CN111670247B - 制备癌球状体的方法和选择结直肠癌患者的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及癌球状体的制备方法，对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择方法，和用于治疗结直肠癌的包含FGFR抑制剂的药物组合物。

Description

制备癌球状体的方法和选择结直肠癌患者的方法
技术领域
本公开要求日本专利申请No.2017-236374和No.2018-195647的权利，并通过整体引用并入本文。
本公开涉及癌球状体的制备方法。本公开也涉及选择用于化疗的结直肠癌患者的方法，和用于治疗结直肠癌的治疗方法和组合物。
背景技术
为了个体化医疗，已经研究了通过将从癌症患者切离的癌症组织移植到免疫缺陷动物中而制备的患者来源的异种移植物(patient-derived xenograft,PDX)模型。然而，PDX模型需要肿瘤组织的重复的移植以制备对于实施药物敏感度实验而言足够数量的模型动物，因此，制备耗时。代替PDX，已经考虑了由患者组织的细胞制备的球状体。然而，对于临床应用而言尚未成功制备具有足够效能的球状体。
关于组织来源的球状体的产生，已经报道了通过如下制备球状体：使用L-WRN成纤维细胞的条件培养基以及ROCK抑制剂Y27632和TGF-βI型受体抑制剂SB431542培养人结肠上皮细胞，所述L-WRN成纤维细胞产生对组织干细胞的增殖不可缺少的Wnt3a，R-spondin-3和Noggin。也已经报告了通过在补充了Y27632和SB431542的基础培养基中培养结直肠癌模型小鼠的肿瘤细胞而制备球状体。
结直肠癌为全世界癌症死亡的主要原因之一。例如，在美国，对于处于IV期的结直肠癌患者的5年生存率只有13％。这样的不良预后归因于难于针对个体患者选择适当的化疗。在结直肠癌中，针对EGFR为靶标的疗法的现有选择标准为：在肿瘤DNA中的RAS通路基因中不存在活化突变。然而，在临床上有40-50％的被选择的患者对抗EGFR疗法不应答。
也已经使用了基因组序列和基因表达信息来预测对化疗的反应。然而，归因于罹患结直肠癌的患者的遗传或表观遗传的复杂性，仍然难于鉴定可信赖的生物标记或基因表达信息。
成纤维细胞生长因子(FGF)家族为直接促进上皮细胞的生长的因素之一。认为FGF信号在癌症细胞增殖，迁移和生存中承担重要作用，FGF和其受体家族被期待作为引领新药物开发的治疗靶点。成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族蛋白质为受体酪氨酸激酶，FGFR家族由四种受体FGFR1至4构成。认为FGFR信号通路的自身稳定性活化深入地参与了一些癌症细胞的增殖。然而，关于结直肠癌患者对适应抑制FGF信号的化疗的敏感度，尚没有可信赖的方法来评价。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kondo J,等.,Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108:6235-40
非专利文献2：van de Wetering M,等.,Cell.2015；161:933-45
非专利文献3：Fujii M,等.,Cell Stem Cel.2016；18:827-38
非专利文献4：Pauli C,等.,Cancer Discov.2017；7:462-77
非专利文献5：Miyoshi H,等.,Science.2012；338:108-13
非专利文献6：Miyoshi H,Stappenbeck TS.Nat Protoc.2013；8:2471-82
非专利文献7：VanDussen KL,等.,Gut.2015；64:911-20
发明概述
技术问题
本公开的目的为提供制备癌球状体的有效方法。
本公开的再一个目的为提供适应FGFR抑制剂的结直肠癌患者的选择方法。本公开的进一步的目的为提供用于治疗结直肠癌的治疗方法和组合物。
解决问题的方案
在一个方面，本公开涉及癌球状体的制备方法，包括
在含有以下成分的培养基中培养从患者的癌症组织获得的细胞群：
ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF；和
选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，钙活化钾通道(KCa)激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和视黄酸受体(RXR)β2激动剂的药剂。
另一方面，本公开涉及患者的药物敏感度的评价方法，或用于癌症的治疗剂的筛选方法，包括
通过如以上描述的方法制备癌球状体，和
使由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体在体外与候选剂接触。
另一方面，本公开涉及来源于患者的球状体异种移植物(patient-derivedspheroid xenograft,PDSX)模型的制备方法，包括
通过如以上描述的方法制备癌球状体，和
将由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体移植到非人动物中。
另一方面，本公开涉及患者的药物敏感度的评价方法，或用于癌症的治疗剂的筛选方法，包括
通过如以上描述的方法制备PDSX模型，
施用候选剂到由此获得的PDSX模型。
另一方面，本公开涉及微卫星不稳定性(MSI)的检测方法，包括通过如以上描述的方法制备癌球状体，和
确定在由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体中的MSI状态或错配修复基因的靶基因的突变。
另一方面，本公开涉及对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择方法，包括
用FGFR抑制剂处理来源于结直肠癌患者的癌球状体或来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型，和
确定癌球状体或PDSX模型对FGFR抑制剂的应答，和
当对FGFR抑制剂的应答为阳性时，选择所述结直肠癌患者。
另一方面，本公开涉及药物组合物，其包含用于治疗结直肠癌的FGFR抑制剂。
发明效果
本公开提供了用于制备癌球状体的有效方法，并实现用于个体化医疗的有效药物敏感度检验和用于药品开发的有效药物筛选，也实现了高灵敏的MSI检验。
本公开也提供了用于选择对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的方法，和使用FGFR抑制剂用于治疗结直肠癌的治疗方法和组合物。
附图说明
图1显示结直肠癌肿瘤原始细胞(CRC-TIC)球状体的组织学特征。显示了来源于相同患者的原发性肿瘤(左)和球状体(右)的H&E染色样品的对。有三个典型的组织型：具有(上)和没有(中)成熟的杯状细胞(箭头)的高分化型，和低分化型(下)。比例尺为100μm。
图2A显示了从在传代至96孔细胞培养平板的孔中后1至4天的来自表达荧光素酶的球状体的生物发光的定量显示。每孔中的灰色水平表示来自相应的Matrigel滴中包埋的球状体的直接光子计数。共计发光表示每孔中的细胞数。
图2B显示表达荧光素酶的球状体的生长监测。在传代后1–4天期间每日对来自正常(HC3N原始；左)和癌症(HC5T原始；右)的球状体的光子计数评分。在图2B和2C中，对于每一数据点显示变异系数(％CV)。
图2C显示针对基于第1天的光子计数的初始细胞数校正的生长速度。对于每株测试了十六个重复孔。
图3A显示在EGF和/或bFGF的存在下培养8天的四种癌球状体株的典型的相差显微照片。比例尺为200μm。
图3B显示在EGF和/或bFGF的存在下的带有野生型RAS/RAF基因的CRC-TIC球状体株的GEI(growth effect index,生长效应指数)。显示三个独立实验中的GEI的点和均值。在图3B-3D中，数据使用单因素ANOVA(P值示于图中)接着进行Tukey’s post检验而分析。平均值之间的统计学显著性通过a，b，c和d表明。在不同文字之间的值的差异为有统计学显著性(P<0.05)，与此相对，在相同的那些之间则不是。
图3C显示在EGF和/或bFGF的存在下的带有变异型RAS/RAF基因的球状体株的GEI。显示三个独立实验中的GEI的点和均值。
图3D显示在EGF和/或bFGF的存在下的正常结肠上皮细胞球状体的GEI。显示在三个独立球状体株中的GEI的点和均值。
图4A显示在筛选中被鉴定的化合物的生长促进效果。显示具有平均值>1.25(即，有>25％的生长增加)的数据集。显示在三个独立球状体株中的GEI的点和均值。星号表明相对于仅有溶剂组有显著差异(P<0.05；使用Student's t检验分析)。NS，不显著。
图4B显示三个化合物对于两种CRC-TIC球状体株(HC18T和HC21T)的生长的剂量依赖性效果。显示三个独立实验中的GEI的点和均值。星号表明与仅有溶剂组有显著差异(P<0.05；使用单因素ANOVA接着进行Tukey’s post检验分析)。
图4C显示在NECA或毛喉素施用后的球状体的典型的相差显微照片。CRC-TIC球状体(HC52T)以仅用溶剂，1μM NECA，或1μM毛喉素培养五天。注意经NECA和毛喉素处理的球状体由于细胞变平而引起的尺寸增大。比例尺为100μm。
图4D显示由三个辅助的因子对慢生长球状体的生长刺激。将表达荧光素酶的球状体在所示的因子(复数)的存在下培养3天。显示由与在图9B中相同的数据集的三个独立实验计算的GEI的点和均值。数据使用单因素ANOVA(P值示于图中)接着进行Tukey’s post检验而分析。在不同文字之间的平均值为有统计学差异(P<0.05)。
图5显示在36个CRC-TIC球状体株中的21个癌基因和肿瘤抑制基因中的突变。显示了影响编码的蛋白质的氨基酸序列的突变。基因被归类入显示在上方的功能生物类别。每一细胞的灰色矩形表示为杂合(部分填充)或纯合(全部填充)的突变。*，以相同符号标记的球状体株来源于相同患者。
图6A显示在EGF和/或bFGF的存在下带有野生型RAS/RAF基因的CRC-TIC株的生长速度。每一直方显示三个独立实验的6个重复的平均生长速度。在图6A-6C中，CRC-TIC和正常结肠上皮的球状体在传代后1–4天自始至终用EGF和/或bFGF处理。表达荧光素酶的球状体的生长速度根据在传代后第1天和第4天它们的生物发光水平计算。
图6B显示在EGF和/或bFGF的存在下的带有变异型RAS/RAF基因的CRC-TIC株的生长速度。每一直方显示三个独立实验的6个重复的平均生长速度。
图6C显示在EGF和/或bFGF的存在下的正常结肠上皮球状体在eL-WRN培养基中培养的生长速度。每一直方显示三个独立球状体株的6个重复的平均生长速度。
图7A显示SB431542对球状体株的生长的剂量依赖性效果。在以指定浓度的SB431542的存在下，表达荧光素酶的癌症和正常球状体培养在分别含有EGF和bFGF的癌症培养基和eL-WRN培养基中。测试了11个CRC-TIC球状体株(圆)和四个正常球状体株(方)。显示了GEI的四个重复的均值。注意对癌球状体的效果小于对正常球状体。
图7B显示在培养来自结直肠癌症组织的细胞中，利用NECA和B27补充剂的生长促进效果。从结直肠癌症组织分离的上皮细胞在NECA和B27补充剂存在或不存在下培养在含有EGF和bFGF的癌培养基中。显示为得到在12孔板中占据四孔的球状体需要的时间。在11个球状体株之间，有两个株仅在NECA和B27的存在下成功建立(三角)，四个株在含有NECA和B27的培养基中增殖更迅速(圆)，和五个株不受NECA和B27(方)影响。
图8A显示80个化合物对三个独立CRC球状体株的生长效果(GEI)。
图8B显示图8A的80个化合物的列表。
图9A显示腺苷受体(AR)激动剂CV1808对两种CRC球状体株(HC18T和HC21T)的生长的剂量依赖性效果。显示均值GEI±SEM(独立实验，n＝3)。星号表明与仅有溶剂(0μM)组有显著差异(P<0.05；使用单因素ANOVA接着进行Tukey’s post检验而分析)。
图9B显示在重复实验中，NECA的剂量-反应效果的可重现性。使用了与图4B中相同的数据集，对于NECA施用进行了拟合曲线分析。显示在三个独立实验中的标准化数据的拟合曲线。
图9C显示在用cAMP-信号激活剂处理后的CRC-TIC球状体的典型的相差显微照片。用仅有溶剂(DMSO)，10μM CV1808，1μM NECA，或1μM毛喉素培养CRC球状体(HC18T，HC21T，和HC52T)五天。比例尺为200μm。
图9D显示由三个辅助因子对慢-生长球状体株的生长刺激。将表达荧光素酶的球状体在所示的因子(复数)的存在下培养3天。显示在三个独立实验中生长速度的均值和点。数据使用单因素ANOVA(P值示于图中)接着进行Tukey’s post检验而分析。在不同文字之间的平均值为有统计学差异(P<0.05)。需注意生长速度在对照组中为～1.0(点线)，这表明它们难于生长。
图10A显示关于在PDX和来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型中的药物敏感度实验的原理流程图。PDX和PDSX小鼠使用相同肿瘤制备(左)。使用PDX小鼠(上；P2–P3)和PDSX小鼠(下)用于药物剂量测试(右)。检验小鼠被分成三组(对照，FOLFOX，和西妥昔单抗)。药物剂量在第1天开始并在第22天结束。
图10B显示采用PDX和PDSX的药物剂量测试结果。每一数据点显示在相应于第1天的相应天数的肿瘤体积。在每组中n＝5–6。误差棒显示SD。*，P<0.05和**；P<0.01。n.s.,在Tukey’s多重比较检验中不显著。
图11A显示用PDSX小鼠的两组药物剂量测试的结果。在每组中n＝3–4。
图11B显示对于在采用PDSX的剂量测试的两组中相应组的Sidak’s多重比较检验的结果。误差棒显示SD。
图11C显示用PDX小鼠的两组药物剂量测试的结果(在每组中n＝2–4)。误差棒显示SD。**，在Sidak’s多重比较检验中P<0.01。
图11D显示对于在采用PDSX的剂量测试的两组中相应组的Sidak’s多重比较检验的结果。误差棒显示SD。
图12A显示在肿瘤(HC1T)切除后患者的血清CEA水平和给予的化疗。黑菱形(a)表明因为意外的膝盖骨折而中断的化疗。CT扫描的时间点(显示在图12B和12E中)以下方的"b–e"表明。
图12B显示在SOX(S-1+奥沙利铂(Ox)；与FOLFOX相似)施用前(b)和后(c)的患者的CT图像。白色箭头指出在腹膜中的转移性病变。在患者中对SOX施用的最佳应答为SD(疾病稳定；RECIST(实体瘤疗效评价标准)+11％)。
图12C显示HC1T来源的PDSX的药物剂量测试的结果。与在对照组中相比，在FOLFOX小鼠中的肿瘤生长显著下降。在图12C和12F中，在每组中n＝3–4。误差棒显示SEM。在单尾非配对t检验中**，P<0.01和***，P<0.001。
图12D显示在对照和经施用的(FOLFOX)小鼠中从施用开始(第1天)到结束(第22天)的个体动物的肿瘤体积的变化百分比。
图12E显示在伊立替康+西妥昔单抗(C-mab)施用前(d)和后(e)的患者的CT图像。白色箭头指出转移性病变。在患者中对伊立替康+西妥昔单抗施用的最佳应答为SD[(疾病稳定；RECIST+3％(在d至e期间)。
图12F显示采用PDSX的药物剂量测试结果。在施用的(伊立替康+C-mab)小鼠中的肿瘤生长与在对照小鼠中相比显著降低，在施用的组中肿瘤体积表现为实质上未改变。
图12G显示在对照和经施用(伊立替康+C-mab)小鼠中，从施用开始(第1天)到结束(第22天)的个体动物的肿瘤体积的变化百分比。
图13A显示在肿瘤(HC6T)切除后的患者的血清CEA水平和给予的化疗。黑菱形(a)表明因为原发性病变的外科切除而中断的化疗。CT扫描的时间点(显示在图13B中)以下方的"b–d"表明。
图13B显示在FOLFOX+帕尼单抗(panitumumab,P-mab)施用前(b)和后(c)，和接着施用FOLFIRI+贝伐珠单抗(bevacizumab,B-mab)(d)的患者的CT图像。在患者中对SOX施用的最佳应答为SD(疾病稳定；RECIST+11％)。在患者中对FOLFOX+P-mab施用的最佳应答为在6个月的施用后为PR(部分响应；RECIST-60％)。在患者中对FOLFIRI+B-mab的施用的最佳应答为在三个月的施用后为SD(疾病稳定；RECIST+10％)。在6个月的FOLFOX+P-mab施用后(d)，转移性病变的尺寸迅速增加。
图13C显示HC6T来源的PDSX的药物剂量测试的结果。与在对照小鼠中相比，FOLFOX+西妥昔单抗小鼠中的肿瘤大小显著降低。在另一方面，与在对照小鼠中相比，FOLFIRI小鼠的肿瘤大小的下降只有轻微。在每组中n＝2–3。误差棒显示SEM。在Tukey’s多重比较检验中*，P<0.05；**，和P<0.01。
图13D显示在对照和经施用的小鼠中从施用开始(第1天)到结束(第22天)中，个体动物的肿瘤体积的变化百分比。
图14A显示(微卫星稳定)案例的Bethesda组的五种微卫星标记的MSS的典型的电泳图。在图14A-14C中，显示来自正常细胞和癌症细胞的PCR产物的结果。
图14B显示MSI-H案例的Bethesda组的五种微卫星标记的典型的电泳图。
图14C显示MSI-H案例的Bethesda组的五种微卫星标记的典型的电泳图。
图14D显示错配修复(MMR)蛋白质(MLH1，MSH2，MSH6和PMS2)的免疫组织化学。较上的图显示来自MMR正常案例的原发性病变和球状体。确认了所有蛋白质的表达。较下的图显示来自MMR缺陷案例的原发性病变和球状体，没有检测到MLH1和PMS的表达。
图14E显示使用球状体来源的DNA样品的含有单核苷酸重复的区域的序列谱图。左，TGFBR2(反向链)，右，BAX(反向链)。分别显示野生型(上)，纯合突变(中)和杂合突变(下)。
图15A显示从球状体和福尔马林保存和石蜡包埋(FFPE)组织(左，浓度；右，A260/A280)提取的DNA样品的浓度和纯度。
图15B显示与球状体和FFPE组织来源的DNA样品中的微卫星标记相应的电泳图谱中，以荧光强度确定的最大峰高。球状体来源的DNA样品比FFPE来源的DNA样品给出了更高的峰。
图15C显示用球状体和FFPE组织来源的DNA样品进行分析的8个MSI案例的突变概况。灰柱标示发生了突变的等位基因，与此相对白色的标示野生型等位基因。用球状体来源DNA样品的分析能够鉴定两个等位基因，而FFPE组织来源的DNA样品给出了混乱的结果。
图15D显示BAX(G7/G7)的纯合突变的案例的测序结果。左，球状体来源的DNA样品；右，FFPE组织来源的DNA样品。用FFPE组织来源的DNA样品，检测到第8个G的轻微低峰。这来自于正常(即，野生型)细胞的DNA。
图16A显示五种FGFR抑制剂对结直肠癌来源于患者的球状体HC6T的生长的剂量依赖性效果(上)和计算机拟合的剂量-反应曲线(下)。在10-5M(10μM)浓度的数据因为它们的毒性的非特异特性而从剂量-反应曲线计算中排除。
图16B显示五种FGFR抑制剂对HC20T的生长的剂量依赖性效果(上)和计算机拟合的剂量-反应曲线(下)。
图16C显示五种FGFR抑制剂对HC9T的生长的剂量依赖性效果(上)和计算机拟合的剂量-反应曲线(下)。
图16D显示厄达替尼(erdafitinib)对RAS/RAF野生型(wt)球状体株，HC1T，HC10T，HC11T和HC73T的生长的效果。
图16E显示厄达替尼对RAS/RAF变异型(mt)球状体株，HC5T和HC13T的生长的效果。
图16F显示厄达替尼对正常结肠上皮球状体的生长的效果。
图17A显示厄洛替尼(左)或西妥昔单抗(右)单药治疗对HC6T，HC9T，HC11T，和HC20T的生长的效果。
图17B显示在厄洛替尼的不存在或存在下(0.1，1和10μM)，厄达替尼对HC6T，HC20T，和HC9T的生长的剂量依赖性抑制效果。
图17C显示厄洛替尼单独(1μM)，厄达替尼单独(0.01μM)，和两者的组合对不包含RAS/RAF热点突变的球状体株(HC1T，HC7T，HC8T，HC10T，HC11T，HC21T和HC73T)的生长的效果。*，P<0.05–0.0001。
图18A显示厄达替尼和/或西妥昔单抗对移植了HC6T的PDSX小鼠的肿瘤体积的效果。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；或****，P<0.0001。
图18B显示厄达替尼和/或西妥昔单抗对移植了HC20T的PDSX小鼠的肿瘤体积的效果。*，P<0.05。
图18C显示第21天的HC20T-PDSX肿瘤的用H&E染色的组织样品。比例尺为100μm或50μm(嵌入图)。
图18D显示第21天的HC20T-PDSX肿瘤的组织样品的对Ki-67的免疫染色。比例尺为100μm或50μm(嵌入图)。
图18E显示第21天的HC6T-PDSX肿瘤的用H&E染色的组织样品。比例尺为100μm或50μm(嵌入图)。
图18F显示第21天的HC6T-PDSX肿瘤的组织样品的对Ki-67的免疫染色。比例尺为100μm或50μm(嵌入图)。
图18G显示每一施用组中通过Ki67表达而监测的增殖细胞的分数(％)。在厄达替尼单药治疗组中三个肿瘤之一消失了(完全性反应)，并将这案例从图中排除。*，P<0.05。
图19显示药物敏感度检验(从移植球状体的日期到所述检验开始)中的PDSX小鼠的肿瘤体积的变化(左，HC6T；右，HC20T)。
图20显示在患者来源的结直肠癌球状体中的FGF或FGFRmRNA的表达水平。
具体实施方式
1.定义
除非另外定义，本文使用的术语为作为本领域如有机化学，医学，药品科学，分子生物学，和微生物学的技术人员通常理解的那样。本文使用的许多术语定义为如下描述。本文的定义优先于常规的理解。
当数值伴随着术语"约"，该值意在代表在该值-10％至该值+10％的范围内的任何值。在将范围用值的下限和值的上限定义时，覆盖从下限到上限所有的值，并包括两限处的值。当范围伴随术语"约"时，两限处的值视为适用于该术语。例如，"约20至30"视为"20±10％至30±10％"。
如本文所用，癌球状体是指含有肿瘤原始细胞的细胞团块。肿瘤原始细胞是指当移植到免疫缺陷动物中时能够形成肿瘤的细胞。一般来说，癌球状体包含约100个细胞～约10,000个细胞，优选约500个细胞～约2000个细胞，并具有直径约0.01mm～约2mm，优选约0.1mm～约0.5mm的接近球体的形状。这里，"直径"是指细胞团块的最长轴的长度。
如本文所用的"从患者的癌症组织获得的细胞群"可以通过常规方法制备。例如，可以使用在Miyoshi H，Stappenbeck TS。Nat Protoc.2013；8:2471-82或VanDussen KL，等.,Gut.2015；64:911-20中描述的方法。在一个实施方式中，从患者的癌症组织获得的细胞群为通过使从患者获得的癌症组织或从这样的癌症组织分离的上皮组织进行酶处理(例如，胶原酶处理)而获得的细胞群。从患者的癌症组织获得的细胞群包括癌症细胞和肿瘤原始细胞。
一般来说，细胞从体积为约0.1cm3至5.0cm3，约0.2cm3至3.0cm3，或约0.5cm3至2.0cm3，优选约0.5cm3至1.0cm3的癌症组织获得并培养。细胞优选用基底膜基质如(Corning)或/>基底膜提取物(Trevigen)进行培养。例如，将103个细胞至105个细胞与基底膜基质混合，将因此获得的细胞悬浮液播种在培养器材(如培养平板或培养皿)上。当基底膜基质在37℃凝固后，将培养溶液覆盖其上而开始细胞培养。
2.用于制备癌球状体的方法和癌球状体的用途
在一个方面，本公开涉及癌球状体的制备方法，包括
在含有以下成分的培养基中培养从患者的癌症组织获得的细胞群：
ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF：和
选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，钙活化钾通道(KCa)激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和视黄酸受体(RXR)β2激动剂的药剂。
癌症的例子包括：结直肠癌，胃癌，前列腺癌，乳癌，宫颈癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，肾癌，胰腺癌，和膀胱癌。优选所述癌症为结直肠癌。癌症组织可以为从原发性病变或转移性病变获得的组织，但优选为从原发性病变获得的组织。癌症组织可以为外科样品或活检样品。
培养基可以为常用于球状体培养的任何培养基，其实例包括改进的DMEM/F-12(Thermo Fisher)和补充了ITS补充剂(Thermo Fisher)的DMEM/F12(Thermo Fisher)。
腺苷受体激动剂的例子包括：NECA(5’-(N-乙基-羰酰氨基)-腺苷)，CV1808(2-苯基氨基腺苷)，和BAY 60-6583(2-[[6-氨基-3,5-二氰基-4-[4-(环丙基甲氧基)苯基]-2-吡啶基]硫代]-乙酰胺)。优选腺苷受体激动剂为NECA或CV1808，更优选为NECA。腺苷受体激动剂可以以例如0.001μM至10μM，优选0.1μM至5μM，更优选0.1μM至1μM的浓度使用。
PPAR激动剂包括PPARα激动剂，PPARγ激动剂和PPARδ激动剂。
PPARα激动剂的例子包括：GW7647(2-甲基-2-[[4-[2-[[(环己基氨基)羰基](4-环己基丁基)氨基]乙基]苯基]硫代]-丙酸)和CP 775146(2-甲基-2-[3-[(3S)-1-[2-[4-(1-甲基乙基)苯基]乙酰基]-3-哌啶基]苯氧基]-丙酸)；
PPARγ激动剂的例子包括：S26948([[4-[2-(6-苯甲酰-2-氧代-3(2H)-苯并噻唑基)乙氧基]苯基]甲基]-1,3-丙二酸二甲基酯)和曲格列酮(5-[[4-[(3,4-二氢-6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基]苯基]甲基]-2,4-噻唑烷二酮)；
PPARδ激动剂的例子包括：GW0742([4-[[[2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-5-噻唑基]甲基]硫代]-2-甲基苯氧基]-乙酸)，L-165,041([4-[3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基苯氧基)丙氧基]苯氧基]乙酸)，和GW 501516(2-[2-甲基-4-[[[4-甲基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-5-噻唑基]甲基]硫代]苯氧基]乙酸)。
KCa激活剂的例子包括：DCEBIO(5,6-二氯-1-乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮)，SKA-31(萘并[1,2-d]噻唑-2-基胺)，和1-EBIO(1-乙基-2-苯并咪唑啉酮)。优选KCa激活剂为DCEBIO或SKA-31。KCa激活剂可以以例如，0.1μM至50μM，优选1μM至30μM，更优选约10μM的浓度使用。
NMDA型谷氨酸受体激动剂的例子包括：NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)和高奎宁酸。优选NMDA型谷氨酸受体激动剂为NMDA。NMDA型谷氨酸受体激动剂可以以例如，0.1μM至50μM，优选1μM至30μM，更优选约10μM的浓度使用。
组胺H3受体激动剂的例子包括：Immepip(4-(1H-咪唑基-4-基甲基)哌啶)和Immethridine(4-(1H-咪唑基-4-基甲基)吡啶)。优选组胺H3受体激动剂为Immepip。组胺H3受体激动剂可以以例如，0.1μM至50μM，优选1μM至30μM，更优选约10μM的浓度使用。
RXRβ2激动剂的例子包括：AC55649(4′-辛基-[1,1′-联苯基]-4-羧酸)和AC261066(4-[4-(2-丁氧基乙氧基-)-5-甲基-2-噻唑基]-2-氟苯甲酸)。优选RXRβ2激动剂为AC55649。RXRβ2激动剂可以以例如，0.1μM至50μM，优选1μM至30μM，更优选约10μM的浓度使用。
ROCK抑制剂的例子包括：Y27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺)和H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂)。优选ROCK抑制剂为Y27632。ROCK抑制剂可以以例如，0.1μM至50μM，优选1μM至30μM，更优选约10μM的浓度使用。
例子TGF-β(转化生长因子-β)I型受体抑制剂包括：SB431542(4-[4-(1，3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)和A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)。优选TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。TGF-βI型受体抑制剂可以以例如，0.01μM至10μM，优选0.1μM至10μM，更优选0.5μM至10μM的浓度使用。
EGF(表皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)可以为重组人蛋白质。EGF可以以例如，10ng/ml至100ng/ml，优选约50ng/ml的浓度使用。bFGF可以以例如，50ng/ml至200ng/ml，优选约100ng/ml的浓度使用。
培养基通常包含血清(如胎牛血清(FBS))。血清可以以约1-10％，优选约5％的浓度使用。
培养基可包含选自下组中2种以上的药剂：腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，KCa激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和RXRβ2激动剂。
培养基中可进一步包含抗生素如青霉素，链霉素，或纤溶酶，L-谷氨酰胺，或B27补充剂(Thermo Fisher)。
对于培养细胞的时期没有特别限定于具体时期，培养可以持续到获得适当数量的癌球状体细胞。一般来说，培养持续到获得约1×105～约1×107，优选约106个癌球状体细胞。培养时期可以为例如，一周至两个月(例如，一周至四周，或一个月至两个月)。在培养时期期间，培养基优选每隔一天或数天(例如，两或三天)替换为新鲜培养基。通常，在连续的培养期间，用酶(如胰蛋白酶)处理形成的细胞团块来分离细胞并形成细胞团块的步骤进行一次以上。
由此获得的癌球状体可以进一步培养数天至数周，培养到细胞数量变为取决于使用目的的适当数目。此外，癌球状体可以冰冻储存到使用，并可以在解冻后培养到获得适当的细胞数。癌球状体可以在培养期间传代。如本文所用，由此获得的癌球状体衍生的癌球状体是指将通过本公开的方法制备的癌球状体传代而获得的癌球状体。所述传代可包括或可不包括用酶(如胰蛋白酶)处理癌球状体来分离细胞和重形成癌球状体。
癌球状体可以以包含癌球状体和适合培养或储存癌球状体的溶液的组合物形式提供。包含癌球状体的组合物可以是冰冻的，该情况下，组合物可包含癌球状体和合适冷冻保存的液体。
癌球状体可以使用于例如，用于在体内或体外药物敏感度评价，药物筛选，和微卫星不稳定性(MSI)检验。癌球状体也能够使用于基于药物敏感度评价的结果而寻找药物敏感度的生物标记。药物敏感度的评价结果不仅可以使用用于选择对患者的治疗，也用于新药物开发中的临床试验参与者的选择。
可以引入报告基因在癌球状体的细胞中而监视细胞增殖。报告基因的例子包括荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。报告基因可以使用载体如质粒载体或病毒载体进行引入。在一个实施方式中，报告基因通过病毒载体如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，或腺相关病毒病毒载体，优选通过慢病毒载体引入在癌球状体的细胞中。载体可以通过常规方法，例如，在本公开的实施例部分或Miyoshi H，Stappenbeck TS.Nat Protoc.2013；8:2471-82中描述的方法引入。报告基因的引入优选在将癌球状体用酶(如胰蛋白酶)处理而分离细胞后进行。在报告基因引入后，可以重形成球状体并使用于分析。
来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型可以通过将癌球状体移植到非人动物中制备。非人动物的例子包括：免疫缺陷动物如裸小鼠，裸大鼠，SCID小鼠，NOD-SCID小鼠，和NOG小鼠。移植位点没有特别限定于具体位点，但优选皮下移植。将进行移植的癌球状体中的细胞数量可以为任何数字，但在小鼠的情况下，经常为每只约1×105～约9×105，优选约5×105。优选非人动物当在移植后肿瘤体积达到约300-500mm3时使用于检验。
通过对PDSX模型施用候选剂和确定对候选剂的应答，可以评价作为癌球状体来源的患者的药物敏感度，或可以进行药物筛选。细胞的反应可以基于肿瘤组织的体积或组织学特征确定。组织学特征的例子包括：有丝分裂像的数量和变性细胞数。例如，当肿瘤组织的体积的增加被显著抑制，或当相比于对照PDSX模型、没有施用候选剂的，组织学特征发生改进(例如，当有丝分裂像的数量下降或变性细胞数提高)时，将作为癌球状体的来源的患者评价为对候选剂敏感，或将候选剂评价为在治疗癌症中有效。
候选剂的例子包括但不限于：单一化合物如低分子量化合物，蛋白质，抗体，肽，核酸；化合物，抗体，核酸，或其他成分的文库；或细胞提取物，细胞培养上清液，微生物发酵产品，海洋生物提取物，和植物提取物。当评价患者的药物敏感度时，候选剂可以是用于癌症治疗的已知药物。
药物敏感度评价和药物筛选也能够通过在体外将癌球状体与候选剂接触并确定对候选剂的应答而进行。例如，当候选剂与没有接触候选剂的对照癌球状体相比，癌球状体的体积的增加显著被抑制或改善了癌球状体的组织学特征，将患者评价为对候选剂敏感，或将候选剂评价为在治疗癌症中有效。
MSI为归因于错配修复基因的功能失调，与非肿瘤组织相比，在肿瘤组织中的微卫星显示的重复数不同的现象。MSI检验为已知的来可作为由错配修复基因的生殖细胞系突变引起的林奇综合征(Lynch syndrome)的辅助诊断，或预测免疫检查点抑制剂(如抗PD-1抗体)对结直肠癌的效果。MSI检验通常检验肿瘤组织和非肿瘤组织中的微卫星重复数，癌球状体可以代替外科或活检样品而用作肿瘤组织。癌球状体的使用可实现更精确的检查。
微卫星重复数可以通过常规方法确定。例如，通过PCR从癌球状体和非肿瘤组织(或当难于收集非肿瘤组织的情况下，血液)获得的DNA中扩增含有微卫星重复序列的区域，并将微卫星的重复数进行比较。当与非肿瘤组织相比，在癌球状体中微卫星重复数发生改变时结果为MSI阳性。MSI状态通常使用BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，和D17S250五种微卫星标记(Bethesda组)确定。对MSI状态而言，当2种以上的标记显示MSI确定为MSI-H(MSI-高)，当一种标记显示MSI为MSI-L(MSI-低)，当MSI没有观察到时为MSS(microsatellitestable,微卫星稳定)。当除了五种标记以外使用一种或多种另外的标记时，对MSI状态而言，当使用的30-40％以上的标记显示MSI时，确定为MSI-H，并当小于30％的标记如此时，为MSI-L。
MSI检验也能够通过确定错配修复基因的靶基因中的突变进行，该基因因为错配修复基因的功能异常而显示异常。靶基因的例子包括：TGFBR2，IGF2R，BAX，和CASP5。所述突变可以通过使用从癌球状体获得的DNA，和用于检测基因突变的常规方法(例如，使用DNA芯片或DNA微阵列的核酸杂交方法，直接序列方法，TaqMan PCR方法，RFLP方法，或PCR-SSCP方法)来检验。从癌球状体获得的DNA比来自外科或活检样品的那些具有更高的纯度，并实现之前不能检测的杂合突变的检测，因此实现精确的检查。
3.结直肠癌患者的选择方法，用于治疗结直肠癌的药物组合物，和用于治疗结直肠癌的方法
在一个方面，本公开提供了对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择方法，包括
用FGFR抑制剂处理来源于结直肠癌患者的癌球状体或来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型，和
确定癌球状体或PDSX模型对FGFR抑制剂的应答，和
当对FGFR抑制剂的应答为阳性时，选择所述结直肠癌患者。
大肠分成结肠和直肠，而本公开中术语"结直肠癌"包括结肠癌和直肠癌。根据程度的进展，结直肠癌被分成0，I，II，III和IV期，本公开中术语"结直肠癌"包括癌症的任意期。
如本文所用，术语"成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂"是指抑制通过FGFR介导的信号转导的物质。FGFR有四种，FGFR1，FGFR2，FGFR3，和FGFR4，FGFR抑制剂能够抑制这四种FGFR中的一种或多种。在一个实施方式中，FGFR抑制剂抑制FGFR1，FGFR2，和FGFR3三种，或FGFR1，FGFR2，FGFR3，和FGFR4四种。FGFR抑制剂可以为小分子化合物，蛋白，抗体，肽或核酸。FGFR抑制剂的例子包括：厄达替尼(JNJ42756493)，Rogaratinib(BAY1163877)，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878和ARQ087。在一个实施方式中，FGFR抑制剂为厄达替尼。
如本文所用，术语"来源于结直肠癌患者的癌球状体"包括从结直肠癌患者的癌症组织获得的细胞群制备的癌球状体，和将这样的癌球状体进行传代获得的癌球状体。癌症组织可以为从原发性病变或转移性病变获得的组织，但优选为从原发性病变获得的组织。癌症组织可以为外科样品或活检样品。如本文所用，"来源于结直肠癌患者的PDSX模型"为通过移植来源于结直肠癌患者的癌球状体到非人动物中而制备的模型动物。
在本方面，癌球状体可以从患者的癌症组织获得的细胞群通过任何方法制备。例如，可以使用在本公开的非专利文献1至7中描述的方法。
在一个实施方式中，癌球状体通过以下方法制备：包括将从患者的癌症组织获得的细胞群在含有ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF的培养基中培养。在本实施方式中，本实施方式的培养基不必须包含选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，KCa激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和-RXRβ2激动剂中的药剂，除此之外，癌球状体可以根据上述项2的描述制备。
在进一步的实施方式中，癌球状体通过在上述项2中描述的用于制备本公开的癌球状体的方法制备。用于制备本公开的癌球状体方法能够实现癌球状体的有效制备。
通过用FGFR抑制剂处理来源于结直肠癌患者的癌球状体或PDSX模型和确定癌球状体或PDSX模型对FGFR抑制剂的应答，可以评价结直肠癌患者对FGFR抑制剂的敏感度。当对FGFR抑制剂的应答为阳性时，将患者评价为作为对FGFR抑制剂敏感并可以被选择用于用FGFR抑制剂治疗。
在本公开中，在体外用FGFR抑制剂处理癌球状体。FGFR抑制剂通常添加到培养癌球状体的培养基中。癌球状体优选用基底膜基质如或/>基底膜提取物培养。例如，将来源于结直肠癌患者的癌球状体用酶(如胰蛋白酶)处理来分离细胞，以约5×104至2×106细胞/ml与基底膜基质混合，并将获得的细胞悬浮液播种在培养器材(如培养平板或培养皿)上。在基底膜基质在37℃凝固后，将培养基覆盖其上用于培养。培养基可以为例如上述项2中描述的常用的用于球状体培养的任何培养基。FGFR抑制剂以取决于待评价的FGFR抑制剂而适当确定的浓度进行添加。例如，FGFR抑制剂可以以10-10M至10-5M或10- 9M至10-6M的终浓度添加。在从用FGFR抑制剂施用开始后一段期间，例如，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，或10天后确定对FGFR抑制剂的应答。
在本公开中，PDSX模型为非人动物。用于制备PDSX模型的非人动物的例子包括：免疫缺陷动物如裸小鼠，裸大鼠，SCID小鼠，NOD-SCID小鼠和NOG小鼠。移植位点没有特别限定于具体位点，优选但皮下移植。将进行移植的癌球状体中的细胞数量可以为任何数字，但在小鼠的情况下，通常为约每只1×105～约9×105，优选约5×105。优选所述非人动物当在移植后肿瘤体积达到约300-500mm3时使用于检验。FGFR抑制剂以取决于待评价的FGFR抑制剂而适当确定的剂量施用。例如，FGFR抑制剂以0.1mg/kg体重至100mg/kg体重，1mg/kg体重至30mg/kg体重，或10mg/kg至30mg/kg体重施用。FGFR抑制剂以适当确定的施用间歇进行施用，可以施用一天一次或多次，这样的施用可以在每天或每数天，或每周或每数周进行。对FGFR抑制剂的应答的时间在用FGFR抑制剂施用开始后的一段时间，例如一周至数月，例如一周，两周，三周或四周后确定。
癌球状体对FGFR抑制剂的应答可以基于例如，癌球状体的生长或组织学特征确定。癌球状体的生长可以通过测定来自癌球状体的细胞中含有的报告基因的信号(例如，荧光)确定。PDSX模型对FGFR抑制剂的应答可以基于来源于移植的癌球状体的肿瘤组织的体积或组织学特征而确定。肿瘤组织的体积可以通过如下算式计算:肿瘤体积(mm3)＝[长度(mm)×宽度2(mm2)]/2(其中，长度是指较长的肿瘤轴，宽度是指较短的肿瘤轴)。癌球状体或肿瘤组织的组织学特征可以通过苏木精/伊红染色(H&E染色)或针对细胞增殖标记(如Ki67，PCNA，或MCM2)的免疫染色而确定。组织学特征包括有丝分裂像的数量和变性细胞数。
对FGFR抑制剂的应答通过将从用FGFR抑制剂处理的癌球状体或PDSX模型获得的值与参考值比较而确定。在一个实施方式中，当从用FGFR抑制剂处理的癌球状体或PDSX模型获得的值低于参考值时，将对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。参考值可以是从没有用FGFR抑制剂处理的癌球状体或PDSX模型获得的值(对照值)。另外，参考值可以是对照值的90％至10％(如90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，或10％)，例如对照值的90％至50％。例如，当用FGFR抑制剂处理的癌球状体的生长，用FGFR抑制剂处理的PDSX模型的肿瘤组织的体积，或在癌球状体或PDSX模型中的有丝分裂像的数量低于参考值时，对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。
在不同的实施方式中，当从用FGFR抑制剂处理的癌球状体或PDSX模型获得的值高于参考值时，对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。参考值可以为对照值。另外，参考值可以为对照值的110-200％(如110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，或200％)，例如对照值的110％-150％。例如，当在用FGFR抑制剂处理的癌球状体中或PDSX模型中的变性细胞数高于参考值时，对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。
与参考值的比较可包括或可不包括统计学分析。统计学分析方法的例子包括：单因素方差分析(单因素ANOVA)，双因素方差分析(双因素ANOVA)，Dunnett's检验，和Tukey′s检验。
在一个实施方式中，癌球状体对FGFR抑制剂的应答基于癌球状体的生长而确定，使用的参考值为对照值的90％-50％，例如70％。当用FGFR抑制剂处理的癌球状体的生长低于参考值时，对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。
在不同的实施方式中，PDSX模型对FGFR抑制剂的应答基于PDSX模型的肿瘤组织的体积而确定，使用的参考值为对照值。当用FGFR抑制剂处理的PDSX模型肿瘤组织的体积为统计学显著低于参考值时，对FGFR抑制剂的应答判定为阳性。
如实施例部分显示，已经用作对于FGFR抑制剂的患者选择标准的基于FGFR基因的拷贝数或mRNA量，并不能选择对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者。本公开患者的选择方法能够实现对于对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择，并扩大了FGFR抑制剂的应用。
本公开的方法除了对FGFR抑制剂的应答以外还可包括，确定FGFR抑制剂与不同于FGFR抑制剂的一种或多种药剂的组合的应答。当一种或多种药剂增强对FGFR抑制剂的应答时，所述药剂(多种)可以与FGFR抑制剂使用在结直肠癌的治疗中。所述一种或多种药剂可以为本文列举的那些可以在结直肠癌的治疗中与FGFR抑制剂组合使用的药剂。
结直肠癌的治疗可以施用在切除癌症组织之前或之后。例如，结直肠癌的治疗可以为无法进行手术切除的结直肠癌的治疗或为了预防在癌症组织切除后的复发的治疗。为了进行结直肠癌的治疗而将有效量的FGFR抑制剂施用至结直肠癌患者。如本文所用，"有效量"为在结直肠癌的治疗中能够发挥期望效果，如肿瘤的消除或收缩，肿瘤生长的抑制，或预防复发的量。FGFR抑制剂以根据患者的年龄或体重，疾病严重程度，合并用药或其他因素而适当确定的剂量进行施用，可以按例如，0.01mg/kg体重至100mg/kg体重，0.1mg/kg体重至100mg/kg体重，0.1mg/kg体重至10mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至1mg/kg体重每天进行施用。在一个实施方式中，FGFR抑制剂为厄达替尼并按1mg/天至30mg/天，1mg/天至15mg/天，1mg/天至12mg/天，或1mg/天至10mg/天施用。FGFR抑制剂可以口服或肠外(例如，通过静脉内施用，肌内施用，或皮下施用)施用。FGFR抑制剂可以施用一天一次，两次，三次，四次或更多次，并可以每日或以定期的间隔施用。
FGFR抑制剂可以与内视镜切除，外科切除，或放射疗法组合用于结直肠癌的治疗，或可以与化疗中的一种或多种药剂组合。所述一种或多种药剂可以选自例如，抗癌剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)，替加氟(tegafur)，替加氟-尿嘧啶(UFT)，doxyfluridine(5′-DFUR)，卡莫氟(carmofur)，替加氟/吉美嘧啶(guimeracil)/奥替拉西钾(S-1)，卡培他滨(Cape)，瑞格非尼(regorafenib)，三氟胸苷(trifluridine)+Tipiracil盐酸盐(TAS-102)，丝裂霉素C，伊立替康(IRI)，和奥沙利铂(OX)，和分子靶向剂如血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂(如贝伐珠单抗和阿柏西普(aflibercept))，血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(如雷莫芦单抗(ramucirumab))，EGFR抑制剂(如西妥昔单抗(cetuximab)，帕尼单抗(panitumumab)，或厄洛替尼(erlotinib))。在一个实施方式中，FGFR抑制剂与EGFR抑制剂组合。在一个实施方式中，EGFR抑制剂为西妥昔单抗或帕尼单抗。在进一步的实施方式中，EGFR抑制剂为西妥昔单抗。当本文描述的FGFR抑制剂与一种或多种药剂组合使用时，也包括这些与一种或多种其他的药剂组合使用的情况。
在一个实施方式中，FGFR抑制剂与化疗如FOLFOX治疗(点滴5-FU+左亚叶酸盐+OX)，FOLFIRI治疗(5-FU+左亚叶酸盐+IRI)，FOLFOXIRI治疗(5-FU+左亚叶酸盐+OX+IRI)，CapeOX治疗(Cape+OX)，SOX治疗(S-1+OX)，或IRIS治疗(S-1+IRI)，或这样的化疗和一种或多种分子靶向剂的组合进行组合使用。在一个实施方式中，一种或多种分子靶向剂包括EGFR抑制剂。在一个实施方式中，EGFR抑制剂为西妥昔单抗或帕尼单抗。在进一步的实施方式中，EGFR抑制剂为西妥昔单抗。
当2种以上的药剂组合使用时，这些剂中的一些或所有可以包含在一个组合物中，或可以是所有的剂包含在分开的组合物中。此外，这些药剂的施用日程表可以相同或不同。
包含FGFR抑制剂的药物组合物可以通过常规方法配制。药物组合物可以为片剂，胶囊，粉末，颗粒，悬浮液，糖浆，酏剂，或注射剂形式。根据剂型，除了FGFR抑制剂以外，药物组合物可包括，选自例如，赋形剂，崩解剂，粘合剂，润滑剂，稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，防腐剂，和甜味剂的药学可接受的添加剂，和/或选自例如，水，盐水，油类和醇类的药学可接受的载剂。
本公开的实施方式的例子记载如下。
1.癌球状体的制备方法，包括
在含有以下成分的培养基中培养从患者的癌症组织获得的细胞群：
ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF；和
选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，钙活化钾通道(KCa)激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和视黄酸受体(RXR)β2激动剂的药剂。
2.项1的方法，其中癌症为结直肠癌。
3.项1或2的方法，其中癌症组织为从原发性病变获得的组织。
4.项1-3中任一项的方法，其中药剂为腺苷受体激动剂。
5.项4的方法，其中腺苷受体激动剂为NECA或CV1808。
6.项5的方法，其中腺苷受体激动剂为NECA。
7.项1-3中任一项的方法，其中药剂为PPAR激动剂。
8.项7的方法，其中PPAR激动剂为GW0742，GW7647，S26948或L-165,041。
9.项1-3中任一项的方法，其中药剂为KCa激活剂。
10.项9的方法，其中KCa激活剂为DCEBIO或SKA-31。
11.项1-3中任一项的方法，其中药剂为NMDA型谷氨酸受体激动剂。
12.项11的方法，其中NMDA型谷氨酸受体激动剂为NMDA。
13.项1-3中任一项的方法，其中药剂为组胺H3受体激动剂。
14.项1-3的方法，其中组胺H3受体激动剂为immepip。
15.项1-3中任一项的方法，其中药剂为RXRβ2激动剂。
16.项15的方法，其中RXRβ2激动剂为AC55649。
17.项1-3中任一项的方法，其中药剂选自NECA，CV1808，GW0742，GW7647，S26948，L-165,041，DCEBIO，SKA-31，NMDA，immepip和AC55649。
18.项1-17中任一项的方法，其中ROCK抑制剂为Y27632。
19.项1-18中任一项的方法，其中TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
20.项1-19中任一项的方法，其中培养基进一步包含血清。
21.项1-20中任一项的方法，其中将细胞群培养一周至两个月。
22.组合物，其包含通过项1-21中任一项的方法获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体。
23.患者的药物敏感度的评价方法，包括
通过项1-21中任一项的方法制备癌球状体，和
使由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体在体外与候选剂接触。
24.用于癌症的治疗剂的筛选方法，包括
通过项1-21中任一项的方法制备癌球状体，和
使由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体在体外与候选剂接触。
25.项23或24的方法，其中，方法进一步包括将报告基因导入到癌球状体中的细胞中。
26.来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型的制备方法，包括通过项1-21中任一项的方法制备癌球状体，和
将由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体移植到非人动物中。
27.患者的药物敏感度的评价方法，包括
通过项26的方法制备PDSX模型，和
施用候选剂到由此获得的PDSX模型。
28.用于癌症的治疗剂的筛选方法，包括
通过项26的方法制备PDSX模型，和
施用候选剂到由此获得的PDSX模型。
29.检测微卫星不稳定性(MSI)的方法，包括
通过项1-21中任一项的方法制备癌球状体，和
确定在由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体中的MSI状态或错配修复基因的靶基因的突变。
30.项29的方法，其中所述方法用于预测免疫检查点抑制剂的功效。
31.项30的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
32.项29-31中任一项的方法，其中所述确定包括确定微卫星标记BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，和D17S250中的每一种的重复数。
33.项29-31中任一项的方法，其中错配修复基因的靶基因为TGFBR2，IGF2R，BAX，或CASP5。
本公开的实施方式的进一步的例子记载如下。
1′.对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择方法，包括
用FGFR抑制剂处理来源于结直肠癌患者的癌球状体或来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型，和
确定癌球状体或PDSX模型对FGFR抑制剂的应答，和
当对FGFR抑制剂的应答为阳性时，选择所述结直肠癌患者。
2′.项1′的方法，其中所述处理包括用FGFR抑制剂处理来源于结直肠癌患者的癌球状体。
3′.项2′的方法，其中对FGFR抑制剂的应答基于癌球状体的生长或组织学特征而确定。
4′.项1′的方法，其中所述处理包括用FGFR抑制剂处理PDSX模型。
5′.项4′的方法，其中对FGFR抑制剂的应答基于PDSX模型的肿瘤组织的体积或组织学特征而确定。
6′.项1′-5′中任一项的方法，其中所述方法进一步包括从结直肠癌患者的癌症组织获得的细胞群制备癌球状体。
7′.项1′-6′中任一项的方法，其中所述方法进一步包括通过移植来源于结直肠癌患者的癌球状体到非人动物中而制备PDSX模型。
8′.项1′-7′中任一项的方法，其中FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
9′.项1′-8′中任一项的方法，其中FGFR抑制剂为厄达替尼。
10′.项1′-9′中任一项的方法，其中癌球状体为通过将从患者的癌症组织获得的细胞群在含有ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF的培养基中培养而制备的球状体。
11′.项10′的方法，其中培养基进一步包括选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，钙活化钾通道(KCa)激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和视黄酸受体(RXR)β2激动剂的药剂。
12′.项11′的方法，其中培养基包括腺苷受体激动剂。
13′.项10′-12′中任一项的方法，其中ROCK抑制剂为Y27632，TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
14′.项11′-13′中任一项的方法，其中腺苷受体激动剂为NECA。
15′.项10′-14′中任一项的方法，其中癌症组织为从原发性病变获得的组织。
16′.治疗结直肠癌的方法，包括对于对其有需要的结直肠癌患者施用有效量的FGFR抑制剂。
17′.项16′的方法，其中结直肠癌患者为通过项1′-15′中任一项的方法选择的患者。
18′.项16′或17′的方法，其中所述方法进一步包括通过1′-15′项中任一项的方法选择结直肠癌患者。
19′.项16′-18′中任一项的方法，其中FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
20′.项16′-19′中任一项的方法，其中FGFR抑制剂为厄达替尼。
21′.项16′-20′中任一项的方法，其中所述方法进一步包括施用EGFR抑制剂。
22′.项21′的方法，其中EGFR抑制剂为西妥昔单抗。
23′.药物组合物，其用于治疗结直肠癌，其包含FGFR抑制剂。
24′.项23′的药物组合物，其中药物组合物施用至通过项1′-15′中任一项的方法选择的结直肠癌患者。
25′.项23′或24′的药物组合物，其中FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
26′.项23′-25′中任一项的药物组合物，其中FGFR抑制剂为厄达替尼。
27′.项23′-26′中任一项的药物组合物，其中药物组合物与EGFR抑制剂组合使用。
28′.项27′的药物组合物，其中EGFR抑制剂为西妥昔单抗。
29′.FGFR抑制剂，用于治疗结直肠癌。
30′.项29′的FGFR抑制剂，其中将FGFR抑制剂施用至通过项1′-15′中任一项的方法选择的结直肠癌患者。
31′.项29′或30′的FGFR抑制剂，其中FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
32′.项29′-31′中任一项的FGFR抑制剂，其中FGFR抑制剂为厄达替尼。
33′.项29′-32′中任一项的FGFR抑制剂，其中FGFR抑制剂与EGFR抑制剂组合使用。
34′.项33′的FGFR抑制剂，其中EGFR抑制剂为西妥昔单抗。
35′.FGFR抑制剂用于制备用于治疗结直肠癌的药物的用途。
36′.项35′的用途，其中将药物施用至通过项1′-15′中任一项的方法选择的结直肠癌患者。
37′.项35′或36′的用途，其中FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
38′.项35′-37′中任一项的用途，其中FGFR抑制剂为厄达替尼。
39′.项35′-38′中任一项的用途，其中FGFR抑制剂与EGFR抑制剂组合使用。
40′.项39′的用途，其中EGFR抑制剂为西妥昔单抗。
在以下实施例中对本发明进行了进一步的描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：患者来源的肿瘤原始细胞(patient-derived tumor initiatingcells,PD-TIC)的球状体的制备
1.方法
结直肠癌的肿瘤原始细胞(tumor initiating cells of colorectal cancer,CRC-TIC)和正常结肠上皮细胞的球状体培养
从收集自141个结直肠癌(CRC)患者的每个外科样品中分离2片肿瘤(各0.5–4cm3)和一片正常粘膜(～4cm3)，并储存在冰冷的洗涤培养基[DMEM/F12，含有HEPES和l-谷氨酰胺(Nacalai)，100单位/ml青霉素(Nacalai)，0.1mg/ml链霉素(Nacalai)，和10％胎牛血清(SAFC Biosciences)]中。组织在外科手术后24h内加工。从结缔组织分离一片CRC样品(0.5–1.0cm3)或正常粘膜(1–2cm2)的片，用PBS洗涤，并使用剪刀在60mm皮氏皿中切碎。将组织碎片在2ml的胶原酶溶液[洗涤培养基中补充有0.2％胶原酶I型(Thermo Fisher)和50μg/ml庆大霉素(Thermo Fisher)]中于37℃消化40–60min，并用1ml移液器通过间隔～20min吹打2–3次进行解离。然后，细胞通过100μm细胞过滤器(Corning)过滤和收集。然后将细胞重悬在Matrigel(Corning)中，并放置在12孔细胞培养板中每一孔的中心(～1×104-5×104细胞/30μl每孔)。在Matrigel于37℃聚合后，将来源于CRC样品的细胞用癌症培养基[改良的DMEM/F-12(Thermo Fisher)，100单位/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，2mM l-谷氨酰胺(Nacalai)，10μM Y27632(R&D)，10或1μM SB431542(R&D)，5μg/ml Plasmocin(Invivogen)，和5％FBS(Thermo Fisher)]培养，将来源于正常粘膜的细胞在eL-WRN培养基[改良的DMEM/F-12，100单位/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，2mM l-谷氨酰胺，50％L-WRN条件培养基，10μMY27632，10或1μM SB431542，50ng/ml EGF(Peprotech)，5μg/ml血浆素，和20％FBS]中培养。L-WRN CM，其为L-WRN细胞(College of American Pathologists ConsensusStatement1999.Arch Pathol Lab Med.2000；124:979-94.)的条件培养基，根据已有报道(Gene.1991；108:193-9)制备。在一些实验中，向癌症培养基中补充了100ng/ml bFGF(Peprotech)，50ng/ml EGF，1μM NECA(Sigma)，和/或B27补充剂(Thermo Fisher)。当癌球状体培养扩张到一个平板(12孔板中的12孔)时，认为球状体株成功建立。在培养结束时，细胞数量为～5×104-2×105细胞/孔。因此获得的癌球状体被储存在冰箱中到使用于各个实验。在如下实验中，冰冻的癌球状体解冻并传代了5-20次，并进行胰蛋白酶解来制备细胞聚集体，每个细胞聚集体含有几个或几十个细胞。细胞聚集体然后包埋在Matrigel(Corning)中用于实验。建立的球状体株用最低限的补充剂培养。
从球状体制备DNA和组织学样品
将在Matrigel中的球状体悬浮在细胞恢复液(Corning)中，并收集在1.5ml管中。Matrigel在4℃旋转消化30–60min。球状体在200×g离心5min，并用PBS于4℃洗涤两次。DNA使用DNeasy血液&组织试剂盒(Qiagen)纯化。关于组织学分析，球状体不经胰蛋白酶解而传代一次或两次以便形成更大的细胞聚集体。将因此获得的球状体包埋在iPGell(Genostaff)中，并于4℃用在PBS中的4％多聚甲醛固定16h。
CRC的组织病理学分类
福尔马林保存的石蜡包埋样品在4μm厚度切片，用H&E染色。原发性癌症和球状体组织学等级根据WHO指南和美国病理学家协会的建议确定。
突变热点分析
在50个癌症相关基因中的热点突变通过Macrogen公司使用Ion AmpliSeq CancerHotspot Panel v2(Thermo Fisher)根据要求进行了检测。测序的基因和突变的列表可从制造商的网站获得(http://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv)。数据集使用Integrative Genomics Viewer软件(Broad Institute)分析。
基于阵列的比较基因组杂交(CGH)分析
基于阵列的CGH分析用Agilent SurePrint G3人CGH微阵列1x1M(G4447A，Agilent，Hachioji，日本)和基因组DNA ULS标记试剂盒(#5190-0419，Agilent)根据制造商的说明书进行。将人基因组DNA(G1521和G1471，Promega，Madison，WI，USA)用作参考和对照。使用Agilent G2565BA微阵列扫描仪(Agilent)扫描了阵列玻片。
球状体的慢病毒感染
将编码萤火虫荧光素酶(luc2，Promega)的cDNA片段插入含有CAG启动子的pCX载体来构建pCX-Luc2。将pCX-Luc2表达单元(CAG-荧光素酶)插入慢病毒载体(pCDH，SystemBiosciences)中来构建pCDH-CAG-Luc2。慢病毒粒子根据之前的报告(Gene.1991；108:193-9)中的方案稍作修改而制备。简而言之，将2×107的293FT细胞(Thermo Fisher)播种在四个10cm皿上，培养过夜。细胞用40μg pCDH-CAG-Luc2质粒的DNA，26μg psPAX2包装质粒，和14μg pMD2.G包膜质粒使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)转染。病毒粒子在转染后第二和第三天回收，并使用PEG-it Virus-Precipitation溶液(System Biosciences)沉淀。将病毒粒子重悬在2ml的洗涤培养基中，等分至1.5ml管(每管50μl)中，并储存在–80℃。将培养在12孔细胞培养平板中的一孔的球状体进行胰蛋白酶解，约半数的细胞通过离心(200×g)被收集到1.5ml管中。将细胞重悬在50μl的含有10μg/ml海美溴铵和10μM Y27632的病毒溶液中，并于37℃孵育6h。然后，通过离心(200×g)收集细胞，重悬在60μl的Matrigel中，并播种至12孔细胞培养板的两孔中。
球状体的基于发光的生长监测
关于生长监测分析，将表达荧光素酶的球状体培养在12孔细胞培养平板的2–3孔中。对球状体进行胰蛋白酶解，通过40μm细胞过滤器(Corning)过滤，用洗涤培养基稀释4–8次(基于Matrigel的体积)而提供5×104-2×106细胞/ml的浓度，所述浓度取决于生长速度和球状体密度。将球状体细胞重悬在Matrigel中，分配至在37℃的平板加热器上的96孔"白"细胞培养平板(Corning；每孔3μl)的孔中，在100μl/孔的培养基中培养过夜。球状体用100μl/孔的PBS洗涤，用50μl的150μg/ml荧光素在无酚红的DMEM/F12培养基(Nacalai)中在室温(20–28℃)温育10min。发光使用常规成像装置(Gel Doc XR+，BioRad)评分。在这初始测定后，每孔中的球状体用100μl的PBS洗涤，培养在100μl的培养基中。每天或3天后测定发光。将每孔的细胞生长速度预估为相对于第1天的那些而言的光子计数的比例。对于化学化合物筛选分析除外的所有的实验中的每一数据点，分析了4或6个重复(具有相似的统计学能力)。
2.结果
患者来源的结直肠癌球状体的制备
为了培养患者来源的结直肠癌的肿瘤原始细胞球状体(PD-CRC-TIC球状体)，发明人制备了"癌症培养基"，其中，在基础培养基(改良的DMEM/F12)中补充了FBS(5％)和Rock抑制剂Y27632和TGF-βI型受体抑制剂SB431542。为了培养来自相同患者的正常结肠上皮细胞的球状体，发明人也通过用Y27632和SB431542补充了L-WRN条件限制培养基而制备了"eL-WRN培养基"。发明人培养了来自141名结直肠癌患者的148个结直肠癌样品。病理学上，样品根据标准组织学标准被归类为低等级(138/148)，高等级(5/148)，和黏液(5/148)腺癌。在原发性肿瘤和它们的球状体之间，癌症上皮的组织学特征良好符合(图1)。为了表征关键遗传突变，发明人测序了36个CRC-TIC球状体株的50个癌症相关基因(图5)。
球状体的基于荧光素酶的生长监测
难于确定在3D培养中的活细胞数和细胞的生长速度。为了精确确定球状体培养中的细胞数量，发明人采用了用含有通过CAG启动子驱动的荧光素酶表达载体的慢病毒感染的球状体。因为感染的高效率消除了富集表达亚群的必要，发明人在没有进行亚克隆下将感染后的球状体传代2–3次，直接对它们进行细胞生长分析。发明人从传代后1至4天每日监测正常和癌球状体株的生长(图2A)。如图2B所示，在16个重复孔之间的生物发光水平相异相当广泛，反映出在初始细胞数中(变异系数，6.5–7.6％)的差异。然而，在相对于第1天的初始光子计数进行校正时，偏差降低至1.6–3.2％(图2C)。因此，本方法为监视球状体生长的可信赖的方法。
用EGF和bFGF刺激的CRC-TIC球状体生长
为了确定EGF和bFGF是否在以上描述的癌症培养基中帮助球状体增殖，发明人用EGF和/或bFGF培养了四个携带野生型RAS/RAF基因的慢生长CRC-TIC球状体株(HC6T，HC9T，HC11T，HC21T)。因为EGF/bFGF基本上是促进这些球状体株的生长的(图3A)，发明人然后通过基于发光的生长监测定量了它们的效果。为了校准效果，发明人引入生长效应指数(GEI)，生长效应指数定义为经施用的组与仅有溶剂的对照在每一对的分析中的相对生长速度。发明人发现，在携带野生型RAS/RAF基因的所有的四球状体株中，添加EGF和bFGF两者使GEI翻倍(图3B和图6A)。根据球状体株不同，通过EGF和bFGF的生长提升的程度不同。在两个株(HC6T，HC9T)中bFGF比EGF更有效，与此相对，在一个株(HC11T)中情况相反(图3B)。在另一个球状体株(HC21T)中，在两种生长因子之间效果相似(图3B)。EGF/bFGF对携带RAS或RAF突变(HC2T，HC13T，HC18T)的三个球状体株只显示受限的生长促进效果(通过两者有<55％的增加；图3C和图6B)。EGF和bFGF也使正常结肠上皮细胞的球状体生长翻倍(图3D)。两种球状体株HC6T和HC9T显示了FGF9染色体区的增幅，这可解释bFGF的GEI在这些系中比在正常球状体中更好。
通过化学文库筛选鉴定的生长促进补充剂
为了找到另外的可以促进球状体生长的辅助的因子，发明人甄别了80个药理学激动剂或激活剂对具有中等生长速度(即，在3天中3–4倍)的三个荧光素酶表达CRC-TIC球状体株(HC21T，HC18T，HC25T)的生长促进效果。发明人鉴定了以>25％刺激球状体生长的11个化合物(图4A；图8A和8B)。11个化合物中包含两种腺苷受体(AR)激动剂(NECA，CV1808)，四种PPAR激动剂(GW7647，GW0742，S26948，L-165,041)，和两种钙活化钾通道(KCa)激活剂(DCEBIO，SKA-31)，一种NMDA型谷氨酸受体激动剂(NMDA)，一种组胺H3受体激动剂(immepip)，和一种视黄酸受体(RXR)β2激动剂(AC55649)(各10μM)。
发明人然后对GW0742(PPARδ激动剂)，NECA(非选择性AR激动剂)，和SKA-31(KCa2和KCa3.1a的激活剂)进行滴定实验。NECA显示生长提升的强活性(在HC18T和HC21T球状体株中，分别EC50＝63.1和195nM)，其他两种化合物在10μM显示显著效果(图4B)。发明人也确认了另一个AR激动剂CV1808(2-苯基氨基腺苷)显示了生长促进效果，虽然比NECA弱(图9A)。这些结果表明，AR激动剂特别是NECA适合CRC-TIC球状体培养物。对于NECA的剂量依赖性反应在三个独立实验中可重现性高(图9B)，强调了本公开的球状体培养在药物敏感度实验中的可靠性。
用NECA通过cAMP-PKA信号通路对CRC-TIC球状体生长的刺激
因为A2B为在结肠上皮中唯一表达的腺苷受体，NECA似乎在这些细胞中刺激环AMP(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)信号。一致地，NECA以及CV1808诱导的球状体中的形态学变化通过细胞平板化和球体大小的提高而表征，与在施用毛喉素的球状体中的特征相似(图4C和图9C)。在EGF和bFGF以外补充NECA，使得我们能够实现当用EGF和bFGF单独时对于它们的生长刺激无效的三个慢生长球状体株(HC28T，HC32T，HC52T)的稳定保持。据此，发明人用慢病毒感染这些球状体株并让它们表达荧光素酶基因来监视它们的生长。通过荧光素酶分析，发明人确认添加EGF，bFGF和NECA以50％以上显著刺激了它们的生长(图4D)。这些球状体株单独在癌症培养基中几乎不生长(生长速度，～1.0)(图9D)。这些结果表明，cAMP-PKA和MAPK/ERK信号的活化增强了CRC-TIC球状体的增殖。因此，通过用三个额外的成分EGF，bFGF和NECA对基础癌症培养基进行补充，发明人能够培育一些甚至生长极慢的球状体。
对于PD-TIC球状体的最优化培养条件
在以上结果的基础上，发明人为正常和癌症球状体两者修改了培养基。在表1中的A-D时期，只有在当用所述培养基的生长不充分时，EGF和bFGF才添加到标准培养基中。发明人最优化了在V时期中SB431542的浓度至1μM，来避免其在10μM经常见到的生长抑制(图7A)。由于B27补充剂(Thermo Fisher)促进CRC-TIC球状体生长(图7B)，发明人在表1中的时期E中，在PD-CRC-TIC的初始培养中包含了EGF，bFGF，NECA和B27补充剂(Thermo Fisher)。
建立CRC-TIC球状体的整体成功率为73％(108/148)。CRC-TIC球状体培养不成功的理由包括，被微生物(细菌或酵母；4例)污染，在外科手术前被放射疗法导致细胞损伤(2例)，在之前传代中细胞生长不良接着细胞死亡(未知原因；34例)。发明人发现，在成功率和肿瘤阶段之间没有统计学相关性(表2)。培养条件的最优化的结果，在表1中时期E，建立CRC-TIC球状体的成功率提高至～90％(表1)。
表1
建立CRC-TIC球状体的成功率
*从其成功建立了球状体株的CRC样品数。
表2
CRC样品的肿瘤阶段
*从其成功建立了球状体株的CRC样品数。
参考例1：在PDSX模型中的药物敏感度实验
(1)在PDX模型和PDSX模型之间的比较
为了比较PDX模型和PDSX模型在药物敏感度实验中的应用，发明人从经受外科切除的89名结直肠癌患者获得的92个样品建立了PDX和PDSX模型。
肿瘤样品用洗涤培养基(含有10％小牛血清，100U/ml青霉素，和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12)和PBS各洗涤两次。尽可能除去肿瘤样品的坏死组织。在洗涤后，发明人将肿瘤样品分成50-100mm3的立方块，并用来建立癌球状体和PDX。
为了建立P0(初始)的PDX，将肿瘤片在异氟烷麻醉下直接植入裸小鼠(BALC/c-nu)和/或NOD-SCID小鼠的每一侧腹部。植入的肿瘤的生长用一对卡尺一周最少测量一次，每个肿瘤体积使用如下算式预估：肿瘤体积(mm3)＝[长度(mm)×宽度2(mm2)]/2(长度是指较长的肿瘤轴，宽度是指较短的肿瘤轴)。所述移植在移植6个月后当预估的肿瘤体积达到～1000mm3时判断为成功，如果没有可见的肿瘤包块则作为失败。为了将肿瘤传代，发明人切离它们并将它们分为50-100mm3的立方块。这些片段被移植到裸小鼠中来建立下一代的PDX。
本实施例使用的患者来源的球状体通过解冻在实施例1中建立的21株冰冻的样品而获得，其中使用了为补充了FBS(5％)，ROCK抑制剂(Y27632)和TGF-βI型受体抑制剂(SB431542)的基础培养基(改良的DMEM/F-12)的癌症培养基，或进一步包含EGF和bFGF的癌症培养基。球状体用建立它们时使用的培养基培养。
PD-CRC-TIC球状体在12孔培养平板中培养。球状体达到融合培养时(4×105-4×106细胞/孔)用PBS洗涤两次，与Matrigel一起转入1.5ml管。用PBS将球状体的悬浮液体积调整至100μl，并以1×105–9×105细胞/小鼠将因此获得的悬浮液注射至裸小鼠皮下。
发明人在92例中的56例(61％)成功建立了P0(初始)代PDX小鼠，在92例中的68例(74％)成功建立了PD-CRC-TIC球状体。
为了确定从PD-CRC-TIC球状体建立移植模型的效率，发明人用21株PD-CRC-TIC球状体株皮下注射了裸小鼠，并有18株成功建立了模型小鼠(86％)。另一方面，从P0(初始)传代到P1代PDX的成功率为70％。对于药物剂量测试，需要制备足够用于强统计学能力(例如，每组n＝3–6)的大数量的小鼠。据此，对于PDX模型，多次移植不可避免地伴随2种以上的传代。在另一方面，对于PDSX模型，一旦发明人在体外繁殖球状体，发明人能够同时生成足够数的PDSX小鼠。
在生成P0(founder)PDX的56例中，236个样品中的148个(63％)形成了P1 PDX。另一方面，198/228(87％)的注射球状体的小鼠发展成PDSX小鼠。与PDX模型相比，PDSX模型在个体小鼠之间的肿瘤体积上显示小得多的差异。对于P1 PDX和PDSX之间的变异系数(CV)分别为0.53和0.29。
为了评价用PDX和PDSX模型的药物敏感度实验中的可靠性，发明人制备了用来自4个结直肠癌患者的样品进行移植的实验小鼠。发明人需要排除94个中的23个(24％)PDX作为异常值，因为生长速度有大的个体差异。另一方面，发明人根据相同标准排除了85个中的9个(11％)PDSX。
首先，发明人由来源于携带BRAFV600E突变的CRC案例(HC13T)制备PDX和PDSX模型，并进行了药物敏感度检验(图10A)。
制备了PDX(P2–P4)和PDSX小鼠并当预估肿瘤体积达到300–500mm3时进行药物敏感度检验。小鼠被分入对照和施用组(每组n＝3–6)。将开始给药之日定义为第1天，每一小鼠的肿瘤体积和体重每周测量两次，共3周(第1–22天)。施用方案设计为用来反映临床方案，用于小鼠的药物剂量根据如下算式计算：小鼠剂量(mg/kg)＝人剂量(mg/kg)×37(人Km)/3(小鼠Km)。在FOLFOX样施用中，小鼠为先腹腔内注射(i.p.)奥沙利铂(12mg/kg)和左亚叶酸钙(30mg/kg)，接着5-氟尿嘧啶(55mg/kg)，每周进行一次，共3周。对于西妥昔单抗施用，小鼠每次注射250μg，腹腔内注射(i.p.)每周两次共3周。这些剂量小于最大耐受剂量，大约为临床相关剂量的80％。相对肿瘤体积通过的在第1天的初始肿瘤体积进行校正。为了评价施用的药物的效果，计算了T/C(施用/对照)和TGI(肿瘤生长抑制)值。T/C定义为施用的组与未经处理的组的相对肿瘤体积的比，表明施用导致的肿瘤生长抑制。T/C的值通过如下算式计算。TGI的值也通过如下算式计算并使用于评价肿瘤生长抑制。
T/C(％)＝相对肿瘤体积(施用)/相对肿瘤体积(对照)×100。
TGI(％)＝[1–Δ相对肿瘤体积(对照)/Δ相对肿瘤体积(施用)]×100，或
TGI(％)＝[1–Δ相对肿瘤体积(对照)]×100(Δ相对肿瘤体积(对照)<0(肿瘤退缩)的情况下)。
Δ相对肿瘤体积＝(在第22天的相对肿瘤体积)–(在第1天的相对肿瘤体积)。
西妥昔单抗在PDX和PDSX模型两者中无效(T/C：利用PDX和PDSX分别为120％和114％)，FOLFOX样方案显著降低了肿瘤生长(T/C：利用PDX和PDSX分别为48％和57％)(图10B)。与利用PDX的相应的数据点相比，利用PDSX的数据显示小得多的差异(图10B)。实质上，在三个另外的患者肿瘤中获得了相同的结果。换言之，利用PDSX的所有的数据集与利用PDX的那些相比只有一半大的CV[CV(均值)：对于PDSX和PDX分别为15和29]。
为了确定可重现性，发明人用从HC13T肿瘤独立制备的两组PDSX(处于第12和16传代的球状体；P12和P16)和PDX(P2和P3代)进行药物敏感度实验。利用PDSX的两组的相对肿瘤体积与利用PDX[Spearman r＝0.8795％CI：0.69–0.95]的那些相比，显示了更强的相关性[Spearman r＝0.99，95％CI：0.96–0.99](图11A-11D)。发明人用另外的两个案例获得了相似的结果，强调了PDSX模型的高可重现性。因此，PDSX模型能够使在生长速度和评价药物敏感度中的个体差异降低，即使在如每组三至四这样少的数量的小鼠的情况下。
(2)在反映临床效果的患者的PDSX模型中的药物敏感度
发明人以回顾性方式比较了PDSX的药物反应与患者的临床效果。发明人从7个经历在原发性肿瘤切除后的针对转移的化疗处理的患者制备了PDSX图。发明人进行了与在相应的患者中的化学疗法方案匹配的共计9个药物剂量测试。应注意，利用PDSX的9个集中的8个(89％)的药物剂量结果很好地反映了它们相应的临床效果。换言之，在患者中有效[部分响应(PR)或疾病稳定(SD)，根据RECIST]的治疗方案在处理PDSX中也有效，与此相对，那些在患者中不有效的[进展性疾病(PD)，根据RECIST]在PDSX中无效。此外，在PDSX剂量测试(施用/对照，T/C)的结果和患者效果[根据RECIST最佳反应(BR)(r＝0.70，p＝0.04)之间，以及在患者中的临床反应持续时间(DOR)(r＝-0.77，p＝0.04)]有强相关性。在TGI(肿瘤生长抑制)和患者效果之间也观察到强相关性[两者BR(r＝-0.72，p＝0.03)和DOR(r＝0.83，p＝0.02)]。
典型的患者的结果示于图12A-12G和图13A-13D中。对于对PDSX模型的FOLFOX样施用，小鼠为先腹腔内注射(i.p.)奥沙利铂(12mg/kg)和左亚叶酸钙(30mg/kg)，接着5-氟尿嘧啶(55mg/kg)，每周进行一次，共3周。对于伊立替康施用，小鼠每周一次注射(i.p.)40mg/kg，共3周。对于FOLFIRI样施用，小鼠先注射(i.p.)伊立替康(40mg/kg)和左亚叶酸钙(30mg/kg)，接着5-氟尿嘧啶(55mg/kg)，每周进行一次，共3周。对于西妥昔单抗施用，小鼠每次注射中腹腔内注射(i.p.)250μg，每周两次共3周。
在图12A-12D中的患者1罹患具有腹膜扩散的右侧结肠癌，经受了原发性病变的外科切除。然后，患者用S-1(-5-FU前药)+奥沙利铂(FOLFOX样方案)治疗，导致4个月的SD(疾病稳定)(图12A和12B)。在PDSX中的另一个FOLFOX样施用导致中等的应答(T/C＝50％，TGI＝82％)，与对照组有显著差异(图12C和12D)。之后，患者用伊立替康+西妥昔单抗治疗，导致了具有6个月的DOR的SD(图12A和12E)，尽管归因于由意外引起的膝盖骨折使施用中断了1个月。由于中断，该患者的血清CEA水平伴随着转移性扩大而迅速提高。然而，恢复施用用2个月迅速降低了CEA水平(图12A)。发明人也在PDSX小鼠上进行了相同的伊立替康+西妥昔单抗方案，其导致中等的应答(T/C＝37％，TGI＝93％)(图12F和12G)。据此，这些临床结果的集两者均在相应的PDSX的剂量实验中良好地再现。
在图13A-13D中的患者3罹患具有肝转移的左侧结肠癌。首先，患者用FOLFOX+帕尼单抗(抗EGFR抗体)方案治疗，导致肿瘤体积和血清CEA水平剧烈降低。在原发性病变切除后，患者再次接受FOLFOX+帕尼单抗，其导致PR[DOR；4个月(第二次FOLFOX+帕尼单抗施用)](图13A和13B)。接着5个月的第二次FOLFOX+帕尼单抗施用，血清CEA水平开始上升，表明对方案有耐药性。然后患者换成FOLFIRI+贝伐珠单抗方案，导致SD(DOR；5个月)(图13A和13B)。在PDSX模型中，肿瘤对FOLFOX+西妥昔单抗敏感，导致PR(T/C＝42％，TGI＝122％)(图13C和13D)。在另一方面，PDSX模型对FOLFIRI方案没有应答(T/C＝76％，TGI＝50％)图13C)。据此，基于FOLFIRI的施用的无效结果表现为原发性癌的固有征的，这反映在PDSX数据中。
PDX模型已被报告为可预测临床反应。为了进一步评价PDSX的预测能力，发明人将在PDSX中的药物剂量测试的结果(T/C和TGI)与来源于相同患者的肿瘤的PDX中的那些进行比较。与在PDX中的那些比较，PDSX的结果显示了T/C[r＝0.93(95％CI：0.63至0.99)，p＝0.001]和TGI[r＝0.93(95％CI：0.64至0.99)，p<0.001]两者的强一致性。这些结果支持了PDSX在药物敏感度的非临床评价中强大的可靠性。
PDX用于个体化医疗最实用性局限之一，为需要长时间来制备对于药物剂量测试而言足够数的PDX小鼠。例如，在我们的研究中花费5个月或更久来制备P2代PDX。[更精确地，对于P0(初始)代肿瘤增长到1,000mm3(中位数)花费70天，在P1代达到相同大小为～50天]。之后，对于P2 PDX生长到300–500mm3大小(适于药物给药)花费～1个月。另一方面，仅花费2–3个月来制备1组～20只的PDSX小鼠。[～1个月用来从原发性病变建立球状体，接着再1–2周来增长它们到对于注射小鼠而言足够数的球状体。]之后，花费～24天用来扩增PDSX到300–500mm3大小。这些结果表明，PDSX方法不只在药物敏感度实验的准确性上比PDX方法更为优越，而且也在肿瘤负荷小鼠的制备上节省时间。发明人能够期待在患者条件恶化之前将剂量数据反馈到临床。
参考例2：微卫星不稳定性的检测
(1)使用DNA样品来源的球状体检测微卫星不稳定性(MSI)，免疫组织化学检测在结直肠癌中的错配修复(MMR)蛋白质
发明人从110名结直肠癌患者的外科样品建立了111株癌细胞球状体株并配对了11株正常上皮细胞球状体株。患者之一具有双重癌。
对于实施例中的在有或没有EGF和bFGF下用癌症培养基(补充FBS(5％)，ROCK抑制剂(Y27632)和TGF-βI型受体抑制剂(SB431542)的基础培养基(改良的DMEM/F12))建立的94株癌球状体而言，用与建立时使用的相同的培养基进行培养。来自相同患者的正常结肠上皮细胞的球状体在"eL-WRN培养基"中培养，其中将Y27632和SB431542添加到L-WRN条件培养基中。对每球状体的约2x105～约1×106细胞提取了DNA。
用于111名患者全员，发明人使用了芯片MSI检验，在Agilent Bioanalyzer chips上分析了从癌症和正常球状体提取的DNA扩增的PCR产物。使用五种微卫星标记BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，和D17S250(Bethesda组)确定MSI状态。在微卫星稳定(MSS)案例中，在癌症细胞和对应的正常细胞之间，PCR产物的峰型一致接近(图14A)，在MSI阳性案例中确认了移位的峰(图14B和14C)。当在五种标记中的2种以上显示移位峰，发明人称为MSI-H。如果只有五种标记之一显示移位峰，发明人称为MSI-L，然后测试两种追加标记：BAT40和MYCL。使用这样的分析，发明人检测到了8个(7.2％)MSI-H，30个MSI-L和73个MSS案例。
接着，为了确认在MSI状态和MMR缺陷之间的相关性，对所有的111案例的原发性病变进行了MMR蛋白质(MLH1，MSH2，MSH6和PMS2)的免疫组织化学(IHC)。结果，检测到8个MMR缺陷案例和87个MMR正常案例(图14D)。在MSI检验和IHC的结果之间存在一个不一致案例(HC13T)。发明人也对在福尔马林保存的石蜡包埋球状体样品中的MMR蛋白质进行了染色。除了一个案例(HC13T)以外，原发性病变和球状体样品之间的IHC结果符合。尽管HC13T通过在球状体样品的芯片MSI检验和MMR蛋白质的序列分析被诊断为MMR正常，但原发性病变样品的分析检测到MLH1和PMS2的缺少。这样的不同可能由IHC分析在原发性病变上的质量不高引起，因为针对球状体的IHC检测到了MLH1和PMS2。根据在111个案例的原发性病变和球状体样品两者中的芯片MSI检验和IHC的结果，8个案例(7.2％)确定为MSI-H(HC4T，HC8T，HC26T，HC49T，HC44T，HC106T，HC114T和HC137T)。
接下来，发明人使用序列分析来确定在TGFBR2，BAX，IGF2R和CAPSP5的单核苷酸重复序列中的突变。由于球状体来源的DNA样品为高纯度，使得能检测杂合突变(图14E)。
(2)使用球状体来源的DNA的精确MSI分析
为了比较球状体来源的DNA样品与福尔马林保存和石蜡包埋(FFPE)组织来源的DNA样品的质量，发明人对FFPE组织来源的DNA样品和球状体来源的DNA样品52例进行了芯片MSI检验。首先，检测了两种DNA样品的质量。球状体来源的DNA样品的A260/A280的中位数显著高于FFPE组织来源的DNA样品(1.8vs 1.7，p<0.0001)，球状体来源的DNA样品的浓度的中位数也高于FFPE组织来源的样品(44ng/μl vs 30ng/μl，p＝0.06)(图15A)。使用FFPE组织来源的DNA样品MSI检验检测到4个(8.0％)MSI-H案例，46个MSI-L和MSS案例(MSI-L:14例，MSS:32例)。在另一方面，使用球状体来源的DNA样品检验的检测到5例(10％)MSI-H，45例MSI-L和MSS。
对于所有测试的基因位点，从球状体来源的DNA扩增的PCR产物峰高显著高于FFPE组织来源的DNA的那些(图15B)。根据芯片MST检验，MMR蛋白质的IHC，和MMR-缺陷靶基因的序列分析的结果，利用球状体来源的DNA样品的MSI检验的敏感度和特异性两者为100％，与此相对，利用FFPE组织来源的DNA的那些分别为60％和98％。这些结果显示球状体来源-DNA样品分析比FFPE组织来源的DNA样品分析更灵敏。
为了进一步检验DNA样品的质量，发明人使用在MSI-H案例中的球状体来源DNA样品和FFPE组织来源的DNA样品进行MMR缺陷靶标的4个基因的测序。用球状体来源DNA样品检测到的杂合突变，用FFPE组织来源的DNA样品没有确认到(图15C)。在球状体来源的DNA样品中的各基因的频率的移框突变为：TGFBR2为75％，IGFR2为0％，BAX为0％和CASP5为63％。用FFPE组织来源的DNA样品检测的所有基因的突变频率低于用球状体来源的DNA样品的那些。这可能是因为正常细胞的DNA污染。图15D为典型的序列谱图。这案例(HC49T)在球状体来源的DNA分析中被解释为BAX的G7/G7纯合突变(图15D，左)。然而，在FFPE组织来源的DNA分析中，代表来自正常细胞的野生型等位基因的峰占重要位置，难以确定是否有任何突变(图15D，右)。据此，球状体来源的DNA样品能够实现比FFPE组织来源的DNA样品更精确的MSI测试。
实施例2:对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的选择
1.方法
化学物质
将厄达替尼(JNJ42756493，Active Biochem，泛FGFR抑制剂)，AZD4547(ActiveBiochem，FGFR1-3抑制剂)，BGJ398(AdooQ，FGFR1-3抑制剂)，BLU-554(Selleck Chemicals，FGFR4选择性抑制剂)，和rogaratinib(MedChemo Express，FGFR1-3抑制剂)溶解和稀释在DMSO中。将西妥昔单抗(Erbitux，Merck)溶解在磷酸缓冲盐水(PBS)中。
患者来源的球状体的建立
本实施例使用的球状体为：实施例1中通过将肿瘤来源的细胞在含有100ng/mlbFGF(Peprotech)和50ng/ml EGF(Peprotech)的癌症培养基中培养而建立的患者来源的癌球状体，和从正常粘膜细胞建立的球状体。建立的癌球状体株用含有bFGF和EGF上述癌症培养基培养。
表达荧光素酶的球状体的制备
如在实施例1中描述的通过使用慢病毒载体而制备了表达荧光素酶的球状体。
球状体中的药物敏感度实验
在12孔细胞培养平板的2–3孔中(在60-90μl Matrigel中)培养表达荧光素酶的球状体。对球状体进行胰蛋白酶解，通过40μm细胞过滤器(Corning)过滤，用洗涤培养基稀释4–8倍(基于Matrigel的体积)而提供5×104-2×106细胞/ml的浓度，所述浓度取决于生长速度和球状体密度。从此获得的球状体溶液取300μl，将细胞重悬在等体积的Matrigel中。将在Matrigel中的球状体细胞分配至在37℃的平板加热器上的96孔"白"细胞培养平板(Corning；每孔3μl)的孔中，在100μl/孔的培养基中培养过夜。球状体用100μl/孔的PBS洗涤，用50μl的150μg/ml荧光素在无酚红的DMEM/F12培养基(Nacalai)中在室温(20–28℃)温育10min。发光使用常规成像装置(Gel Doc XR+，BioRad)评分。在这初始测定后，每孔中的球状体用100μl的PBS洗涤，培养在100μl的培养基中。在第1天和第3天确定发光。通过获得GEI(生长效应指数)确定药物的效果，GEI为药物用处理的组与对照组(施用溶剂的组)相比的生长速度。结果用三个独立实验，每一份重复3次的均值来显示。
来源于患者的球状体异种移植物(PDSX)模型的制备
来源于患者的球状体在12孔培养平板中培养至变得融合(4×105-4×106细胞/平板)，球状体用PBS洗涤两次并与Matrigel一起放置在1.5ml管中。用PBS将球状体悬浮液的体积调整至100μl，将因此获得的悬浮液按1×105-9×105细胞/小鼠皮下注射至4-6周雌性裸小鼠(BALB/c-nu)。
在PDSX模型中的药物敏感度实验
当预估肿瘤体积的均值达到300mm3时，将PDSX小鼠用于药物剂量检验。肿瘤体积(mm3)通过如下算式预估：长度x宽度2/2。发明人将如下种的肿瘤作为异常值从测试排除：过小(<100mm3)，自发地缩小，大小保持不变，或植入较深并难于测量。
将每集的小鼠分为对照和施用组(每组n＝3–4)，施用组包含以下：厄达替尼单药治疗，西妥昔单抗单药治疗，和厄达替尼+西妥昔单抗。将开始给药之日定义为第0天，对每一小鼠的肿瘤体积一周测量两次，共3周(第0–21天)。对于厄达替尼施用，根据之前的报告将小鼠剂量设为10mg/kg(Perera TPS等.Mol Cancer Ther.2017；16(6):1010-20)，通过允许小鼠摄入含有DMSO作为溶剂的10mg/mL药物的凝胶(蔗糖素，ClearH2O)代替水进行口服给药。对于西妥昔单抗施用，根据如下算式设置小鼠剂量：小鼠剂量(mg/kg)＝人剂量(mg/kg)×37(hKm)/3(mKm)，其中，Km表明人或小鼠体表面系数，小鼠为按250μg每次注射进行腹腔内注射(i.p.)，一周两次，共三周。
相对肿瘤体积通过以在第0天的初始肿瘤体积进行校准来预测。为了评价药物剂量效果，在四组之间比较了第21天的肿瘤体积相对于在第0天的肿瘤体积的比。
组织学检查
根据标准步骤制备PDSX的石蜡包埋组织。切片用H&E染色或进行对Ki67的免疫染色。
从球状体制备DNA
将在Matrigel中的球状体悬浮在细胞恢复液(Corning)中，并收集在1.5ml管中。Matrigel在4℃旋转消化30–60min。球状体在200×g离心5min，并用PBS于4℃洗涤两次。DNA使用DNeasy血液&组织试剂盒(Qiagen)纯化。
基于阵列的比较基因组杂交(CGH)分析
基于阵列的CGH分析用用Agilent SurePrint G3人CGH微阵列1x1M(G4447A，Agilent，Santa Clara，CA，USA)和基因组DNA ULS标记试剂盒(#5190-0419，Agilent)根据制造商的说明书进行。将人基因组DNA(G1521和G1471，Promega，Madison，WI，USA)用作参考和对照。使用Agilent G4900DA SureScan微阵列扫描仪(Agilent)扫描了阵列玻片。
从球状体制备RNA
将在Matrigel中的球状体悬浮在细胞裂解液(TaKaRa)中，RNA使用RNA kit(#U0955C，TaKaRa)纯化。
RNA的微阵列分析
基于阵列的mRNA表达分析用SurePrint G3人基因表达8x 60k版本3.0(G4851C，Agilent)和Quick Amp标记试剂盒(#5190-0442，Agilent)根据制造商的说明书进行。使用Agilent G4900DA SureScan微阵列扫描仪(Agilent)扫描了阵列玻片。
统计分析
数据使用GrafPad Prism ver.6(GraphPad software Inc.)使用单因素和双因素ANOVA，接着进行Tukey’s post检验分析。
2.结果
(1)由成纤维细胞生长因子受体抑制剂引起的患者来源的结直肠癌球状体的体外生长的抑制
本实施例中使用了表3中显示的球状体株。发明人首先用FGFR抑制剂(厄达替尼，AZD4547，BGJ398，BLU554或rogaratinib)处理三个球状体株(HC6T，HC9T，和HC20T)，并确定GEI。这些球状体株(HC6T，HC9T和HC20T)不含有在KRAS，NRAS和BRAF基因中的任何热点突变(表3)。此外，HC6T和HC9T的生长高度地依赖bFGF(未显示数据)。如图16A-16C所示，所有的五种FGFR抑制剂以剂量依赖性方式抑制这些球状体株的生长。其中，厄达替尼是最强的(IC50:2.2–3.1nM)。
表3
本实施例使用的各球状体的特征
氨基酸替换用在影响的密码子的替换前和后的氨基酸显示。
需注意，在检验中，APC基因的50.5％的突变是能检测到的。
良好，高分化腺癌；中，中分化腺癌：不良，分化不良的腺癌；Muc，黏液癌。
然后，发明人测试了不依赖于bFGF进行体外生长的6个球状体株(HC1T，HC10T，HC11T，HC73T，HC5T和HC13T)。厄达替尼按临床相关剂量(0.01–1μM)对6个球状体株没有显示生长抑制(图16C和16D)，尽管HC1T，HC10T，HC11T，和HC73T在RAS/RAF基因中没有任何突变，而HC5T和HC13T有。这些结果表明，它们的生长是通过其他生长因子受体如表皮生长因子受体(EGFR)，或通过在HCT5T和HCT13T中在RAS/RAF蛋白质中的活化突变而刺激。厄达替尼在低于1μM的浓度几乎不抑制正常结肠上皮干细胞球状体(图16F)的生长，预测FGFR抑制的效果与正常结肠粘膜的关联极小。
(2)通过FGFR和EGFR抑制剂的组合对结直肠癌球状体的生长抑制
发明人测试了FGFR和EGFR抑制剂的组合对结直肠癌球状体的生长的效果。在EGFR抑制剂之间，抗EGFR抗体西妥昔单抗和帕尼单抗已经被批准用于治疗RAS/RAF无突变的结直肠癌。然而，西妥昔单抗抑制球状体的体外生长失败(图17A，右)。这可能是因为其通过Matrigel的渗透性不良。据此，发明人使用小分子酪氨酸激酶抑制剂之一的厄洛替尼作为EGFR抑制剂来代替。
厄洛替尼对于RAS/RAF无突变球状体株(HC6T，HC9T，HC11T，和HC20T)显示剂量依赖性生长抑制(图17A，左)。厄洛替尼在0.1μM时对HC20T显示轻微的生长促进效果。发明人然后测试了用厄达替尼和厄洛替尼的组合对HC6T，HC9T和HC20T施用。与1μM厄洛替尼和0.01μM厄达替尼的临床相关剂量的任一单药治疗比较，在抑制剂两者的存在下，生长抑制提高(HC6T，p<0.05；HC9T，p<0.01：和HC20T，p<0.01)(图17B)。在HC20T中，0.1μM的厄洛替尼反而提高其生长(不显著)。
此外，发明人在包括对单独厄达替尼几近于不敏感的四个(HC1T，HC10T，HC11T，和HC73T；图16D)的其他不包含RAS/RAF热点突变的7个球状体株中，评价了厄达替尼和厄洛替尼的组合的效果。所有的7个系显示了50％以下的GEI(p<0.05–0.0001，图17C)。这些结果显示，对于结直肠癌，FGFR和EGFR的双重阻断可以比任一单药治疗更有效。
(3)由临床相关剂量的厄达替尼和/或西妥昔单抗引起的PDSX肿瘤的尺寸减少
为了确定阻断FGFR和/或EGFR信号在肿瘤负荷小鼠中的潜在功效，发明人从体外对FGFR和EGFR抑制剂两者应答良好的两种结直肠癌球状体系HC6T和HC20T建立了PDSX小鼠(图19)。发明人将PDSX小鼠分四个施用组：对照(仅有溶剂)，西妥昔单抗单药治疗，厄达替尼单药治疗，和厄达替尼和西妥昔单抗联合治疗(厄达替尼+西妥昔单抗)。每组用临床相关剂量的厄达替尼和/或西妥昔单抗(或溶剂)处理21天，并预估肿瘤体积。
在HC6T-PDSX小鼠中，与对照肿瘤相比，西妥昔单抗单药治疗，厄达替尼单药治疗和厄达替尼+西妥昔单抗组合降低了肿瘤体积，统计学差异显著(p<0.05–0.0001；图18A)。在西妥昔单抗单独和厄达替尼+西妥昔单抗之间也有显著差异(p<0.05)。另一方面，在厄达替尼单独和厄达替尼+西妥昔单抗之间没有统计学显著差异。在HC20T-PDSX中，与对照相比，厄达替尼+西妥昔单抗组合显著抑制了肿瘤生长(p<0.05)，而相比于对照，西妥昔单抗或厄达替尼单独也具有相似的肿瘤生长抑制(p<0.05；图18B)。在联合治疗组中Ki-67阳性细胞增殖的比例显著降低，尽管通过施用在PDSX肿瘤的组织学特征上没有发现可辨别的变化(图18C–18G)。
(4)在患者来源的结直肠癌球状体中的FGF和FGFR基因拷贝数和mRNA表达水平
发明人检验了在患者来源的结直肠癌球状体中，FGF9和FGFR1-4基因的拷贝数是否有变化。如表4所示，在FGFR抑制剂单独有效的HC6T，HC9T，和HC20T中观察到FGFR1至4的拷贝数没有增加(正常值为2)，。利用FGFR抑制剂没有效果的HC11T观察到拷贝数增加。对于FGF9，在FGFR抑制剂有效的HC6T和HC9T中，和FGFR抑制剂无效的HC11T和HC73T中观察到拷贝数增加。进一步地检验了FGF3，9，19和20和FGFR1至4的mRNA表达水平，但观察到与对FGFR抑制剂的应答没有相关性(图20)。这些结果表明，结直肠癌患者对FGFR抑制剂的敏感度不能基于FGF或FGFR基因的拷贝数或mRNA表达水平来评价。
表4
R：耐药性，S：敏感。

Claims (17)

1.癌球状体的制备方法，包括
在含有以下成分的培养基中培养从患者的结直肠癌上皮组织获得的细胞群：
ROCK抑制剂，TGF-βI型受体抑制剂，EGF和bFGF；和
选自腺苷受体激动剂，PPAR激动剂，钙活化钾通道激活剂，NMDA型谷氨酸受体激动剂，组胺H3受体激动剂，和视黄酸受体β2激动剂的药剂。
2.权利要求1的方法，其中所述药剂为腺苷受体激动剂。
3.权利要求2的方法，其中所述腺苷受体激动剂为NECA或CV1808。
4.权利要求1的方法，其中所述药剂选自NECA，CV1808，GW0742，GW7647，S26948，L-165,041，DCEBIO，SKA-31，NMDA，immepip和AC55649。
5.权利要求1的方法，其中所述ROCK抑制剂为Y27632。
6.权利要求1的方法，其中所述TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
7.权利要求1的方法，其中所述培养基进一步包含血清。
8.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于评价患者的药物敏感度的癌球状体中的用途。
9.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于筛选癌症的治疗剂的癌球状体中的用途。
10.来源于患者的球状体异种移植物模型的制备方法，包括
通过权利要求1-7中任一项的方法制备癌球状体，和
将由此获得的癌球状体或从其衍生的癌球状体移植到非人动物中。
11.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于评价患者的药物敏感度的来源于患者的球状体异种移植物模型中的用途。
12.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于筛选癌症的治疗剂的来源于患者的球状体异种移植物模型的用途。
13.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于检测微卫星不稳定性的癌球状体中的用途。
14.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于选择对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的癌球状体中的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
16.权利要求1-7中任一项定义的培养基在制备用于选择对FGFR抑制剂敏感的结直肠癌患者的来源于患者的球状体异种移植物模型中的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述FGFR抑制剂选自厄达替尼，rogaratinib，AZD4547，BGJ398，BLU554，LY2874455，ASP5878，和ARQ087。
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