CN106492217B - Parp1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中的应用 - Google Patents

Parp1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明发明人通过研究发现针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制A‑NHEJ通路的关键蛋白PARP1，能够降低DHFR基因拷贝数、减少细胞内的DMs，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。因此，在上述研究的基础上本发明提出了PARP1抑制剂在制备通过降低DHFR基因拷贝数从而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。本发明的提出为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。此外，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。

Description

PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中 的应用
技术领域
本发明涉及PARP1抑制剂通过降低肿瘤细胞中DHFR基因拷贝数进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的方法，为揭示新的治疗靶点、更加有效地对抗MTX耐药提供科学的依据，属于肿瘤生物治疗技术领域。
背景技术
氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抗叶酸类抗肿瘤药物，能竞争性结合二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR)抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成，特异性地杀伤增殖期细胞。但是，在肿瘤治疗过程中，长时间持续给药会使肿瘤细胞获得耐药性，使治疗效果不佳。DHFR基因扩增，酶水平升高，是导致MTX耐药的重要机制。基因扩增是指细胞内基因组某一特定区域拷贝数大量增加的现象，是激活细胞癌基因使肿瘤细胞获得无限生长的重要途径。文献报道，基因扩增与肿瘤耐药密切相关：慢性髓细胞性白血病中Bcr-Abl融合基因的扩增可产生伊马替尼抗性；多发性骨髓瘤中PDZK1基因的扩增可产生顺铂耐药等。
双微体(double minutes，DMs)是1962年首次在结肠癌细胞中发现的成对环状、无着丝粒、能自主复制的染色小体，是基因扩增的主要细胞遗传学表现形式，其上常携带耐药基因。DMs形成机制十分复杂，常伴随染色体的断裂重排，与DNA双链断裂(double strandbreaks，DSBs)的产生和错误修复有关。因此，及时正确地修复DSBs可能是减少DMs形成进而防止基因扩增发生的有效途径。哺乳动物细胞中，修复DSBs的方式主要有两种：同源重组(homologous recombination，HR)修复和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)修复。其中，NHEJ又分为经典的非同源末端连接(classical non-homologous endjoining，C-NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining，A-NHEJ)。A-NHEJ是一种依赖微同源的，较C-NHEJ慢得多的修复方式，A-NHEJ可以增加多个DSBs共存在的机会。另外，A-NHEJ修复过程经常产生大的基因组缺失、微同源和大的未知起源的DNA片段插入，是一种保真性更差、更倾向于产生基因组重排、染色体结构异常。
A-NHEJ途径的主要蛋白包括：PARP1(Poly[ADP-ribose]polymerase 1)、LIG3、XRCC1、剪切酶复合体(MRE11/RAD50/NBS1)等，其中PARP1发挥着核心作用。PARP1能与Ku蛋白竞争性识别绑定DSBs末端，并募集下游MRN复合体和LIG3/XRCC1对DSBs末端进行剪切和连接，完成A-NHEJ修复。文献报道，PARP1在恶性淋巴瘤、大肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达，因此，A-NHEJ修复功能增强，增加了基因组不稳定的几率。
本发明发明人在前期的研究中发现，在高浓度MTX耐药细胞中，随着DMs的出现，PARP1表达增加，猜测PARP1可能促进DMs形成，使DHFR基因拷贝数增加进而使肿瘤细胞耐药性增强。因此，本发明发明人在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰PARP1，结果观察到干扰PARP1可以通过去除DMs降低DHFR基因拷贝数，逆转肿瘤耐药表型，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。
发明内容
针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复发的现象，本发明的目的在于提供PARP1抑制剂通过下调DHFR基因拷贝数进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的新的生物治疗策略，从而为揭示新的治疗靶点、更加有效地对抗MTX耐药提供科学的依据。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的技术方案是检测HT29及含DMs的HT29 MTX耐药细胞(HT29 10-4mol/LMTX)中，A-NHEJ通路关键蛋白的表达差异。然后，将阴性对照和干扰PARP1的慢病毒载体分别转入含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，获得稳定转染克隆。应用Western Blot、免疫荧光、Real-time PCR、FISH、MTT等方法，检测转染PARP1前后细胞的DSBs形成及修复、基因拷贝数、含DHFR基因的DMs数目、微核/核出芽外排、细胞生长、凋亡、自噬、耐药的变化情况。同时，FISH分析PARP1抑制剂ABT-888短期作用含DMs的HT29 MTX耐药细胞，含DHFR基因的DMs数目变化情况。通过以上实验，明确干扰PARP1抑制A-NHEJ功能是否可以通过去除DMs降低DHFR基因拷贝数，达到逆转耐药的肿瘤作用。从而为揭示新的治疗靶点，更加有效对抗MTX耐药提供科学依据。
1.A-NHEJ相关蛋白的表达分析
提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测PARP1、LIG3和XRCC1在HT29及含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的表达情况。
2.含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰PARP1克隆的建立
确定含DMs的HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将细胞以7×104个/孔的密度接种于24孔培养板中，培养24小时待细胞贴壁后，进行转染。细胞转染分两组进行：第一组转染阴性对照病毒；第二组转染PARP1干扰病毒。混匀后继续培养，8～12小时以后观察细胞形态，更换为新鲜培养基。培养24h后，加入0.3μg/ml的嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。含DMs的HT29 MTX耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-PARP1。
3.检测PARP1蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测PARP1蛋白在sh-control和sh-PARP1克隆中的表达情况。
4.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DSBs产生及修复的影响
(1)应用Western Blot和免疫荧光方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中γ-H2AX的表达及灶点数变化。
(2)应用Western Blot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中C-NHEJ通路关键蛋白DNA-PKcs、Ku70、Ku86、Ligase4、XRCC4和Artemis的表达情况。
(3)应用Western Blot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中HR通路关键蛋白BRCA1、MRE11、RAD50和NBS1的表达情况。
5.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因拷贝数及蛋白表达情况的影响
(1)以sh-control和sh-PARP1克隆的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰PARP1对DHFR基因拷贝数的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。
(2)提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中DHFR蛋白表达情况。
6.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因扩增形式及同一扩增子上其他基因拷贝数的影响
(1)分别制备sh-control和sh-PARP1克隆中期核型标本，FISH检测干扰PARP1对含DHFR基因的DMs数目的影响。
(2)以sh-control和sh-PARP1克隆的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰PARP1，与DHFR位于5号染色体同一扩增子的msh3和zfyve16拷贝数的变化。
7.含DMs的HT29 MTX耐药细胞在PARP1抑制剂短期作用下含DHFR基因的DMs数目的变化
取生长状态良好的含DMs的HT29 MTX耐药细胞，以每孔45万的细胞种在6孔板中。第二天更换新鲜培养基，并分别加入终浓度为10-4mol/L的MTX及终浓度为10μmol/L的ABT-888。分别于培养24h、48h、72h收获细胞并制备中期核型。随后用FISH方法检测ABT-888短期作用含DMs的HT29 MTX耐药细胞后，含DHFR基因的DMs数目的变化情况。
8.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对微核/核出芽形成和外排的影响
制备sh-control和sh-PARP1克隆中期核型标本，FISH检测微核/核出芽形成及含DHFR基因微核/核出芽外排情况。
9.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对细胞功能的影响
(1)MTT法绘制生长曲线检测干扰PARP1对细胞生长的影响。
(2)Western Blot方法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白cleaved-Caspase3和Bax的表达，明确干扰PARP1对细胞凋亡的影响。
(3)Western Blot检测细胞内LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达，通过计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值变化，明确干扰PARP1对细胞自噬的影响。
(4)MTT法检测干扰PARP1对细胞耐药性的影响。
通过MTT法检测药物半数致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰PARP1对含DMs的HT29 MTX耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。
通过上述研究，本发明发明人发现针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制A-NHEJ通路的关键蛋白PARP1，能够降低DHFR基因拷贝数、减少细胞内的DMs，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。更重要的是，这种基因拷贝数降低机制可能适用于多种不同药物引起的以基因扩增为基础的耐药。
因此，在上述研究的基础上本发明提出了PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性药物中的应用。
在本发明中，优选的，所述的PARP1抑制剂为ABT-888(2-[(2R)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1H-苯并咪唑-7-甲酰胺)或干扰PARP1的慢病毒载体。
更优选的，所述的干扰PARP1的慢病毒载体为PIEL248074090，购自上海吉凯基因公司。
在本发明中，优选的，所述的肿瘤细胞为含DMs的MTX耐药细胞。
更优选的，所述的肿瘤细胞为含DMs的人结肠癌HT29 MTX耐药细胞，其中，优选的，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10-4mol/L。
在本发明中，优选的，所述的药物通过降低DHFR基因拷贝数、减少细胞内的DMs，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明的方法为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。此外，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。
附图说明
图1是Western Blot图，表示A-NHEJ途径相关蛋白在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的表达增加；
图2是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1克隆的干扰效果良好；
图3是Western Blot图(A)和免疫荧光图(B)，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1导致γ-H2AX表达降低和γ-H2AX灶点数减少；
图4是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1导致C-NHEJ通路功能增强；
图5是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1导致HR通路功能增强；
图6是Real-time PCR柱状图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使DHFR基因拷贝数明显降低；
图7是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使DHFR蛋白表达水平明显降低；
图8是荧光原位杂交图(B)及统计图(A)，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使含DHFR基因的DMs数目减少；
图9是Real-time PCR柱状图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使5号染色体同一扩增子上其他基因拷贝数降低；
图10是荧光原位杂交统计图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞中利用PARP1抑制剂使含DHFR基因的DMs数目减少；
图10A是ABT-888处理细胞第1天细胞内含DHFR基因的DMs数目的统计图，图10B是ABT-888处理细胞第2天细胞内含DHFR基因的DMs数目的统计图，图10C是ABT-888处理细胞第3天细胞内含DHFR基因的DMs数目的统计图；
图11是细胞生长曲线图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使细胞增殖能力下降；
图12是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1使细胞凋亡能力增强；
图13是Western Blot图，表示含DMs的HT29 MTX耐药细胞干扰PARP1不影响细胞自噬。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，以便更明确的阐述其优点和特点。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1.细胞培养
人结肠癌细胞系HT29及含DMs的HT29 MTX耐药细胞(HT29 10-4mol/L MTX)，在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX。所有细胞均在5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。
2.A-NHEJ通路相关蛋白的表达分析
提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测PARP1、LIG3、XRCC1在HT29及含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的表达变化。
a.细胞总蛋白的提取
将细胞用预冷的PBS冲洗3次，以去除细胞表面附着的蛋白成份。将细胞培养瓶放在冰上，吸净残余的PBS。加入适量的细胞裂解液(蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂:RIPAbuffer的体积比为1:1:10)，用细胞刮刮下细胞并收集于1.5ml Eppendorf管中，冰上静置，每10min涡旋1次，涡旋3次后，4℃、12000转/分离心40min，取上清，应用BCA法测定所提取细胞总蛋白浓度，并加入相应体积的RIPA buffer将所测样本调至统一浓度，加入相应体积的5×loading buffer，沸水中变性5分钟，–20℃保存备用。
b.SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质
应用30％的凝胶储备液(甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺＝1：29)制备浓度分别为10％和5％的SDS-聚丙烯酰胺分离胶及积层胶(表1)。
表1 聚丙烯酰胺凝胶成分
蛋白样品，瞬时离心后上样。
先以80V电压电泳至分离胶中出现蛋白质marker的第一条带后，再以110V电压电泳至与待测蛋白分子量相近的蛋白质marker条带达到分离胶中1/3处。
c.转膜
剪取1张与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于甲醇中30s后备用。同时，将凝胶转移用滤纸、纤维垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按如下顺序组装转移装置：阳极→纤维垫→3张3M滤纸→PVDF膜→凝胶→3张3M滤纸→纤维垫→阴极，确定排出气泡后封闭转移装置，放入转移槽中并在槽中放置冰盒降温，以300mA恒流转膜，时间根据蛋白大小而定。
d.免疫反应
转膜结束后，取出PVDF膜并作标记，放入TBS-T洗涤10min，然后放入适量TBS-T溶解的5％脱脂奶粉中，室温封闭1小时。
将封闭好的PVDF膜，加入稀释好的一抗(一抗稀释比例分别为PARP1，1:200；LIG3，1:500；XRCC1，1:500；GAPDH，1：10000)。4℃摇床过夜。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10min，然后加入以1:10000比例稀释的二抗，室温下避光杂交1h。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10min。最后用Odyssey Infrared Imaging System扫膜，获取图像。
结果显示，与HT29细胞相比，含DMs的HT29 MTX耐药细胞中A-NHEJ途径相关蛋白PARP1、LIG3过表达；而XRCC1无明显变化(图1)。
3.含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰PARP1克隆的建立
a.细胞转染分组
细胞转染分两组进行：第一组转染阴性对照病毒载体LVCON077；第二组转染干扰PARP1的慢病毒载体PIEL248074090(购自上海吉凯基因公司)。
b.确定含DMs的HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性
取生长良好的含DMs的HT29 MTX耐药细胞，制备成单细胞悬液，计数种板，六孔板每孔种3×105个细胞，种六个孔。第二天，待细胞贴壁后，换新鲜培养基，每孔加入终浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml的嘌呤霉素，连续培养7天，观察到，嘌呤霉素浓度为0.3μg/ml时含DMs的HT29MTX耐药细胞恰好全部死亡，故选此浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。
c.稳定转染
将处于对数生长期的细胞以7×104个/孔的密度接种于24孔培养板中，培养24小时待细胞贴壁后，进行转染。使用DMEM高糖培养基稀释polybrene(聚凝胺)，至终浓度为50μg/ml；使用enhanced infection solution(增强转染液，ENi.S)分别将阴性对照和PARP1干扰病毒稀释至1×108TU/ml。将24孔板内的培养基弃掉加入50μl 1×108TU/ml病毒液、50μl50μg/ml的polybrene稀释液和400μl ENi.S。混匀后继续培养，8～12小时以后观察细胞形态，更换为新鲜培养基。感染3～4天后，观察荧光表达情况，确定转染效率。
d.转染细胞及克隆筛选
培养24h后，加入嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。含DMs的HT29 MTX耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-PARP1。
4.检测PARP1蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测PARP1在sh-control和sh-PARP1克隆中的表达情况。提取细胞总蛋白、Western Blot具体实验条件及步骤同前。含DMs的HT29MTX耐药细胞干扰PARP1效果良好(图2)。
5.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DSBs产生及修复的影响
(1)应用Western Blot及免疫荧光检测γ-H2AX表达及灶点数，以确定干扰PARP1对DSBs的影响。
Western Blot方法同前，免疫荧光方法如下：
将20mm×20mm的盖玻片铺于6孔板底部，以5×104个细胞/孔进行接种。待细胞贴壁后，用PBS清洗3次，每次10分钟。吸净PBS，加入4％多聚甲醛固定10分钟。固定结束后，用PBS清洗3次，每次10分钟。加入2ml PBS-T(0.1％的Triton X-100溶于PBS中)，4℃孵育10分钟。孵育过后，加入PBS室温清洗5分钟。加入2ml PBS-B(4％的BSA溶于PBS中)，37℃孵育30分钟。之后，加入稀释好的γ-H2AX一抗(1：500)100μl，4℃孵育过夜。孵育结束后，PBS清洗5分钟，并加入稀释好的荧光二抗(1：1000)100μl，37℃孵育1小时。孵育结束后，PBS清洗3次，每次5分钟。用DAPI染液进行复染，并将盖玻片倒扣于载玻片上，镜下观察。
Western Blot及免疫荧光检测结果表明，与sh-control相比，sh-PARP1克隆中γ-H2AX表达降低，灶点数减少，表明干扰PARP1使DSBs累积减少(图3A、B)。
(2)运用Western Blot分别检测sh-control和sh-PARP1克隆中C-NHEJ通路关键蛋白DNA-PKcs、Ku86、Ku70、Ligase4、XRCC4和Artemis的表达情况，以确定干扰PARP1对C-NHEJ修复通路的影响。(一抗稀释浓度分别为：DNA-PKcs，1：100；Ku86，1：100；Ku70,1:1000；Ligase4，1:100；XRCC4，1：100；Artemis，1：100，GAPDH，1：10000)
与sh-control相比，sh-PARP1克隆中DNA-PKcs、Ku86和Ku70表达增加而Ligase4、XRCC4和Artemis表达无明显变化(图4)，表明干扰PARP1可以使C-NHEJ通路功能增强。
(2)运用Western Blot分别检测sh-control和sh-PARP1克隆中HR通路关键蛋白BRCA1、MRE11、RAD50和NBS1的表达情况，以确定干扰PARP1对HR修复通路的影响。(一抗稀释浓度分别为：BRCA1，1：200；MRE11，1：100；RAD50，1：200；NBS1，1：1000；GAPDH，1：10000)
与sh-control相比，sh-PARP1克隆中BRCA1表达明显增加，而MRE11、RAD50和NBS1表达无明显变化(图5)，表明干扰PARP1也可以使HR修复功能增强。
6.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因拷贝数及蛋白表达情况的影响
(1)以sh-control和sh-PARP1克隆的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰PARP1对DHFR基因拷贝数的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。
a.细胞基因组DNA提取
应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞系基因组DNA的提取。将处于对数期生长期的细胞，用胰酶消化收集细胞(细胞数量不超过5×106个)，600转/分离心5min收集细胞沉淀。PBS冲洗，1000转/分离心5min。弃上清，然后将细胞沉淀弹开，加入200μl PBS混匀，再加入20μl蛋白酶K及200μl Buffer AL，涡旋15s混匀。56℃水浴10min后瞬时离心，然后加入200μl无水乙醇，涡旋15s，8000转/分离心1min。转移混合物至QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1min。将离心柱放在新的2ml收集管上，加500μl Buffer AW1，8000转/分离心1min。将离心柱放在新的2ml收集管上，加500μl BufferAW2，14000转/分离心3min。将离心柱放在新的2ml收集管上，14000转/分离心1min。将离心柱至于1.5ml Eppendorf管上，加200μl Buffer AE，室温孵育1min，8000转/分离心1min，其中1.5ml Eppendorf管中收集到的液体即为基因组DNA。应用Nanodrop2000紫外光分光光度计测定所提取DNA的浓度，放入-20℃冰箱储存备用。
b.应用Real-time PCR技术检测含DMs的HT29 MTX耐药细胞中DHFR基因的拷贝数。
20μl PCR反应体系：480SYBR Green Master 10μl，上下游引物各为1μl(即终浓度为50μmol/L)，cDNA模板为2μl(即终浓度为100ng/μl)，ddH2O 7μl。
PCR的反应条件为：95℃6min；95℃20s，Tm 20s，72℃20s，进行45个循环的反应；融解曲线95℃5s，65℃，97℃。
每个样本中目的基因的结果均利用内参对照基因β-ACTIN进行归一化处理，然后应用配对t检验统计学方法，将目的基因在sh-control和sh-PARP1克隆中的结果进行比较，得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P≤0.05时，差异具有显著的统计学意义，用*表示；当P≤0.01时，差异具有极显著的统计学意义，用**表示。
与sh-control相比，sh-PARP1克隆中DHFR基因拷贝数明显下降(图6)。
(2)提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测含DMs的HT29 MTX耐药细胞sh-control和sh-PARP1克隆中DHFR蛋白的表达情况。
与sh-control相比，sh-PARP1克隆中DHFR蛋白表达水平明显降低(图7)。
7.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因扩增形式及同一扩增子上其他基因拷贝数的影响
(1)含DMs的HT29 MTX耐药细胞sh-control和sh-PARP1克隆中期核型标本制备，FISH检测干扰PARP1对DHFR基因扩增形式的影响
a.细胞中期核型标本制备
选取处于有丝分裂旺盛期的sh-control和sh-PARP1克隆制备染色体标本。向培养于50ml培养瓶中处于生长旺盛期的细胞加入10μl秋水仙胺(10μg/μl)，作用1h后收获细胞。PBS冲洗，胰酶消化收集细胞，1000转/分离心6min使细胞沉淀。弃上清，将细胞沉淀弹开成为细胞悬液，加入9ml 37℃预热的KCl低渗液(0.075mol/L)，37℃低渗13min后，加入1ml新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)预固定1min，1700转/分离心7min。弃上清，弹开细胞沉淀，10ml固定液，固定1h后1700转/分离心7min，弃上清，弹匀，加10ml固定液固定40min后1700转/分离心7min。弃上清，加入2ml新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝2:1)，吹匀细胞。
取预冷的载玻片，将吹匀的细胞悬液滴片。空气中干燥后，镜检。室温老化2天，准备做FISH。
b.FISH探针制备及探针沉淀
应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，按说明书提供方法提取BAC克隆(RP11-90A9：DHFR；5号染色体着丝粒替代探针)DNA，以所提取的DNA为模板，应用BioPrime DNALabeling System试剂盒通过随机引物法标记FISH探针。反应体系：先配制总体系5μl的反应液，其中Random Primer占80％，BAC DNA模板浓度为8μg/ml，其余以H2O补齐。反应液95℃反应10min后，立刻置于冰上静置2min，之后加入终浓度为0.25mmol/L缺T的dNTP，2％的Klenow和终浓度为125μmol/L的dNTP，37℃水浴3h，加入10％的终止Buffer。用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
反应结束后，进行探针沉淀。反应体系为：Labeled BAC DNA 3μl，ssDNA 6μl，Human CotI 6μl，H2O补齐至50μl，醋酸钠(3mol/L)5μl，冷的无水乙醇(-20℃冰箱冷藏)110μl。然后将探针放置-80℃冰箱沉淀20min后12000rpm离心10min，吸去上清(200μl枪头，勿碰到探针沉淀)，110μl 75％冷乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心10min，吸去上清，避光干燥5min～10min。加9μl杂交液，37℃水浴1～2h，使探针溶解。随后75℃水浴8min进行探针变性，立即置冰上2min。最后，37℃水浴30min进行探针预复性。
c.FISH玻片处理流程
用钻石笔将之前滴好的片子标出目标区域(约一个20mm×20mm盖玻片大小)，随后加100μl RNase工作液于目标区域，盖上PE手套(剪成小块)，放在湿盒里，37℃孵育40min。孵育结束后，在室温条件下，用2×SSC洗3min，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3min并用吹风机吹干。每个目标区域加100μl胃蛋白酶工作液，盖上手套，放在湿盒里，37℃孵育15min。孵育结束，1×PBS洗5min后用1％多聚甲醛处理10min，1×PBS洗5min，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3min，吹风机吹干。将玻片放入预热的70％甲酰胺，75℃水浴3min。最后将玻片放入4℃预冷的2×SSC I、2×SSC II中各洗3min，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3min。
d.FISH杂交流程
每个目标区域加9μl探针，盖上盖玻片(20×20)，rubber cement封片；放入湿盒37℃孵育，隔天收。
隔天，揭去Rubber Cement封片剂，将玻片放入44℃水浴预热的50％甲酰胺中，夹住玻片晃动，使盖玻片脱落，计时15min。2×SSC I、2×SSC II各3min，75％、85％、100％乙醇脱水各3min，吹干。5μl DAPI复染，24mm×32mm盖玻片封片。荧光显微镜下观察。
分别随机选取sh-control和sh-PARP1克隆各50个核型，统计含DHFR基因的DMs数目，与sh-control相比，sh-PARP1克隆中含DHFR扩增基因的DMs数目明显减少(图8)。
(2)以sh-control和sh-PARP1克隆的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰PARP1对与DHFR位于5号染色体同一扩增子上其他基因拷贝数的影响
实验室前期对耐药细胞系进行array CGH芯片分析，结果显示RAD1和PLK2在HT29MTX耐药过程中不发生基因扩增，作为阴性对照。DHFR、MSH3和ZFYVE16均随MTX药物浓度升高而扩增增加。在HT29 10-4mol/L MTX耐药细胞中，MSH3和ZFYVE16与DHFR基因位于同一扩增子内，主要存在于DMs上。
Real-time PCR结果显示，与sh-control相比，sh-PARP1克隆中MSH3和ZFYVE16基因拷贝数明显下降。表明干扰PARP1抑制A-NHEJ能够降低与DMs形成相关的基因拷贝数(图9)。
8.含DMs的HT29 MTX耐药细胞在PARP抑制剂ABT-888(2-[(2R)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1H-苯并咪唑-7-甲酰胺)短期作用下对DHFR基因扩增形式的影响
取生长状态良好的细胞，以45万/孔的细胞密度接种在6孔板中。第2天待细胞完全贴壁后，更换新鲜培养基，并加入终浓度为1×10-4mol/L的MTX及终浓度为10μmol/L的ABT-888，37℃孵箱中连续培养3天，并分别于加药后1天、2天、3天之后收获细胞进行中期染色体核型制备，并利用FISH方法分析ABT-888短期作用后，含DHFR基因的DMs的数目变化情况。
中期核型制备及FISH具体实验条件及步骤同前。
分别随机选取ABT-888处理组和DMSO处理组细胞各50个核型，统计含DHFR基因的DMs数目的变化。我们发现，与DMSO处理组相比，ABT-888处理细胞第1天，细胞内含DHFR基因的DMs数目呈增加趋势，但无统计学意义(图10A)；ABT-888处理细胞第2天和第3天细胞内含DHFR基因的DMs数目明显减少(图10B、C)。
9.干扰PARP1对微核/核出芽形成及外排的影响
含DMs的HT29 MTX耐药细胞sh-control和sh-PARP1克隆中期核型标本制备，FISH检测微核/核出芽形成及含DHFR基因微核/核出芽外排情况。
分别随机选取sh-control和sh-PARP1克隆的500个间期核进行统计分析，将细胞进行分类：(Ⅰ)没有微核/核出芽；(Ⅱ)不含有DHFR信号的微核/核出芽；(Ⅲ)含有DHFR信号的微核/核出芽。结果发现sh-control和sh-PARP1克隆中微核/核出芽形成率分别为11.40％和11.20％(表2)，含DHFR基因的微核/核出芽外排率分别为66.67％和64.28％(表3)。因此，稳定干扰PARP1不影响微核/核出芽形成，同样也不影响含DHFR基因的微核/核出芽外排。
表2 DMs的HT29 MTX耐药细胞对照及稳定干扰PARP1克隆微核/核出芽形成情况
P>0.05
表3 DMs的HT29 MTX耐药细胞对照及稳定干扰PARP1克隆含DHFR扩增基因的微核/核出芽外排情况
P>0.05
10.含DMs的HT29 MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对细胞功能的影响
(1)MTT法绘制生长曲线检测干扰PARP1对细胞生长的影响
收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔1000个细胞密度接种到96孔板，并加相应浓度的MTX。培养的前三天不换液，第四天开始酌情换液。从培养的第二天开始，每天读数一块96孔板。吸出培养基，小心用PBS冲洗一遍后每孔加入100μl新鲜培养基，并加入20μl的MTS溶液，继续培养4h后终止培养。在酶标仪OD 492nm处测量各孔吸光值。计算每个浓度吸光值的平均值，并以此绘制生长曲线。
MTT结果显示，与sh-control相比，sh-PARP1克隆中细胞的增殖能力下降(图11)。
(2)Western Blot检测干扰PARP1对细胞凋亡的影响
提取细胞总蛋白、Western Blot具体实验条件及步骤同前，(一抗稀释比例Bcl-21：500；caspase3 1:500；Bax 1:500)。与sh-control相比，sh-PARP1克隆中抗调亡蛋白Bcl-2表达下降，凋亡蛋白cleaved-caspase和Bax表达增加。表明干扰PARP1使细胞凋亡能力增强(图12)。
(3)Western Blot检测干扰PARP1对细胞自噬的影响
提取细胞总蛋白、Western Blot具体实验条件及步骤同前，(一抗稀释比例LC31：1000)。检测sh-control和sh-PARP1细胞中LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达，通过计算LC3Ⅱ/Ⅰ的比值变化，来评价细胞自噬形成。稳定干扰PARP1后，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达均增加，LC3Ⅱ/Ⅰ的相对比值与sh-control相比无差异，表明稳定干扰PARP1不影响细胞自噬发生(图13)。
(4)MTT法检测干扰PARP1对细胞耐药性的影响
通过MTT法检测药物半致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰PARP1对MTX耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。
收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔5000个细胞密度接种到96孔板，并加浓度梯度连续的MTX。酌情换液，培养72h后读数，方法同MTT测生长曲线。
根据对照孔(未加药)计算MTX对细胞的生长抑制率，根据各个浓度对细胞的生长抑制率计算得出MTX对细胞的药物半致死浓度。
在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，与sh-control相比，MTX对sh-PARP1的IC50值降低了1.63倍，即干扰PARP1导致细胞对MTX的药物敏感性增加(表4)。表4含DMs的HT29 MTX耐药细胞对照及稳定干扰PARP1克隆对MTX药物敏感性的差异情况
A:对照克隆的IC50值比干扰PARP1克隆的IC50值
*:P<0.05。

Claims (5)

1.PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤(MTX)耐药性药物中的应用，所述的肿瘤细胞为含双微体的人结肠癌HT29MTX耐药细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PARP1抑制剂为ABT-888(2-[(2R)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1H-苯并咪唑-7-甲酰胺)或干扰PARP1的慢病毒载体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的干扰PARP1的慢病毒载体为PIEL248074090，购自上海吉凯基因公司。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10-4mol/L。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物通过降低DHFR基因拷贝数、减少细胞内的双微体，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。
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