CN101254191B

CN101254191B - 喹唑啉咪唑化合物的用途

Info

Publication number: CN101254191B
Application number: CN2008100608844A
Authority: CN
Inventors: 楼宜嘉; 俞永平; 胡颖; 朱丹雁; 章砚东; 梁星光; 欧丽丽
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2028-03-25
Also published as: CN101254191A

Abstract

本发明提供喹唑啉咪唑化合物的用途，所述化合物的化学名为8-(3-乙氧基丙基)-7-异丁基-N-(4-甲氧基苯基)-8H-吡咯并[3，2-g]喹唑啉-4-胺，能诱导胚胎干细胞体外定向分化获得的单一类型心肌细胞，可在制备干细胞移植心肌再生或心肌细胞重建术中的促细胞分化剂中应用。本发明在细胞层面对该化合物的药效进行了严格论证，对其中所蕴含的大量生物学信息进行了初步探讨。本发明另一方面明确了该化合物所具备的药理活性，为进一步开发喹唑啉咪唑类化合物的新用途奠定了物质基础。

Description

喹唑啉咪唑化合物的用途

技术领域

本发明属药理学和药物化学领域，涉及喹唑啉类衍生物的用途，尤其涉及喹唑啉咪唑类化合物在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，可用于干细胞移植心肌再生或心肌细胞重建术中的促细胞分化剂。

背景技术

近年来，喹唑啉类衍生物因其具有广泛生物活性和多变的结构类型而倍受人们关注，关于喹唑啉类衍生物新合成方法及其生物活性的研究也不断报道，成为化学界和生物学界学者们研究的一个热点之一。喹唑啉类衍生物具有广泛生物活性：

1、喹唑啉类衍生物对EGF受体(EGFR)或EGF受体酪氨酸激酶有抑制作用，进而表现出抗癌活性，可用于抗前列腺癌、肺癌、胃癌和胆癌等。上市的治疗药物，如Genentech公司开发的具有喹唑啉母环结构的新药Tarceva可用于治疗肺癌，正在进行临床三期试验；

2、具有抗HIV的活性；

3、喹唑啉类衍生物为脱氧尿苷三磷酸酶和胸苷酸合成酶抑制剂，能被用于抗疟、抗肿瘤和抗菌；

4、作为α-受体阻滞剂，喹唑啉类衍生物在心血管疾病的防治中占据较为重要作用，可预防动脉粥样硬化和冠心病；

5、对良性前列腺肿瘤(BPH)细胞增殖方面有抑制作用，可用于治疗良性前列腺增生和肥大；

6、具备抗微生物和抗真菌的生物活性；

7、有镇静止痛抗炎作用，对水肿因子(EF)有抑制作用，能被用作镇静催眠药；

8、喹唑啉类衍生物是降血压药的重要中间体，国家基本药物高血压降亚药——脉宁平和多唑嗪，就具有喹唑啉结构；

9、可以抑制神经生长因子(NGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，集中黑色素受体1(MCHR-1)；

10、在中草药板蓝根的提取物中也发现有喹唑啉酮类化合物；

11、喹唑啉类衍生物具有抗烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的活性。

但目前尚未见有此类化合物用于诱导胚胎干细胞定向分化的报道。

发明内容

本发明的目的是提供喹唑啉咪唑化合物的用途，所述喹唑啉咪唑化合物的化学名为：8-(3-乙氧基丙基)-7-异丁基-N-(4-甲氧基苯基)-8H-吡咯并[3，2-g]喹唑啉-4-胺(8-(3-ethoxyproryl)-7-isobutyl-N-(4-methoxyphenyl)-8H-pyrrolo[3，2-g]quinazolin-4-amine)，具有以下化学结构：

本发明提供的喹唑啉咪唑化合物能诱导胚胎干细胞体外定向分化获得的单一类型心肌细胞，可在制备干细胞移植心肌再生或心肌细胞重建术中的促细胞分化剂中应用。

本发明所提供的化合物是从四个以喹唑啉咪唑为母核的化合物中筛选获得，四个化学结构如下：

本发明在细胞层面上对喹唑啉咪唑化合物A的药效进行了严格论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有以下优点：

1.本发明提供了喹唑啉咪唑化合物A的新用途，即诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞。

2.本发明在基因和蛋白层面论证了喹唑啉咪唑化合物A在诱导心肌细胞分化时能显著增强心肌特异性基因和蛋白表达，及提高心肌细胞数量。

3.本化合物可用作干细胞移植心肌再生(myocardial regeneration)或心肌细胞重建术(cellular cardiomyoplasty)中的促细胞分化剂。干细胞移植心肌再生目前正处于实验研究阶段(含临床实验研究)，预计该促细胞分化剂的介入将有助于该领域的深入研究。

4.本发明明确了喹唑啉咪唑类化合物A所具备的药理活性，为进一步开发喹唑啉咪唑类化合物的新用途奠定了物质基础。

附图说明

图1为喹唑啉库内化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞百分率(n＝6)。

图2为免疫荧光法检测由化合物A诱导分化成的细胞心肌特异性蛋白表达呈阳性。

具体实施例

本发明结合附图和实施例作进一步说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：喹唑啉咪唑类化合物A诱导胚胎干细胞(ES细胞)体外定向分化为心肌细胞量效关系研究

1.ES细胞的支持培养：

小鼠ES细胞D3细胞株(ES-D3细胞)在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2×10⁷-5×10⁷个/mL的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法进行传代培养。

2.化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的培养：

①ES-D3细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，按20-30μL接种于培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10mL D-Hanks液，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中悬滴培养3天。此后将悬滴转入盛有10mL ES细胞分化培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)的培养皿中，进行ES细胞集落悬浮培养2天，形成ES细胞拟胚体(EB)。

②附着ES细胞的分化培养：将EB转移到24孔板内，孵育4-5小时，使其吸附后，每孔中缓慢加入1mL ES分化培养基，加入化合物A与EB共孵育，终浓度为10^-6和10^-7mol/L。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞开始跳动的最初时间。

3.化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞诱导效应评价

通过上述分化培养，以出现节律性搏动的心肌细胞团作为定向分化成心肌细胞的指标，评价不同浓度的化合物A对ES细胞诱导成心肌细胞百分率，以此作为药效评价指标。结果显示，化合物A能显著诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，且具有很好量效关系，其与EB共培养5-7天时，就有90％以上的细胞克隆出现节律性搏动。参见图1，图中化合物A终浓度分别为：1×10^-6、1×10^-7mol/L，每组n＝400 EB，相同实验重复做了6次。

实施例2：免疫荧光法检测化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞心肌特异性蛋白表达

收集经化合物A诱导成的心肌细胞样本，用纯冷甲醇固定15min，PBS清洗三遍，每次10min。再用含10％胎牛血清PBS封闭30min，PBS清洗三遍，每次5min。然后加入心肌细胞特异性一抗：(1)Monoclonal mouse anti-α-Actinin，1∶200稀释；(2)Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin-T，1∶100稀释，4℃孵育过夜。PBS洗三次，每次10min，吸干多余的液体，再加入二抗：Texa-goatanti-rabbit IgG，1∶200稀释，37℃孵育1.5h。再用PBS洗三次，每次10min，吸干多余的液体，无荧光甘油封片后用荧光显微镜观察，拍照记录。以是否出现肌小节表示由ES细胞分化而来的是否是心肌细胞。

结果显示，拟胚体(EB)贴壁培养后经化合物A诱导成的细胞内表达大量肌小节蛋白α-Actinin或Troponin-T，并可据此观察到大量纤维状的心肌细胞，高倍镜下可见明显的明暗相间肌小节。参见图2，图2A是α-Actinin，图2B是Troponin-T。

实施例3：流式细胞术检测化合物A对分化得到心肌细胞数量的影响

样本用4％甲醛4℃固定15分，PBS清洗三遍，每次10分。再用含10％胎牛血清PBS封闭30分，PBS清洗三遍，每次5分。然后加入一抗：(1)Monoclonalmouse anti-α-Actinin，1∶200稀释；(2)Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin-T，1∶100稀释，4℃孵育过夜。PBS洗三次，每次10min，吸干多余的液体，再加入二抗：FITC-F(ab’)2 fragment goat anti-mouse IgG，1∶500稀释，37℃孵育1.5h。再用PBS洗三次，每次10min，吸干多余的液体，0.25％胰酶消化0.5h，轻柔吹散成单个细胞，离心除去上清液，重悬于0.5％ml PBS液，上机检测。

结果显示，未给药组α-Actinin及Troponin-T阳性细胞分别占总数的7.88％及1.73％，而加入化合物A诱导组分别为18.3％及6.70％，提示化合物A能有效增加分化得到心肌细胞的数量(参见表1)。

表1.流式细胞术检测化合物A诱导ES细胞定向分化成的心肌细胞数量

实施例4.实时荧光定量RT-PCR检测化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞时心肌特异性基因表达的调控

收集化合物A诱导组和溶剂对照组分化得到的心肌细胞样本，常规提取RNA，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液：总RNA 3μg，Oligo-dT(15μg/μl)0.5μl，dNTP mix(10mmol/L)1μl，双蒸水(DEPC)10μl，将反应管置于PCR仪中，65℃预变性5min。变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系，将PCR管子置于PCR仪中进行42℃保温50min后，70℃变性15min(灭活反转录酶)，4℃放置。将cDNA稀释100倍作为模板，加入引物和SYBR Green进行PCR扩增和荧光标记反应。反应条件为：50℃孵育2min，然后95℃ 2min；接着进行40个循环，95℃，15s；63℃，1min。PCR仪器使用ABI Prism 7000。β-actin作为内参照基因，其引物为F：TCTGTGTGGATTGGTGGCTCT；R：AGAAGCATTTGCGGTGCAC。

目的基因MLC-2v引物为F：TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG；R：GAAGGCTGACTATGTCCGGGAGATGC。

目的基因α-MHC引物为：F：CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG；R：GGAAGAGTGAGCGGCGCATCAAGG。

目的基因表达值的计算法：通过一系列的参数设定分析，得到不同样本目的基因的Ct值。Ct值的含义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因为比较的是目的基因转录水平的差异，所以通过检测每个样品的内参照基因，将目的基因归一化。PCR产物的增长形式为2ⁿ，n就是循环数。先得到ΔCt(ΔCt＝目的基因Ct-内参照基因Ct)，再转换为原始模板浓度Ratio＝2^-ΔCt。

实验结果显示，根据上述公式计算出贴壁分化3天各样本的MLC-2v表达值分别为0.26±0.06，0.46±0.09，α-MHC表达值分别为0.30±0.10，0.54±0.12；而贴壁分化7天各样本的MLC-2v表达值分别为0.35±0.11，0.57±0.12，α-MHC表达值分别为0.53±0.14，0.79±0.11。化合物A诱导组的表达值比溶剂对照组明显上调(P＜0.05)(表2)。以目的基因和内参照基因浓度为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制目的基因和内参照基因PCR扩增标准曲线，标准曲线相关性良好。

表2经β-actin校正过的目的基因相对表达值

^*P＜0.05vs溶剂组

利用ES细胞定向分化为心肌细胞的药效筛选模型论证了化合物A对ES细胞定向分化为心肌细胞这一过程具有显著的诱导作用。实验中以ES细胞作为实验测试载体，用培养基(含DMEM和胎牛血清)将ES细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养形成拟胚体，拟胚体再进行贴壁培养；此时加入化合物A共培养(以加DMSO作为阴性对照组)，以拟胚体细胞团出现有节律性地搏动为定向分化成心肌细胞成功的指标。根据化合物A诱导拟胚体细胞团出现节律性地搏动，及该化合物诱导分化百分率进行统计学分析，以此作为药效评价指标。结果显示化合物A可使ES细胞分化为心肌细胞率显著提高(附图1)。而且，实验中化合物A组诱导的心肌细胞与对照组比较其跳动频率和强度都有增加。化合物A对ES细胞分化为心肌细胞这一过程具有显著的诱导分化作用，化合物A有望成为一种以心脏为作用靶点的新型诱导分化剂。通过免疫荧光实验，流式细胞术和实时定量PCR实验验证了化合物A在诱导分化时能明显提高心肌特异性基因和蛋白表达及心肌细胞数量。由于在化合物A诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的过程中富含发育依赖性生物信息，能提供很多的靶点供药效评价用，因此可将多种心肌发育依赖性特殊基因表达、心肌结构蛋白表达和离子通道形成等能够反映心肌细胞功能的指标，借助膜片钳、PCR、免疫组化等技术对化合物A的药效进行更深入评价，以论证化合物A对心肌细胞生长和功能改善的促进作用。

实施例5：化合物A定向分化为心肌细胞在其他方面的用途

利用化合物A诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞，若能将其成功引入衰竭的心脏并与宿主细胞一起工作，则这条途径能够成为移植治疗心功能不全的重要组织细胞来源；用这种方法可以培育大量心肌细胞克隆，提供组织工程学等其他方面研究。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明涉及的序列

<110>浙江大学

<120>喹唑啉咪唑化合物的用途

<160>6

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-actin mRNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400>1

TCTGTGTGGATTGGTGGCTCT 21

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-actin mRNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400>2

AGAAGCATTTGCGGTGCAC 19

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据MLC-2v mRNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400>3

TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG 27

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据MLC-2v mRNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400>4

GAAGGCTGACTATGTCCGGGAGATGC 26

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据α-MHC mRNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400>5

CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG 22

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据α-MHC mRNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400>6

GGAAGAGTGAGCGGCGCATCAAGG 24

Claims

1.喹唑啉咪唑化合物在制备干细胞移植心肌再生术中的促细胞分化剂中的应用，所述喹唑啉咪唑化合物的化学名为：8-(3-乙氧基丙基)-7-异丁基-N-(4-甲氧基苯基)-8H-吡咯并[3，2-g]喹唑啉-4-胺，具有以下化学结构：

所述干细胞是指小鼠胚胎干细胞。

2.权利要求1所述的喹唑啉咪唑化合物在制备心肌细胞重建术中的促细胞分化剂中的应用。