기 치료를 반복하였다.

연구를 시작하기 전, 실험 프로토콜은 기관심의위원회 및 윤리위원회에 의해 재검토 및 승인되었으며, 기관 법규에 따라 모든 환자로부터 고지에 입각한 동의를 얻었다.

평가

2 주기의 치료 후, 측정가능한 질병을 재평가하였다. 반응 기준은 국립 협동 단체 시험에 대해 사용되는 표준 정의였다(Green, S. et al., Investig. New. Drugs, 10: 239-253, 1992). 반응은 간, 림프절 및 폐 전이 뿐 아니라 원발병변에서의 CT로 분석하였다. 반응자로서 분류하기 위해, 종양은 다른 질환의 발달 또는 새로운 병변의 발생 없이 지표 병변의 수직 직경 산출값의 합의 50% 감소를 나타내야 한다(상기 인용 문헌).

미세해부

헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 슬라이드를 검사한 후, 병리학자는 대표적인 포르말린 고정 후 파라핀에 포매된 사전 S-1 치료 종양 표본을 선택하였다. 레이저 캡쳐 미세해부(P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Munich Germany)를 위한 조직 구조를 시각화하기 위해 10 μ 두께의 절편을 중성의 선명한 적색으로 염색하였는데, 이는 종양 세포만을 연구했음을 확실히 하기 위해 수행하는 것이다. 조직병리적으로 암이 침투하지 않은 표본에서 수거한 조직은 정상 조직으로 간주하였다.

RNA 분리 및 cDNA 합성

본원에 참고 인용된 미국 특허 제6,248,535호에 개시된 절차에 따라, 파라핀 포매된 표본으로부터의 RNA 분리를 시행하였다. RNA를 분리한 후, 상기 기재된 바와 같이 각 샘플로부터 cDNA를 제조하였다(Lord RV, et al., J. Gastrointest Surg., 4: 135-142, 2000).

RT-PCR

TS 및 내부 기준 유전자(p-액틴)에 대한 상대적 cDNA 정량화는, 상기 기재된 바와 같이, 형광계 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7900 서열 검출 시스템[TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행하였다(Lord RV, et al., J. Gastrointest Surg., 4: 135-142, 2000; Heid CA, et al., Geraome Res., 6: 986-994, 1996; Gibson UE, et al., Genome Res., 6: 995-1001, 1996). 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 표 1에 나타나 있다. PCR 반응 혼합물은 각 프라이머 600 nM, 프로브 200 nM, AmpliTaq Gold 폴리머라제 2.5 U, dATP, dCTP, dGTP 각각 200 μＭ, dUTP 400 μＭ, MgCl₂ 5.5 mM, 및 기준 염색제를 함유하는, 최종 부피가 25 ㎕인 1 x Taqman 완충제 A로 구성되어 있다(모든 제제: Applied Biosystems, Foster City, CA). 주기 조건은 50℃에서 10초, 95℃에서 10분에 이어, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분간의 46 주기였다. 결장, 간 및 폐 RNA(모두 Stratagene, La Jolla, CA)를 각 플레이트 상에서 대조군 교정자로 사용하였다.

DNA 추출, PCR 및 전기영동

수거한 DNA는 QIAamp Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 정방향 프라이머 5'-GCGGAAGGGGTCCTGCCA-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-TCCGAGCCGGCCACAGGCAT-3'(서열번호 2)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 TS 유전자의 프로모터 영역을 증폭시켰다. 상기한 조건을 사용하여 PCR을 수행하였다(Kawakami, K., et al., Anticancer Res., 19: 3249-3252, 1999). 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 상에서 전기영동으로 PCR 산물을 분석하였다.

통계적 분석

유전자 발현값은 2개의 절대 측정치 간의 비로 나타낸다(관심 유전자/내부 기준 유전자). 각 TS 유전자형 군에서의 유전자 발현값은 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 분석하였다. 개별 시험에 대해 카이 제곱을 사용하여 TS 유전자형과 화학치료에 대한 반응 간의 관련성을 분석하였다. 로그-랭크 시험을 사용하여 TS 유전자형과 생존성 간의 관련성을 측정하였다.

결과

모두 Ⅵ기 질환을 앓고 있는 30명 환자로부터의 30개 원발성 사전 S-1 치료 결장직장암 표본 전체를 연구하였다. 환자 중 13명(43.3%)은 S-1에 대한 반응자로, 17명(56.7%)은 무반응자로 분류되었다. 30명의 환자 모두에 대해 TS 유전자형 및 TS 발현값을 얻었다. 연구에 포함된 30명의 환자 중 14명(46.6%)은 남성이며, 중간 나이는 65.0세(범위 39～79세)였다. 모든 30명의 환자에 대한 총 생존 시간 중간값은 215.5일(범위 98～627일)이었다. S-1 반응성 종양을 가진 환자에 대한 총 생존시간의 중간값은 303일(범위 139～627일)이고, 무반응자에 대해서는 190일(범위 98～435일)이었다.

결장 정상 조직 및 암 조직 중 TS 반복 서열의 수의 TS 다형성 및 LOH

염기쌍의 추정 길이(도 1)가 107 및 145인 PCR 단편을 얻었다. 107개 및 135개 염기쌍 단편은 2회 반복 및 3회 반복(2R 및 3R) 서열을 나타낸다. TS 유전자형은 2R-동형접합형(2R/2R), 3R-동형접합형(3R/3R) 및 2R/3R-이종접합형으로 분류하였다. 30개의 정상 결장 조직 중 각 유전자형에 대한 빈도는 표 2에 나타나 있다. 2R/3R 유전자형을 가진 22개의 정상 조직에서, 10개의 암 조직이 2R 서열 밴드(2R/ 소실)를 나타냈고, 7개의 암 조직은 3R-서열 밴드(3R/소실) 만을 나타냈다. 표 3과 도 1을 참조한다. TS 유전자좌 중 이종접합성 소실 발생률은 각각 2R/소실 유전자형에 대해 45%(10/22), 소실/3R 유전자형에 대해서는 31.8%(7/22)이다(표 3).

임상병리적 특성 및 LOH로 조절된 TS 다형성

LOH로 조절된 TS 유전자형에 따라 30명의 환자를 다섯 그룹으로 나누었다. 임상병리적 특성을 대해, 다섯 그룹 간의 유의적인 차이는 없었다(표 4). 재발 카테고리에 대해, 모든 30명의 환자 중 13명(43%)이 간 전이를 보였다. 종양 대부분(29/30)은 조직 구조적으로 잘 또는 적당히 분화된 선암이었다.

LOH로 조절된 TS 다형성 및 S-1 화학치료에 대한 반응

암 중 2R/소실 유전자형을 가진 10명의 환자의 반응률은 80%(8/10)로 각 유전자형 중에서 가장 높고, 3R/소실 유전자형을 가진 7명의 환자의 반응률은 14%(7/22)로 각 유전자형 중에서 가장 낮다. 각 반응률 간의 유의적인 차이가 존재한다(p = 0.029)(표 5).

LOH로 조절된 TS 다형성 및 전체 생존율

정상 조직 중 2R/3R 유전자형과 암 조직 중 2R/소실 유전자형을 가진 결장직장암 환자에 대한 전체 생존 기간의 중간값은 333일이었다(95% C.I; 241～468일). 이 생존 기간은 다른 유전자형을 가진 환자에 비해 상당히 긴 것이다(p = 0.004)(표 4 및 도 2). 암 조직 중 2R/2R 또는 2R/소실 유전자형을 가진 결장직장암 환자에 대한 전체 생존 기간의 중간값은 308일이었다(95% C.I; 233～418일). 이는 암 조직 중 다른 유전자형을 가진 환자에 비해 상당히 긴 것이다(p = 0.002)(표 5 및 도 3).

LOH로 조절된 TS 다형성 및 종양내 TS mRNA 발현

종양내 TS mRAN 발현의 중간값은 암 조직 중 2R/2R 또는 2R/소실 유전자형을 가진 환자에 대해서는 2.45(범위 0.6～4.14), 암 조직 중 2R/3R 유전자형을 가진 환자에 대해서는 2.97(범위 1.63～19.23), 및 소실/3R 또는 3R/3R 유전자형을 가진 환자에 대해서는 3.68(범위 1.64～11.97)이었다. 암 조직 중 LOH로 조절되는 TS 유전자형은 종양내 TS mRNA 발현과 통계적으로 관련이 있었다(p = 0.026)(표 6).

SEQUENCE LISTING <110> RESPONSE GENETICS, INC. <120> METHODS OF DETERMINING A CHEMOTHERAPEUTIC REGIMEN BASED ON LOSS OF HETEROZYGOSITY AT THE THYMIDYLATE SYNTHASE LOCUS <130> 11220/230 <140> <141> 2004-02-20 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 1 gcctcggtgt gcctttca 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 2 cccgtgatgt gcgcaat 17 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe <400> 3 tcgccagcta cgccctgctc a 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 tgagcgcggc tacagctt 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 tccttaatgt cacgcacgat tt 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe <400> 6 accaccacgg ccgagcgg 18

Claims

(a) 환자의 정상 조직 내의 TS 유전자 인핸서 영역(TSER)에 반복 배열(tandem repeat) 다형성(polymorphism)의 유전자형을 결정하는 단계;

(b) 환자의 종양 조직 내의 상기 유전자형을 결정하는 단계;

(c) 종양 조직 내의 TS 유전자 인핸서 영역(TSER)에 이종 접합성 소실(loss of heterozygosity)이 발생하였는지 여부를 결정하기 위해 정상 조직의 유전자형과 종양 조직의 유전자형을 비교하는 단계; 및

(d) 이종 접합성 소실이 존재한다면 종양 조직 내의 이종 접합성 소실에 근거하여 종양 환자에 대한 반응성을 예측하는 단계

로 이루어진 화학요법제의 종양 환자에 대한 반응성을 예측하는 방법에 있어서,

상기 화학요법제는 티미딜레이트 신타제(TS) 저해제이며,

(ⅰ) 삼중 TSER 반복(3R) 대립형질의 존재는 종양의 화학요법제에 대한 직접적인 감수성 저하를 나타냄을 예측할 수 있는 결정;

(ⅱ) 정상 조직 내의 2R/3R 유전자형이 종양조직 내에서 2R/소실 형태로 이종 접합성 소실이 나타나는 경우, 종양조직 내의 2R/3R 유전자형보다 종양의 화학요법제에 대한 감수성이 증가됨을 예측할 수 있는 결정; 및

(ⅲ) 정상 조직 내의 2R/3R 유전자형이 종양조직 내에서 3R/소실 형태로 이종 접합성 소실이 나타나는 경우, 종양조직 내의 3R/3R 유전자형과 유사한 정도로 종양의 화학요법제에 대한 감수성 저하를 예측할 수 있는 결정;

을 통해 화학요법제의 종양 환자에 대한 반응성을 예측하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 종양 조직은 포르말린-고정 파라핀-포매된 조직임을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 방법은 포르말린-고정 파라핀-포매된 종양 조직을 레이저 캡쳐 미세해부를 통해 분리하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 종양 조직 내의 TS 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 방법은

(a) 화학요법제에 대한 감수성을 지닌 종양 환자의 종양 세포 내에서 TS 유전자 발현 수준을 측정하는 단계;

(b) 화학요법제에 대한 감수성을 지니지 않은 무반응 종양 환자의 종양 세포 내에서 TS 유전자 발현 수준을 측정하는 단계;

(c) 상기 감수성을 지닌 종양 환자의 종양 조직 내에서 TS 유전자 발현 수준과 상기 무반응 종양 환자의 TS 유전자 발현 수준을 비교하는 단계;

(d) 단계 (c)의 비교 결과에 근거하여 화학요법제의 종양 환자에 대한 반응을 예측하는 단계

를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 화학요법제는 5-FU, FUdR, UFT, S-1, 카페시타빈, 라티트렉시드, 페메트렉시드 또는 놀라트렉시드에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 화학요법제는 5-FU, FUdR, UFT, S-1, 카페시타빈, 라티트렉시드, 페메트렉시드 또는 놀라트렉시드에서 선택된 1종 이상의 화학요법제와 시스플라틴, 옥살리플라틴, 탁산 또는 방사선과의 병용 투여임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은

(a) 종양 환자의 정상 조직 유전자형과 동일한 정상 조직 유전자형을 지니는 다른 환자를 찾아 확인하는 단계;

(b) 화학요법제 처치 후 다른 환자의 약물 독성 수준을 산정하는 단계; 및

(c) 화학요법제에 대한 환자의 감수성을 예측하기 위해 종양 환자간의 약물 독성 수준을 상호 관련시키는 단계

를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.