KR102195593B1 - Ddc의 다형성을 이용한 소세포폐암의 예후 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)의 예후 예측을 위한 DDC(Dopa Decarboxylase) 유전자 단일염기 다형성에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 DDC 유전자는 rs12666409 의 SNP를 이용하여 항암 화학 요법으로 치료된 소세포폐암의 생존 결과에 영향을 미치는 예후를 진단 및 예측할 수 있는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Description

DDC의 다형성을 이용한 소세포폐암의 예후 진단 방법{DIAGNOSTIC METHODS FOR PROGNOSIS OF SMALL-CELL LUNG CANCER USING DDC SNP}

본 발명은 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)의 예후 예측을 위한 DDC(Dopa decarboxylase) 유전자의 단일염기 다형성 및 이를 이용한 소세포폐암의 항암제 치료에 대한 반응 및 예후를 예측하기 위한 정보제공방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 폐암은 매년 1,600,000명에 이르는 새로운 환자가 발생하고, 이 중 1,400,000명이 사망한다. 이는 전체 암 발생의 13%를 차지하고, 암 관련 사망의 18%를 차지하는 수치이다. 2010년에는 폐암으로 인한 사망이 1,500,000건으로 증가하여, 전체 암 관련 사망의 19%를 차지했다.

폐암은 비소세포 폐암 (NSCLC)과 소세포 폐암 (SCLC)의 두 가지 유형으로 나뉜다. 초기 단계에서 수술이 최선의 치료 옵션인 비소세포폐암은 모든 폐암의 약 85 %를 차지한다. 소세포폐암은 모든 폐암의 약 15 %를 차지하는 매우 공격적인 암종이다. 소세포폐암은 신경 내분비 세포에서 유래된 것으로 예측되며, 빠른 종양 형성, 전이 및 재발률이 높은 특징을 가진다. 소세포폐암 환자의 생존과 치료 방법은 지속적으로 연구 중인 분야이다.

또한, 암은 흔히 국소적으로 재발하거나 본래의 암 조직으로부터 원거리의 조직 및 기관으로 전이하는 특성을 가지며, 병기에 따라 치료방법을 적절하게 선택하여야 효과적인 치료가 가능한 질병이기 때문에, 치료방법에 대한 예후를 예측하는 것이 매우 중요하다.

폐암의 이상적인 치료법은 조기 발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단 시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 또한, 폐암 발병 후의 경우, 특히 소세포암은 발견 시 외과적 수술을 통해 치료할 수 있는 가능성이 극히 적다. 현재 임상적 진단 방법으로는 재발할 가능성이 높은 환자에 대해 보다 공격적인 치료요법을 지시하기에 충분한 정확도로 조기 소세포폐암의 예후를 확인할 수 없다.

따라서, 병기 및 특성에 따라 화학 치료요법의 종류를 결정하여 치료 방법을 적용할 필요가 있고, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있도록 소세포폐암 환자의 예후를 판단할 수 있으면 생존율을 현저히 높일 수 있다.

Achaete-scute homolog 1 (ASCL1)은 기본적인 나선 루프 나선 전사 인자이며 신경 내분비 세포와 신경 조직의 분화에 필수적인 역할을 한다. 특히 ASCL1은 소세포 폐암 (SCLC)에서 자주 과발현되며 SCLC의 발병 기전에서 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은, 상기 전사인자의 타겟이 되는 유전자에서 발견되는 단일염기 다형성과 SCLC 환자의 임상 결과가 서로 연관되어 있다는 사실을 바탕으로, SCLC 환자에 있어, 항암 화학요법에 의한 치료 이후 생존률을 예측하는 방법에 대한 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 DDC(Dopa decarboxylase) 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DDC(Dopa decarboxylase) 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DDC 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 501번째 염기에 해당하는 rs12666409A>T 다형성일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐암은 소세포암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐암은 항암 화학요법으로 치료된 경우일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

나아가 본 발명은 폐암 환자에서 추출한 핵산으로부터, DDC 유전자의 rs12666409 A>T 다형성 을 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DDC 유전자의 rs12666409A>T 다형성의 유전자형이 AT+TT인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐암은 소세포암일 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

도 1은 본 발명의 rs12666409 A>T SNP에 따른 전체 생존 곡선을 나타낸 것으로, A는 공동 모델, B는 우성 모델을 각각 표시한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"예후"는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암, 바람직하게는 소세포폐암의 발병 위험성 및 발병 후의 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암을 항암 화학요법으로 치료한 환자, 보다 바람직하게는 소세포암을 항암 화학요법으로 치료한 환자의 예후를 의미한다.

"예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다.

본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.

"유전적 다형성(genetic polymorphism)"은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.

"다형성"이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다.

"단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG,AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

"유전자형(genotype)"이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.

"대립 인자" 또는 '대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다.

"대립유전자 빈도"는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 특히 췌장의 고형 가유두상 종양 진단에 유용하다. 본 발명에서는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암 재발(Recurrence) 진행(progression), 전이(metastasis)를 예측하는 것을 포함한다. 이에, 비소세포폐암의 재발 및 진행을 정확히 예측할 수 있는 지표가 매우 중요하며 조직의 분화도와 병기와 같은 임상적 지표를 보완하면서 치료의 반응을 예측할 수 있는 인자가 필요한데, 본 발명의 DDC 유전자의 SNP가 이러한 지표 기능을 하므로 소세포폐암 진단 인자로 이용할 수 있다. 즉, 이러한 유전자들의 다형성 특성 측정은 소세포폐암의 분화도 및 병기, 진행을 예측하는데 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

"진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 소세포폐암을 가진 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 소세포폐암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

"폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 항암 화학 요법으로 치료한 환자를 의미한다. 상기 폐암을 항암화학요법으로 치료한 환자는 바람직하게는 소세포 폐암에 대하여 항암화학요법을 시행한 환자를 의미한다. 상시 소세포암은 병기에 따라서 제한기, 확장기에 있는 암을 모두 포함하며, 소세포암종 혹은 복합소세포암을 모두 포함하는 개념이다.

상기 “항암 화학요법”은 환자에 항암효과를 가지는, 암 치료에 유용한 물질을 환자에 유효량으로 투여함으로써 종양을 치료하는 암 치료 방법의 하나로서, 상기 암 치료에 유용한 물질은 “항암 조성물” 또는 “항암제”, “항신생물 조성물＂등이 있다. 항암제는 이에 제한되는 것은 아니나, 화학요법제; 성장 억제제; 세포독성제; 방사선요법에서 사용되는 약제; 항혈관신생제; 항림프관신생제; 아폽토시스제; 항-튜불린제; 및 다른암 치료제, 예컨대, 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 길항제(예를 들면, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제(예를 들면, 에를로티니브(타세바(Tarceva)(상표)), 혈소판 유래 성장 인자 억제제(예를 들면, 글리벡(Gleevec)(상표)(이마티니브 메실레이트)), COX-2 억제제(예를 들면, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA VEGF 및 VEGF 수용체(들) 중 1종 이상의 표적에 결합하는 길항제(예를 들면, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생체활성 및 유기 화학 약제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 소세포폐암을 치료하기 위한 항암제로서, 보다 바람직하게는 에토포사이드(Etoposide), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈크리스틴(Vincristine), 싸이톡산(Cyclophosphamide), 아이포스파마이드(Ifosphamide) 중 1 이상을 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

“유효량”은 필요한 기간 동안 필요한 투여량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 의미하며, “치료 유효량”은 치료적으로 유리한 효과가 상기 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가할 때의 양이다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암세포의 수를 감소시킬 수 있고, 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고, 말초 기관 내로의 암세포 침윤을 억제할 수 있고, 종양 전이를 억제할 수 있고, 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고 암과 관련된 증상들 중 1 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다.

"위험"은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 진단하고자 하는 질병은 폐암과 관련된 질병이다.

상기 폐암은 바람직하게는 소세포폐암(SCLC)일 수 있으며, 상기 소세포폐암은 소세포암종 혹은 복합소세포를 모두 포함한다.

환자는 폐암, 소세포암 또는 비소세포암인 편평상피암, 선암, 대세포암이 발병한 환자로, 특히 소세포암이 발병한 환자를 의미한다. 바람직하게, 상기 환자는 폐암을 항암 화학요법으로 치료한 환자를 포함한다.

소세포폐암은 전체 폐암의 15% ~25% 정도를 차지하며, 비소세포폐암보다 발병 빈도가 낮은 편이나, 매우 공격적인 특성을 가지며, 높은 전이율 및 재발률을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 소세포폐암은 전이성으로 수술로 치료가 어려운 경우가 많아, 병기에 따라 항암 화학요법 혹은 방사선 치료를 병행한다. 소세포폐암 환자들에 대한 예후 인자를 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화 할 수 있어 소세포폐암 환자의 맞춤 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다. 이에 소세포폐암 환자의 예후 예측에 관한 연구가 국내외적으로 현재 실시되고 있으나, 아직까지 뚜렷한 연구 결과는 없는 실정이다.

본 발명은 DDC(Dopa decarboxylase) 유전자의 다형성을 이용한, 소세포폐암(SCLC) 예후 진단 및 예측 마커로서의 용도에 관한 것으로, DDC 유전자의 특정 SNP가 소세포폐암의 항암 화학요법에 의한 치료 단계에서의 나쁜 예후와 관련되어 있음을 처음으로 규명하였다. 상기 예후는 소세포폐암의 진행(progression), 재발(Recurrence) 및 전이(metastasis)를 포함한다.

DDC(DOPA Decarboxylase) 유전자는 카테콜아민 생합성 경로에 참여하는 피리독살 5-포스페이트-의존성 효소인 DOPA Decarboxylase를 암호화하며, 주요 신경 전달 물질인 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌의 합성을 주로 담당한다. 많은 연구에 따르면 DDC 유전자의 다형성은 흡연 습관과 니코틴 의존성, 알코올 소비 표현형, 자폐증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애와 같은 다양한 특성 또는 질병과 관련이 있다고 알려져 있다. DDC는 신경 전달 물질의 생합성 기능을 발휘하는 중추 신경계와 간, 신장, 폐 및 위장관을 포함한 많은 말초 기관, 심지어 생물학적 기능이 아직 밝혀지지 않은 말초 백혈구에서도 발현 된다. 이러한 사실을 통하여 도파민을 포함한 생체 아민이 혈관 신생, 세포 증식, 분화 및 세포 사멸과 같은 다양한 생물학적 과정에 참여하며, 암의 발병에서 DDC가 잠재적인 역할을 할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 특히 본 발명과 관련하여, 소세포폐암 및 신경 아세포종 및 갈색 세포종에서 높은 DDC mRNA 발현이 보고된 바 있으나 어떤 종류의 암에서는 DDC의 높은 발현이 좋은 예후를 보여주는 결과도 보고되어 있다. DDC의 발현은 세포 유형 특이적, 맥락-의존적 방식으로 다양한 암의 발병과 관련 될 수 있음을 시사하는 이며, 본 발명자들은 특히 소세포폐암과 관련하여, DDC 유전자의 특정 부위의 SNP가 환자의 치료 예후 예측에 활용될 수 있는 점을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 Achaete-scute homolog 1 (ASCL1)이 소세포폐암 환자에서 과발현된다는 사실을 바탕으로 상기 ASCL1 의 타겟이 되는 유전자를 스크리닝하였다. 기존 연구에서 ASCL1 유전자의 억제가 폐 신경 내분비 세포를 잃게하고, SCLC에서 성장 억제 및 세포사멸을 유도한다는 사실이 공지되어 있으며, 특히 ASCL1이 Notch 신호 전달과의 상호 작용을 통해 소세포폐암의 진행을 촉진할 수 있다고 알려져 왔다. 따라서 본 발명자들은 ASCL1 의 타겟이 되는 58개의 표적 유전자로부터 각각의 SNP를 검색하여, 항암화학요법을 시행한 소세포폐암 환자의 임상 결과와 상기 SNP 간의 연관성을 평가하였다. 그 결과, DDC 유전자의 501번째 염기의 rs12666409A>T 가 항암 화학요법을 시행한 환자의 예후와 크게 관련되어 있음을 발견하게 된 것이다.

그러므로, 본 발명은 일 관점에서 DDC 유전자의 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 예후의 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.

구체적으로, DDC 유전자의 단일염기다형성(SNP) rs12666409A>T 의 소세포폐암 예후 진단 및 예측 용도 및 이의 이용에 관한 것이다.

상기 DDC 유전자는 공지된 것, 예를 들면 공지된 인간 유래의 서열을 공지된 DB로부터 수득할 수 있는데, 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 소세포폐암 예후 진단 마커는, 폐암, 바람직하게는 소세포폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 변화하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명자들은 소세포폐암 환자로, 항암화학요법을 진행한 환자를 대상으로, DDC 유전자의 다형성을 조사하여, 유전형과 전체 생존 (overall survival, OS)과의 관계를 분석하였다.

상기 전체 생존(OS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막으로 추적 조사한 날까지를 말한다. 분석 결과, 소세포암 환자에서 DDC 유전자는 rs12666409 A>T 다형성이 전체 생존과 유의적으로 관련성이 있음을 알 수 있었다.

rs12666409의 AT+TT 유전형은, rs12666409의 AA 유전형보다 OS 및 항암 화학요법에 대한 치료 반응에서 좋지 않은 결과를 보였다.

따라서, 본 발명의 DDC rs12666409 A>T SNP는 항암 화학요법을 시행한 소세포폐암 환자에 대하여 독립적인 예후 마커로 볼 수 있으므로. 이에 대한 분석은 소세포폐암 예후에 대한 고위험을 가진 환자 그룹을 판별하는데 도움을 주어, 소세포폐암의 치료 방법을 결정하는 데 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 일 구체예로서, DDC 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 rs12666409 A>T SNP를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 20개 이상, 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 50개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

본 발명은 DDC 유전자의 rs12666409 A>T 에 대한 유전적 접근까지 확장한다.

본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism),PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 생존 예후 예측(진단)용 마커 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 포함되는, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs12666409 A>T SNP를 포함하는 20~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 상기의 rs12666409 A>T SNP를 포함하는 20~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific) 이다.

대립형질 특이적 (allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화 되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립 형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지될 수 있으며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르,포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 다른 구체예로서 상기 조성물을 포함하는 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 마이크로어레이(Microarray) 방법은 종양 내의 수천 또는 심지어 수만 개의 유전자의 RNA 발현을 동시에 연구할 수 있어, 인간 질병의 분자적 기초에 대한 포괄적 통찰력을 보다 효과적으로 얻을 수 있게 해준다. 또한, 이를 이용하여 종양 분류에서의 유전자 발현 패턴, 임상학적 결과 및 화학적 치료요법에 대한 반응의 평가가 가능하다.

유사한 관점에서 본 발명은 또 하나의 예로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 폐암 생존 예후의 예측용 마커인, DDC rs12666409 A>T 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 폐암 생존 예후를 예측하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 폐암 생존 예후의 예측용 키트에는 DDC rs12666409 A>T의 SNP 를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 발견에 기초하여 DDC 유전자의 rs12666409 A>T SNP 발현수준 변이, 바람직하게는 프레임 시프트 변이를 측정하는 것을 포함하는, 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 예후 진단 및 예측 방법 또는 이를 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기 방법은 또한, 소세포폐암의 항암 화학요법 치료 후 재발 또는 전이 방지를 위한 치료 방법의 결정에도 유용한 정보를 제공한다.

일 구체예로서, 본 발명의 방법은

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DDC 유전자의 rs12666409 A>T SNP 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 DDC 유전자의 rs12666409 A>T SNP 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현과 비교하는 단계를 포함하는 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

이 때, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 DDC rs12666409 A>T 다형성의 경우 AT+TT 유전형을 갖는 환자군의 전체생존 및 무병생존의 위험비가 다른 유전자형보다 매우 높은 것으로 판별하는 것을 특징으로 한다. 즉, SNP의 유전자형이 AT+TT인 경우 생존 예후가 나쁘다고 진단 및 예측될 수 있다.

상기 진단방법은, 특히 소세포폐암에 따른 특정 마커의 발현 특징을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 소세포폐암 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.

폐암 환자의 핵산은 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.

상기 폐암 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명은, 또한, 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 항암 화학요법의 재발 또는 전이 방지를 위해 필요한 치료방법의 결정을 위한 정보도 제공할 수 있다.

즉, 본 발명은 소세포폐암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DDC 유전자의 rs12666409 A>T 다형성을 확인하여 예후가 나쁜 경우와 그렇지 않은 경우에 따라 폐암 수술 후 투여할 항암제의 종류, 양 및 농도 등 항암제 투여 방법을, 해당 폐암의 종류에 따라 적합하도록 서로 상이하게 적용할 수 있다.

이처럼, 본 발명에서는 폐암, 바람직하게는 소세포폐암 환자에게서 DDC rs12666409 A>T 발현 프로파일을 이용하는, 폐암 예후 진단 및 예측 마커로서의 모든 용도를 포함한다.

그러므로 본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

<실험 재료 및 방법>

1. 연구 대상 (Study populations)

이 연구는 1997 년부터 2017 년까지 경북 대학교 병원에서 SCLC 진단을 받은 후, 항암 화학요법을 받은 261 명의 환자를 대상으로 하였다. 화학요법에 대한 방사선 치료의 영향을 방지하기 위하여 1차치료 방식으로서 화학 요법과 방사선 요법을 동시에 받은 환자는 제외하였다. 본 연구에 사용된 샘플 및 임상 정보는 경북 대학교 병원의 국립 바이오 뱅크 기관 심사위원회(IRB) 승인 프로토콜에 따라 제공 하였으며, 모든 환자의 동의하에 진행되었다. 1차 항암화학요법으로 에토포시드와 시스플라틴을 처리하거나 이리노테칸과 시스플라틴을 처리한 환자들을 연구대상으로 하였다. 에토포시드는 3주마다 1내지 3일차에 환자의 정맥으로 100 mg/m²를 투여 하고, 1일 차에 시스플라틴 60mg/m² 를 투여하였으며. 이리노테칸은 매 4주마다 1 일, 8 일, 15 일차에 60mg/m²을 투여하고, 1일차에 시스플라틴 60mg/m² 를 정맥 내 투여하였다. 환자의 질병 진행, 주요 독성 또는 환자 또는 의사의 결정에 따라 치료 유지여부를 결정하였다. 종양 반응의 평가는 매 2 사이클마다 컴퓨터 단층 촬영 스캔에 의해 수행되었다. 고형 종양에서의 반응 평가 기준을 사용하여 반응을 평가 하였다(Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer 2009; 45: 228-247.). 각 환자에 대한 최상의 전반적인 반응(best overall response)이 보고되었으며 모든 반응은 별도의 방사선 전문의가 검토하였다. 1 차 화학 요법에 대한 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)을 갖는 환자는 반응자, 안정된 질환 (SD) 및 진행성 질환 (PD)을 갖는 환자는 비 반응자로 간주되었다.

2. 단일염기 다형성 선정 및 유전형 분석

Public research를 통해 얻은 총 58개의 ASCL1 타겟 유전자에 있는 모든 다형성은 public SNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)를 이용하여 선정하였다. HapMap JPT data를 기반으로 소수 대립유전자의 빈도(MAF)가 5% 미만이며 연관불균형(LD;linkage disequilibrium) 계수 r²이 0.8이상인 것은 제외하여 134개의 다형성이 선정되었다. 유전형 분석을 진행한 후, call rate가 95% 미만이며 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium) 계수 0.05 미만인 것을 제외하여 최종 103개의 다형성을 선정하였다. Blood QuickGene DNA whole blood kit S (Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 103개의 다형성은 SEQUENOM’S MassARRAY® iPLEX assay (SEQUENOM Inc., San Diego, CA)를 사용하여 유전자형을 분석하였다. (도 1)

우리는 발표 된 연구 논문 (Lasky-Su J, Neale BM, Franke B et al. Genome-wide association scan of quantitative traits for attention deficit hyperactivity disorder identifies novel associations and confirms candidate gene associations. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2008; 147B: 1345-1354.)에서 58 개의 ASCL1 표적 유전자 목록을 검색하고, 잠재적으로 기능적인 다형성을 찾기 위해 공개 데이터베이스를 사용하여 해당 유전자의 모든 SNP(n=35,995)를 수집 했다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). 즉, SNPinfo 웹 서버 (https://snpinfo.niehs.nih.gov/)에서 기능적 SNP를 예측하기 위해 FuncPred 유틸리티를 사용하여 331 개의 SNP를 수집하였다. 소수 대립 유전자 빈도(MAF)가 0.1 미만인 SNP(HapMap-JPT 데이터에서 0.1미만, n=95)는 NCBI SNP 데이터베이스 (https://snpinfo.niehs.nih.gov/)에 근거하여 제외되었으며, 236개의 SNP가 남아 있었다. 다음으로, SNPinfo 웹 서버에서 TagSNP 유틸리티를 기반으로 연관불균형(LD;linkage disequilibrium) 계수 r²이 0.8이상인 것은 제외하여 95개의 SNP가 제외되었으며, 추가 연구를 위해 141개의 SNP를 선발하였다. 다중화 수준에서 24 plex의 프라이머를 설계하였고 프라이머 조합으로 7개의 SNP를 배제한 후 총 134개의 SNP를 사용하여 3 단계 PCR을 처리 하였다. 유전자 변형은 제조 지침에 따라 SEQUENOM의 MassARRAY iPLEX 분석 (SEQUENOM Inc., Sandiego, USA)을 사용하여 수행 하였다. 상기 134 개의 SNP 중에서, call rate가 95% 미만이며 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium) 계수 0.05 미만인 것을 제외하여 최종 103개 SNP가 통계 분석을 위해 처리되었다.

3. 통계분석

이러한 모든 통계 과정은 통계 소프트웨어 (SAS, Ver. 9.4, SAS institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행되었다. 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)은 적합도 χ2 테스트를 사용하여 테스트되었다. 환자의 특성에 따른 유전자형 분포의 차이는 카이 제곱 검정을 사용하여 비교 하였다. 생존 평가를 위해, 첫 화학 요법 날짜와 사망 날짜 사이의 시간을 전체 생존(OS)으로 측정 하였다. 상이한 유전자형 및 임상 변수에 따른 추정 생존은 Kaplan-Meier 방법 및 로그-순위 검정법(log-rank test)을 사용하여 분석하였다. 위험비(Hazard ratio, HR) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 다변량 콕스의 비례위험모형(multivariate Cox proportional hazards models)을 사용하여 계산하였다. 항암화학요법에 대한 치료 반응분석은 logistic regression test를 통해 오즈비(Odds ratio, OR) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 사용하여 계산하였다. Cut-off P=0.05는 모든 통계적 분석에 채택되었고, 모든 임상적 요인은 다음과 같이 조정되었다; 성별 (남성 vs 여성), 흡연 상태 (흡연자 없음 / 흡연자 / 현재 흡연자), 임상 단계(제한된 질병 대 광범위한 질병), ECOG PS(0-1 대 2), 체중 감량 (예 vs 아니오), 2차-line 화학 요법 (예 vs 아니오), 종양에 대한 방사선 치료여부(예 vs 아니오).

<실시예 1> 환자 특성 및 임상적 예측 인자

SCLC로 진단 된 261 명의 환자에 대하여, 특성 및 임상적 예측 인자를 선발하였으며, 기준이 되는 특성은 표 1에 제시하였다. 환자의 평균 연령은 68 세( 34-86)로, 모든 환자 중 226 명이 남성이고 242 명이 흡연자였다. 62 명의 환자가 제한 질환 (LD)을 갖고 195 명의 환자가 광범위한 질병 (ED)을 가지고 있었다. 전체 환자 중 215 명의 환자가 ECOG 수치 0-1인 PS(performance states)로 기록되었으며 76 명의 환자는 체중 감소가 나타났다(지난 3개월간 >5%). 1 차 화학 요법으로, 134 명의 환자가 에토포시드/시스플라틴을, 127 명의 환자가 이리노테칸/시스플라틴을 처방 받았다. 140 명의 환자는 2 차 화학 요법을 받았으며, LD를 가진 66 명의 환자 중 34 명은 순차적으로 방사선 치료를 받았다.

<실시예 2> SNPs 및 생존 결과 사이의 관련성

임상 결과는 환자의 임상 특성에 따라 추정되었다 (표 1). 1 차 화학 요법 반응자에 대한 결과는 261 명의 환자 중 190 명(72.8 %)에서 측정되었다. ECOG PS 2인 환자 는 ECOG PS 0-1(P = 0.05)인 군과 비교하여 화학 요법에 대한 더 나쁜 반응을 나타내는 것으로 확인되었고, 1차 화학요법으로 이리노테칸/시스플라틴을 처방한 환자는 에토포시드/시스플라틴 (P = 0.04)에 비해 상당히 더 나은 반응과 관련이 있었다. 그러나 연령, 성별, 흡연 상태, 단계 및 체중 감량에 따른 반응률에는 큰 차이가 없었다. 추정된 평균 생존 시간 (MST)은 10.5 개월 (95 % CI = 9.3-11.4 개월)이었다. OS 악화와 유의하게 관련된 임상적 요인은 나이(68 세 이상, P=0.0004), ED(P=0.001), ECOG PS 2 (P=0.0004), 체중 감소 (P=0.03), 2 차 화학 요법 진행 여부(받지 않은 경우 P=0.0003), 방사선 요법 진행 여부(받지 않은 경우, P=2×10^-5) 등이 있었다. 그러나 성별, 흡연 상태 및 1 차 화학 요법은 OS와 크게 관련이 없는 것으로 확인되었다.

<실시예 3> 임상적 결과와 ASCL1 타겟 유전자의 SNP 사이의 연관성

선발된 SNP ID 및 이들의 빈도(%) 및 소수 대립 유전자 빈도를 확인하였다. 다변량 분석에 따르면, 10개의 SNPs(DDC rs12666409, BEND5 rs1385152, FOXG1 rs12589013, DBH rs1611131, DBH rs1611114, CACNA1C rs10466907, CACNA1A rs2248069, DDC rs3735273, SLC8A3 rs3809401, GABRB3 rs4906902)가 명백하게 항암 화학요법에 대한 반응과 연관되어 있었고, 19 개의 SNPs(DDC rs12666409, CACNA1A rs7254351, SNAP25 rs3746544, GABRB3 rs751994, GRIP1 rs4617664, GRIP1 rs17827030, KCNK16 rs4714238, LFNG rs755179, ADCYAP1 rs1610037, FOXA2 rs1055080, DLL3 rs3212275, GNAO1 rs3790112, SLC8A3 rs8022091, DBH rs5320, TPH1 rs10488682, JAG2 rs1057744, MYT1 rs2427625, BARX1 rs4563951, SLC8A3 rs8018340)가 OS와 연관되어 있음을 확인하였다.

상기 28개의 SNP 중에서도 특히 DDC rs12666409 A>T의 단일염기 다형성은 화학 요법에 대한 반응 악화 및 전체 생존(OS) 감소 모두와 명백히 관련이 있었다. (Domonant 모델에서, 조정된 오드비(odd ratio)[aOR]=0.40, 95% CI=0.18-0.90, P=0.03, 조정된 위험률(hazard ratio)[aHR]=1.52, 95% CI=1.10-2.10, P=0.01) (표 2 및 그림 1).

단계적 층화 분석(stage-stratified analyses)에서, SNP와 항암 화학요법 반응에 대한 연관성은 ED 환자(Dominant 모델, aOR=0.19, 95% CI=0.06-0.60, P=0.01; aHR=1.73, 95% CI=1.16-2.56, P=0.01)에서만 유의 하게 나타났으며, LD와는 명확한 관련성은 관찰되지 않았다(Dominant 모델, aOR=0.99, 95% CI=0.26-3.73, P=0.99; aHR=1.20, 95% CI=0.61-2.35, P=0.60)(표 3). 화학 요법 요법에 따라 계층화하였을 ‹š, 에토포시드-시스플라틴을 투여받은 환자(Dominant 모델에서, aOR=0.35, 95% CI=0.13-0.94, P=0.04; aHR=1.65, 95% CI=1.05-2.59, P=0.03)에서 명확한 연관성이 있는 것으로 나타났고, 이리노테칸-시스플라틴을 투여받은 환자(Dominant 모델, aOR=0.52, 95% CI=0.13-2.05, P=0.35; aHR=1.30, 95% CI=0.81-2.09, P=0.28)의 경우에는 그렇지 않았다 (표 3).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyoungpook National University industry-university Coorperation Foundation <120> DIAGNOSTIC METHODS FOR PROGNOSIS OF SMALL-CELL LUNG CANCER USING DDC SNP <130> PN1907-351 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DOPA Decarboxylase gene <400> 1 ttctgggtga ggcaatgcct cgccctgctt cagctcacac tcagtgcact gcacccactg 60 tcctgcaccc actttctgac actccccagt gagatgaacc tggtacctca gttggaaatg 120 cagaaatcac ccgtcttctg cgtcgctcat gctgggagct gtagactgga gctgttccta 180 ttcagccatc ttggctccat ccctctcttt tgtactcttt ccctttattt ctcagagtgg 240 ccgacactta gggaaaatag aaaagaacct acgttgaaat atttgggact ggttcccctg 300 atatctggca cccacgtggg tttttttttt tcctaagtgc atatgggaac acaattccct 360 ttggtaggtg cagagaaatg tcatcggttc agtccacaga aatgcatgtt tgactcccta 420 acaactggtg agtagtctgt gtatggtccg ggttaactat gggtcacatg gagtctaaaa 480 attatactta tctcttttat attaaactcc gattaaaaca aatgaaaaga gtttgagtgc 540 ccatggaaaa tatggtcact ctattcaggg cagtggaaga atacagtcct tggtttcctg 600 aaaaaggaac cttagatgta gaactatggg atcatgttgg ttcaacattc caggaaatgg 660 tctcggcagg gaattatgtt cccgtccctg tttttggtga ttgggccttg gtacgtgcca 720 tattaatgac ataccaatcc cgtgaccccc tacagttacc acaattttct gaatctgttg 780 accctccacc tcttcctcaa ccctcctctc ctgcacggcc ttcgttatct gatcagcctc 840 ttccttcgtc tactcctccc ccacctgacg atgttgagaa ttcaatgtct aaccccggtg 900 agtttggatt gcagtcagcg cctgatgatc ttatttcttt tcacaaagag ctggtactca 960 tagctcctgc ggcccggacc cacatatcct gggaccatag a 1001

Claims (9)

1. DDC 유전자의 단일염기다형성(SNP)을 함유하는, 소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물에서,
   상기 DDC 유전자의 단일염기다형성은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 501번째 염기에 해당하는 rs12666409 A>T 다형성인 것을 특징으로 하는, 소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 소세포폐암은 항암 화학요법을 사용하여 치료한 것을 특징으로 하는, 소세포폐암 예후 진단 및 예측을 위한 마커용 조성물.
5. 제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트.
6. 제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이.
7. 소세포폐암 환자에서 추출한 핵산으로부터, DDC 유전자의 rs12666409 A>T 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 DDC 유전자의 rs12666409 다형성의 유전자형이 AT+TT인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
9. 삭제

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