KR101219794B1

KR101219794B1 - Ｈｏｘａ１１유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비소세포폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 비소세포폐암 진단방법

Info

Publication number: KR101219794B1
Application number: KR1020100080804A
Authority: KR
Inventors: 이연수; 황정아; 박주배; 김덕환
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2013-01-10
Also published as: WO2012023648A1; KR20120046799A

Abstract

본 발명은 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 HOXA11 유전자의 메틸화 여부에 따라 폐암을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HOXA11 유전자의 메틸화는 폐암세포에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 폐암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＯＸＡ１１유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비소세포폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 비소세포폐암 진단방법{Composition for diagnosing non-small cell lung cancer comprising an agent for determining level of methylation of HOXA11 gene and a method for diagnosing non-small cell lung cancer using the same}

본 발명은 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비소세포폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HOXA11 유전자의 메틸화 여부에 따라 비소세포폐암을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 비소세포폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전 세계 암 관련 사망 원인 중 가장 흔한 것이다. 과거 20년간 폐암의 발견과 치료에 상당한 발전들이 있었음에도 불구하고, 병을 가진 환자들에 대한 예후는 모든 기의 폐암에 대한 5년 생존율을 합해도 10% 에서 15% 사이로 여전히 좋지 못하다. 폐암환자들에 대한 좋지 못한 예후는 일부 재발의 결과인데, 이는 적절한 림프결절 절단과 함께 치료적인 외과적 절제를 받은 환자들의 대략 20-50%에서 나타난다. 1기 폐암을 가진 환자들조차도 암을 미처 발견하기도 전에, 암이 림프결절 근처 또는 다른 곳으로 퍼져서 5년 생존율이 50%보다 낮다.

폐암은 소세포암(small cell lung cancer, 이하 SCLC라고도 함)과 비소세포암(non-small cell lung cancer, 이하 NSCLC라고도 함)의 두 가지로 분류되며, 비소세포암은 다시 편평상피암, 선암, 대세포암, 선편평상피암 등의 조직형으로 분류 된다. 소세포암은 비소세포암에 비해 수술 후 예후가 좋지 않아 대개 항암제가 주 치료제로 사용되고 있으며 비소세포암은 일반적으로 1-2기 에서는 수술, 그리고 진행된 경우는 항암제가 주 치료제로 사용된다.

편평상피암은 전체 폐암의 약 35~50%를 차지하며, 주로 근위 기관지에서 발생한다. 흡연과 매우 밀접한 관련이 있으며 남자에게 흔히 발생한다. 조직학적으로 각질(keratin)을 형성하고, 세포간 교(cellular bridge)를 형성하는 특징을 가지며, 성장속도와 전이속도가 다른 형태의 폐암에 비해 비교적 느리다. 반면에, 선암은 전체 폐암의 약 15~35%를 차지하며, 서양에 비해 한국에서는 여성에게 비교적 많은 편이다. 발생부위는 폐의 주변부인 말초기관지에서 주로 발생하며, 조직학적으로 선관(gland)을 형성하며, 무친(mucin, 동물체의 점성물질로 특히 점액 중의 고무 단백질)을 생성하는 암이다. 조직학적으로 폐실질 내에 고립성으로 존재하며, 전이속도가 비교적 빨라 예후가 편평상피암에 비해 불량한 편이다.

이러한 서로 다른 종류의 조직형에 따라 발생하기 쉬운 부위, 진행형식과 속도 및 증상 등의 임상상이 다양하며 치료방법 또한 다양하다 (Brambilla et al., Eur Respir J.18(6):1059-68, 2001).

상기의 폐암 중 80% 정도를 차지하는 비소세포 암은 암 덩어리의 크기, 주변조직 침투여부, 림프선의 침범 정도, 및 멀리 떨어진 장기로의 전이 여부에 따라 병기를 정하고 치료방법을 결정하는데, 수술을 제외하고는 치료효과가 적어서 치유하기 힘든 암 중의 하나이다. 이렇게 나쁜 예후와 높은 치사율을 보이는 것은 폐암을 효과적으로 진단할 수 있는 제제 또는 방법이 부족하기 때문이다. 따라서, 난치병인 폐암에서는 조기 진단 및 치료가 매우 중요하다.

현재까지의 폐암의 검사 수단은 물리적인 것이 대부분이며, 흉부 X선 촬영과함께 조직 검사, 기관지경 검사, 흉부진찰, 고전압촬영, 객담세포진 검사 등이 행해지고 있다. 그러나 이러한 진단 방법은 경제적으로 부담이 될 뿐만 아니라 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다. 따라서, 폐암의 발병 여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 폐암의 진단제의 개발이 필요한 실정이다.

수많은 질병들이 유전자 이상에 의하여 발생하고, 유전자 이상의 가장 빈번한 형태가 유전자 코드 서열의 변화이다. 이러한 유전자 변화를 돌연변이라고 한다. 어떠한 유전자에 돌연변이가 있으면, 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의구조 및 기능이 변화하고, 이상 및 절단이 발생하며, 이러한 변이된 단백질은 질병을 일으킨다. 그러나, 특정 유전자에 변이가 없어도, 상기 유전자의 발현에 이상이생겨 병을 유발할 수 있다. 전형적인 예가 유전자 전사조절부위, 예를 들면, CpG섬의 사이토신 염기 부위에 메틸 그룹이 부착되는 메틸화이다. 이를 후생유전학적(epigenetic) 변화라고 하며, 돌연변이와 비슷한 방식으로 자손 세포에 전이되고, 예를 들면, 대응하는 단백질의 발현이 소실되는 것과 같은 동일한 효과를 나타낸다. 암 세포의 경우, 종양 억제 유전자의 발현이 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의하여 억제되고, 이러한 억제된 발현은 암을 유발하는 중요한 메카니즘의 하나로 인식되고 있다 (Robertson, K. and Jones, P., Carcinogen, 21, 461, 2000). 종양 억제 유전자들의 프로모터 지역에서 정상적으로 비메틸화되어 있는 CpG 섬의 비정상적인 메틸화는 악성으로의 형질변환(malignant transformation) 및 종양 진행에 있어 중요한 역할을 하는 유전자들의 전사 침묵(transcriptional silencing)과 연관이 있다 (Baylin SB, Herman JG, GraV JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect ofneoplasia. Adv Cancer Res 1998;72:141-6, Jones PA, Baylin SB. The epigenomics of cancer. Cell 2007;128:683-92). 실제로 전립선암, 결장암, 자궁암, 유방암 등 다양한 암 세포에서 CpG 섬에서의 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 이들이 암 형성 초기에 중요한 역할을 하고 있다는 점이 밝혀지고 있어서 DNA 메틸화 경향이 유력한 암 조기진단의 마커로서 주목받고 있다. 하지만, 암을 진단할 수 있을 정도로 충분한 수의 마커가 부족하여 특이적인 DNA 메틸화 경향을 보이는 마커의 지속적인 개발이 요구되고 있는 실정이다.

종래에 폐암에서 호메오박스 유전자들의 과메틸화는 몇 그룹에서 보고되었다. Shiraishi et al(Shiraishi M, Sekiguchi A, Oates AJ, Terry MJ, Miyamoto Y. HOX gene clusters are hotspots of de novo methylation in CpG islands of human lung adenocarcinomas. Oncogene 2002;21:3659-62)은 인간 폐 선암(human lung adenocarcinoma)에서 HOXA4, HOXA7, HOSD11, 및 HOXD13 유전자의 프로모터 지역에서 CpG 섬의 과메틸화를 발견하였다. 그리고 Rauch et al(Rauch T, Wang Z, Zhang X, et al. Homeobox gene methylation in lung cancer studied by genome-wide analysis with a microarray-based methylated CpG island recovery assay. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:55) 또한 초기 편평상피암(squamous cell carcinomas)에서 HOXA5, HOXA9의 프로모터 지역에서 CpG 섬의 빈번한 과메틸화를 규명하였다. 그러나, 이러한 과메틸화는 폐암의 진단을 위해 활용하기에는 아직 불충분하여 보다 정확한 마커의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 폐암 특이적인 DNA 마커를 개발하기 위하여 연구한 결과, HOXA11 유전자에서 폐암 특이적인 메틸화 경향을 보이고, 이러한 메틸화 수준의 측정을 통해 폐암을 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 HOXA11 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 쌍, 및 상기 HOXA11 유전자의 비메틸화된 서열에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍을 제공하는 것이다.

폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 폐암은 비소세포폐암이다.

본 발명에서 용어, "메틸화"는 염기에 메틸기가 붙어 유전자 발현양상이 변하는 것을 말한다. 본 발명에서 메틸화는 HOXA11 유전자에서 일어난다. 본 발명의 메틸화는 구체적으로 HOXA11 유전자의 염기서열에 C와 G의 염기들이 연속해서 존재하는 것을 CpG가 밀집되어 있는 CpG섬의 사이토신에서 일어나는 것을 포함하고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 핵산서열의 메틸화 정도를 측정하는 것으로서, 특히 본 발명에서는 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것이 중요하다. 상기 메틸화 수준의 측정은 당업계의 메틸화 수준을 측정하는 공지의 방법을 제한없이 사용가능하나, 그 예로 Goldengate Methylation Cancer Panel Ⅰ 마이크로어레이, EpiTYPER^TM분석, 메틸화 특이적인 PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, 이하, MSP라고도 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사할 수 있다. 정상 폐 조직 세포에서는 HOXA11 유전자에 메틸화 상태가 나타나지 않으나, 비소세포폐암 조직 세포에서는 HOXA11 유전자에서의 메틸화가 특이적으로 나타나 HOXA11 유전자의 낮은 수준의 발현을 보이는 것을 통해서, HOXA11 유전자의 메틸화 여부에 따라 폐암 여부를 진단할 수 있다.

본 발명은 HOXA11 유전자 프로모터의 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "CpG 섬(CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 상기 CpG에서, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포디에스테르 결합을 의미한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.

포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문이다.

DNA 메틸트렌스퍼라아제의 증가된 효율은 암억제 유전자들의 프로모터 지역에서 CpG 섬의 비정상적인 메틸화를 더 쉽게 일으키는데 책임이 있는 유력한 요인들 중 하나이다

본 발명에서 용어, "HOXA11"은 호메오박스 유전자라고 불리는 전사 조절인자 부류를 코딩하는 유전자로, 호메오박스 유전자는 4가지 분리된 염색체 상에 A, B, C 및 D로 명명된 복합체로 구성되어 있다(Krumlauf R. Hox genes in vertebrate development. Cell 1994;78:191-201). HOXA11 유전자는 7번 염색체의 A 부류이다. HOXA 복합체는 12개의 유전자(11개의 HOX 유전자들과 EVX1)를 포함하고 있는데, 7p15-7p14.2 염색체상의 155kb길이(155-kb-long) 게놈 지역에 위치하고 있다(Rauch T, Wang Z, Zhang X, et al. Homeobox gene methylation in lung cancer studied by genome-wide analysis with a microarray-based methylated CpG island recovery assay. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:5527-32). 대부분의 HOXA 프로모터들은 고도로 밀집된 CpG 섬을 포함하고, 그것의 메틸화는 HOXA 유전자 발현의 제어와 관련이 있다. 호메오박스는 약 180개의 뉴클레오타이드 서열로, 서열 특이적으로 DNA에 결합할 수 있는 호메오 도메인을 암호화할 수 있으며, 모든 진핵생물 종에 존재한다고 알려져 있다(Abate-Shen C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence Nat Rev Cancer 2002;2:777-85). 인간 게놈은 HOX 패밀리를 포함하여 적어도 200개의 호메오박스 유전자들을 가지고 있는 것으로 짐작된다 (Tupler R, Perini G, Green MR. Expressing the human genome. Nature 2001; 409: 832-33). 호메오박스 유전자들은 배아의 성장 및 성체 세포의 분화에 중요한 역할을 하는 전사 인자들을 암호화한다. HOX 유전자들은 편재하여 발현하며, 배아기적 성장에서 잘 특징지어진 역할을 가지고 있는데, 여기에서 anteroposterior body axis를 따르는 배아 지역의 정체성을 결정하게 된다 (Daftary GS, Taylor HS. Endocrine regulation of HOX genes. Endocr Rev 2006;27:331-55).

또한, HOX 유전자들은 폐의 성장과 정상 성인 폐로 발현하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Golpon HA, Geraci MW, Moore MD, et al. HOX genes in human lung: altered expression in primary pulmonary hypertension and emphysema. Am J Pathol 2001;158:955-66). HOX 유전자들의 변화된 발현은 종양형성과 종양억제에 연관이 있고, 다양한 혈액종양(hematological malignancies) 및 고체종양(solid tumor)을 생기게 하는데, 그중 몇몇은 up-regulation을 보이고 다른 것들은 down-regulation을 보인다(Shah N, Sukumar S. The Hox genes and their roles in oncogenesis. Nat Rev Cancer 2010;10:361-71). HOX 유전자들의 조절장애발현(dysregulated expression)은 폐암에서 조직-특이적 성향으로 발견된다(tissue-specific manner). 예를 들어, HOXA1, A5, A10 및 C6의 발현 정도는 편평 상피 세포암에서, HOXA5와 A10의 발현정도는 선암에서 높게 비조절(deregualted)되었다(Abe M, Hamada J, Takahashi O, et al. Disordered expression of HOX genes in human non-small cell lung cancer. Oncol Rep 2006;15:797-802).

본 발명자는 비소세포 폐암에서 HOXA11 유전자의 과메틸화 상태를 조사하고, 그 결과를 폐암 환자의 임상병리학적 특징과 연관지어 본 결과, HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정한다면 폐암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 메틸화 여부를 조사하기 위해 Goldengate Methylation Cancer Panel Ⅰ 마이크로어레이 및 EpiTYPER^TM assay를 사용하여 수행하였다 (도 1). 그 결과 대부분의 폐암 세포주에서 과메틸화를 관찰하였다. 또한, 메틸화와 연관된 HOXA11 발현을 조사하기 위해 RT-PCR과 정량적인 리얼 타임 PCR을 이용하여 분석한 결과 폐암 세포주에서 유전자 발현의 하향 조절을 관찰하였다. 즉, 비소세포폐암 조직 세포에서는 HOXA11 유전자의 프로모터에서의 메틸화가 특이적으로 나타나 HOXA11 유전자의 낮은 수준의 발현 보이는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, HOXA11의 발현이 HOXA11의 비메틸화에 의한 것인지 확인하기 위해 5-aza-dC를 처리하여 탈메틸화를 시켜 재발현 여부를 RT-PCR, 정량적인 리얼 타임 PCR 및 EpiTYPER^TM assay를 이용하여 분석한 결과, mRNA 레벨의 증가를 관찰하였다 (도 2). 즉, HOXA11 유전자의 프로모터에서의 메틸화에 의해 발현이 하향 조절됨을 확인할 수 있었다.

또한, 과메틸화가 전사를 억제하는지 조사하기 위해 SSI 메틸 트랜스퍼라제의 처리에 의해 과메틸화를 일으킨 프로모터의 활성을 측정한 결과 메틸화된 구조들의 프로모터 활성은 비메틸화된 구조들과 비교할 때 현저히 낮았다(도 3). 그리고 임상병리학적 특성을 조사하기 위해 MSP를 수행한 결과, 과메틸화는 선암 보다 편평상피암에서 높은 빈도로 발견되었으며, 과메틸화는 Tp2 등급에서 더 빈번하게 관찰하였다(도 4).

본 발명에서 TSA에 의한 히스톤 탈아세틸 억제제(histone deacetylase inhibition)는 5-Aza-dC에 의해 유도된 전사 재활성을 촉진시킨다(도 1E). 메틸화와 히스톤 탈아세틸화는 염색질 상태의 억제 및 유전자 전사 침묵을 유지하고 확립하기 위해 상호보완적으로 작용한다고 알려져 있다. 본 발명에서는, 적은 양의 5-Aza-dC에 반응하는 과메틸화와, 그의 HOXA11의 재발현에 주는 영향에 관해 6개의 폐암 세포주에서 조사하였다. 구체적으로, H226와 A549을 제외한 대부분의 세포주에서 유전자 비활성이 발견되었다. TSA에 의한 히스톤 탈아세틸 억제제(histone deacetylase inhibition)가 5-Aza-dC에 의해 유도된 전사 재활성을 촉진시킨다고 알려져 있듯이, TSA 처리는 A549 세포에서 RT-PCR을 사용해서 H226세포들에서 리얼 타임 PCR을 이용해서, 탐지 가능할 정도로 HOXA11 유전자의 재발현을 약간 높여주었다. 이러한 관찰은, 히스톤 탈아세틸 활성에 대한 DNA 메틸화가, CpG 섬의 과메틸화와 연관된 유전자 침묵을 유지하기 위한 유력한 구성요소일 것이라는 이전의 보고들과 맥락을 같이 한다(Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG, Baylin SB. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat Genet 1999;21:103-7.). H226 세포들에서 5-Aza-dC와 TSA에 반응하는 HOXA11의 약간의 재활성은 또한 다른 종류의 탈아세틸화 억제제(HDACI)가 H226 세포들에서 HOXA11의 재발현을 위해 필요하다는 것을 시사한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 위미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단 대상이 되는 폐암은 바람직하게는 비소세포폐암(NSCLC)일 수 있으며, 상기 비소세포폐암은 편평상피암, 선암, 대세포암, 또는 선편평상피암을 포함한다. 더욱 바람직하게는 편평상피암일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, HOXA11 메틸화가 pT1 등급에서 보다 pT2 등급에서 1.76배라 더 많이 발생함을 관찰하였다(표 1). 본 발명에서 pT2 등급은 다음의 4개의 요소로 분류-정의한다. (1) 최대 크기가 3cm 이상, (2) 장측 흉막 침윤(visceral pleura invasion), (3) 무기폐(atelectasis) 또는 혈관 문(hilum)을 확장하는 간질성 폐렴(pneumonitis)과 같은 전체 폐와는 관련이 없는 방해패턴, (4) 주 기관지와의 인접도가 용골자리(carina)로부터 2cm 이상 먼 거리이다. 구체적으로, pT2 등급으로 분류된 239개의 종양들 중 118개의 종양들은 다른 요소에 관계없이 그 최대 크기가 3cm 이상으로 관찰되었고, 66개의 종양들은 종양 사이즈와 무관하게 장측 흉막 침윤을 보였다. 11개의 종양들은 종양 사이즈와 무관하게 주 기관지와 인접하여 있었고, 6개의 종양들은 3개 이상의 요소들과 관련이 있었다. 즉, HOXA11 과메틸화의 빈도는 종양사이즈 3cm 이상을 가지거나 방해 패턴인 pT2 등급에서, 장측 흉막 침윤을 보이거나 주기관지와 인접한 pT2 등급에 비해 높게 나타났다. 덧붙여서 HOXA11 과메틸화를 가진 종양들은, HOXA11 과메틸화를 가지지 않은 것들과 비교할 때, 현저하게 높은 Ki-67 레벨을 보였다(26 ± 18 vs. 19 ± 24; P = 0.02). 이러한 관찰은 HOXA11 과메틸화가 아마도 NSCLC에서 세포 증식이나 방해적인 pneumopathy와 연관이 있을 것이라는 것을 시사한다.

본 발명에서, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, HOXA11 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소이다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

폐암이 의심되는 환자의 HOXA11 유전자의 메틸화 수준은 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 HOXA11 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 바람직하게, 상기 HOXA11 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍이고, 상기 HOXA11유전자의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍일 수 있다.

폐암의 발병 또는 예상기 폐암 진단용 조성물에는 상기 제제 이외에도, 중합효소, 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 HOXA11 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 쌍, 및 HOXA11 유전자의 비메틸화된 서열에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열번호로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 폐암은 비소세포폐암이며, 더욱 바람직하게는 편평상피암이다.

상기 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 HOXA11 유전자의 mRNA 레벨을 RT-PCR 또는 리얼타임 PCR에 의해 측정하는 단계를 포함하는 폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, HOXA11의 발현정도를 GAPDH로 표준화 한 것으로, 이때 사용되는 HOXA11 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6의 한쌍이고, GAPDH 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 한 쌍일 수 있다.

상기 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 HOXA11 유전자 프로모터의 CpG섬의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 폐암 발병에 의해 HOXA11 유전자의 메틸화 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 생물학적 시료는 환자의 조직일 수 있다.

먼저, 폐암이 의심되는 환자로부터 게놈 DNA의 수득하여 메틸화 수준을 측정하는데, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에서는 MagAttract DNA Blood M48 kit (Qiagen, Hilden, Germany), QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 및 DNeasy Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 추출하였다.

상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는 a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 b) 상기 처리된 DNA를 HOXA11 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite)일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Herman JG et al., 1996, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1). 또한, 상기 a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 바람직하게, 상기 HOXA11 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머이고, 상기 HOXA11 유전자의 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머일 수 있다.

상기 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 c) 상기 b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 여부를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하고, HOXA11 유전자의 CpG 섬의 모든 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.

또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 비메틸화 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다. 따라서, 상기 본 발명의 비소세포폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법을 이용하면 HOXA11 유전자 프로모터의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 비소세포폐암 여부를 진단할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 HOXA11 유전자의 메틸화가 나타나면 폐암세포에서의 HOXA11의 발현에 영향을 미치고, 본 발명의 HOXA11 유전자의 메틸화는 폐암세포에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 폐암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시험관 내에서 HOXA11의 메틸화 상태 및 mRNA의 발현 분석을 나타낸 것이다. (A) 두 방향 복합체 분석(two-way cluster analysis)은 여섯 개의 폐암 세포주(H23, H226, H460, H520 및 A549) 및 정상 세포주(HDF)에서 HOXA11의 메틸화 상태를 나타낸다. 메틸화 정도는 빨간색(0% 메틸화)에서부터 밝은 노란색(100% 메틸화)의 연속적인 등급에서 색 변화로 표현하였다. X축은 CpG 지역을 Y축은 세포주를 나타낸다. B-C. 특정 CpG 지역의 메틸화 상태를 (B) 에피그램 및 (C) 스펙트럼으로 나타내었다. D-E. HOXA11의 mRNA 레벨은 (D) RT-PCR 및 (E) real-time PCR로 분석하였다. mRNA 레벨은 6개의 폐암세포주에서 정상 세포주부다 현저히 조절저하되었다.
도 2는 침묵된 HOXA11의 과메틸화 및 재발현에서의 5-aza-dC 와/또는 TSA의 영향을 나타낸 것이다. A-B. 침묵된 HOXA11의 재발현은 세포들을 72시간 동안 5-aza-dC로 처리한 후에, 여섯 개의 폐암세포주에서 (A) RT-PCR과 (B) 리얼타임 PCR에 의해 검사하였다. 다른 세포주들과 비교할 때, HOXA11의 재발현은 H226과 A549 세포들에서 아주 적었다. C. HOXA11 유전자의 메틸화 상태는 또한 72시간 동안 5-aza-dC을 처리한 후에 판단하였다. 히트맵(heatmap)은 과메틸화의 특이한 패턴을 보여주는데, 탈메틸화 정도는 적은 밀도로 메틸화된 HOXA11을 가진 H460 세포들에서 확연하고, 높은 밀도로 메틸화된 HOXA11을 가진 A549세포들에서는 미미하다. D-E. 아주 적은 HOXA11의 재발현을 보였던 H226 및 A549세포들은 10 M 5-aza-dC을 0.5 M TSA와 같이 72시간 동안 처리해주었다. TSA는 (D)RT-PCR과 (E)리얼타임-PCR로 추가적인 HOXA11의 재발현을 유도하였다.
도 3은 HOXA11의 프로모터 분석을 나타낸 것이다. (A) SssI 메틸화효소(methylase)를 처리한 후에 CpG 쌍염기(CpG dinucleotide)에서 사이토신(cytosine)의 염기 변화는 바이설파이트 씨퀀싱(bisulfite sequencing)을 통해 확인하였다. SssI에 의해 메틸화 된 사이토신은 바이설파이트 변이에 저항성을 갖는다. U는 비메틸화된 염기들은 메틸화된 서열들을 각각 나타낸다. (B) 4개의 HOXA11 프로모터 구조들의 상대적 발광효소 활성을 측정하였다. 발광효소 활성은 메틸화된 프로모터 서열들을 가진 구조((파란 상자)에서 비메틸화된 프로모터 서열들을 가진 구조(빨간 상자)에서 보다 현저히 낮았다.
도 4는 HOXA11 과메틸화 분석을 나타낸 것이다. (A) HOXA11의 프로모터 과메틸화는 MSP를 이용하여 354 NSCLC 환자들에게서 얻은 파라핀이 포매된 조직들에서 분석하였다. (B) HOXA11 과메틸화 빈도는 병기(pathologic stage) (P = 0.42)가 아닌 pT 등급(P = 0.02)과 밀접하게 관련이 있었다. (C) pT2 등급의 환자들을 네 개의 그룹으로 나누었다. HOXA11 과메틸화는 pT1 등급을 가진 환자들보다 크기가 3cm 보다 큰 종양을 가지거나 이상 패턴(P = 0.004)을 가진 환자들에게서 높은 빈도로 나타났다. 별표(*)는 pT1과 비교하여 HOXA11 과메틸화의 빈도에서 어떠한 통계적인 차이점이 없다는 것을 나타낸다.
도 5는 HOXA11 과메틸화에 연관된 RFS와 OS에 대한 카플란-메이어 방법(Kaplan-Meier plot)을 나타낸 것이다. HOXA11 과메틸화에 연관된 무재발(recurrence-free) 생존률(RFS)은 (A) 1기와 (B) 2기, 그리고 NSCLCs의 (C)1기와 (D) 2기의 전체생존율(OS)을 비교하였다. HOXA11 과메틸화는 NSCLCs의 1기와 2기에서 RFS 및 OS와 연관이 없었다. 어두운 파랑과 오렌지 선들은 HOXA11의 메틸화된 그룹과 비메틸화된 그룹을 가진 것을 각각 나타낸다. 피-값은(P-value) 로그-랭크 테스트(log-rank test)를 통해서 계산하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

실시예 1: 세포배양

여섯 개의 인간 폐암 세포주(H23, H226, H460, H520, H1650, A549)와 하나의 정상 세포주(HDF, 인간 피부 섬유아세포)를 American Type Culture Collection (Manassa, VA)로부터 얻었다. 폐암세포들과 정상세포들을 RPMI1640(Cellgro^ⓡMediatech, Herndon)와 DMEM (WelGENE, KOREA)에서 각각 키우고, 10% 열-비활성화(heat-inactivated) 우태아 혈청(Hyclone, Logan, UT)과 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, New York, NY)을 넣어주었다. 그리고 5% 이산화탄소(CO₂) 상태에서 37˚C로 배양하였다.

실시예 2: 세포의 TSA 및 5- Aza - dC 처리

세포들을 총 72시간 동안 10μM의 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 넣어 배양하거나, 72시간 중 마지막 24시간 동안 0.5 μM trichostatin A(TSA)를 같이 넣어 배양해주었다. 세포들을 채취하고, 아주 찬(ice-cold) PBS로 세척했다. 그 후, 게놈DNA(genomic DNA)와 mRNA를 분리하였고, EpiTYPER^TM assay로 메틸화 상태를 분석하고, RT-PCR과 정량적인 real-time PCR로 발현 정도를 분석에 사용하였다.

실시예 3: 조직 샘플 준비

97개 급속동결 종양과 그에 상응하는 정상조직, 그리고 354개의 파라핀이 포매된 종양 조직들을, 1994년 8월부터 2005년 11월 사이에 서울 삼성 의료 센터 흉부외과(the Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Samsung Medical Center, Seoul, Korea)에서 치료적 절제술을 한 경험이 있는 451명의 NSCLC 환자들로부터 얻었다. 종양 샘플의 사용에 대한 환자동의서(written informed consent)를 모든 참여자들로부터 받았다. 환자 인구통계상(patient demographics)의 정보는 면접관-운영의 설문조사를 통해 얻었다. 치료적인 절제술 후 후속조치의 평균기간은 4.9년이었다. 병기는 American Joint Committee on Cancer (AJCC)의 지침을 통해서 결정하였다.

실시예 4 : 게놈 DNA 추출 및 소듐 바이설파이트 (sodium bisulfite)변이

배양한 세포들로부터 얻은 게놈 DNA, 파라핀이 포매된 조직들, 그리고 급속동결 종양 및 그에 상응하는 정상 조직들을 각각 MagAttract DNA Blood M48 kit (Qiagen, Hilden, Germany), QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 및 DNeasy Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA)를 써서 사용방법지침에 따라 추출하였다. 게놈 DNA 1마이크로그램을 사용방법지침에 따라 EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO Research, Orange, CA)를 사용하여 소듐 바이설파이트에 의해 변이시켰다.

실시예 5 : 마이크로어레이를 이용한 게놈 전체 메틸화 분석

NSCLC의 발병에 관여하는 후보 유전자를 찾기 위해, 97개의 급속동결 종양 및 그에 상응하는 정상 조직들의 메틸화 상태를, 기존에 방법대로(Bibikova M, Lin Z, Zhou L, et al. High-throughput DNA methylation profiling using universal bead arrays. Genome Res 2006;16:383-93), Illumina’s GoldenGate Methylation Cancer Panel I으로 분석하였다.

실시예 6 : EpiTYPER 를 이용한 HOXA11 과메틸화의 정량적 분석

마이크로어레이 데이터의 검증을 위해, 6개의 폐암세포주에, HOXA11의 프로모터 상에서 90 CpG의 메틸화 상태를 EpiTYPER^TM assay (Sequenom, San Diego, CA)를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 프라이머들은 EpiDesigner software를 이용하여 디자인하였다. PCR 증폭 이후에 시험관 내에서 전사시킨 증폭조각(amplicons)들을 shrimp alkaline phosphatase로 처리하고, RNaseA로 자르고, 메틸화 상태를 결정하기 위해 MALDI-TOF Mass Spectrometry에 넣어 주었다. 그 결과는 EpiTYPER^TM ver. 1.0 software을 이용해 분석하였다.

실시예 7: 메틸화-특이적( methylation - specific ) 중합 효소 연쇄 반응( MSP ) 분석

HOXA11 유전자의 메틸화 상태는 소듐 바이설파이트와 함께 게놈에 처리한 후, 각 유전자의 메틸화와 비메틸화 대립유전자에 대한 특이적인 프라이머를 이용하여 메틸화에 특이적인 중합효소 연쇄반응 PCR로 결정하였다.

세포주의 PCR 조건 및 조성은 하기 표 1과 같으며, 조직 샘플의 PCR 조건 및 조성은 하기 표 2에 나타내었다.

PCR 조건
Initial denaturation	94℃	15 분
Denaturation	94℃	30 초
Anealling	55℃	30 초
Extension	72℃	1 분
Final extension	72℃	7분
Step 2 ~ 4 :35 사이클
PCR 조성
Hotstar 10X Buffer (Qiagen)	final 1 X
10mM dNTP Mix (Intron)	final 0.1 mM
Primer	final 100 nM each
Hotstar Taq enzyme	0.05 U / 15ul reaction
Bisulfite treated gDNA	10 ng

PCR 조건
Initial denaturation	94℃	10 분
Denaturation	94℃	30 초
Anealling	60℃	30 초
Extension	72℃	30 초
Final extension	72℃	7분
Step 2 ~ 4 :35 사이클
PCR 조성
2X HS prime Taq premix (GENET BIO)	final 1 X
Bisulfite treated gDNA	10 ng
Primer	final 1uM each

354개 포르말린-고정 파라핀이 포매된 조직들에서 HOXA11 유전자의 메틸화 상태는 두 세트의 프라이머들을 가지고, MSP를 이용하여 결정하였다. Herman et al (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:9821-6)에 설명되었듯이, 두 개의 프라이머 중 하나는 비메틸화된 프로모터를 위한 것이고 다른 하나는 메틸화된 프로모터를 위한 것이다. 메틸화된 HOXA11의 증폭에 관련하는 염기서열들은 5’- GTTTAGGGTAGGGGGTTTTC - 3’(센스; 서열번호 1) 및 5’- CAATCTTTCCCGACTACGAC - 3’(안티센스; 서열번호 2)이었고, 비메틸화된 HOXA11의 증폭에 관련하는 프라이머 서열들은 5’- GGTTTAGGGTAGGGGGTTTTT -3’ (센스; 서열번호 3) 및 5’- CCCAATCTTTCCCAACTACAAC - 3’ (안티센스; 서열번호 4)였다. 모든 PCR 반응은 적어도 두 번 반복해서 수행하였다.

실시예 8: HOXA11 발현의 분석

HOXA11의 mRNA 레벨은 RT-PCR 및 정량적 리얼타임 PCR(quantitative real-time PCR)을 사용하여 분석하였다. 전체 RNA는 TRIzol® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 배양된 세포들로부터 추출하였고, cDNA는 RT-PCR (Invitrogen) kit와 함께 사용하는 SuperScript^TM Ⅲ First-Strand Synthesis System을 이용하여 사용방법지침에 따라 합성하였다. RT-PCR은, 최종 0.6 μM 농도인 전체 RNA 와 HOXA11 특이적 프라이머를 0.5 μg를 포함하는 튜브에서, 사용방법지침에 따라 one step RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 실험하였다. PCR 결과물들은 GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 가지고 양을 평가하였다. HOXA11의 발현 정도는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 표준화하였다. 사용한 프라이머 쌍은 다음과 같다. HOXA11, 5’-CAGCAGAGGAGAAAGAGCGG-3’ (센스; 서열번호 5) 및 5’-TGCAGGCGCTTCTCTTTGTTA-3’(안티센스; 서열번호 6); GAPDH, 5-‘TGCACCACCAACTGCTTA-3’ (센스; 서열번호 7) 및 5’- GGATGCAGGGATGATGTTC-3’ (안티센스; 서열번호 8). 정량적인 리얼타임 PCR은 LightCyclerⓡ480 Real-Time PCR System (Roche, Germany)에서 SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN, Germany)를 가지고 수행하였다. 정량적인 PCR들은 각각의 샘플 프라이머 세트에 대해 세차례 실험하였고, 세가지 실험들의 평균을 상대적 정량 값으로서 사용하였다.

실시예 9: 발광효소시험( luciferase assay )에 의한 시험관 내 메틸화 분석

HOXA11의 프로모터상의 4개의 지역들(-779~-1, -576~-1, -309~-1, 및 -191~-1)을 KPNI (5’) 및 HindⅢ(3’) 서열이 붙은 PCR 프라이머들을 사용하여 증폭하고(표 3), pGL3-기반 발광효소 구조(pGL3-basic luciferase constructs, Promega, Madison, WI)로 복제하였다.

Primer ID	Sequence
HOXA11-promoter Forward 1(-779)	CCCGGTACCGAAGGCACTAAAGCGCTTCG (서열번호 9)
	(KPN Ⅰ)
HOXA11-promoter Forward 2(-779)	CCCGGTACCACTCCAGGAGAACAGACTCC (서열번호 10)
HOXA11-promoter Forward 3(-779)	CCCGGTACCTCGGTGAGAACACCGAGTGA (서열번호 11)
HOXA11-promoter Forward 4(-779)	CCCGGTACCGGACTAGCTAGCAGCTTGTC (서열번호 12)
HOXA11-promoter Reverse	CCCAAGCTTTATTGGGCTACCTTGGGCTC (서열번호 13)
	(Hind Ⅲ)

각각의 구조들에서, 20 μg 플라스미드 DNA를 KPNI 및 Hind Ⅲ로 자르고, 겔 전기영동을 이용해서 삽입물들을 분리하였다. 분리된 삽입물들을 CpG 특이적 SssI 메틸화효소(CpG-specific SssI methylase, New England Biolabs, Ipswich, MA)에 의해서 시험관 내에서 메틸화하고, pGL3-기반 구조로 다시 클로닝하였다. H23 세포들을 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 상기 구조로 트랜스펙션시켰다. 반딧불이 발광효소(firefly luciferase)를 포함한 pGL3-기반 벡터는, 전이 효율을 위한 내부 조절인자로서 Renilla 발광효소를 포함하고 있는 pRL-CMV벡터 10ng과 같이 넣고 트랜스펙션시켰다. 발광효소 활성은 트랜스펙션으로부터 24시간 후에 관찰하였다.

실시예 10: 통계적 분석

Wilcoxon rank sum test(또는 t-test) 및 Fisher’s exact test (또는 the Chi-squared test)를 각각 지속적이고 단정적인 변수들의 univariate분석을 위해 사용하였다. 다변수 통계적 회귀분석(Multivariate logistic regression analysis)을 HOXA11 과메틸화와 univariate analysis에서 통계학적으로 중요하다고 발견된 공변량(covariate) 사이의 관계를 결정하고, 교차비(odds ratios, ORs)를 계산하기 위해서 수행하였다. 모든 통계조사는 5%의 타입I 오류율을 가진 두 방향(two-sided)이었다. 재발 또는 사망 시의 HOXA11 메틸화의 효과는, Kaplan-Meier 생존 커브(Kaplan-Meier survival curves)에 의해 측정하였고, 두 그룹 사이의 예후에서의 눈에 띄는 차이점들은 log-rank test로 측정하였다.

결과

폐암 세포주에서 프로모터 과메틸화 및 HOXA11 의 억제

폐암 발병과 연관이 있는 후생적 마커들을 찾기 위해서, 본 발명자들은 97명의 NSCLC 환자들로부터 얻은 급속동결 종양과 그에 상응하는 정상 조직에서 GoldenGate Methylation Cancer Panel I (Illumina) microarray를 이용해 메틸화 상태를 분석하였다. 그 결과, 그들 중 63명(67%)에서 HOXA11 과메틸화를 발견하였다.

HOXA11의 메틸화 상태는 6개의 폐암 세포주(NCI-H23, NCI-H226, NCI-H460, NCI-H520, NCI-H1650 및 A549) 및 한 개의 정상 세포주에서(HDF) EpiTYPER^TM Assay를 이용해 확인하였다. HOXA11의 프로모터 서열은 전사적 조절 성분 데이터베이스(Transcriptional Regulatory Element Database)프로그램(http://rulai.cshl.edu/cgibin/TRED/tred.cgi?process=searchOrthForm)을 이용하여 탐색하였고, 전사 시작 지점으로부터 1.8kb 위쪽을 포함하는 프로모터 지역 내에서 90 CpGs의 메틸화 상태는 EpiTYPER^TM를 사용하여 정량적으로 분석하였다.

비록 H23, H520 및 H1650의 몇몇 CpG 지역들에서 부분적으로 비메틸화 되었다고 하더라도, 6개의 폐암 세포주에서 그들 중 대부분은 높게 메틸화 되었다(도1A). H460 세포들은 전사의 시작 지점인 근부지역(proximal region, dotted box)에서 다른 세포주들보다 덜 메틸화된 것으로 확인되었다. 두 개의 에피그램(epigram)(도 1B)과 스펙트럼(도 1C)은 다른 세포주들과 비교했을 때 H460 세포들에서 HOXA11 과메틸화가 낮은 비율로 나타나는 것을 보여주었다. HOXA11 발현은 RT-PCR(도 1D)과 정량적인 리얼 타임 PCR을 이용하여 분석하였는데, 이는 이러한 메틸화 상태와 깊이 연관되어 있었다. 6개의 폐암 세포주에서의 mRNA 레벨은, H460에서의 약한 발현을 제외하고는, HDF 정상 세포들과 비교했을 때 하향 조절되었다(도 1D와 1E). 이런 결과는 HOXA11 과메틸화가 HOXA11의 전사적 조절저하에 책임이 있을 것이라는 바를 시사한다.

5- Aza - dC 유래된 메틸화 및 침묵된 HOXA11 ( silenced HOXA11 )의 재발현

HOXA11의 발현이 HOXA11의 비메틸화에 의한 것인지 확인하기 위해, 메틸화를 억제하여 비메틸화를 유도시 HOXA11의 발현여부 확인을 통해, HOXA11 프로모터의 비메틸화는 HOXA11의 발현에 중요한 역할을 한다는 것을 검증하기 위해, 본 발명자들은 폐암 세포주를 10 μM 5-aza-dC와 함께 72시간 동안 처리한 후에, 침묵된 HOXA11의 탈메틸화 및 재발현을 RT-PCR(도 2A), 정량적인 리얼타임 PCR(도 2B), 및 EpiTYPER^TM assay(도 2C)을 이용하여 분석하였다. H123, H460, H520 및 H1650 세포들에 5-aza-dC의 처리는 mRNA 레벨의 상당한 증가를 일으켰다(도 2A 및 2B). 탈메틸화는 처리 후 모든 세포 주에서 발견되었고, 도 2C는 탈메틸화의 전형적인 양상을 보여준다. 탈메틸화는 세포에서 밀도가 높게 메틸화된 CpGs를 가진 A549 세포들보다 좀 더 낮은 밀도로 메틸화된 CpGs를 가진 H460에서 더욱 확실하게 나타났다. 5-Aza-dC에 반응하는 침묵된 HOXA11의 재발현은 H226와 A549 세포들에서 미미하였다(도 2A). 히스톤 탈아세틸화 억제제(histone deacetylase inhibitor)는 과메틸화된 유전들의 재발현에 협조한다고 알려져 있기 때문에, 이러한 세포들은 처음으로 5-aza-dC를 48시간 동안 처리 한 후에 0.5 μM TSA가 있는 상태에서 5-aza-dC와 함께 24시간 더 배양하였다, H226 세포들 및 A549 세포들에 5-aza-dC와 TSA를 써서 RT-PCR(도 2D) 및 real-time PCR(도 2E)에 의한 mRNA 레벨에서 침묵된 HOXA11의 재활성을 유도하였다.

HOXA11 프로모터의 리포터 분석( reporter assay )

HOXA11 과메틸화가 유전자 전사에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해서, Dual Luciferase assay에 의해서 프로모터 활성을 측정하였다. 프로모터 서열은 TESS (http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)로부터 얻었고, 상기 서열은 TFII, SP1, 및 GATA에 대한 결합 지역을 포함하는 것이었다. 각각의 메틸화 및 비메틸화 된 프로모터에 대한 4개의 구조들(-779~-1, -576~-1, -309~-1, -191~-1)을 만들었고, 그들의 프로모터 활성은 발광효소 활성의 발광(luminescence)을 측정함으로서 분석하였다(RLU). 메틸화된 프로모터는 아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine)의 존재하에, SSI 메틸트렌스퍼라아제(SSI methyltransferase) (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)를 사용하여 HOXA11의 과메틸화를 일으켜 얻었다. SSI 메틸트렌스퍼라아제의 처리에 의해 변형된 서열들은 소듐 바이설파이트 시퀀싱(sodium bisulfite sequencing)에 의해서 확인하였다(도 3A). 그러나 메틸화된 구조들의 프로모터 활성은 그에 상응하는 비메틸화된 구조들과 비교할 때 현저히 낮은 것으로 나타났다(도 3B). 상기 결과는 HOXA11의 프로모터 과메틸화가 HOXA11의 하향조절과 밀접한 관계가 있다는 것을 입증해준다.

초기 NSCLCs 에서 HOXA11 과메틸화의 임상학적 중요성

HOXA11 과메틸화의 임상병리학적 중요성을 이해하기 위해서, 우리는 354개 포르말린-고정 파라핀이 포매된 조직에서 메틸화-특이적 PCR(MSP)을 이용해서 HOXA11 유전자의 메틸화 상태를 재분석하였다(도 4A). HOXA11 과메틸화는 연구된 354명의 환자들 중 76%인 269명에서 발견되었다. HOXA11 과메틸화는 환자의 나이, 성별, 흡연여부, 분화, 및 종양 재발과 연관이 없는 것으로 나타났다.

그러나 HOXA11 과메틸화는 선암에서 보다 편평상피암에서 높은 빈도로 발견되었다. 구체적으로, HOXA11 과메틸화는 185개 편평상피암의 81%인 149개에서 나타났고, 137개의 선암 중 70%인 96개에서 나타났다.

더욱이, HOXA11 과메틸화는 종양의 기(stage)보다 종양의 등급(grade)과 밀접한 관련이 있었다(도 4B). HOXA11 과메틸화는 pT1 등급을 가진 환자 71명 중 63%인 45명, pT2 등급을 가진 239명 중 77%인 185명, pT3 등급을 가진 21명 중 90%인 19명, 그리고 pT4 등급으로 진단 된 23명 중 85%인 21명에서 발생한 것으로 나타났다(P=0.02). 추가로 239개 종양들을 pT2 등급 분류기준에 기초하여 4개의 그룹으로 분리한 후, pT2 등급인 종양들 사이의 HOXA11 과메틸화의 빈도를 비교하였다. HOXA11 과메틸화는 pT1 등급을 가진 환자들보다 최대 크기가 3cm 이상인 종양(P=0.02)을 가진 환자들 또는 방해패턴(P=0.04)을 가진 환자들에서 더 높은 빈도로 나타났다(도 4C). 즉, HOXA11 메틸화는 방해패턴을 보이는 43개의 종양들 중 88%인 38개에서 발견되었고 198개의 종양들 중 77%인 153개는 지름이 3cm 보다 큰 것으로 나타났다.

나이, 성별과 같은 변이 인자들의 잠재적인 혼동 효과를 통제하고, ORs를 산출하기 위해 Multivariate logistic regression analysis을 하였다(표 4).

	HR(hazard ratio)	95% 신뢰구간	P-값
조직(Histology)
선암	1.00
편평상피암	1.48	1.08-2.02	0.01
pT1	1.00
pT2	1.76	1.21-2.56	0.03
pT3	1.12	0.60-2.09	0.72
pT4	1.27	0.68-2.34	0.46

나이, 성별 통제

HOXA11 과메틸화는 선암 보다 편평상피암에서 1.48배 더 높은 빈도로 나타났다(95% CI = 1.08-2.02; P = 0.01). 더욱이, HOXA11 과메틸화는 pT1등급에서 보다 pT2등급에서 1.76배 더 빈번하게 관찰되었다(95% CI = 1.21-2.56; P = 0.003). 마지막으로 HOXA11 과메틸화와 환자 생존율 사이의 관계를 조사하였다. NSCLC에서 병의 종양 기(stage)가 환자의 생존율과 밀접한 관련이 있기 때문에, 데이터를 종양 기(stage)에 따라 분리하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐의 편평상피암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, HOXA11 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머인 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머인 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍을 포함하는 것인 조성물.
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제2항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite)인 조성물.
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분리된 생물학적 시료로부터 HOXA11 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조구 시료의 HOXA11 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐의 편평상피암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는
a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
b) 상기 처리된 DNA를 HOXA11 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머인 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 메틸화 특이적인 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 비메틸화 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 PCR 에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.
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제9항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐바이설파이트이고, 상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reastion)인 방법.
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