CN109289051A - Msh2抑制剂在制备逆转mtx耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MSH2抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以MSH2为靶点，抑制DSBs的修复，减少DMs和HSRs的形成；同时使含有DHFR扩增基因的微芽/微核形成增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，使细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转MTX耐药肿瘤细胞的耐药情况，提高肿瘤治疗的效率。本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。此外，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。

Description

MSH2抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及以MSH2为靶点抑制基因扩增逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的应用，特别涉及MSH2抑制剂在制备通过抑制DSBs修复，下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)是一种抗代谢类抗肿瘤药物，是应用最广泛的化疗药之一。MTX是二氢叶酸还原酶(DHFR)的竞争抑制剂，通过阻断叶酸代谢抑制DNA合成和细胞增殖。目前，MTX的联合化疗用于多种肿瘤如乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、骨肉瘤、绒毛膜上皮癌和白血病，也用于炎性疾病、类风湿性关节炎和皮肤病治疗，然而MTX在多数肿瘤包括结肠癌的临床使用中受到限制，主要原因是DHFR基因的扩增，使细胞发生获得性耐药。

基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不稳定性的一种主要形式，在肿瘤的发展和耐药过程中起着重要的作用。扩增的基因通常以双微体(Double minute chromosomes,DMs)和均质染色区(Homogeneously stainingregions,HSRs)两种形式存在。DMs是染色体外成对存在，无着丝粒，能自主复制，在细胞分裂中随机分配的环状DNA。HSRs是染色体内扩增形成的一段基因组区域，人们利用G显带技术发现了这种缺乏典型带纹的染色体片段。DMs和HSRs存在于多数的血液系统肿瘤和实体瘤中，可以作为肿瘤进展和耐药过程中出现的细胞遗传学特异标志。研究发现，包含DHFR耐药基因的DMs和HSRs数量减少会逆转细胞对MTX的耐药情况。由于DMs和HSRs在结构上的明显差异，它们的形成机制也是不同的。一般认为HSRs是“断裂-融合-桥”循环形成，或者由DMs重新插入染色体形成；DMs的形成涉及多种不同的分子机制。例如，染色体碎裂形成的基因组片段可形成DMs；复制叉停滞处的断裂和重组能够产生环状的DNA分子；在G1或G2期DNA片段从染色体内切除并环化形成DMs。而无论由哪种分子机制形成，都与DNA双链断裂(Double strain break，DSB)引发基因组不稳定相关。

DNA错配修复(DNA mismatch repair，MMR)系统广泛存在于生物体中，是细胞复制后的一种修复方式，通过矫正在DNA复制和重组过程中产生的碱基对错配和小的核苷酸插入或缺失而保持基因组的稳定性。直接参与人MMR过程的有MSH2、MSH3、MSH6、MLH1和PMS2。当错配发生时，MSH2与MSH6或MSH3形成MutSα或MutSβ异源二聚体，分别用于识别DNA复制或重组过程中产生的碱基-碱基错配或小的核苷酸插入或缺失，并在增殖细胞核抗原(PCNA)的协助下完成MMR起始阶段；随后，MutSα或MutSβ招募MLH1-PMS2(MutLα)异源二聚体，在核酸外切酶1(EXO1)的协助下完成错配切除；最后，通过DNA聚合酶Ⅲ和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA，从而完成MMR的整个过程。

研究发现MMR关键蛋白在DSBs修复过程中也发挥重要作用。DSBs修复的两种主要机制为同源重组(Homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)：HR需要完整的模板来恢复DSBs位点遗失的序列信息，主要发生在S期后期或G2期；NHEJ包括DNA-PKcs依赖的经典NHEJ修复，以及不依赖DNA-PKcs的选择性非同源末端连接(Alternative non-homologous end joining,A-EJ)，NHEJ可发生在细胞周期各个阶段。酵母中的HR修复需在新的DNA合成前移除末端非同源的DNA，而MSH2和MSH3在这一过程中起着重要的作用。研究者还发现MSH3与HR通路关键基因MRE11间接相互作用，在Holliday连接的移除中发挥重要的作用，MSH3缺失将导致HR修复DSBs的能力受损。而MLH1、MSH6或PMS2缺失的细胞将发生MRE11和RAD51基因的移码突变，进而导致HR修复受损。以上均表明MMR蛋白在HR修复中发挥重要的作用。MSH3缺失的细胞中DSBs水平明显增加，与此同时NHEJ修复也明显增加，表明MSH3缺失能够促进NHEJ修复。MLH1和MSH6缺失将导致RAD50和MRE11蛋白表达受损，进而导致NHEJ修复活性降低，说明MLH1和MSH6在NHEJ修复中发挥着重要的作用。

此外，MMR系统也可以参与修复细胞毒性物所引起的一部分DNA损伤应答，如参与SN1型DNA烷化剂、6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine，6-TG)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、顺铂、紫外线以及可以形成DNA加合物的某些环境致癌物等所引起的DNA损伤。

本发明以MSH2为靶点进行干扰后发现，干扰MSH2能够抑制DSBs的修复，减少DMs和HSRs的形成；同时使含有DHFR扩增基因的微芽/微核形成增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，使细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转MTX耐药肿瘤细胞的耐药情况，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于针对肿瘤化疗药物MTX在治疗过程中常产生耐药而导致化疗失败的现象，提供以MSH2为靶点抑制基因扩增逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的方法，具体涉及MSH2抑制剂在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。

本发明发明人前期构建了人结肠癌细胞系HT29MTX耐药的进化模型。本发明选用的细胞为对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的人结肠癌细胞，此时细胞中同时存在DMs和HSRs两种扩增形式，且以DMs为主。

本发明的技术方案是通过Western Blot检测HT29亲本及含DMs的MTX耐药细胞中MMR通路主要蛋白MSH2、MSH3、MSH6以及MLH1的表达。之后应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲减MMR关键蛋白MSH2，建立稳定干扰MSH2的克隆；应用Western Blot检测细胞中双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)的变化，并应用质粒报道系统检测DSBs相关修HR、NHEJ以及A-EJ的变化；检测稳定干扰MSH2后DHFR及与其位于同一扩增子上的6个基因MSH3、XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK的扩增程度改变；利用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)检测基因扩增形式变化、微芽(Micronuclei buddings，MBUDs)及微核(Micronuclei,MN)形成及外排情况；最后通过MTS检测抑制MSH2后细胞对MTX药物敏感性的变化。

本发明在含DMs的MTX耐药细胞中，发现稳定干扰MSH2可以通过抑制HR、NHEJ和A-EJ修复能力减少DMs和HSRs的形成，促进微芽/微核形成影响DMs和HSRs的稳定存在。并发现稳定干扰MSH2可提高MTX耐药细胞对MTX的敏感性。从而为揭示新的治疗靶点、为更加有效对抗MTX耐药提供科学的依据。

具体的，为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

1、细胞培养

本发明选取对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的含DMs的人结肠癌细胞HT29耐药细胞作为研究对象。

2、MMR关键蛋白的表达分析

提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测MSH2及其他MMR关键蛋白在HT29亲本及含DMs的MTX耐药细胞中的表达情况。与HT29亲本细胞相比，含DMs的MTX耐药细胞中MSH2与MSH3高表达，MSH6蛋白表达水平下降。

3、在含DMs的HT29MTX耐药细胞中稳定干扰MSH2克隆的建立

确定含DMs的HT29MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的含DMs的HT29MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞3×10⁵个。待细胞长至80％时，进行稳定转染。细胞转染分两组进行：第一组转染质粒MSH2shRNA；第二组转染质粒Control shRNA。培养72小时后，每个孔中加入相应浓度的嘌呤霉素进行稳定筛选，连续换液培养15天左右，当形成肉眼可见大小的克隆时，挑取单克隆。对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-MSH2。

4、检测MSH2蛋白表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果

应用Western Blot方法检测MSH2在含DMs的HT29MTX耐药细胞的对照克隆及干扰MSH2的克隆中的表达情况。经检测，干扰克隆中MSH2的表达量明显低于对照克隆中的表达量，证明所挑选的克隆为有效克隆。

5、稳定干扰MSH2对MMR其他关键蛋白表达的影响

应用Western Blot检测含DMs的HT29MTX耐药细胞中稳定干扰MSH2后MMR相关蛋白水平变化。结果发现与sh-control相比，sh-MSH2克隆中MSH3及MSH6蛋白表达明显降低，说明稳定干扰MSH2可以抑制MMR通路。

6、稳定干扰MSH2对DSB的产生及DSB修复功能的影响

(1)应用Western Blot检测稳定干扰MSH2前后细胞中γH2AX的蛋白表达水平，以确定干扰MSH2对DSB产生的影响。在含DMs的HT29MTX耐药细胞中，稳定干扰MSH2后，细胞核内γH2AX的表达量明显增加，说明稳定干扰MSH2可增加DSBs在细胞内的累积。

(2)报道质粒DR-GFP可用来检测HR的修复能力，DR-GFP由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-SceⅠ的酶切识别位点，而第二个GFP的序列缺少3′和5′端，因而均不能表达GFP。我们利用RNAi技术瞬时干扰含DMs的HT29MTX耐药细胞中的MSH2，其中对照组命名为si-Control，MSH2干扰组命名为si-MSH2。随后通过质粒转染使细胞中表达I-SceⅠ，此时第一个GFP被切断，并可利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，进而表达GFP。随后我们利用流式细胞仪检测GFP阳性比率，判断细胞的HR修复能力。发现瞬时转染干扰MSH2后，HT29MTX耐药细胞的GFP阳性表达率明显下降，表明干扰MSH2可降低HR通路的修复能力。

(3)我们应用报道质粒EJ5-GFP来检测抑制MSH2后细胞NHEJ能力的变化。在质粒EJ5-GFP中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-SceⅠ识别位点，若细胞中表达I-SceⅠ且诱导DSBs，细胞可通过NHEJ途径修复该DSBs，并表达GFP。我们在HT29MTX耐药细胞中稳定转染EJ5-GFP质粒，比较干扰MSH2前后细胞GFP表达比率的变化，结果显示与si-Control相比，si-MSH2组NHEJ修复能力显著下降。表明NHEJ修复过程需要MSH2的参与。

(4)我们采用EJ2-GFP对A-EJ的修复能力进行评估。该质粒包含了一个N末端被标记的融合GFP，且其N末端和GFP中间隔有一个跟随着终止密码子的I-SceⅠ识别位点，同时在I-SceⅠ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。若I-SceⅠ位点被识别且被切断形成的DSBs被A-EJ修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框，从而表达GFP，并造成35个碱基的缺失。我们利用稳定表达EJ2-GFP报道质粒的HT29MTX耐药细胞评估干扰MSH2后，细胞A-EJ的修复能力。结果显示si-MSH2组较si-Control组阳性细胞比率明显下降，说明干扰MSH2可降低HT29MTX耐药细胞的A-EJ修复能力。

7、稳定干扰MSH2对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响

(1)以sh-control及sh-MSH2克隆DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰MSH2对DHFR基因扩增程度的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。在sh-MSH2中，DHFR的基因扩增程度显著降低。为进一步探究稳定干扰MSH2是否影响DHFR的表达，我们通过WesternBlot检测sh-control及sh-MSH2克隆中DHFR蛋白水平，结果发现稳定干扰MSH2之后DHFR蛋白表达明显降低

(2)制备sh-control和sh-MSH2中期核型标本，FISH检测干扰MSH2对DHFR基因扩增形式的影响，进一步验证Real-time PCR结果。与对照组相比，sh-MSH2含有DHFR的DMs和HSR的数目显著降低。

(3)以sh-control和sh-MSH2克隆DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰MSH2对5号染色体上与DHFR基因位于同一扩增子上其它基因扩增程度的影响。根据实验室前期aCGH芯片结果可知：MSH3基因同DHFR基因一样，位于DMs和HSRs扩增子上；XRCC4、CCNH、GLRX、POLK和CAST等基因位于HSRs扩增子上；RAD1和PLK2基因既不位于DMs也不位于HSRs扩增子上，在细胞耐药过程中不发生扩增，为该实验的阴性对照。Real-time PCR结果显示，与对照组相比，sh-MSH2中对照基因RAD1和PLK2基因的拷贝数无明显变化，MSH3、XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK基因的拷贝数均明显下降。说明稳定干扰MSH2可以降低与DMs和HSR形成相关基因的扩增。

8、稳定干扰MSH2对微芽/微核形成的影响

我们运用FISH检测sh-control及sh-MSH2克隆中微芽/微核形成情况，发现稳定干扰MSH2导致含DHFR基因微芽/微核外排明显增加。说明稳定干扰MSH2可以促进细胞中微芽的形成，并且促进含DHFR的DMs和HSRs的微核外排，提示我们DHFR基因扩增的降低与微芽/微核形成相关。

9、稳定干扰MSH2对细胞对MTX敏感性的影响

为了明确稳定干扰MSH2是否会影响MTX耐药结肠癌细胞对MTX的敏感性，我们采用MTS法检测了药物半致死浓度(IC₅₀值)。结果显示在HT29MTX耐药细胞中，对照组克隆的IC₅₀值是MSH2干扰组的2.54倍，即稳定干扰MSH2的表达导致含DMs的HT29耐药细胞对MTX的敏感性升高。

在上述研究的基础上，本发明提出了MSH2抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

其中，优选的，所述的MSH2抑制剂为在转录水平上抑制MSH2蛋白表达的药物。

其中，优选的，所述的药物为含有MSH2shRNA的干扰载体。

其中，优选的，所述的含有MSH2shRNA的干扰载体为含有MSH2shRNA的质粒载体。

其中，优选的，所述的MSH2shRNA的靶序列为SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体的MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体的人结肠癌HT29MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

其中，优选的，所述的药物通过抑制DSBs修复，下调DHFR基因扩增，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。本发明针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以MSH2为靶点特异性地抑制MMR通路，能够降低基因扩增程度、减少细胞内的DMs和HSR，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。更重要的是，这种基因扩增去除机制可能适用于其他多种不同药物引起的以基因扩增为机制的耐药，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点都有指导性的意义。

附图说明

图1为MMR关键蛋白在HT29亲本及含DMs的HT29MTX耐药细胞中的表达情况的Western Blot图及柱状图；

图2为鉴定含DMs的HT29MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的Western Blot图；

图3为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致MMR关键蛋白表达变化的Western Blot图及柱状图；

图4为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致细胞核中γH2AX表达增多的Western Blot图及柱状图；

图5为在HT29MTX耐药细胞中瞬时转染siRNA后MSH2干涉效果的Western Blot图及柱状图；

图6为质粒DR-GFP的结构示意图(A)及在HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致HR修复能力下降的柱状图(B)；

图7为质粒EJ5-GFP的结构示意图(A)及在HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致NHEJ修复能力下降的柱状图(B)；

图8为质粒EJ2-GFP的结构示意图(A)及在HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致A-EJ修复能力下降的柱状图(B)；

图9为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致细胞内DHFR基因扩增量下降的实时定量PCR柱状图；

图10为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致细胞内DHFR蛋白表达量下降的Western Blot图及柱状图；

图11为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致细胞内含DHFR基因的双微体数目下降的荧光原位杂交图(A)及统计图(B)；

图12为在含DMs的HT29MTX耐药细胞中干扰MSH2导致5号染色体同一扩增子内DMs和HSR形成相关基因扩增程度下降的实时定量PCR柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，以便更明确的阐述其优点和特点。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.细胞培养

本发明选取对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的含DMs的人结肠癌细胞HT29耐药细胞作为研究对象。HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，所有细胞均培养在5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中。

2.MMR关键蛋白的表达分析

应用Western Blot方法检测MMR关键蛋白MSH2、MSH3、MSH6和MLH1在HT29亲本及含DMs HT29MTX耐药细胞中的表达水平。

(1)细胞总蛋白的提取

将细胞培养瓶放在冰上，并用预冷的PBS冲洗细胞3次，吸净残余的PBS。加入适量的细胞裂解液(蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂:RIPA buffer的体积比为1:1:10)，用细胞刮刮下细胞并收集于1.5mL Eppendorf管中，冰上静置，每10分钟涡旋1次，涡旋3次后，4℃、12000转/分钟离心40分钟，取上清，应用BCA法测定所提取细胞总蛋白浓度，加入相应体积的RIPA buffer调至统一浓度，再加入相应体积的5×loading buffer，于沸水中变性10分钟，-20℃保存备用。

(2)SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质

应用30％的凝胶储备液(甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺＝1：29)制备浓度分别为10％和5％的SDS-聚丙烯酰胺分离胶及积层胶(表1)。

表1聚丙烯酰胺凝胶成分

取蛋白样，瞬时离心后上样。先以80伏特电压电泳至分离胶中出现蛋白质marker的第一条带后，再以110伏特电压电泳至与待测蛋白分子量相近的蛋白质marker条带达到分离胶中1/3处。

(3)转膜

剪取1张与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于甲醇中30秒后备用。同时，将凝胶转移用滤纸、纤维垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按如下顺序组装转移装置：阳极→纤维垫→3张3M滤纸→PVDF膜→凝胶→3张3M滤纸→纤维垫→阴极，确定排出气泡后封闭转移装置，放入转移槽中并在槽中放置冰盒降温，以300毫安室温转移1～2小时。

(4)免疫反应

转膜结束后，取出PVDF膜并作标记，放入TBS-T洗涤10分钟，然后放入适量TBS-T溶解的5％脱脂奶粉中，室温封闭1小时。

将封闭好的PVDF膜，加入稀释的一抗4℃震荡过夜。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗5分钟，然后加入以1:10000比例稀释的二抗，室温下避光杂交1小时。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗5分钟。最后用Odyssey Infrared Imaging System扫膜，获取图像。

结果发现与HT29亲本细胞相比，含DMs的HT29MTX耐药细胞中MMR关键蛋白MSH2和MSH3蛋白表达水平均明显增加，MSH6蛋白表达水平下降，MLH1蛋白表达无明显改变(图1)。这表明，MSH2可能参与含DMs的HT29MTX耐药细胞的耐药过程。

3.稳定干扰MSH2的含DMs的HT29MTX克隆的建立

(1)确定含DMs的HT29MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性

取生长良好的HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞，制备成单细胞悬液，计数种板，十二孔板每孔种10⁵个细胞。第二天，待细胞贴壁后，换新鲜培养基，每孔加入终浓度分别为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL、1.1μg/mL、1.2μg/mL的嘌呤霉素，连续培养7天，观察到嘌呤霉素浓度为0.5μg/mL时HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞恰好全部死亡，故选此浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。

(2)稳定转染

MSH2shRNA质粒及阴性对照购自GeneCopoeia(广州复能基因)有限公司，质粒名称为HSH055530-5-CU6(CS4OS397623)。MSH2shRNA质粒载体的靶序列为：gcatccaaggagaatgattgg(SEQ ID NO.1所示)。

将处于对数生长期的含DMs的HT29MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞3×10⁵个。待细胞长至70％～80％时，进行转染。第一步配制溶液①：10μL Lipo2000加入到240μLOpti-MEM培养基中，室温静置15分钟。第二步配制溶液②:8μL(4ng)质粒加入到242μLOpti-MEM培养基中。第三步将溶液②加入到溶液①中，缓缓混匀，室温放置20分钟。同时，将6孔板中的细胞用Opti-MEM培养基清洗两遍，再加入1.5mL Opti-MEM培养基。最后将混合液逐滴加入细胞中，培养在37℃，5％CO₂培养箱中。培养5～6h后，更换含血清的DMEM高糖培养基。

(3)转染细胞及克隆筛选

感染72小时后，更换新鲜培养基，每个孔中加入相应浓度的嘌呤霉素进行稳定筛选。连续培养15天左右，当形成肉眼可见大小的克隆时，挑取单克隆。对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-MSH2。

4.检测MSH2蛋白表达情况鉴定稳定干扰的干扰效果

通过Western Blot法检测稳定干扰后MSH2蛋白表达水平鉴定稳定干扰效果。Western Blot具体实验条件及步骤同前。含DMs的HT29MTX耐药细胞的MSH2干扰效果如图2所示，干扰克隆中MSH2的表达量明显低于对照组，证明所挑选的克隆为有效克隆。

5.稳定干扰MSH2对MMR其他关键蛋白表达的影响

本发明应用Western Blot检测含DMs的MTX耐药细胞中稳定干扰MSH2后MMR相关蛋白水平变化。结果如图3所示，发现与sh-control相比，sh-MSH2克隆中MSH3及MSH6蛋白表达明显降低，MLH1蛋白表达无明显变化，说明稳定干扰MSH2可以抑制MMR通路。(抗体稀释比例如下：MSH2，1:500；MSH3，1:500；MSH6，1:500；GAPDH，1:10000)

6.稳定干扰MSH2对DSB的产生及DSB修复功能的影响

(1)稳定干扰MSH2对DSB的产生的影响

γH2AX常被作为细胞中DSB的标志物，因此本研究通过Western Blot检测sh-control及sh-MSH2克隆中γH2AX蛋白表达水平，发现稳定干扰MSH2导致DSBs水平明显增加(如图4所示)。说明稳定干扰MSH2可以增加细胞内DSBs损伤(抗体稀释比例如下：γH2AX，1:1000；GAPDH，1:10000)。核蛋白提取步骤如下：

吸净培养皿中的培养基，用预冷的PBS洗3遍，并用移液器吸净PBS。加入400μLCEB-A，用细胞刮刮取细胞至1.5mL Eppendorf管中。涡旋30s，冰上静置15分钟，每5分钟涡旋一次。加入20μLCEB-B，涡旋10s，冰上静置1min。1000g，4℃离心5分钟。弃上清，加入100μLCEB-A清洗沉淀，1000g，4℃离心5分钟。弃上清加入50μLNEB，涡旋10s。冰上静置30分钟，每10分钟涡旋15秒。12000g，4℃离心5分钟。上清即为细胞核蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，并用NEB将样品调至统一浓度，加入1/4蛋白体积的5×loading buffer，于沸水中变性7分钟，保存于-20℃冰箱。

(2)稳定干扰MSH2抑制HR修复功能

HR是细胞修复DSBs的主要途径之一，为检验干扰MSH2后是否会影响HR途径对DSBs的修复，我们引进了一系列基于绿色荧光蛋白的报道质粒系统。报道质粒DR-GFP可用来检测HR的修复能力，DR-GFP由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-SceⅠ的酶切识别位点，而第二个GFP的序列缺少3′和5′端，因而均不能表达GFP。首先我们利用RNAi技术瞬时干扰含DMs的HT29MTX耐药细胞中的MSH2，干扰效果如图5所示，其中对照组命名为si-Control，MSH2干扰组命名为si-MSH2。随后通过质粒转染使细胞中表达I-SceⅠ，此时第一个GFP被切断，并可利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，并表达GFP。随后我们利用流式细胞仪检测GFP阳性比率，判断细胞的HR修复能力。如图6所示，瞬时转染抑制MSH2后，含DMs的HT29MTX耐药细胞的GFP阳性表达率明显下降，表明抑制MSH2可降低HR通路的修复能力。

a含报道质粒系统细胞系的构建

将生长状态良好的HT29MTX耐药细胞按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行转染。首先配制混合液A(10μLLIPO2000和240μLOpti-MEM)和250μL混合液B(4μg质粒DNA和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。同时弃掉6孔板中的培养基并加入1.5mL新鲜培养基。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。72小时后待细胞状态稳定，用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，连续培养获得稳定表达报道质粒的细胞系。

b瞬转siRNA

将生长状态良好的含上述报道质粒的细胞按4×10⁵个/孔的密度接种于12孔板中。同时配制混合液A(2μLDharmaFECT 1Transfection Reagent和98μL Opti-MEM)和混合液B(2μL siRNA和98μL Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。随后将混合液加入到12孔板中的细胞悬液中，培养24小时后将12孔板中的细胞传代至6孔板。

c共转染I-SceⅠ质粒和siRNA

配制混合液A(10μL LIPO2000和240μL Opti-MEM)和250μL混合液B(5μL siRNA、4μg I-SceⅠ质粒和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。同时弃掉6孔板中的培养基并加入1.5mL新鲜培养基。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。I-SceⅠ表达后可识别报道质粒上相应的酶切位点并产生DSBs。

d流式分析

I-Sce Ⅰ质粒和siRNA共转染后72小时，用胰酶消化6孔板中的细胞，收集细胞沉淀，用PBS洗2次细胞沉淀后，用1mL PBS重悬细胞沉淀。应用流式细胞仪检测含有绿色荧光蛋白信号的细胞，比较si-Control和si-MSH2两组细胞绿色荧光蛋白表达阳性率，进而明确干扰MSH2后细胞对DSBs修复能力的变化。

(3)稳定干扰MSH2抑制NHEJ修复功能

NHEJ不需要同源链，可对细胞周期中各个时期产生的DSBs进行修复，因而是真核细胞修复DSBs的又一主要途径，为检验干扰MSH2是否会影响NHEJ对DSBs的修复，我们应用报道质粒EJ5-GFP来检测抑制MSH2后细胞NHEJ能力的变化。在质粒EJ5-GFP中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-SceⅠ识别位点，若细胞中表达I-SceⅠ且诱导DSBs，细胞可通过NHEJ途径修复该DSBs，并表达GFP。因而我们在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定转染EJ5-GFP质粒，比较干扰MSH2前后细胞GFP表达比率的变化，从而判断NHEJ修复能力的变化。结果如图7所示，与si-Control相比，si-MSH2组NHEJ修复能力显著下降。表明NHEJ修复过程需要MSH2的参与。

(4)稳定干扰MSH2抑制A-EJ修复功能

A-EJ是一条由PARP1、XRCC1和DNA LIG III共同介导的DSB修复通路，被认为是HR和NHEJ均不进行修复时才会发挥作用的一种DSBs修复途径，因此为了明确稳定干扰MSH2对A-EJ修复通路产生的影响，我们采用EJ2-GFP对A-EJ的修复能力进行评估。该质粒包含了一个N末端被标记的融合GFP，且其N末端和GFP中间隔有一个跟随着终止密码子的I-SceⅠ识别位点，同时在I-SceⅠ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。若I-SceⅠ位点被识别且被切断形成的DSBs被A-EJ修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框，从而表达GFP，并造成35个碱基的缺失。我们利用稳定表达EJ2-GFP报道质粒的HT29MTX耐药细胞评估干扰MSH2后，细胞A-EJ的修复能力。结果如图8所示，si-MSH2组较si-Control组阳性细胞比率明显下降，说明抑制MSH2可降低HT29MTX耐药细胞的A-EJ修复能力。

7.稳定干扰MSH2对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响

(1)为了探究MSH2是否对基因扩增程度产生影响，我们利用Real-time PCR的方法检测了sh-control及sh-MSH2克隆中DHFR基因的扩增情况(如图9所示)，结果发现与对照组相比，sh-MSH2克隆中DHFR基因拷贝数明显降低。为进一步探究稳定干扰MSH2是否影响DHFR的表达，我们通过Western Blot检测对照组及sh-MSH2克隆中DHFR蛋白水平，结果如图10所示，发现稳定干扰MSH2之后DHFR蛋白表达明显降低。Western blot方法同上，DHFR一抗稀释比例为1：1000，Real-time PCR的方法如下：

a细胞DNA的提取

应用QIAmp DNA mini kit并按照说明书进行DNA提取。取生长状态良好的细胞(细胞数量最多不超过5×10⁶个)，PBS冲洗2次，胰酶消化细胞，培养基终止消化，将细胞悬液收集于1.5mL Eppendorf管中，1000转/分离心5分钟，弃上清，PBS清洗细胞沉淀，离心，条件同上，弃上清得细胞沉淀。用弹指法将细胞沉淀弹开，加入200μl PBS混匀，再加入20μL蛋白酶K及200μlLBuffer AL，涡旋混匀。56℃水浴10分钟，瞬时离心，加入200μL无水乙醇，涡旋15秒。之后，8000转/分离心1分钟。将混合物转移至QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟。更换新的2mL收集管，加500μL Buffer AW1，8000转/分离心1分钟。更换新的2mL收集管，加500μL Buffer AW2，14000转/分离心3分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，14000转/分离心1分钟。将离心柱置于1.5mL Eppendorf管上，加入200μL Buffer AE，室温孵育1分钟，8000转/分离心1分钟，其中1.5mL Eppendorf管中收集到的液体即为基因组DNA。利用分光光度计测定所获得的DNA浓度，并统一调至50ng/μL，–20℃保存备用。

b Real-time PCR

20μL Real-time PCR反应体系如下：10μL 480SYBR GreenMaster，7μL ddH2O，0.5μL(0.01nmol/L)上游引物，0.5μL(0.01nmol/L)下游引物，2μL DNA模板(DNA浓度为50ng/μL)。

PCR反应条件为：95℃6分钟，95℃20秒，Tm 20秒，72℃20秒，进行45个循环反应；融解曲线为95℃5秒，65℃1分钟，97℃。

收三次独立重复样本进行试验，利用2^-ΔΔt方法进行计算分析，每个样本中的目的基因结果均用内参基因ACTIN进行归一化处理，然后应用t检验进行统计分析，以对照组中基因的扩增量作为标准，将干扰MAH2的实验组与其进行对比，得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P≤0.05时，具有统计学差异。

(2)为了确定稳定干扰MSH2后DHFR拷贝数的降低是否由DMs和HSR数目改变引起，我们采用FISH技术检测并统计了细胞中含DHFR基因DMs和HSR数目。将所提取的DHFR基因BAC DNA标记Green(绿色)，制备特异性荧光素探针，与sh-control及sh-MSH2克隆中的中期分裂相特异性杂交，在两种细胞中各随机选取100个以上核型，统计含DHFR基因的DMs和HSR数目，结果显示稳定干扰MSH2导致含DHFR基因的DMs和HSR数目明显降低(如图11、表2)。

表2

***P<0.001

FISH检测DHFR扩增程度及形式的方法：

a细胞中期核型标本制备

挑选处于有丝分裂旺盛期的细胞制备染色体标本。向培养于50mL培养瓶中处于生长旺盛期的细胞加入10μL秋水仙胺(10μg/μL)，作用1小时后收获细胞。PBS冲洗，胰酶消化收集细胞，1000转/分钟离心6分钟使细胞沉淀。弃上清，将细胞沉淀弹开成为细胞悬液，加入9mL 37℃预热的KCl低渗液(0.075mol/L)，37℃低渗12分钟后，加入1mL新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)预固定1分钟，1620转/分钟离心7分钟。弃上清，弹开细胞沉淀，10mL固定液，固定1小时后1620转/分钟离心7分钟，弃上清，弹匀，加10mL固定液固定40分钟后1620转/分钟离心7分钟。弃上清，加入2mL新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝2:1)，吹匀细胞。

取预冷的载玻片，将吹匀的细胞悬液滴片。空气中干燥后，镜检，检测是否可做FISH。

b FISH探针制备及探针沉淀

应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，按说明书提供方法提取BAC克隆(RP11-90A9：DHFR)DNA，以所提取的DNA为模板，应用BioPrime DNA Labeling System试剂盒通过随机引物法标记FISH探针。反应体系：先配制总体系5μL的反应液，其中Random Primer占80％，BAC DNA模板浓度为8μg/mL，其余以H₂O补齐。反应液95℃反应10分钟后，立刻置于冰上静置2分钟，之后加入终浓度为0.25mmol/L缺T的dNTP，2％的Klenow和终浓度为125μmol/L的dNTP，37℃水浴3小时，加入10％的终止Buffer。用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。

反应结束后，进行探针沉淀。反应体系为：Labeled BAC DNA 3μL，ssDNA 6μL，Human CotI 6μL，H2O补齐至50μL，醋酸钠(3mol/L)5μL，冷的无水乙醇(-20℃冰箱冷藏)110μL。然后将探针放置-80℃冰箱沉淀20分钟后12000rpm离心10分钟，吸去上清(200μL枪头，勿碰到探针沉淀)，110μL75％冷乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心10分钟，吸去上清，避光干燥5分钟～10分钟。加9μL杂交液，37℃水浴1～2小时，使探针溶解。随后75℃水浴8分钟进行探针变性，立即置冰上2分钟。最后，37℃水浴30分钟进行探针预复性。

c FISH玻片处理流程

用钻石笔将之前滴好的片子标出目标区域(约一个20mm×20mm盖玻片大小)，随后加100μL RNase工作液于目标区域，盖上PE手套(剪成小块)，放在湿盒里，37℃孵育40分钟。孵育结束后，在室温条件下，用2×SSC洗3分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟并用吹风机吹干。每个目标区域加100μL胃蛋白酶工作液，盖上手套，放在湿盒里，37℃孵育15分钟。孵育结束，1×PBS洗5分钟后用1％多聚甲醛处理10分钟，1×PBS洗5分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟，吹风机吹干。将玻片放入预热的70％甲酰胺，75℃水浴3分钟。最后将玻片放入4℃预冷的2×SSC I、2×SSC II中各洗3分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟。

d FISH杂交流程

每个目标区域加9μL探针，盖上盖玻片(20mm×20mm)，rubber cement封片；放入湿盒37℃孵育，隔天收。

隔天，揭去Rubber Cement封片剂，将玻片放入44℃水浴预热的50％甲酰胺中，夹住玻片晃动，使盖玻片脱落，计时15分钟。2×SSC I、2×SSC II各3分钟，75％、85％、100％乙醇脱水各3分钟，吹干。5μL DAPI复染，24×32盖玻片封片。荧光显微镜下观察。

(3)为了进一步明确干扰MSH2对其他扩增基因的影响，我们运用Real-time PCR检测与DHFR共同位于5号染色体同一扩增子上的6个基因MSH3、XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK的扩增水平。实验室前期对耐药细胞aCGH芯片结果显示，RAD1和PLK2在HT29MTX耐药过程中不发生基因扩增，作为阴性对照。MSH3、XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK均随MTX药物浓度升高而扩增增加。在含DMs的耐药细胞中，MSH3与DHFR基因位于同一扩增子内，主要存在于DMs上；在含HSRs的耐药细胞中，MSH3、XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK与DHFR基因共同位于5号染色体同一扩增子上，存在于HSRs上。

结果如图12所示，与sh-control相比，sh-MSH2克隆中，对照基因RAD1和PLK2基因的拷贝数无明显变化，位于DMs上的MSH3明显下降，说明稳定干扰MSH2可以降低与DMs形成相关的基因扩增。位于HSRs上的XRCC4、CAST、CCNH、GLRX和POLK基因的拷贝数也明显下降，说明稳定干扰MSH2可降低与HSR形成相关的基因扩增。Real-time PCR的实验步骤及条件同上。

8.稳定干扰MSH2对微芽/微核形成的影响

为了明确干扰MSH2导致的含DHFR基因的DMs和HSR数目的减少是否是由微芽/微核形成增多引起，我们运用FISH检测sh-control及sh-MSH2克隆中微芽/微核形成情况，随机选取了500个以上的细胞，统计了微芽/微核形成的细胞数，结果如表3所示，稳定干扰MSH2后微芽/微核外排数目明显增多，说明稳定干扰MSH2促进微芽/微核形成。接下来，我们又统计了对照组及sh-MSH2克隆中含DHFR的微芽/微核外排情况，将产生的微芽/微核按有无DHFR信号进行分类：不含有DHFR信号的微芽/微核即MBUD/MN^DHFR-，含有DHFR信号的微芽/微核即MBUD/MN^DHFR+。我们发现稳定干扰MSH2导致含DHFR基因微芽/微核外排明显增加。说明稳定干扰MSH2可以促进细胞中微芽的形成，并且促进含DHFR的DMs的微核外排，提示我们DHFR等DMs和HSR形成相关基因扩增的降低与微芽/微核外排相关。

表3

***:P<0.001

9.稳定干扰MSH2对细胞对MTX敏感性的影响

为了明确稳定干扰MSH2是否会影响MTX耐药结肠癌细胞对MTX的敏感性，我们采用MTS法检测了药物半致死浓度(IC₅₀值)。结果如表4所示，sh-control克隆IC₅₀值为sh-MSH2的2.54倍，即稳定干扰MSH2的表达导致含DMs的HT29耐药细胞对MTX的敏感性升高。MTS法检测了药物半致死浓度方法如下：

取生长状态良好的细胞，胰酶消化制备成单细胞悬液。以5000个/孔的细胞浓度接种于96孔板中。倍比稀释法配制1.0×10^-2mol/L、1.0×10^-3mol/L、1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-8mol/L和1.0×10^-9mol/L浓度的MTX，每个浓度设置6个副孔，将相应药物加入到细胞悬液当中，37℃连续培养72小时。将孔内培养基弃掉，每孔加入100μL新鲜培养基和20Μl MTS混合溶液，37℃孵育4小时。孵育结束后，在酶标仪上测定OD492nm处每孔的吸光度值。根据对照孔(未加入MTX)及加药孔的吸光度值计算MTX对细胞的生长抑制率，进而计算出MTX对细胞的半数抑制浓度，从而分析细胞耐药性的改变情况。

表4

***P<0.001。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> MSH2抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用

<160>1

<170>Patent-In 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>MSH2

<400>1

gcatccaagg agaatgattg g 21

Claims (9)

1.MSH2抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的MSH2抑制剂为在转录水平上抑制MSH2蛋白表达的药物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为含有MSH2 shRNA的干扰载体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的含有MSH2 shRNA的干扰载体为含有MSH2 shRNA的质粒载体。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的MSH2 shRNA的靶序列为SEQ IDNO.1所示。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为含双微体的MTX耐药细胞。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为含双微体的人结肠癌HT29MTX耐药细胞。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物通过抑制DSBs修复，下调DHFR基因扩增，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。