ES2657696T3 - Método para reducir la cicatrización durante la curación de una herida utilizando compuestos antisentido dirigidos al CTGF - Google Patents

Abstract

Un compuesto antisentido que se dirige a un ácido nucleico que codifica e inhibe la expresión del factor de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF) para su uso en la reducción de la cicatrización hipertrófica resultante de la curación de heridas dérmicas en un sujeto que lo necesita, en el que el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, en el que el compuesto antisentido debe administrarse comenzando aproximadamente 14 días después de que el sujeto ha resultado herido.

Description

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Los LNA y la preparación de los mismos se describen en las Solicitudes de Patente Internacional publicadas Números WO 98/39352 y WO 99/14226.

Otras modificaciones actualmente preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3) 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alil (2'-CH2-CH=CH2); 2'-O-alil (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación 2' puede estar en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo). Una modificación 2'-arabino preferida es 2'-F. También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los oligonucleótidos unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, entre otras, las patentes US-4.981.957; US-5.118.800; US-5.319.080; US5.359.044; US-5.393.878; US-5.446.137; US-5.466.786; US-5.514.785; US-5.519.134; US-5.567.811; US-5.576.427; US-5.591.722; US-5.597.909; US-5.610.300; US-5.627.053; US-5.639.873; US-5.646.265; US-5.658.873; US5.670.633; US-5.792.747; US-5.700.920 y 6.600.032. Una lista representativa de azúcares modificados preferidos incluye, pero no se limita a azúcares sustituidos que tienen un grupo sustituyente 2'-F, 2'-OCH2 o 2'-O(CH2)2OCH3; azúcares modificados 4'-tio y azúcares modificados bicíclicos.

En una realización adicional, el método de la invención proporciona que al menos una y generalmente más de una de las nucleobases contenidas en el oligonucleótido antisentido será un nucleótido modificado tal como una 5metilcitosina.

En una realización de la presente divulgación, el oligonucleótido antisentido se administra comenzando no antes de 7 días después de que el sujeto se haya herido, y de acuerdo con la presente invención aproximadamente 14 días después de que el sujeto se ha herido y continúa después durante el período de curación de la herida. Las heridas pueden ser inducidas por (pero no limitadas a) las siguientes: lesiones en la piel, abrasiones en la piel, cirugía electiva, cirugía reconstructiva, cirugía general, quemaduras, cirugía cosmética y cualquier lesión que resulte en rotura o daño a la piel.

En ciertas realizaciones de la invención, el método comprende además administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión del factor de crecimiento transformante β1 (TGF β1) además del oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de CTGF. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido adecuados para el TGF β1 se describen en la patente US-6.436.909, uno de los cuales se prefiere actualmente, es decir, el oligonucleótido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:13, divulgada en este documento como SEQ ID NO:3.

En el método de esta invención, también se puede administrar un segundo oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión del factor de crecimiento del tejido conjuntivo. En ciertas realizaciones, la administración conjunta del segundo oligonucleótido antisentido potencia el efecto del primer oligonucleótido antisentido, de manera que la administración conjunta da como resultado un efecto que es mayor que el efecto de administrar cada uno por separado.

Se pueden emplear diversos regímenes en la práctica del método de esta invención para administrar oligonucleótidos antisentido que incluyen regímenes de administración simultáneos y secuenciales. Por ejemplo, el OAS que inhibe la expresión del factor de crecimiento del tejido conjuntivo se puede administrar de forma intermitente con cada administración posterior que se efectúa al menos 4 días después de la administración anterior.

En los métodos de esta invención, el oligonucleótido antisentido se administra deseablemente en una cantidad eficaz para reducir la cicatrización sin tener un efecto adverso sobre la curación de la herida, por ejemplo, una cantidad entre aproximadamente 300 μg/cm y aproximadamente 10 mg/cm de la herida, preferiblemente entre 250 μg/cm y 5 mg/cm; siendo preferiblemente entre 500 μg/cm y 5 mg/cm.

En una realización de la invención, la cantidad de oligonucleótido antisentido administrada está entre 100 μg/cm y 10 mg/cm de la herida.

En otra realización de la invención, la cantidad de oligonucleótido antisentido administrada es superior a 300 μg/cm.

En una realización adicional de la invención, el oligonucleótido antisentido se administra en una cantidad eficaz para reducir la cicatrización sin tener un efecto sobre la curación de la herida.

Esta invención también proporciona un método para reducir la cicatrización hipertrófica resultante de la curación de las heridas dérmicas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un compuesto antisentido que inhibe la expresión del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) en una cantidad efectiva para inhibir la expresión del TGF-β1 y de ese modo reducir la cicatrización hipertrófica.

Esta invención se ilustra en la sección de Detalles experimentales expuesta a continuación. Esta sección se expone para ayudar a la comprensión de la invención, pero no pretende, y no debe interpretarse que limite, de ninguna manera, la invención tal como se presenta en las reivindicaciones expuestas a continuación.

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necesario hasta que se produjo el cierre total de la herida o se cosechó la herida, lo que ocurriera primero. Se excluyeron las heridas que mostraban signos de desecación, necrosis o infección. Menos del cinco por ciento de las heridas fueron excluidas; estas se distribuyeron uniformemente entre los grupos de tratamiento. Esta tasa fue consistente con las versiones no tratadas de los modelos.

Tratamiento de heridas y cicatrices

Los oligonucleótidos antisentido se inyectaron intradérmicamente usando una aguja de calibre 29. Cuando se realizaba el tratamiento antes de la herida, se creaba una ampolla de 150 μl donde se planificaba la herida una hora antes de la cirugía. El tratamiento de las heridas existentes se realizó con seis inyecciones intradérmicas iguales (17 μl cada una) en la periferia de cada herida en curación. Para validar el proceso de inyección y evaluar la durabilidad in vivo de los oligonucleótidos, las heridas de 6 mm en dos conejos se inyectaron con 150 μg de un oligonucleótido modificado con 2'-O-metoxietilo una hora antes de realizar herida. Estas heridas se recogieron en los días 2, 4, 6 y 8. La distribución de oligonucleótidos se determinó usando inmunohistoquímica de los cortes de heridas de heridas inyectadas con oligonucleótidos e inyectadas con vehículo, como se describió previamente, usando un anticuerpo monoclonal patentado que reconoce específicamente esta clase de antisentido (Butler et al., 1997)

Cohortes de heridas

Para evaluar si el bloqueo antisentido de CTGF afecta la reparación de la herida, se realizaron heridas de 6 mm en las orejas de seis conejos. Estas heridas se trataron con oligonucleótidos anti-CTGF u oligonucleótidos inespecíficos una hora antes de la herida y en los días 3 y 6 posteriores a la herida. Las heridas se fotografiaron los días 7 y 10 y se recogieron el día 10 para el análisis histológico. Se usaron tres cohortes de conejos para evaluar si el bloqueo del CTGF afecta a la cicatrización hipertrófica. El grupo de control, que consistía en 12 conejos con cuatro heridas de 7 mm en cada oreja, se utilizó para determinar la expresión temporal del CTGF durante el desarrollo de la cicatriz. Se recogieron las heridas de tres conejos en cada punto temporal (días 7, 14, 28 y 40) para el análisis de la histología y el ARNm. Seis conejos, con cuatro heridas de 7 mm en cada oreja, comprendían la cohorte de tratamiento de cicatrización temprana. Estas heridas se trataron con oligonucleótidos anti-CTGF u oligonucleótidos inespecíficos una hora antes de la herida (día 0) y en los días 5 y 10 después de la herida. La cohorte de tratamiento de la cicatriz tardía, que consistía en 12 conejos, se trató con oligonucleótidos anti-CTGF u oligonucleótidos inespecíficos en los días posteriores a la herida 14, 19 y 24. Se extrajo ARN total de cicatrices en la cohorte de tratamiento tardío y se realizó la RT-PCR como se describe a continuación para confirmar una reducción en la expresión del ARNm del CTGF y determinar los niveles de colágeno tipo I y III, fibronectina y TIMP-1.

Histología

Se tiñeron cortes de herida y cicatriz de cinco micrómetros con hematoxilina y eosina para cuantificar la epitelización de la herida, la deposición de tejido de granulación y la hipertrofia de la cicatriz, como se describió previamente, utilizando un sistema de análisis de imágenes digitales (NIS-Elements Basic Research, Nikon Instech Co, Kanagawa, Japón) (Lu et al., 2005). Se midió la hipertrofia de la cicatriz mediante el índice de elevación de la cicatriz (SEI), una relación entre el área de la cicatriz de la sección transversal y el área del tejido extirpado para formar la herida (Figura 6d). Los cortes se tiñeron usando tricrómico de Masson y rojo sirio para evaluar la organización del colágeno dentro de la cicatriz, que se clasificó con un aumento de 40 como baja, media o alta. Dos observadores enmascarados para el tratamiento evaluaron cada corte.

Inmunoquímica

Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron CTGF antihumano de cabra (del Dr. Gary Grotendorst, Lovelace Resp Res Institute, Albuquerque, Nuevo México), anticuerpo anti-CD31 humano de ratón (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) y el kit de inmunotinción del α-SMA (Sigma, St. Louis, MO). La recuperación de antígeno se realizó para la tinción de α-SMA y CD31 hirviendo los cortes en el tampón de recuperación de antígeno (Dako NA) durante 15 o 60 minutos, respectivamente.

Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios dirigidos contra CTGF (1:150), CD31 (1:10) o α-SMA. Los portaobjetos de CD31 y α-SMA se incubaron a continuación con anticuerpo anti-ratón secundario biotinilado (Sigma). Los portaobjetos de CTGF se incubaron con anticuerpo anti-cabra de conejo biotinilado (1:100, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). La detección del complejo de anticuerpo se realizó con ExtrAvidina-Peroxidasa (CD31 y α-SMA) o complejo de avidina-biotina (CTGF) y DAB (Vector Laboratories, Inc.). Las heridas inyectadas con el oligonucleótido indicador se tiñeron usando un anticuerpo monoclonal como se describió previamente (Butler et al., 1997).

Las células inflamatorias se contaron manualmente (en función de la morfología) en cuatro campos de alta potencia por dos observadores enmascarados para el grupo de tratamiento. Para el análisis digital, las imágenes de campo brillante se adquirieron utilizando el sistema Nikon. Las imágenes se convirtieron en un canal monocromático y se estableció un umbral para cada mancha, permitiendo la cuantificación automática de DAB. El mismo umbral se

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utilizó para cada sección de una mancha determinada. El ensamblado de las imágenes digitales permitió el análisis de cada cicatriz en su totalidad.

Los lúmenes de los vasos sanguíneos en los cortes teñidos con CD31 dentro de las cicatrices se contaron automáticamente usando este umbral. Del mismo modo, la densidad de la tinción de α-SMA y CTGF dentro de las cicatrices se analizó digitalmente y se expresa como un porcentaje del área total de la cicatriz.

PCR en tiempo real

De cada muestra congelada, se cortó afiladamente la epidermis y la dermis del lado no dañado de la oreja. El tejido se rompió y se homogeneizó en un molino de perlas Mini-Beadbeater (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK) en tampón de lisis basado en tiocianato de guanidina (tampón RLT, Qiagen). El ARN total se extrajo utilizando el mini kit RNeasy basado en columna (Qiagen) según el protocolo del fabricante. La digestión de ADN en la columna se realizó usando el RNase-free DNase Set (Qiagen) para evitar el arrastre de ADN genómico. El ADNc de la primera cadena se creó a partir de 1 μg de ARN total usando el High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster, CA) usando cebadores hexámeros aleatorios según las instrucciones del fabricante. Los cebadores y las sondas de PCR (Tabla 1) se diseñaron basándose en los datos de secuencia de GenBank de CTGF, colágeno I-a2, colágeno IIIa1, fibronectina e inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1). Los extremos 5' de las sondas indicadoras se marcaron con 6-FAM (carboxifluoresceína); los extremos 3' se marcaron con TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina). Antes del uso, cada conjunto de cebadores se evaluó para garantizar una eficacia aceptable y una unión específica. Los cebadores comercialmente disponibles para el ARNr 18S, marcados con una sonda VIC (Applied Biosystems) se usaron como control endógeno. La expresión del ARNm se midió por triplicado usando PCR múltiple en tiempo real en un ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Cada reacción de PCR incluía 1 μl de molde de ADNc (10 ng de ARN total), cebadores diana 900 nM y 1,25 μl de cebadores 18S en un volumen de reacción final de 25 μl. Los parámetros de ciclado fueron los siguientes: 50 °C (2 min), 95 °C (10 min) y 40 ciclos de 95 °C (15 segundos) y 60 °C (1 min). Se realizaron controles sin molde para excluir la amplificación del ADN genómico. Las curvas de fluorescencia de los productos de PCR se evaluaron usando el software ABI Prism 7000 SDS Study (Applied Biosystems) para obtener datos de expresión relativa.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos cebador y sonda utilizadas para la RT-PCR en tiempo real.

Gen

Secuencia

CTGF

Directa: 5'-AGCCGCCTCTGCATGGT-3' Inversa: 5'-CACTTCTTGCCCTTCTTAATGTTCT-3' Sonda: 5'-AGGCCTTGCGAAGCTGACCTGGA-3'

Col Ia2

Directa: 5'-TTCTGCAGGGCTCCAATGAT-3' Inversa: 5'-TCGACAAGAACAGTGTAAGTGAACCT-3' Sonda: 5'-TTGAACTTGTTGCCGAGGGCAACAG-3'

Col IIIa1

Directa: 5'-CCTGAAGCCCCAGCAGAAA-3' Inversa: 5'-AACAGAAATTTAGTTGGTCACTTGTACTG-3' Sonda: 5'-TTGCACATTTTATATGTGTTCCTTTTGTTCTAATCTTGTC-3'

TIMP-1

Directa: 5'-CGCAGCGAGGAGTTTCTCA-3' Inversa: 5'-GCAAGTCGTGATGTGCAAGAG-3' Sonda: 5'-CGCTGGACAACTGCGGAACGG-3'

Fn

Directa: 5'-CACCCCAGAGGAAGAAACATG-3' Inversa: 5'-AAGACAGGGTCTGCCAACGT-3' Sonda: 5'-CTCTGCAAAGGTCCATCCCAACTGGA-3'

18S

Directa: 5'-GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG-3' Inversa: 5'-CATTCTTGGCAAATGCTTTCG-3' Sonda: 5'-ACCGGCGCAAGACGGACCAG-3'

Análisis estadístico

Los datos se analizaron usando el software Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Las comparaciones del SEI y la expresión génica entre los grupos que recibieron oligonucleótidos inespecíficos y de tratamiento se realizaron mediante la prueba t de Student. Se realizaron comparaciones de más de dos grupos usando un análisis de varianza monodireccional con pruebas de Bonferroni basadas en nuestro protocolo experimental. Las diferencias en la organización del colágeno se evaluaron mediante el análisis tabular bivariable de chi cuadrado. Se consideró que un valor P de menos de 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

El CTGF demuestra una regulación al alza progresiva durante la formación de cicatrices

Un objetivo de este estudio es observar la expresión temporal del CTGF en un modelo de cicatriz hipertrófica en la oreja de conejo y comparar este patrón con su expresión durante la curación normal de heridas. Los niveles de

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ARNm del CTGF fueron insignificantes en la piel no herida; su expresión en la curación de las úlceras dérmicas continuó aumentando constantemente hasta el día 40 (Figura 1). Esto contrasta con un informe anterior en un modelo de cámara de espacio muerto de deposición de tejido de granulación (Igarashi et al., 1993) en el que la expresión del CTGF alcanzó su punto máximo entre los días 6-9 y luego volvió a la línea base. Anteriormente, este modelo había mostrado que el máximo de TGF-β1 y TGF-β2 se alcanza cerca del día 7 y entre los días 14-28, respectivamente (Kryger et al., 2007). El hecho de que el CTGF se exprese en niveles altos durante la cicatrización tardía en este modelo implica que puede aumentar el depósito elevado de matriz extracelular que continúa hasta el día 40 o en la remodelación de la matriz en este punto relativamente tardío. Además, implica que el alto nivel de expresión de CTGF en el día 40 es independiente de TGF-β1 o TGF-β2, lo que sugiere una vía reguladora alternativa.

Los oligonucleótidos inyectados son duraderos en un modelo de conejo de curación de heridas

La sensibilidad de los oligonucleótidos antisentido a la degradación por nucleasas in vivo ha sido ampliamente superado por el desarrollo de una modificación química 2'-O-metoxietilo (Zhang et al., 2000). Sin embargo, las heridas tienen una población heterogénea de células que migran, se dividen y liberan una variedad de enzimas que podrían diluir o degradar la efectividad de los ácidos nucleicos. Por lo tanto, para evaluar la durabilidad y la absorción de los oligonucleótidos de 2'-O-metoxietilo en este modelo, se controló la distribución y la durabilidad de un oligonucleótido en la piel usando un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente ciertas secuencias de oligonucleótidos (Butler et al., 1997). La inmunohistoquímica demostró la retención intracelular del oligonucleótido inyectado dentro y adyacente a la herida los días 2, 4, 6 y 8 después de la herida. El oligonucleótido no se encontró en la piel no herida en el lado opuesto de la oreja.

Los oligonucleótidos antisentido contra CTGF son bioactivos in vivo

Se usó la RT-PCR para medir el ARNm del CTGF y la inmunohistoquímica para medir la proteína CTGF después del tratamiento con oligonucleótidos anti-CTGF en la cohorte de tratamiento tardío (tratados los días 14, 19 y 24, cosecha el día 28). En el momento de la cosecha, el nivel de ARNm del CTGF en las cicatrices tratadas con oligonucleótidos antisentido se había reducido en un 55 % (P<0,05) en comparación con las cicatrices tratadas con oligonucleótidos inespecíficos (Figura 2A). El análisis digital de los cortes teñidos para CTGF reveló una reducción en la tinción de CTGF entre las heridas tratadas con antisentido (Figuras 2B, 2C y 2D). La diferencia en la eficacia que observamos entre el oligonucleótido in vitro (92 % reducción en el ARNm) frente a in vivo subraya las diferencias entre el cultivo celular y la farmacología animal. Es probable que refleje diferentes mecanismos de absorción cuando se usan lípidos catiónicos en cultivos de monocapa, así como la naturaleza heterogénea de la población celular in vivo.

La inhibición de la señalización del CTGF no afecta significativamente al cierre temprano de la herida

Las investigaciones previas han demostrado que el bloqueo de TGF-β1 y TGF-β2 mediado por oligonucleótidos retrasa la deposición de tejido de granulación en este modelo (Sisco et al., 2005). Dado que el CTGF media en muchos de los efectos proliferativos y relacionados con la matriz de TGF-β1 o TGF-β2, el estudio pretendía determinar si el CTGF es necesario para la curación normal (Mustoe et al., 1991). La inyección de oligonucleótidos anti-CTGF en el momento de la herida y el día 3 no tuvo un impacto significativo en la curación de la herida. El cierre grueso de la herida, medido histomorfométricamente, no se vio afectado en los días 7 y 10 (Figura 3). El área de la sección transversal del tejido de granulación en la herida no fue diferente entre las heridas tratadas con oligonucleótidos anti-CTGF, las tratadas con oligonucleótidos inespecíficos y las heridas no tratadas (0,29 ± 0,03 frente a 0,28 ± 0,03 mm2 frente a 0,28 ± 0,04 mm2) (Figura 4A). La brecha entre los bordes salientes del epitelio que migra hacia la herida también fue similar entre los grupos de tratamiento (2,2 ± 0,4 mm frente a 2,0 ± 0,3 mm frente a 2,2 ± 0,3 mm, respectivamente) (Figura 4B). La Figura 4C muestra una herida representativa tratada con OAS inespecíficos de control el día 10. La Figura 4D muestra una herida representativa tratada con OAS anti-CTGF el día

10. La barra de escala es de 1 mm. En la preparación de la muestra se usó la tinción con hematoxilina y eosina. Estos resultados demuestran claramente que el tratamiento con un OAS inhibidor de la expresión de CTGF tal como un OAS con la secuencia expuesta en la SEQ ID No. 1 o 2, no tiene efecto sobre la respuesta temprana de curación posterior a la generación de una herida, aunque este tratamiento reduce la gravedad subsecuente de la cicatrización hipertrófica. Este fue un hallazgo inesperado y novedoso.

La inhibición temprana y tardía del CTGF reduce la hipertrofia de la cicatriz

Experimentos previos de bloqueo del TGF-β1 o TGF-β2 o de la procolágeno C-proteinasa han sugerido que el tiempo juega un papel decisivo en la determinación de la atenuación de la cicatrización; los tratamientos posteriores se correlacionan con reducciones más eficaces en la hipertrofia de la cicatriz (Lu et al., 2005, Reid et al., 2006).

Como la expresión del ARNm del CTGF alcanza un pico más tardío que la de TGF-β1 o TGFβ2 en este modelo, se postula que el bloqueo tardío de CTGF tendría un efecto más pronunciado sobre la cicatrización. La Figura 5A muestra que el bloqueo temprano y tardío del CTGF reducía la hipertrofia de la cicatriz. Inesperadamente, los datos presentados indican que la administración tardía proporciona mejores respuestas en comparación con la respuesta

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colágeno, fibronectina y TIMP-1 en la cohorte de tratamiento temprano. Esto se debe presumiblemente a que estas heridas se recogieron 18 días después del último tratamiento antisentido, en cuyo momento no se pudo demostrar una diferencia medible para el oligonucleótido en la expresión génica corriente abajo.

Discusión

Este estudio evalúa la importancia del CTGF en la reparación de heridas y la cicatrización hipertrófica y evalúa su idoneidad como objetivo para terapias anticicatrización. Los datos demuestran que los oligonucleótidos antisentido modificados contra CTGF reducen la cicatrización hipertrófica en un modelo animal. Los datos también muestran que el bloqueo del CTGF no tiene un impacto medible en la deposición de la formación de tejido de granulación o epitelización, esta falta de efecto sobre la curación de la herida fue inesperada y será altamente beneficiosa en un contexto clínico, donde no se desee una reducción de la curación de la herida. La reducción de la cicatrización que se observó se asocia con una disminución de la presencia de miofibroblastos en las cicatrices y una reducción en los genes asociados con la producción de matriz y la prevención de la degradación de la matriz. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el CTGF es un mediador importante de la cicatrización hipertrófica y arrojan luz sobre su papel en la patogénesis de la cicatriz.

Muchos de los hallazgos corroboran las observaciones clínicas e in vitro que han sido publicadas previamente. Los altos niveles de CTGF están presentes transitoriamente en las heridas agudas (Lin et al, 2005; Igarashi et al., 1993, Dammeier et al., 1998). En nuestro modelo de cicatrización hipertrófica, la expresión del ARNm del CTGF continúa aumentando hasta el día 40 después de la herida y es paralela a la hipertrofia progresiva de las cicatrices en estos puntos temporales. Esta expresión continua del CTGF dura más que la expresión elevada de TGF-β1 o TGF-β2 (Kryger et al., 2007). Esta se correlaciona con los datos del cultivo celular de los fibroblastos cicatriciales hipertróficos (Colwell et al., 2005) y refleja las observaciones de varios trastornos fibróticos como la esclerodermia.

La expresión prolongada de CTGF es probable que contribuya a la acumulación excesiva de matriz, lo que da lugar a la elevación de la cicatriz en este modelo. La autoinducción del CTGF puede contribuir a la aparición de altos niveles de CTGF en ausencia de TGF-β1 o TGF-β2 (Riser et al., 2000). Además, existen pruebas acumuladas de que el estrés mecánico es un inductor importante e independiente de la expresión de CTGF (Garrett et al., 2004; Kessler et al., 2001; Schild et al., 2002; Chaqou et al., 2006). Este modelo, en el que la base cartilaginosa impide que la herida se contraiga, es un modelo rígido de curación. La tensión isométrica generada en los fibroblastos cuando intentan contraer la herida puede explicar los niveles elevados de expresión de CTGF y la acumulación excesiva de matriz resultante.

Una gran cantidad de datos observacionales ha alimentado la especulación de que el CTGF es un importante mediador de la curación de heridas: existe una expresión aumentada de CTGF en heridas en curación; el CTGF aumenta la producción de muchas proteínas que son esenciales para la curación y los ratones con CTGF desactivado exhiben defectos en la producción de matriz y en la remodelación durante la embriogénesis (Ivkovic et al., 2003). Sin embargo, no se ha establecido la importancia del CTGF para la curación de heridas in vivo. Este estudio demuestra inesperadamente que la inhibición antisentido del ARNm del CTGF durante y poco después de la lesión no tiene un impacto medible en dos parámetros de la curación. La migración del epitelio a través de las heridas agudas y el grosor del epitelio en las cicatrices maduras no se modificaron por el bloqueo del CTGF.

Aunque se sabe que el CTGF participa en la formación de tejido de granulación cuando se inyecta (Frazier et al., 1996; Mori et al., 1999), su inhibición aquí no afectó a la producción de tejido de granulación. Estos resultados sugieren que la expresión normal de CTGF puede no ser necesaria para la capacidad regenerativa de la herida aguda. Es posible que el oligonucleótido antisentido no bloqueara el CTGF suficientemente para desenmascarar un papel sutil en la curación. Sin embargo, los datos demostraron claramente que existe una ventana terapéutica en la que la hipertrofia de la cicatriz relacionada con el CTGF puede bloquearse sin tener un efecto perjudicial sobre la curación.

El corolario para evaluar la importancia del CTGF para la curación de heridas es si el CTGF juega un papel importante en la formación de cicatrices. Si bien varios trabajos han demostrado una capacidad para reducir la fibrosis tisular mediante el bloqueo de la transducción de señales del CTGF in vivo, el efecto de la modulación del CTGF sobre la formación de cicatrices dérmicas no ha sido explorado. El hallazgo más importante aquí es que los oligonucleótidos antisentido contra CTGF provocan una reducción significativa en la cicatrización hipertrófica. La administración tardía de oligonucleótidos antisentido contra CTGF reduce la elevación de la cicatriz más que la administración temprana. Esto va acompañado de una expresión reducida del colágeno tipo I, colágeno tipo III y TIMP-1, todos los cuales se sabe que son inducidos por el CTGF.

El grado de reducción de la cicatriz fue proporcional al nivel de expresión del ARNm del CTGF en el momento de la administración de oligonucleótidos. Estos hallazgos establecen que la expresión excesiva del ARNm del CTGF es responsable de al menos una parte del fenotipo de la cicatriz hipertrófica que observamos. Este efecto clínico es significativo dado que no hemos podido lograr el mismo grado de reducción de la transcripción in vivo como in vitro. Se sabe que los oligonucleótidos antisentido desnudos se internalizan en múltiples células en animales después de la administración sistémica (Butler et al., 1997). En este estudio, la dificultad refleja la complejidad de la herida en

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Resultados y discusión

Para evaluar si el bloqueo antisentido de CTGF afecta a la cicatrización hipertrófica, se usaron tres grupos de conejos. El grupo de control, que consistía en 12 conejos con cuatro heridas de 7 mm en cada oreja, se utilizó para determinar la expresión temporal de CTGF durante el desarrollo de la cicatriz.

Se recogieron las heridas de tres conejos en cada punto temporal (días 7, 14, 28 y 40) para histología y el análisis de ARNm. Seis conejos, con cuatro heridas de 7 mm en cada oreja, comprendían la cohorte de tratamiento temprano de la cicatriz. Se realizaron análisis fotométricos e histológicos de curación los días 7 y 10. La Figura 10 muestra el porcentaje de cierre de la herida, es decir, la respuesta de curación temprana asociada con el bloqueo del OAS contra CTGF en conejos heridos. Estas heridas se trataron con oligonucleótidos anti-CTGF u oligonucleótidos inespecíficos una hora antes de la herida (día 0) y en los días 5 y 10 después de la herida. La cohorte de tratamiento de la cicatriz tardía, que consistía en 12 conejos, se trató con oligonucleótidos anti-CTGF u oligonucleótidos inespecífico en los días 14, 19 y 24 posteriores a la herida.

La inyección de heridas con oligonucleótidos anti-CTGF en los días 0, 5 y 10 después de la herida redujo el índice de elevación de la cicatriz (SEI) en un 29 % en comparación con el oligonucleótido inespecífico de control el día 28 (p<0,05). La inyección tardía de heridas en curación, en los días 14, 19 y 24, redujo la elevación de la cicatriz en un 53 % (Figura 11) en dos cohortes separadas de conejos (P<0.001). La Figura 11 muestra el efecto de estos esquemas de dosis, medido por el índice de elevación de la cicatriz, para las cohortes de administración temprana y tardía. La diferencia en la cicatrización entre las cohortes de tratamiento temprano y tardío fue estadísticamente significativa (P=0,05).

En una cohorte de conejos administrados tardíamente que reciben una dosis de 100 μg o 1000 μg, la respuesta a la dosis medida por el índice de elevación de la cicatriz muestra una reducción más favorable de cicatrices hipertróficas en los conejos que reciben dosis de 1000 μg que con la dosis de 100 μg (Figura 12).

En comparación, la cohorte de conejos administrados tardíamente que reciben una combinación de OAS contra CTGF y OAS contra TGF-β1 en el día 28 proporciona un resultado particularmente más favorable en términos de reducción de cicatrices hipertróficas que las cohortes que reciben OAS contra CTGF u OAS contra TGF-β1 (SEQ ID NO:3) por separado (Figura 13). Esto fue inesperado dados los mecanismos de acción superpuestos de estas dos dianas, y representa un hallazgo novedoso.

Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos antisentido modificados con 2'MOE contra CTGF reducen la cicatrización hipertrófica en un modelo animal y el bloqueo del CTGF no tiene un impacto medible en la deposición de formación de tejido de granulación o epitelización. La reducción en la cicatrización que se observó se asocia con una disminución de la presencia de miofibroblastos en las cicatrices y una reducción en los genes asociados con la producción de matriz y la prevención de la degradación de la matriz. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el CTGF es un mediador importante de la cicatrización hipertrófica y arrojan luz sobre su papel en la patogénesis de la cicatriz.

Referencias

Abreu JG, Ketpura NI, Reversade B, De Robertis EM. Connective-tissue growth factor (CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-beta. Nat Cell Biol 2002;4(8):599-604.

Arem AJ, Madden JW. Effects of stress on healing wounds: I. Intermittent noncyclical tension. The Journal of surgical research 1976;20(2):93-102.

Baur PS, Larson DL, Stacey TR. The observation of myofibroblasts in hypertrophic scars. Surg Gynecol Obstet 1975;141 (1) :22-6.

Blalock TD, Duncan MR, Varela JC, Goldstein MH, Tuli SS, Grotendorst GR, et al. Connective tissue growth factor expression and action in human corneal fibroblast cultures and rat corneas after photorefractive keratectomy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(5):1879-87.

Bonniaud P, Margetts PJ, Kolb M, Haberberger T, Kelly M, Robertson J, et al. Adenoviral gene transfer of connective tissue growth factor in the lung induces transient fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003;168(7):770

8.

Butler M, Stecker K, Bennett CF. Cellular distribution of phosphorothioate oligodeoxynucleotides in normal rodent tissues. Lab Invest 1997;77(4):379-88.

Chaqour B, Yang R, Sha Q. Mechanical stretch modulates the promoter activity of the profibrotic factor CCN2 through increased actin polymerization and NF-kappaB activation. The Journal of biological chemistry 2006;281(29):20608-22.

15

25

35

45

55

65

Colwell AS, Krummel TM, Longaker MT, Lorenz HP. Fetal and adult fibroblasts have similar TGF-beta-mediated, Smad-dependent signaling pathways. Plast Reconstr Surg 2006; 117 (7): 2277-83.

Colwell AS, Phan TT, Kong W, Longaker MT, Lorenz PH. Hypertrophic scar fibroblasts have increased connective tissue growth factor expression after transforming growth factor-beta stimulation. Plast Reconstr Surg 2005;116(5):1387-90; discussion 91-2.

Dammeier J, Beer HD, Brauchle M, Werner S. Dexamethasone is a novel potent inducer of connective tissue growth factor expression. Implications for glucocorticoid therapy. J Biol Chem 1998;273(29):18185-90.

Ehrlich HP, Desmouliere A, Diegelmann RF, Cohen IK, Compton CC, Garner WL, et al. Morphological and immunochemical differences between keloid and hypertrophic scar. The American journal of pathology 1994;145(1):105-13.

Folger PA, Zekaria D, Grotendorst G, Masur SK. Transforming growth factor-betastimulated connective tissue growth factor expression during corneal myofibroblast differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42(11):2534-41.

Frazier K, Williams S, Kothapalli D, Klapper H, Grotendorst GR. Stimulation of fibroblast cell growth, matrix production, and granulation tissue formation by connective tissue growth factor. J Invest Dermatol 1996;107(3):404-11.

Garrett Q, Khaw PT, Blalock TD, Schultz GS, Grotendorst GR, Daniels JT. Involvement of CTGF in TGF-beta1stimulation of myofibroblast differentiation and collagen matrix contraction in the presence of mechanical stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004; 45(4) :1109-16.

Ghahary A, Shen YJ, Scott PG, Gong Y, Tredget EE. Enhanced expression of mRNA for transforming growth factor-beta, type I and type III procollagen in human post-burn hypertrophic scar tissues. J Lab Clin Med 1993;122(4):465-73.

Grotendorst GR, Rahmanie H, Duncan MR. Combinatorial signaling pathways determine fibroblast proliferation and myofibroblast differentiation. Faseb J 2004;18(3):469-79.

Grotendorst GR. Connective tissue growth factor: a mediator of TGF-beta action on fibroblasts. Cytokine Growth Factor Rev 1997;8(3):171-9.

Harrop AR, Ghahary A, Scott PG, Forsyth N, Uji-Friedland A, Tredget EE. Regulation of collagen synthesis and mRNA expression in normal and hypertrophic scar fibroblasts in vitro by interferon-gamma. J Surg Res 1995;58(5):471-7.

Hinz B, Mastrangelo D, Iselin CE, Chaponnier C, Gabbiani G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American journal of pathology 2001;159(3):1009-20.

Igarashi A, Nashiro K, Kikuchi K, Sato S, Ihn H, Fujimoto M, et al. Connective tissue growth factor gene expression in tissue sections from localized scleroderma, keloid, and other fibrotic skin disorders. The Journal of investigative dermatology 1996;106(4):729-33.

Igarashi A, Okochi H, Bradham DM, Grotendorst GR. Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repair. Mol Biol Cell 1993;4 (6) :637-45.

Ivkovic S, Yoon BS, Popoff SN, Safadi FF, Libuda DE, Stephenson RC, et al. Connective tissue growth factor coordinates chondrogenesis and angiogenesis during skeletal development. Development (Cambridge, England) 2003;130(12):2779-91.

Kessler D, Dethlefsen S, Haase I, Plomann M, Hirche F, Krieg T, et al. Fibroblasts in mechanically stressed collagen lattices assume a "synthetic" phenotype. J Biol Chem 2001;276(39):36575-85.

Kryger ZB, Sisco M, Roy NK, Lu L, Rosenberg D, Mustoe TA. Temporal expression of the transfo ming growth factor-Beta pathway in the rabbit ear model of wound healing and scarring. J Am Coll Surg 2007;205(1):78-88.

Leask A, and Abraham DJ. TGF-beta signaling and the fibrotic response. Faseb J 2004;18(7) :816-27.

Li G, Xie Q, Shi Y, Li D, Zhang M, Jiang S, et al. Inhibition of connective tissue growth factor by siRNA prevents liver fibrosis in rats. The journal of gene medicine 2006; 8(7):889-900.

15

25

35

45

55

65

Lin CG, Chen CC, Leu SJ, Grzeszkiewicz TM, Lau LF. Integrin-dependent functions of the angiogenic inducer NOV (CCN3): implication in wound healing. J Biol Chem 2005;280(9):8229-37.

Lu L, Saulis AS, Liu WR, Roy NK, Chao JD, Ledbetter S, et al. The temporal effects of anti-TGF-betal, 2, and 3 monoclonal antibody on wound healing and hypertrophic scar formation. J Am Coll Surg 2005;201(3):391-7.

Marcus JR, Tyrone JW, Bonomo S, Xia Y, Mustoe TA. Cellular mechanisms for diminished scarring with aging. Plast Reconstr Surg 2000;105(5):1591-9.

McKay RA, Miraglia LJ, Cummins LL, Owens SR, Sasmor H, Dean NM. Characterization of a potent and specific class of antisense oligonucleotide inhibitor of human protein kinase C-alpha expression. J Biol Chem 1999;274(3):1715-22.

Mori T, Kawara S, Shinozaki M, Hayashi N, Kakinuma T, Igarashi A, et al. Role and interaction of connective tissue growth factor with transforming growth factor-beta in persistent fibrosis: A mouse fibrosis model. J Cell Physiol 1999;181(1):153-9.

Morris DE, Wu L, Zhao LL, Bolton L, Roth SI, Ladin DA, et al. Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring: quantitative studies. Plast Reconstr Surg 1997;100(3):674-81.

Mustoe TA, Pierce GF, Morishima C, Deuel TF. Growth factor-induced acceleration of tissue repair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcer model. J Clin Invest 1991;87(2):694-703.

Mustoe TA. Scars and keloids. BMJ Clinical research ed 2004;328 (7452) :1329-30.

Reid RR, Mogford JE, Butt R, deGiorgio-Miller A, Mustoe TA. Inhibition of procollagen C-proteinase reduces scar hypertrophy in a rabbit model of cutaneous scarring. Wound Repair Regen 2006;14(2):138-41.

Riser BL, Denichilo M, Cortes P, Baker C, Grondin JM, Yee J, et al. Regulation of connective tissue growth factor activity in cultured rat mesangial cells and its expression in experimental diabetic glomerulosclerosis. J Am Soc Nephrol 2000;11(1) :25-38.

Saulis AS, Mogford JH, Mustoe TA. Effect of Mederma on hypertrophic scarring in the rabbit ear model. Plast Reconstr Surg 2002;110(1):177-83; discussion 84-6.

Schild C, Trueb B. Mechanical stress is required for high-level expression of connective tissue growth factor. Exp Cell Res 2002;274(1):83-91.

Shah M, Foreman DM, Ferguson MW. Control of scarring in adult wounds by neutralising antibody to transforming growth factor beta. Lancet 1992;339(8787):213-4.

Shah M, Foreman DM, Ferguson MW. Neutralisation of TGF-beta 1 and TGF-beta 2 or exogenous addition of TGF-beta 3 to cutaneous rat wounds reduces scarring. Journal of cell science 1995;108 (Pt 3):985-1002.

Shah M, Foreman DM, Ferguson MW. Neutralising antibody to TGF-beta 1, 2 reduces cutaneous scarring in adult rodents. J Cell Sci 1994;107 (Pt 5):1137-57.

Shi-wen X, Pennington D, Holmes A, Leask A, Bradham D, Beauchamp JR, et al. Autocrine overexpression of CTGF maintains fibrosis: RDA analysis of fibrosis genes in systemic sclerosis. Exp Cell Res 2000;259(1):213-24.

Shull MM, Ormsby I, Kier AB, Pawlowski S, Diebold RJ, Yin M, et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature 1992;359(6397):693-9.

Sisco M, Kryger ZB, Jia SC, Schultz GS, Dean NM, Mustoe TA. Antisense oligonucleotides against transforming growth factor-beta delay wound healing in a rabbit ear model. J Am Coll Surg 2005;201:S60.

Tomasek JJ, Gabbiani G, Hinz B, Chaponnier C, Brown RA. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3(5):349-63.

Wang JF, Olson ME, Ma L, Brigstock DR, Hart DA. Connective tissue growth factor siRNA modulates mRNA levels for a subset of molecules in normal and TGF-beta 1-stimulated porcine skin fibroblasts. Wound Repair Regen 2004;12(2):205-16.

Zhang H, Cook J, Nickel J, Yu R, Stecker K, Myers K, et al. Reduction of liver Fas expression by an antisense oligonucleotide protects mice from fulminant hepatitis. Nat Biotechnol 2000;18(8):862-7. Reid RR, Mogford JE,

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