JP6348115B2 - がん療法のためのエンドサイトーシス阻害剤および抗体の使用 - Google Patents
がん療法のためのエンドサイトーシス阻害剤および抗体の使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6348115B2 JP6348115B2 JP2015538212A JP2015538212A JP6348115B2 JP 6348115 B2 JP6348115 B2 JP 6348115B2 JP 2015538212 A JP2015538212 A JP 2015538212A JP 2015538212 A JP2015538212 A JP 2015538212A JP 6348115 B2 JP6348115 B2 JP 6348115B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- tumor
- antibody
- cell surface
- egfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
- A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/18—Sulfonamides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
- A61K31/5415—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. phenothiazine, chlorpromazine, piroxicam
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/724—Cyclodextrins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
Description
本発明は広くは、がんを処置または予防するための薬剤に関する。より詳細には、本発明は、がん関連受容体陽性のがんを含むがんを処置するための、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤およびダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤を含む、エンドサイトーシス阻害剤の使用に関する。具体的な態様において、エンドサイトーシス阻害剤は、がんに対する免疫応答を増強するために免疫療法剤と組み合わせて用いられる。
抗体療法は、自己免疫疾患およびがんを含むいくつかの疾患に対処するのに有望な治療戦略として幅広い支持を得てきた。抗体単独療法および併用処置を開発するうえでの急速かつ素晴らしい進展にもかかわらず、そのような病気に起因する疾患の負担は、あまり緩和されていない。そのような疾患に関連した正常なおよび病的な免疫学的プロセスの複雑性は、抗体処置に対する抵抗性または獲得抵抗性と相まって、良好な患者転帰の進展に対する障害の一部であり続けている。
[本発明1001]
受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体、および受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物。
[本発明1002]
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤である、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、メチル-B-シクロデキストリン、フェノチアジン、モノダンシルカダベリン、クロロキン、モネンシン、およびダイナミン阻害剤から選択される、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤である、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、ダイナミンGTPase阻害剤およびダイナミン環安定剤から選択される、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
細胞表面抗原が腫瘍関連抗原である、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
腫瘍関連抗原がEGFRおよびHer2/neuから選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法であって、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤の有効量と、受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体の有効量とを対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1009]
増強された免疫応答が、増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
増強された免疫応答が、腫瘍細胞の表面上のMHCクラスIIの発現を刺激することまたは増強することを含む、本発明1008または本発明1009の方法。
[本発明1011]
対象においてがんを処置または予防するための方法であって、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と、がんに関連する腫瘍細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体とを、がんの処置または予防に有効な量で、対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1012]
腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体の効力を対象において増強するための方法であって、抗体の効力を増強するのに有効な量で受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を対象に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1013]
腫瘍を、抗体感受性サブタイプまたは抗体抵抗性サブタイプから選択されるサブタイプに分類する段階、および腫瘍が抗体抵抗性サブタイプに分類されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階をさらに含む、本発明1008〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
分類が、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を分析する段階を含む方法によって行われ、ここで、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態から、腫瘍が抗体感受性サブタイプであることが示され、かつここで、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の状態から、腫瘍が抗体抵抗性サブタイプであることが示される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
細胞表面抗原のリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90%が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、本発明1014の方法。
[本発明1016]
細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において、少なくとも10分後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の90%未満が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、本発明1014の方法。
[本発明1017]
腫瘍が、細胞表面抗原陽性の腫瘍である、本発明1008〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
腫瘍が、前がん性、非転移性、転移性、およびがん性の腫瘍から選択される、本発明1008〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
腫瘍が、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病、およびリンパ性悪性疾患から選択されるがんに関連している、本発明1017または本発明1018の方法。
[本発明1020]
がんが、肺がん、肝細胞がん、胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんから選択される、本発明1019の方法。具体的な態様において、腫瘍は上皮由来のものであり、その非限定的な例としては、肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および皮膚がんが挙げられる。
[本発明1021]
がんが扁平上皮がん(SCC)である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
対象を、抗体に対する応答者および抗体に対する非応答者から選択される処置亜群に層別化する段階、および対象が非応答者として層別化されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階をさらに含む、本発明1013〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
層別化が、
本発明1013〜1021のいずれかの腫瘍分類方法にしたがって腫瘍を分類する段階、および
対象の腫瘍が、損なわれたもしくは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する応答者と特定する段階、または対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する非応答者と特定する段階
を含む方法によって行われる、本発明1022の方法。
[本発明1024]
分析のために対象から腫瘍サンプルを得る段階をさらに含む、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
対象に補助的がん療法を施行する段階をさらに含む、本発明1013〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
補助的療法が、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、および抗体以外の免疫療法から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
本発明1013〜1023のいずれかの方法で用いるための試薬を含むキット。
[本発明1028]
試薬が、細胞表面抗原のリガンドである、本発明1027のキット。
[本発明1029]
試薬が、細胞表面抗原に結合する抗体である、本発明1027のキット。
[本発明1030]
方法の全部または一部が処理システムによって行われる、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
1. 定義
特に明記していなければ、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における記述と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を記述する。本発明の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。
本発明は、対象において腫瘍に対する増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む増強された免疫応答を刺激するための組成物を提供する。これらの組成物は概して、(1) 受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原と結合する治療用抗体、および(2) 受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を利用する。
抗体が標的とする細胞表面抗原は、適当には腫瘍関連抗原であり、その説明に役立つ実例としては、Her2/neu、EGFR、Epcam、VEGFR、FGFR、MUC-I、CA 125、CEA、MAGE、CD20、CD19、CD40、CD33、A3、A33抗体に特異的な抗原、BrE3抗原、CD1、CD1a、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD21、CD22、CD23、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD45、CD46、CD52、CD54、CD74、CD79a、CD126、CD138、CD154、B7、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR (例えば、HLA-DR10)、NCA95、NCA90、HCGおよびサブユニット、CEA (CEACAM5)、CEACAM-6、CSAp、EGP-I、EGP-2、Ba 733、KC4抗原、KS-I抗原、KS1-4、Le-Y、MUC2、MUC3、MUC4、P1GF、ED-Bフィブロネクチン、NCA 66a-d、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、SlOO、TAG-72、TlOl、TAG TRAIL-R1、TRAIL-R2、p53、テネイシン、インスリン増殖因子-1 (IGF-I)、Tn抗原などが挙げられる。
本発明によって企図される受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、治療用抗体が対象にする細胞表面抗原のエンドサイトーシスまたは内部移行を任意の手段によって阻害または抑止する任意の薬剤を包含する。適当には、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、可逆性の受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤である。具体的な態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤であり、その説明に役立つ実例としては、メチル-β-シクロデキストリン(β-CD)、疎水性アミン(フェノチアジン、モノダンシルカダベリンおよびクロロキンのような)、モネンシン、高張性スクロースならびにDynasoreが挙げられる。フェノチアジンには、クロルプロマジン、フルフェナジン、メソリダジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、プロマジン、チオリダジン、トリフルオペラジンおよびトリフルプロマジンが含まれるが、これらに限定されることはない。β-CDは、原形質膜からコレステロールを選択的に除去することによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。疎水性アミンは、クラスリンおよびクラスリンコート小胞の機能に影響を与えることによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。モネンシンは、プロトン勾配をなくすことによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。高張性スクロースは、クラスリンおよびアダプタが相互作用するのを防ぐことによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。Dynasoreは、被覆ピットの形成を促進するダイナミンGTPaseを阻害する。
M-Sp-M' (I)
式中、
MおよびM'は、各々独立して式II:
の部分であり、同じものまたは異なるものであり、
Spはスペーサーであり;
VはCまたはCHであり;
WはCHまたはリンカー基であり;
Yは、水素、シアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換C1〜C3基もしくはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基であり; あるいは
W、VおよびYが、Zと縮合された5員または6員置換または非置換複素環または炭素環を形成し、ここで複素環は、O、NおよびSから選択される1〜3個のヘテロ原子を含み、炭素環または複素環は、置換時に、シアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換C1〜C3基もしくはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基から選択される少なくとも1つの置換基を有し;
Rは、CH2R'、CXR'またはCHX'R'であり;
XはOまたはSであり;
X'は、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換C1〜C3基またはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基であり;
R'はスペーサーに結合されたNH、OまたはSであり;
Zは以下から選択され:
(a) O、NおよびSから選択される最大3個までのヘテロ原子を含む5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる非置換複素環基;
(b) 5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる非置換炭素環基;
(c) O、NおよびSから選択される最大3個までのヘテロ原子を含む5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる複素環基、ここで、この複素環基は、以下から独立して選択される1つまたは複数の置換基を有し:
(i) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシル;ならびに
(ii) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシルから選択される少なくとも1つの置換基を有するC1〜C2アルキルまたはC1〜C2アルケニル基;ならびに
(d) 5員環もしくは6員環を独立して有する1つもしくは2つの環、ならびに、Wが、CHもしくはリンカー基であるか、またはW、VおよびYが、非置換炭素環基を形成する場合には、少なくとも2つの置換基、あるいはW、VおよびYが複素環基を形成する場合に、以下から独立して選択される、少なくとも1つの置換基からなる炭素環基:
(i) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシル;ならびに
(ii) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシルから選択される少なくとも1つの置換基を有するC1〜C2アルキルまたはC1〜C2アルケニル基;
ここでMまたはM'の一方のZが(b)から選択される場合、MまたはM'の他方のZは(a)、(c)または(d)から選択される。
式中、例えば、R1はOHであり、R2はOHであり、かつR3はHであり; R1はHであり、R2はOHであり、かつR3はOHであり; またはR1、R2およびR3はOHであり; nは通常0、1、2または3、および最も通常は1である。
放射線療法には、DNA損傷を引き起こす放射線および波動、例えば、γ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体などが含まれる。治療法は、局所腫瘍部位に上記の形態の放射線照射を照射することによって達成されうる。これらの因子は全てDNAに、DNAの前駆体に、DNAの複製および修復に、ならびに染色体の構築および維持に広範囲の損傷を及ぼす可能性が最も高い。
化学療法剤は、以下のカテゴリのいずれかの1つまたは複数から選択されうる。
免疫治療法には、例えば患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるためのエクスビボおよびインビボ手法、例えばインターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインでのトランスフェクション、T細胞アネルギーを減少させるための手法、サイトカインでトランスフェクションされた樹状細胞のようなトランスフェクションされた免疫細胞を用いた手法、サイトカインでトランスフェクションされた腫瘍細胞株を用いた手法および抗イディオタイプ抗体を用いた手法が含まれる。これらの手法は一般に、がん細胞を標的化し破壊する免疫エフェクタ細胞および分子の使用に依る。免疫エフェクタは、例えば、悪性細胞表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体のみで治療のエフェクタとなりえ、または抗体は他の細胞を動員して、細胞死滅を実際に容易にし得る。抗体は、薬物または毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合され、単に標的化薬剤として働いてもよい。あるいは、エフェクタは悪性細胞標的と、直接的にまたは間接的に、相互作用する表面分子を保有しているリンパ球でありうる。さまざまなエフェクタ細胞が細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。
他のがん治療法の例としては、光線療法、凍結療法、毒素療法またはアポトーシス促進療法が挙げられる。当業者は、この一覧が、がんおよび他の過形成病変に利用可能な治療法のタイプを網羅するものではないことを承知しているであろう。
本発明は同様に、治療用抗体に対する非応答者である対象をより良好に管理するために、腫瘍を治療用抗体感受性および治療用抗体抵抗性のサブタイプに分類する方法の使用を企図する。本発明によれば、これらの分類方法は、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原(例えば、受容体)の内部移行状態を分析することを含む。対照(例えば、正常な細胞表面抗原発現細胞)と比べて損なわれまたは抑止されている、検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行から、腫瘍が治療用抗体感受性と分類されるのに対し、対照と同じであるか、対照と同様であるか、または対照よりもさらに高い、検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行から、腫瘍が治療用抗体抵抗性と分類される。いくつかの態様において、細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるEGFRの少なくとも90% (例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%)が細胞の原形質膜(例えば、側底膜)に局在化しているか、もしくは局在化したままである場合; (b) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞の原形質膜に局在化している細胞表面抗原と、それらの細胞の細胞内区画(例えば、細胞質、核など)において局在化している細胞表面抗原との比率が90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1もしくは100:0から選択される場合; または(c) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%未満である場合、損なわれたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示唆される。
材料および方法
材料
細胞株には、舌、咽頭および下咽頭に由来する例を含めてHNSCC由来の7種の株; SCC-9、SCC-15、SCC-25、Detroit-562、Cal 27、FaDu、およびColo-16が含まれる。加えて、さらに2種の株、形質転換されたヒト上皮ケラチン生成細胞に由来するKJD、および外陰部SCCに由来しかつEGFRを過剰発現することが知られているA-431を用いた。細胞株の同一性をSNP分析によって検証した。細胞はマイコプラズマを含まなかったが、定期的に試験した。細胞をHam's F-12培地: 10% FBS、10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM (Gibco, Invitrogen)中で増殖させた。基本条件の場合、細胞を完全培地中で、しかし10% FBSなしで3時間増殖させた。他の試薬には、Alexa488標識EGF (Invitrogen)、EGFR (クローン31G7; Invitrogen) Alexa-594ヤギ抗マウスIgG (A11005; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗マウスIgG (A10547; Invitrogen)、マウス抗フロチリン-1 IgG (610821; BD Transduction Laboratories)が含まれた。
SCCまたは表皮内がん(IEC)の疑いのある患者を医師が特定する。生きている組織サンプルを氷上で解剖病理学部に搬送し、そこで熟練した病理学者がサンプルを解剖し、実験室内試験に適した組織部分を提供する。日光角化症は通常は切除されないため本試験には特に要求されないものの、日光角化症(AK)であることが後に判明する任意の生検病変が含まれている可能性があり、非病変部の皮膚組織は切除標本の辺縁に由来する。
手短に言えば、サンプル調製に用いられる技法は、以下の通りである。患者より切除直後に臨床領域から組織サンプルを回収する。病理医が、小さい、代表的な切片を提供し、特定の方法でこれを薄片にする。サンプルを垂直に切って厚さがおよそ1 mmの切片を作製し、いずれの皮下脂肪も薄片作製の前に切除して少なくし、標本の全層を包含しうるように、ペトリ皿の中でサンプルの向きを定める。薄片作製は外科用メスまたはかみそりの刃を用いて手作業で行う。サンプルをその後、冷無血清培地の洗浄液中で最大1時間処理する。EGF (EGF-Alexa Fluor 488 -Invitrogen)をSFMに加え、さまざまな時点についてサンプルを37℃でインキュベートする。サンプルのなかには、対照としてEGFが加えられていないものもあれば、最初にセツキシマブが加えられているものもあり、リガンド結合が遮断されるべき対照としてのEGFの添加の前に30分間インキュベートする。適切な時点についてのインキュベーションの後、氷中で冷却し、0.1% Triton X-100を含む冷PBS (PBTx)中で洗浄することによって取り込みを停止させる。数回の洗浄の後、サンプルを4%パラホルムアルデヒド中で終夜固定する。
デントの脱色液(Dent's bleach)、その後にサンプルを水性に戻すためのメタノール系列を用いてサンプルを脱色プロトコルに供する。次いで、さまざまな抗体を用い、PBTx中10%のウマ血清中でのインキュベーションによって過剰な結合をブロックして、免疫蛍光を行うことができる。ほとんどの場合、抗EGFR抗体(マウス抗EGFR、クローン31G7-Invitrogen)を用いて、受容体を可視化するが、複数の切片が利用可能な大きい腫瘍サンプルの場合、抗EEA1抗体および抗クラスリン抗体のような他の抗体をさらに用いてもよい。この後に、Alexaを結合した適切な二次抗体を用い、核染色のためにDAPIを加える。一部のサンプルは、二次抗体にだけ曝露させ、染色対照とする。サンプルを次に、ProLong Gold(商標)抗フェードマウンティング試薬(Invitrogen)を用いて中心がくぼんだスライド上にマウントし、Zeiss共焦点顕微鏡での画像化の前に密封する。
Zeiss 510 Metaレーザー共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×でZen 2008ソフトウェアを用いてスライドを画像化した。組織学的特徴についてスライドを調べて、63×と25×の両方で表皮への局在化を確認した。気付いた特徴は、表皮真皮接合部および基底膜の存在、自己蛍光コラーゲンおよび細胞不足を伴う典型的な真皮外観、重層扁平上皮を伴うおよび異形成組織における表皮の典型的な外観、核多形性を伴う不規則さであった。表皮の厚さは、表皮肥厚として重要であり、過形成は異形成病変の特徴である。角質層においても、ともに異形成病変の特徴である肥厚を、不全角化と同様に認めることができる。表皮または浸潤性ケラチン生成細胞巣の複数の領域を63×で画像化して、EGF488の分布を明示する。可能な場合、代表的な腫瘍領域でzスタック画像を撮る。画像を倍率25×で撮ってまたはタイルを63×でスキャンして、標本の全体的な特徴を示す。
画像は経験豊富な研究者が細胞免疫蛍光法(スーパーバイザーFS)を用いて再検査し、Alexa-EGF488の分布の原則外観に基づいて「内部移行」または「調節不全」のいずれかに分類した。内部移行していた腫瘍のサンプルは、核からさまざまな距離のエンドソーム構造にグループ分けされる内部移行受容体に対応した点状の染色パターンを主に示す。EGF-488による刺激から30分後、調節不全の例では、原形質膜の位置と一致した分布で点状または半集密の染色を示す(図1)。
腫瘍分析およびEGF取り込み
ホールマウント共焦点像による皮膚サンプル分析の最適化に取り組んだ。手作業による注意深い薄片作製は、加工処理されマウントされたサンプルに関して全ての皮膚垂直領域を明示するのに十分であった。これにより、対応する病理学的診断のうちの限定された一連の組織学的特徴について各切片を評価することが可能になった(図2および3)。これに加えて、核形態計測の初期分析により、腫瘍組織と正常皮膚との間の有意差(図4)や、異なる病理タイプの扁平病変間での核領域における有意ではないが、差異(図5)が実証された。
上記のように病態およびEGFの取り込み状態に関して気が付いた悪性度または浸潤段階にしたがって腫瘍を特徴付けた。8症例(27%)では、EGF-488が認められず、これらは内部移行しているかまたは調節不全とされたかを判定することができなかった。組織が研究室に到達し、取り込み研究を行う時までに組織が生きていなかったことを含めて、いくつかの可能性がある。残りの症例のうち、17例(59%)ではEGFが内部移行していることが認められたが、4例(14%)では調節不全とされた(図11)。腫瘍タイプおよび患者リスク因子ならびに輸送状態の要約は、表3に示されている。
強調表示された病変コードは、単色で表された単一患者由来の病変を示す。腫瘍リスク因子は紫色で強調表示され、患者の高リスク因子は薄紫色で強調表示されている。EGFR輸送状態は内部移行(I)、調節不全(D)または可視化されず(N)として表されている。
HR=高リスクSCC、Ag=侵襲性SCC、PNI=神経周囲の浸潤、IS=免疫抑制、PS=場合により再発性SCC (確認されない限りHRの独自の証拠と見なされない)
生きているヒト組織のEGF取り込み研究を行った。分析は、ホールマウントレーザー共焦点蛍光画像法によって行われた。この技法を用いて、早期SCCおよび前駆病変における輸送状態を判定することができる。病理学的特徴を判定することができ、異形成ケラチン生成細胞集団を主観的および客観的尺度によって判定した。このデータセットから、以下の結論を下すことができる:
> 調節不全はSCCの発生における初期事象でありうる;
> 調節不全は、低リスクの特徴を有するSCCにおいてより多く見られる;
> 調節不全は、既往SCCを有していた患者において発生し、複数の既往SCCを有する患者においてより多く見られる;
> 調節不全は、SCCのリスクが高い患者において発生する;
> 調節不全は、EGFR全発現レベルに依らない。
> 調節不全は、既往SCCを有する高リスク個体において発生する可能性があり、より低侵襲性の腫瘍が優勢であることに関連している;
> 調節不全は、侵襲性腫瘍の特徴と強い相関があるようには思われず、全EGFR発現レベルと無関係である。
材料および方法
細胞株
細胞株の同一性はSNP分析によって検証された。細胞はマイコプラズマ不含であり、定期的に試験された。細胞は、Ham's F-12培地: 10% FBS、10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM (Gibco, Invitrogen)中で増殖させた。新生児包皮由来の正常ヒト胎児ケラチン生成細胞(HEK)は、(11)において記述されているように培養された。EGF 2.5μgおよびBPE 25 mgを補充した低カルシウム無血清KC培地(Gibco, Invitrogen)中でHEK培養物を増殖させ、維持した。基本条件の場合、細胞を完全な、しかし10% FBS不含の培地中で3時間増殖させた。
一次Ab: AKT (C67E6; Cell Signaling Technology)、クラスリン(BF-06; EXBIO) EGFR (528; Cell Signaling Technology)、EGFR (31G7; Invitrogen)、ERK2 (c-14; Santa Cruz)、ホスホ-EGFR (Tyr1068, D7A5; Cell Signaling Technology)、ホスホ-AKT (Ser473, D9E; Cell Signaling Technology)、ホスホ-44/42 MAPK (ERK1/2, Thr202/Tyr204, E10, Cell Signaling Technology)およびβ-チューブリン(2-28-33, Zymed)。二次Ab: Alexa 488ヤギ抗マウスIgG (A11001; Invitrogen)、Alexa 594ロバ抗ウサギIgG (A21207; Invitrogen)、Alexa 594ヤギ抗ヒトIgG (A11014; Invitrogen)、Alexa 594ヤギ抗マウスIgG (A11005; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗マウス(F21453; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗ウサギ(A10547; Invitrogen)。
PA Hospitalの同意および倫理承認を得て、PAH Pathology (手術後)からまたは処置室(生検)から氷上に、腫瘍サンプルを回収した。サンプルをおよそ1 mmのサイズに薄く切り、4℃にて基本培地中で10分間3回洗浄し、20 ng/mLのEGF-Alexa488 (E-13345; Invitrogen)を最終洗浄液に5分、15分または30分間加えておき、37℃に置いた。さらに、サンプルを処理しないまま放置し、15分間のEGF添加前の30分間25μg/mLのセツキシマブ(Erbitux; MerckSerono)で処理し、または10μg/mLのTfn-Alexa555 (Invitrogen, T-35352)もしくは10μg/mLのDextran-Alexa594 (Invitrogen, D-22913)で処理した。サンプルを30分間PBS + 0.1% Triton X-100 (PBTX)中で4℃にて5回洗浄し、その後、4℃にて4% PFA/PBS中で終夜(O/N)固定した。サンプルをPBS中で2回洗浄し、2時間4℃にて100% MeOH中に置いた。室温(RT)で2時間デントの漂白液(4 MeOH: 1 DMSO: 1 30% H2O2) (12)を用いて組織の自己蛍光を低減させた。メタノール/PBTX系列を用いてサンプルを再水和させた。サンプルを10分間DAPI (50 mM)とともにインキュベートし、PBTXで2時間洗浄し、PBS中で2回洗浄し、H2Oですすぎ、凹面顕微鏡スライド上にProlong Gold (Invitrogen)中にてマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×でZen 2008ソフトウェアを用いて画像を取得した。
ホールマウントサンプルを上記のように、しかし脱色段階の後に加工処理し、サンプルを10%ウマ血清/PBTX中で4時間ブロッキングし、4℃にてO/N、ブロック液中の一次Abとともにインキュベートした。PBTX中で5×20分の洗浄後、ブロック液中の、対応するAlexa Fluor 594二次AbをRTで1時間適用した。サンプルを10分間 DAPI (50 mM)とともにインキュベートし、マウントし、上記のように画像化した。
ホルムアルデヒド固定された腫瘍サンプルをパラフィン包埋し、4μmで薄片作製した。切片を再水和の前に1時間、加熱オーブン(56℃)中でインキュベートした。IFの場合、切片をキシレン処理し、標準的なアルコール系列を通じて再水和した。pH 9.0 Tris-EDTA緩衝液を用いた抗原回復の後に、切片をRTにて1時間4%ウマ血清/1% BSA/PBS中でブロッキングし、一次Abを4℃にてO/Nインキュベートした。ブロック液中での洗浄後に、Alexa fluor 488二次AbをRTにて1時間加えた。洗浄後、切片を上記のようにDAPI染色し、マウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ25×でZen 2008ソフトウェアを用いて画像を取得した。PA HospitalのPathology Queenslandによって標準的なH&E染色プロトコルが行われ、Nikon Eclipse 50i顕微鏡にて対物レンズ4×または20×を用い画像を取得した。
SCC細胞株を80%の密集度で100 mmのディッシュにプレーティングした。(13)において記述されているリガンド内部移行アッセイ法の修正版を行って、EGFの内部移行を測定した。基底化(basaling)の後、細胞を0、5、15または30分間37℃にて1 ng/mLのBiotin-EGF (E3477; Invitrogen)で処理した。細胞を氷上に置き、氷冷PBSで洗浄することによって内部移行を停止させた。1μg/mLのアビジン(Sigma)での洗浄、引き続き10μg/mLのビオチン(Sigma)でのクエンチングによって内部非移行型および膜結合型のビオチン-EGFをブロッキングした。非アビジン-ビオチン・ブロッキング対照を含めて、15分の時点での全EGFレベルを判定した。細胞をその後、冷PBS中で3回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)を含有するRIPA緩衝液150μL中で溶解させた。いくぶん修正を加えながらHuman EGF ELISA Kit (KHG0061; Invitrogen)を用いてEGFレベルを測定した。サンプル希釈液中のタンパク質溶解物(10μg)および2倍希釈系列(1 ng/ml〜15.6 pg/mL)のビオチン-EGF (標準曲線)を、ヒトEGFコーティング96ウェルプレート上にプレーティングし、2時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン-HRPを加え、プレートをRTで30分間インキュベートした。安定化色素原を洗浄後に加え、プレートを暗所中でインキュベートした。30分後、停止溶液を各ウェルに加えて、吸光度を450 nmで読み取った。アッセイ法は技術的2つ組として3回行った。
細胞をカバースリップ上に80%の集密度でプレーティングした。基底化(basaling)の後、細胞を5、15もしくは30分間37℃にて10 ng/mLのEGF-Alexa488もしくは25μg/mlのTFN-Alexa555で処理し、または処理しないまま放置した。細胞を冷PBS中で3回洗浄し、3% PFA中で固定した。さらなる洗浄の後、細胞をDAPI染色し、スライドグラスの上にマウントし、Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像化した。
SCC細胞株およびHEKを100 mmのディッシュにプレーティングした。細胞を冷PBS中で3回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)を含有するRIPA緩衝液1501.11中に溶解した。STAR EGFR ELISA Kit (Millipore)を用いて全タンパク質溶解物12〜15μgからEGFRレベルを測定した。アッセイ法は技術的2つ組として3回行った。対応のないスチューデントのt検定を行って、GraphPad Prizm 5を用いHEKと比べて各SCC株のEGFRのレベルを比較した。
SCC細胞株を100 mmディッシュ中に80%の集密度でプレーティングした。基底化(basaling)の後、細胞を5、15もしくは30分間37℃にて1 ng/mLのEGF-Alexa488で処理し、または処理しないまま放置した(対照およびEGFR)。細胞をその後、冷PBS中で3回洗浄し、溶解用緩衝液[50 Mm Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)] 4 mL中に溶解した。免疫ブロッティングのため、BCAアッセイ法(Pierce)によって判定された、等濃度のタンパク質溶解物をSDS-PAGEによって分離し、PDVF膜(Millipore)へセミドライ転写した。膜をTBS+0.1% Tween-20 (TBST)中2%のBSAの中でブロッキングし、4℃にて終夜(O/N)一次Abでプローブし、その後、10分間3回TBSTで洗浄した。膜を1時間、ブロック液中の対応する二次Abとともにインキュベートした。洗浄後、膜をECL (1:1のSupersignal West PicoおよびSupersignal Dura; Thermo Scientific)とともにインキュベートし、フィルム(FUGI)に曝露した。各実験を3回行った。
リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスは、生きているヒト腫瘍ではこれまでに調べられていなかった。それゆえ、本発明者らは、リアルタイムで、生きているヒト腫瘍においてEGFRエンドサイトーシスを画像化できる方法を開発しようとした。過去の研究によっては、二次元組織培養系での樹立細胞株モデルにおいてEGFRエンドサイトーシスが特徴付けられている(12)。しかしながら、これらは、インビトロにおいて認められた受容体輸送の生物学がインビボにおける受容体輸送を反映しえないことを示唆している報告である(13)。インビボにおいて、腫瘍細胞は、非形質転換細胞および結合組織要素で取り囲まれた三次元の微小環境内に存在する。腫瘍細胞とその間質環境(細胞性および非細胞性)との間の相互作用が、細胞挙動を決定付け、受容体生物学に影響を与える可能性が高いと考えられる。それゆえ、本発明者らは、新鮮な、生きているヒト腫瘍のエクスビボサンプルにおける、リガンド依存性のEGFRエンドサイトーシスを調べるための方法を開発した。
ヒト腫瘍を用いる前に、本発明者らは、NOD/SCIDマウスへ注射された樹立SCC細胞株の異種移植片モデルを用いてその方法論を最適化した(14)。本実施例の材料および方法において記述されているように腫瘍を切除し、加工処理した。取り込み後、記述されているように組織を固定し、漂白した。サンプルをその後、顕微鏡検査ウェル中にマウントし、共焦点顕微鏡検査によって分析した(図17)。全ての異種移植片腫瘍が、インビトロにおいておよびインビボにおいて15分の時点で特異的なEGF結合およびさまざまな程度の受容体内部移行を実証した(図17)。異種移植片腫瘍は、単層培養されたその対応物と同様の取り込みを示した。
その方法を異種移植片において検証してから、本発明者らは、ヒト腫瘍においてリガンド依存性のEGFR内部移行を分析した(図18)。ここでは、手術時に切除されたまたはコア生検から得られた、生きているSCC腫瘍サンプル8例について調べた。これらの態様において、組織は、取り込みが行われるために非凍結、非固定かつ非壊死とされなければならない。8例中3例の患者において、エンドソーム構造へのEGFの取り込みが、患者AC3Pについて示されたように、認められた(図18A)。8例中5例の腫瘍はEGFの原形質膜結合を示すも、ほとんど内部移行を示さず(図18B、表4)、とはいえ、30分後にわずかな細胞亜集団(全腫瘍細胞のおよそ2〜5%)においては内部移行が認められる。内部移行の欠如は、患者サンプルの生存性の喪失に起因しえない。というのは、本発明者らは、これらの同じサンプルにおいてデキストランの取り込みおよび/またはトランスフェリン受容体(TfnR)の内部移行の両方を示すことができたからである。非生存性のサンプルでは、組織の自己蛍光レベルを上回る結合または取り込みは示されなかった。対照には、EGF添加なしおよび4℃を含めた。EGF蛍光の特異性をさらに検証するため、腫瘍サンプルを高濃度のセツキシマブ、つまりEGFRのリガンド結合ドメインに結合し、かつSCC治療において用いられるモノクローナル抗体とともにプレインキュベートした。事前のセツキシマブの結合によって、EGF-Alexa488の結合および取り込みが抑止されることが分かった(図18C)。サンプル固定化後の抗EGFRによる標識によって、EGF-Alexa488の同時局在が示された(図18D)。最後に、認められたEGFの結合および取り込みが異形成/腫瘍形成細胞においてのみ行われたことを確認するため、患者AC3PおよびDP5に対する未処理組織(切除時にホルマリン固定された)サンプルの連続切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)または蛍光標識された抗EGFR Abで染色した。H&E染色(図19)によって示されるように、異形成細胞においてのみ検出可能なレベルまでのEGFR染色が実証可能であった。
次に、本発明者らは、リガンド依存性のEGFR輸送状態とEGFR発現レベルまたはリガンド誘導性のシグナル伝達との間に相関関係が存在するかどうか調べた。ヒトSCCサンプルも樹立ヒトSCC細胞株もともに、さまざまな程度のリガンド依存性EGFR内部移行の機能不全を呈することが示された(図17および18)。したがって、SCC細胞株は、EGFR内部移行の機能不全とEGFR発現またはシグナル伝達活性との間の相関関係を調べるのに有用なモデルである。低濃度の組み換えEGFリガンドを用いて、取り込みがクラスリン被覆ピットによって媒介されたことを確認した(15)。表示した細胞株の各々について、記述(実施例2の材料および方法)されているように標準的なエンドサイトーシスアッセイ法を用いてビオチン化EGFの内部移行を測定した。15分の時点の全EGF結合に対する割合としての、受容体内部移行を、細胞株ごとに30分の時間的経過にわたって測定した(図20A)。全結合の測定の時点として15分を選んだ。というのは、この時点の後に、受容体の分解が増すからである。最初の5分におけるリガンド刺激性のEGFR内部移行は、リガンド結合の初速度およびリガンド結合が受容体エンドサイトーシスを刺激する効率の推定値を提示する。対照的に、15分の時点で測定された内部移行は、EGFRを結合させ内部移行させる、細胞の相対能力を反映している。8例のヒトSCC細胞株は、5分以内にリガンドを結合させ内部移行させるその能力がかなり異なっており、興味深いことに、ヒト腫瘍サンプルよりも低い調節不全を示し、異種移植片または腫瘍モデルとは対照的に、培養下の細胞株の応答間でこれまでに認められた差異を反映していた(16)。
各細胞株におけるEGFR発現レベルを、ELISAアッセイ法によって測定した(図20B)。EGFR発現とEGF依存性の受容体内部移行の初速度(5分)との間には相関がなかった(図20C)。しかしながら、EGFR発現レベルとEGFRを内部移行させる細胞株の全能力(15分)との間には関連性があった(図20D)。EGF-Alexa488を生化学的実験におけるビオチン-EGFの場合のようにカバースリップ上の細胞に加えた。時点を固定し、画像化した。各細胞株における免疫蛍光の取り込みは、取り込みのアッセイレベルと相関していた(図20E)。したがって、リガンド結合および内部移行の初速度定数は、受容体数と無関係であるように思われ、リガンド結合と内部移行の連関に付随する直接の効果がSCCにおいて調節不全とさせうることを示唆している。
EGFR発現と初期内部移行速度が連関しないことは、クラスリン被覆小胞(CCV)へのリガンド誘導性の動員の障害またはCCV形成の調節不全を示唆する。しかしながら、TfnR内部移行の分析からは正常な取り込みが示され、エンドサイトーシスの障害がSCC細胞株におけるEGFRのリガンド誘導性の取り込みに特異的であることを示唆していた(図20F)。これらのデータから、調節不全は、リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスの全般的な障害ではないことが示される。リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスの障害は、リガンド誘導性のシグナル伝達事象の障害を反映しているものと予想された。それゆえ、ウエスタンブロッティングにより全ての細胞株のシグナル伝達のアウトプットについて調べた(図21)。細胞を、同じ時間的経過にわたり上記のエンドサイトーシスアッセイ法について記述されたようにEGFで刺激した。生物学的3つ組みを、時点ごとにおよび細胞株ごとにプローブした。溶解物をEGFR、ホスホEGFR、チューブリン、全ERK、ホスホERK、全AKTおよびホスホAKTについてプローブした(図21)。細胞株間でシグナル伝達の大きなバラツキが認められたが、これとEGFRレベルとの間の相関は認められず、単一のシグナル伝達の変化はエンドサイトーシスの障害と相関していなかった。
最後に、本発明者らは、腫瘍サンプルにおける受容体輸送の障害が正常な組織病理学的標本において可視化されうるかどうか調べた。詳細には、ここでは、15分間EGFで刺激された腫瘍サンプルの固定化後の標識について試験し、本実施例の材料および方法において記述されているように組織を加工処理し、サンプルを抗EGFR Abで標識した(図22)。刺激は、単に無血清培地中の新鮮腫瘍サンプルにEGFを加えることによって行われた。固定化後の標識によって観察されたEGFRの局在性は、本発明者らがEGFリガンドの直接画像化で観察した結果を反映していた(図18AおよびB)。かくして、刺激後、EGFの直接標識とは対照的に二次Ab標識からの蛍光の増大という利点を伴って、EGFRの標識を用いてもSCCを、エンドサイトーシス能有りまたは調節不全に分類することができる。
抗EGFR療法に対する患者応答と腫瘍生物学との間の相関関係を判定しようと、相当な国際的努力がプロテオミクス、ゲノミクスおよびトランスクリプトミクスに費やされてきた。しかしながら、ヒト腫瘍における受容体の輸送および時空的調節を特徴付けることは可能ではなかった。本発明者らは、エクスビボの状況においてヒト腫瘍サンプルにおけるリガンド結合および受容体を介したEGF/EGFRエンドサイトーシスを調べるための方法を開発した。ここでは、EGFRエンドサイトーシスがヒトSCCにおいて高い頻度で調節不全とされていることが実証された。ヒトSCC細胞株の調査からも、EGFRのリガンド誘導性の動員の初期段階に影響を与えるものと思われたEGFRエンドサイトーシスの調節不全が明らかにされた。最後に、EGFRエンドサイトーシスの機能不全は、EGFR発現レベル、EGFRリン酸化との、またはAKTもしくはERKのような下流のエフェクタの活性化との、単一の相関関係がないことが示されたが、EGFRエンドサイトーシスの調節不全は全般的なシグナル伝達機能不全のバイオマーカーでありうる。これによって今回、EGFR輸送と、予後、腫瘍進行、EGFR阻害剤抵抗性および獲得抵抗性との間の潜在的な関係を上皮腫瘍において調べることが可能になる。
材料および方法
セツキシマブ媒介性の増殖阻害MTSアッセイ法
セツキシマブ媒介性の増殖阻害効果をCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)によって測定した。A431細胞(1ウェルあたりの数=1000、2500および5000個)を96ウェル平底プレート中に播種し、終夜インキュベートして接着させた。細胞を次いで48時間、0から100μg/mLに及ぶさまざまな濃度のセツキシマブに曝露した。MTS試薬20μLを各ウェルの中に加え、2時間、5% CO2中37℃でインキュベートした。マイクロプレート分光光度計により490 nmで光学密度(OD値)を読み取った。非処理対照と比べて処理細胞のOD値の比較により、細胞増殖率を示した。
セツキシマブ媒介性のADCC効果をCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)によって測定した。標的細胞(A431、1ウェルあたりの数=2,500個)を96ウェル丸底プレート中に播種し、2時間定着させた。標的細胞を次に、エフェクタ細胞(PBMC)とともに50/1のE/T (エフェクタ/標的)比でセツキシマブ(60μg/mL)あり/なしとし5% CO2中37℃にてインキュベートした。24時間のインキュベーション後、MTS試薬20μLを各ウェルの中に加え、2時間、5% CO2中37℃にてインキュベートした。マイクロプレート分光光度計により490 nmで光学密度(OD値)を読み取った。非処理細胞と比べてセツキシマブ処理細胞の比較により、細胞生存率を示した。
フローサイトメトリーを処理ごとに三つ組の試験管にて行った。標的細胞を収集し、10分間0.5μM CFSE (Life technologies)で標識し、その後に洗浄して過剰な色素を除去した。CFSE標識された標的細胞を次に、試験管あたり細胞20,000個の濃度でプレーティングし、60μg/mLのセツキシマブおよび新鮮PBMC (E/T=50/1)とともに4時間インキュベートした。30μMのDyngo4aを図の説明に記述されているように所与の時点で加えた。インキュベーション後、7-AAD (BD Pharmingen) 5 ulを各試験管の中に加えて、死滅した標的細胞を示した。サンプルをフローサイトメトリー(BD FACSCanto)によって分析した。以下の式:
を用いて特異的な標的細胞死の割合を計算した。
A431細胞を12ウェルプレート内のカバースリップ上に播種し、80%の密集度に達するまで終夜インキュベートした。細胞を3時間の血清飢餓後に30分間、異なる濃度のDynasore(0および30μM)で処理し、続けて15分のEGF-Alexa488 (100 ng/mL)の取り込みを行った。EGFの取り込みは氷冷PBS中での3回の洗浄によって停止した。細胞を30分間4% PFA/PBS中で固定し、30分のDAPI染色の前にPBS中で3回洗浄した。カバースリップを、スライド上にProlong Gold (Life technologies)中でマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像を取得した。
A431細胞を12ウェルプレート内のカバースリップ上に播種し、80%の密集度に達するまで終夜インキュベートした。細胞を4時間、60μg/mLのセツキシマブとともにインキュベートした。30μMのdyngo4aを図の説明に記述されているように所与の時点で加えた。細胞をその後、氷冷PBS中で3回洗浄し、30分間4% PFA/PBS中で固定し、その後に20分間、0.1% TritonX/PBS (PBTX)中での透過処理を行った。セツキシマブを1時間の二次抗体(Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, Life technologies)とのインキュベーションによって標識し、引き続き2% BSA/PBSでのブロッキングおよび30分のDAPI染色を行った。カバースリップを、スライド上にProlong Gold (Life technologies)中でマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像を取得した。
MHC分子が免疫系の腫瘍細胞回避において重要な役割を果たすので、本発明者らは、SCC細胞におけるEGFR輸送とMHC I & II発現とを関連付けた。詳細には、ここでは、HeLa細胞と比べA431細胞において、エンドサイトーシスの阻害がMHC I & IIのレベルおよび/または分布の変化を引き起こすかどうかを免疫蛍光(IF)によって試験した。これらの細胞株を選んだ理由は、A431が、高いEGFR発現レベルを有するSCC細胞株であり、発がん的にRTKシグナル伝達に高度に依存しているからである。A431細胞はまた、増殖の阻害に関してセツキシマブ感受性細胞株のモデルとして使用される(21, 22)。HeLa細胞は、EGFRの上方制御を有しない非SCC細胞株である。
・ IFNγの添加は、得られた全体の結果に影響を及ぼさなかったが、MHC発現の全レベルを増大させ、いっそう容易な可視化を可能にした。
・ MHCIの原形質膜染色のわずかな減少がEGF刺激後に認められた。MHCIの原形質膜レベルは、EGF刺激をDynasore阻害と連関させた場合にはもはや検出できなかった。これは興味深かった。というのは、SCCにおける高レベルのEGFR発現がMHCIの表面発現の喪失につながり、腫瘍回避を増大させうるからである。
・ A431細胞において、24時間を超えるDynasore処理は、細胞核凝縮を示し(図24A下段パネル)、その一方でHeLa細胞はアポトーシスまたは細胞質分裂の欠陥を有するように思われた。
セツキシマブ結合性の細胞株A431 (図26、図27A)、および低レベルの原形質膜結合セツキシマブを示した細胞株KJD (図26、図28A)に関しても、さらなる分析のために比較実験を行った。本発明者らの仮説では、EGF刺激性のEGFR輸送が阻害された場合、EGFRの原形質膜レベルの比例的増大と、ADCCの類似した比例的増大をもたらすものと予測された。したがって、ダイナミンの可逆的な低分子量阻害剤Dyngo4aの効果を、A431細胞およびKJD細胞の両方において、セツキシマブ誘導性のADCCに関して試験した。図27Aは、A431細胞においてADCCアッセイ法の4時間の時間的経過にわたりセツキシマブが原形質膜と内部移行構造の両方に局在化されうることを示す。セツキシマブは4時間の時点で依然として表面に曝露されており、これによってADCCが可能であると考えられる。Dyngo4aの添加は、セツキシマブの表面レベルを増加させ、内部移行レベルを減少させる。図27Bおよび27Cは、A431のおよそ38%がセツキシマブ誘導性のADCCの結果として死滅したことを示す。予想通り、Dyngo4aによるEGFRエンドサイトーシスの阻害は、EGFRの原形質膜レベルを増加させ、セツキシマブ誘導性ADCCのレベルの増大をもたらした。ADCCアッセイ法の繰り返し実験は、複数アッセイにわたって統計分析を可能とするように、特異的な最高の腫瘍細胞死滅率に対する割合(%)として表現された。このデータから、特異的な腫瘍細胞死の有意な増加がDyngo4a添加の複数のプロトコルにわたって認められ、4時間のADCCアッセイ法のうちの最後の1時間中の高度に可逆性であるDygno4aの添加が最も高い効率を示したことが明らかである。KJD細胞は、セツキシマブ媒介性のADCCに抵抗性である。予想通り、セツキシマブとの4時間のインキュベーション後であっても原形質膜上に低レベルのEGFRを発現するKJD細胞(図28A)は、比較的低レベルのセツキシマブ誘導性ADCCを示す(およそ10%の細胞死滅; 図28C.1およびC.2)。セツキシマブの代わりにIgGアイソタイプ対照を加えることでは、PBMC単独を上回って改善されたADCCは示されなかった(データは示されていない)。意義深いことに、Dyngo4aとのインキュベーションは、EGFRの原形質膜発現を増加させ(図28A)、40%超の細胞死滅にまでセツキシマブ誘導性のADCCを増加させた(図28C1および4C2)。Dyngo4a単独ではやはり、腫瘍細胞を死滅させなかった。A431細胞にて認められた効果と同様に、KJD細胞死の増大は、4時間のADCCアッセイ法のうちの最後の1時間にだけDyngo4aを加えた場合に最大であった。免疫蛍光分析(図29)から、Dyngo4aがリガンド誘導性のEGFRエンドサイトーシスに阻害効果を及ぼすことが明らかである。
化合物Dyngo4aおよびピリミジン-7を、実施例4に記述されているように多変量FACS分析アッセイ法においても、MTTアッセイ法によっても試験した。詳細には、化合物をセツキシマブ感受性A431細胞およびセツキシマブ抵抗性KJD細胞に対する、セツキシマブ依存性ADCCの改善と単剤毒性について試験した。多変量FACS分析により、Dyngo4aもピリミジン-7もともに、セツキシマブ依存性ADCCを改善することが分かった(図30A〜D)。Dyngo4aの場合、ADCCの改善は全て、セツキシマブおよびPBMCの存在に依存していた(図30B)。ピリミジン-7を導入した場合、セツキシマブの非存在下においてADCCにより細胞死のいくらかの増加が認められた(図30C)。PBMC、KJDまたはA431細胞のいずれかに加えられた場合に、Dyngo4aが単剤としての毒性を持たないことがMTTアッセイ法から示された(図30E〜F)。ピリミジン-7は、腫瘍細胞株およびPBMCの両方に対して単剤毒性を示した(図30E〜F)。このように、Dyngo4aはこれらの実験において最小の単一化合物毒性を示し、両ダイナミン阻害剤はセツキシマブ媒介性ADCCを改善することができる。
Dyngo4aを、実施例4および5に記述されているように多変量FACS分析アッセイ法において、A431細胞およびKJD細胞に対するセツキシマブ依存性およびハーセプチン依存性ADCCの改善について試験した。注目すべきことに、Dyngo4aはA431細胞およびKJD細胞のセツキシマブ依存性およびハーセプチン依存性の両方のADCCを増強することがわかった(図31A〜B)。セツキシマブ依存性ADCCと同様に、Dyngo4aは、A431細胞のハーセプチン依存性ADCCよりもKJD細胞のハーセプチン依存性ADCCをさらになお増強することが分かった。というのは、KJD細胞がその表面にA431細胞よりも少ないHer2受容体を有し、その結果として、ハーセプチン媒介性のADCCに対してA431細胞よりもさらに抵抗性だからである。
材料および方法
超解像顕微鏡法
三次元構造化照明顕微鏡法(3D-SIM)の場合、Deltavision OMX V3 Imaging System (Applied Precision)、EMCCDカメラ(CascadeII 512×512 Photometrics)、および60× 1.4-NA UplanSApo油浸対物レンズ(Olympus)を屈折率1.524の油とともに用い、画像を捕捉した。画像は10%のレーザー出力にて、3〜6.5μmの厚さにわたって23〜53段階でZステップ0.125μmにより取得された。画像は、Deltavision SoftWorX6.0 Beta19 (Applied Precision)を用いてコンピュータにより再構築された。
本発明者らはまた、患者サンプル内でのEGFR輸送差をより明確に示すために三次元構造化照明(超解像)顕微鏡法(3D-SIM)によって腫瘍サンプルを分析した。図32Aは、EGFRがEGF誘導性の内部移行を起こさず、原形質膜局在だけが観察されうる患者を示し、その一方で図32Aはまた、正常に内部移行しているEGFRの患者を示し、この場合にはヒト細胞エンドソームが明確に観察されうる。EGFRとクラスリンとの同時局在(図32B)から、EGFRを内部移行できない患者サンプルでは、膜へのクラスリンの動員がEGFRリガンド刺激に応じて減少し、トランスゴルジ網への分布の増大を有するように思われることが実証された。
要約すると、本発明者らは本明細書において、生きているヒト腫瘍サンプルにおいてEGF誘導性のEGFR内部移行をモニタリングするための新規の画像化アッセイ法について記述する。これは、ヒトSCCを、EGFR輸送能あり、またはEGFR輸送能無しのいずれかに分類できることを示す。加えて、それらは、EGFR輸送状態がEGFR原形質膜発現レベルに寄与しえ、これが今度は、標的SCC細胞のセツキシマブ誘導性ADCCの予測となることを示す。さらに、本発明者らは、ダイナミンの阻害剤(Dyngo4aのようなダイナミンの可逆的阻害剤を含む)のようなエンドサイトーシス阻害剤を用いて、セツキシマブ感受性のSCC細胞において特異的な腫瘍細胞死滅を増大させることができ、重要なことには、セツキシマブ誘導性のADCCに対して非感受性であるSCC細胞を、セツキシマブ誘導性のSCCに対して感受性である細胞に変換させることができることを示す。これらの所見に基づき、EGFR受容体が原形質膜にトラップされている患者は、モノクローナル抗体療法に最もよく応答するものと予測される。本発明者らはまた、患者におけるセツキシマブとのエンドサイトーシス阻害剤の同時投与が、EGFRの原形質膜発現およびセツキシマブ感受性を増強するように作用しうることを提唱する。本発明者らは、この主作用が、例えば実施例6において証明されるように、抗VEGFR、抗FGFR、抗CD20および抗Her2/neu (例えば、ハーセプチン)抗体療法のような他の抗体療法に当てはまることを提唱する。
Claims (28)
- 受容体を介したエンドサイトーシスに供される抗原である、腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体、および受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物。
- ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、ダイナミンGTPase阻害剤およびダイナミン環安定剤から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 細胞表面抗原が腫瘍関連抗原である、請求項1または2に記載の組成物。
- 腫瘍関連抗原がEGFRおよびHer2/neuから選択される、請求項3に記載の組成物。
- 対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量、および受容体を介したエンドサイトーシスに供される抗原である、腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体の有効量の使用であって、該医薬が、対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するために有効な量で該阻害剤および該抗体を対象に同時に投与するために製剤化されている、使用。
- 増強された免疫応答が、増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む、請求項5に記載の使用。
- 増強された免疫応答が、腫瘍細胞の表面上のMHCクラスIIの発現を刺激することまたは増強することを含む、請求項5または請求項6に記載の使用。
- 対象においてがんを処置または予防するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量、およびがんに関連する腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する、抗体の有効量の使用であって、該医薬が、対象のがんの処置または予防に有効な量で該阻害剤および該抗体を対象に同時に投与するために製剤化されている、使用。
- 腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体の効力を、対象において増強するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量の使用であって、該医薬が、対象において抗体の効力を増強するのに有効な量で該阻害剤を対象に投与するために製剤化されている、使用。
- 抗体感受性サブタイプまたは抗体抵抗性サブタイプから選択されるサブタイプに腫瘍を分類する方法によって、腫瘍が分類されている、請求項5〜9のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍を分類する方法が、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を分析する段階を含み、ここで、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態から、腫瘍が抗体感受性サブタイプであることが示され、かつここで、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の状態から、腫瘍が抗体抵抗性サブタイプであることが示される、請求項10に記載の使用。
- 細胞表面抗原のリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90%が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、請求項11に記載の使用。
- 細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の90%未満が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、請求項11に記載の使用。
- 医薬が、抗体抵抗性サブタイプに分類されている腫瘍を有する対象に、阻害剤および抗体を同時投与するために製剤化されている、請求項10〜13のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍が、細胞表面抗原陽性の腫瘍である、請求項5〜14のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍が、前がん性、非転移性、転移性、およびがん性の腫瘍から選択される、請求項5〜14のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍が、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病、およびリンパ性悪性疾患から選択されるがんに関連している、請求項15または請求項16に記載の使用。
- がんが、肺がん、肝細胞がん、胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんから選択される、請求項17に記載の使用。
- 腫瘍が上皮由来のものである、請求項5〜18のいずれか一項に記載の使用。
- がんが肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および皮膚がんから選択される、請求項18または19に記載の使用。
- がんが扁平上皮がん(SCC)である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の使用。
- 抗体に対する応答者および抗体に対する非応答者から選択される処置亜群に対象を層別化する方法によって、対象が層別化されている、請求項10〜21のいずれか一項に記載の使用。
- 対象を層別化する方法が、
請求項10〜21のいずれか一項に特定される、腫瘍を分類する方法にしたがって、対象の腫瘍を分類する段階、および
対象の腫瘍が、損なわれたもしくは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する応答者と特定する段階、または対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する非応答者と特定する段階
を含む、請求項22に記載の使用。 - 医薬が、抗体に対する非応答者として層別化されている対象に、阻害剤および抗体を同時投与するために製剤化されている、請求項22または23に記載の使用。
- 腫瘍を分類する方法、および/または対象を層別化する方法が、対象から得た腫瘍サンプルによって実施される、請求項10〜24のいずれか一項に記載の使用。
- 対象が、補助的がん療法を施行されている、請求項10〜25のいずれか一項に記載の使用。
- 補助的療法が、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、および抗体以外の免疫療法から選択される、請求項26に記載の使用。
- 腫瘍を分類する方法、および/または対象を層別化する方法の全部または一部が処理システムによって行われる、請求項10〜24のいずれか一項に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2012904722 | 2012-10-26 | ||
AU2012904722A AU2012904722A0 (en) | 2012-10-26 | Agents for cancer therapy or prophylaxis and uses therefor | |
PCT/AU2013/001246 WO2014063205A1 (en) | 2012-10-26 | 2013-10-28 | Use of endocytosis inhibitors and antibodies for cancer therapy |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015536327A JP2015536327A (ja) | 2015-12-21 |
JP6348115B2 true JP6348115B2 (ja) | 2018-06-27 |
Family
ID=50543787
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015538212A Active JP6348115B2 (ja) | 2012-10-26 | 2013-10-28 | がん療法のためのエンドサイトーシス阻害剤および抗体の使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10253107B2 (ja) |
EP (1) | EP2911692B1 (ja) |
JP (1) | JP6348115B2 (ja) |
AU (1) | AU2013334493B2 (ja) |
WO (1) | WO2014063205A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105765081A (zh) * | 2013-11-26 | 2016-07-13 | 英特盖根公司 | 一种用于预测对采用egfr抑制剂的治疗的响应性的方法 |
WO2017151418A1 (en) * | 2016-02-29 | 2017-09-08 | The Johns Hopkins University | Inducing cell death by hyperactivation of motility networks |
EP3432880A4 (en) * | 2016-03-20 | 2019-12-11 | Asdera LLC | USE OF CYCLODEXTRINS TO REDUCE ENDOCYTOSIS IN MALIGNANT AND NEURODEGENERATIVE DISORDERS |
EP3613434A4 (en) * | 2017-04-18 | 2020-12-23 | SBI Pharmaceuticals Co., Ltd. | AMPLIFIER OF A PHOTODYNAMIC EFFECT IN ALA-PDT OR ALA-PDD |
WO2019016784A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Universidade De Coimbra | ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES |
EP3687549A4 (en) | 2017-09-28 | 2021-07-14 | Asdera LLC | USE OF CYCLODEXTRIN IN DISEASES AND DISORDERS WITH PHOSPHOLIPID FAILURE REGULATION |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
CU22545A1 (es) | 1994-11-18 | 1999-03-31 | Centro Inmunologia Molecular | Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4517288A (en) | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4943533A (en) | 1984-03-01 | 1990-07-24 | The Regents Of The University Of California | Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
CA2066428C (en) | 1989-09-08 | 2000-11-28 | Bert Vogelstein | Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas |
EP1690935A3 (en) | 1990-01-12 | 2008-07-30 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
DK0546073T3 (da) | 1990-08-29 | 1998-02-02 | Genpharm Int | Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
DK0590058T3 (da) | 1991-06-14 | 2004-03-29 | Genentech Inc | Humaniseret heregulin-antistof |
DE69637481T2 (de) | 1995-04-27 | 2009-04-09 | Amgen Fremont Inc. | Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8 |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU6267896A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Imclone Systems Incorporated | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors |
BR9609743A (pt) | 1995-07-27 | 1999-03-02 | Genentech Inc | Formulação reconstituída estável método para a preparação de uma formulação artigo manufaturado e uso da formação |
DE19544393A1 (de) | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Synergistische herbizide Mischungen |
GB9624482D0 (en) | 1995-12-18 | 1997-01-15 | Zeneca Phaema S A | Chemical compounds |
HUP9901155A3 (en) | 1996-02-13 | 2003-04-28 | Astrazeneca Ab | Quinazoline derivatives as vegf inhibitors |
KR100489174B1 (ko) | 1996-03-05 | 2005-09-30 | 제네카-파마 소시에떼아노님 | 4-아닐리노퀴나졸린유도체 |
GB9718972D0 (en) | 1996-09-25 | 1997-11-12 | Zeneca Ltd | Chemical compounds |
ATE387495T1 (de) | 1996-12-03 | 2008-03-15 | Amgen Fremont Inc | Vollkommen humane antikörper die egfr binden |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
GB9714249D0 (en) | 1997-07-08 | 1997-09-10 | Angiogene Pharm Ltd | Vascular damaging agents |
GB9900334D0 (en) | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Angiogene Pharm Ltd | Tricylic vascular damaging agents |
GB9900752D0 (en) | 1999-01-15 | 1999-03-03 | Angiogene Pharm Ltd | Benzimidazole vascular damaging agents |
EP1301497A1 (en) | 2000-07-07 | 2003-04-16 | Angiogene Pharmaceuticals Limited | Colchinol derivatives as vascular damaging agents |
HUP0301742A3 (en) | 2000-07-07 | 2005-08-29 | Angiogene Pharm Ltd | Colchinol derivatives as angiogenesis inhibitors, process for producing them, pharmaceutical compositions containing them and their use |
EP1345968A2 (en) | 2000-12-28 | 2003-09-24 | Altus Biologics Inc. | Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them |
RU2006112834A (ru) | 2003-09-18 | 2007-10-27 | Комбинаторкс, Инкорпорейтед (Us) | Сочетание лекарственных средств для лечения новообразований |
US20070225363A1 (en) | 2003-11-21 | 2007-09-27 | The University Of Newcastle Research Associates Ltd. | Methods and Agents for Inhibiting Dynamin-Dependent Endocytosis |
US7531164B2 (en) * | 2005-10-21 | 2009-05-12 | Duke University | Preventing bacterial or viral infectivity and composition containing infection preventing additive |
WO2010033507A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | St. Louis University | Method of enhancing tgf-beta signalling |
CA2762600C (en) * | 2009-05-21 | 2018-05-15 | Children's Medical Research Institute | Use of dynamin ring stabilizers |
JP4841656B2 (ja) * | 2009-08-03 | 2011-12-21 | 株式会社江東微生物研究所 | 予後予測のための大腸癌組織の検査方法 |
US20120252038A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Chianese David A | Steroid receptor assays |
-
2013
- 2013-10-28 US US14/438,440 patent/US10253107B2/en active Active
- 2013-10-28 JP JP2015538212A patent/JP6348115B2/ja active Active
- 2013-10-28 AU AU2013334493A patent/AU2013334493B2/en active Active
- 2013-10-28 WO PCT/AU2013/001246 patent/WO2014063205A1/en active Application Filing
- 2013-10-28 EP EP13848409.2A patent/EP2911692B1/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150284469A1 (en) | 2015-10-08 |
AU2013334493B2 (en) | 2018-11-29 |
AU2013334493A1 (en) | 2015-05-14 |
EP2911692B1 (en) | 2019-08-21 |
JP2015536327A (ja) | 2015-12-21 |
US10253107B2 (en) | 2019-04-09 |
WO2014063205A1 (en) | 2014-05-01 |
EP2911692A4 (en) | 2016-04-20 |
EP2911692A1 (en) | 2015-09-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10273308B2 (en) | Methods of producing antibodies specific for p95 | |
JP6348115B2 (ja) | がん療法のためのエンドサイトーシス阻害剤および抗体の使用 | |
US20220033502A1 (en) | METHODS FOR UPREGULATING IMMUNE RESPONSES USING COMBINATIONS OF ANTI-RGMb AND ANTI-PD-1 AGENTS | |
EP3130674B1 (en) | Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen | |
CN107532217A (zh) | 用于癌症的治疗和诊断方法 | |
JP2008533490A (ja) | 上皮成長因子受容体キナーゼ阻害剤に対する抗癌応答を予測する生物学的マーカー | |
KR20190015408A (ko) | 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-pd-1 항체 | |
CN103201290A (zh) | S100a4抗体及其治疗用途 | |
JP4799863B2 (ja) | 癌制御方法 | |
MX2014011745A (es) | Metodos para aumentar la eficacia de terapia basada en cd37. | |
US20200348280A1 (en) | Methods for predicting cancer drug responsiveness | |
JP7236164B2 (ja) | 治療法に対する応答を予測する薬剤及び方法 | |
RU2677656C2 (ru) | Способ прогнозирования терапевтического эффекта для пациента с колоректальным раком, у которого повышена экспрессия белка tk1 | |
KR20220103921A (ko) | 암을 치료하기 위한 dkk-1 길항제의 용도 | |
US20150293105A1 (en) | Methods for classifying tumors and uses therefor | |
US20100248265A1 (en) | Compositions and methods for diagnosis and treatment of cancer | |
US20240043529A1 (en) | Methods and compositions related to bcl2 and bim heterodimer antibodies | |
JP2023553247A (ja) | がん診断のための組成物および方法 | |
MX2014013931A (es) | Metodos para tratar el cancer gastrico. | |
NZ711375A (en) | Methods for increasing efficacy of folr1 cancer therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161025 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170809 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171102 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180207 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180326 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180420 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180516 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180530 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6348115 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |