CN104946755A - Brca1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对mtx耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Brca1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对mtx耐药性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明在已建立的MTX耐药细胞进化模型中，选取含DMs的耐药细胞为研究对象，通过确定BRCA1蛋白在HT29含DMs的耐药细胞中的高表达，进一步探讨BRCA1蛋白及其所在通路与含有DHFR耐药基因的双微体稳定存在的关系。本发明利用脂质体转染方法构建了稳定干扰BRCA1的HT29MTX耐药克隆，并利用Western Blot，FISH，Real-time PCR，MTT和免疫荧光等方法，分别检测了干扰BRCA1对细胞耐药性、DHFR基因的扩增程度及扩增形式、DNA双链断裂及双链断裂修复途径、细胞周期及微核外排的影响。从而确定抑制BRCA1蛋白可以促进DMs外排，逆转肿瘤细胞对MTX耐药。

Description

BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用
技术领域
本发明涉及BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。
背景技术
氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是恶性肿瘤治疗中的一个有效的抗代谢药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成、特异性地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但是，由于长时间的用药会导致耐药性的产生，从而严重影响药物的疗效，所以克服MTX耐药是提高其肿瘤治疗疗效的关键。
MTX耐药分为先天耐药和获得性耐药。其中MTX获得性耐药的机制可以概括为以下三类：第一、还原性叶酸载体(Reduced folate carrier,RFC)的缺失或功能缺陷致使MTX的摄入量减少；第二、胞内多聚谷氨酸合成酶(Folylpolyglutamatesynthetase,FPGS)活性下降或表达降低导致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，产生耐药；第三、MTX的靶酶DHFR水平升高导致的耐药，DHFR表达增强通常是由DHFR基因扩增引起的。
基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不稳定性的一种主要形式。基因扩增会形成两种主要的细胞遗传学结构，即染色体外元件双微体(Double minutes,DMs)及染色体上的异常结构均质染色区(Homogeneousstaining regions,HSRs)。1962年，人们首次在结肠癌细胞中发现DMs。DMs是染色体外成对环状，能自主复制的染色小体。DMs没有着丝粒，在细胞分裂中随机分配，正因为如此，DMs随时面临着丢失的风险。但是，DMs本身带有的扩增基因或者与耐药相关的基因能为细胞本身提供生长优势，因此在群体中会出现DMs逐渐增多的现象。人们最早在人神经母细胞瘤细胞系及耐MTX的中国仓鼠细胞系中发现了均质染色区。应用G显带技术发现一段缺乏典型带纹的染色体片段，并称其为均质染色区或异常显带区域。
研究发现，包含DHFR耐药基因的DMs数量减少会逆转细胞对MTX的耐药情况。而目前DMs减少的机制还不十分明确。根据实验室前期结果及相关文献报道，我们推测使DMs数量减少的原因主要有以下两种：第一，DMs转化为HSRs；第二，DMs以微核形式外排。目前研究表明，微核外排具有典型的细胞周期依赖性，主要发生在G0期和M期。因此，细胞周期进程加快可能导致微核外排量增加，进而促进细胞内DMs数量的减少。
基因扩增产生的前提条件是DNA双链断裂(double strands break，DSB)的发生。在此基础上，细胞对于DSB的修复能力异常增加。DSB修复主要存在两种机制，同源重组修复(homologous recombination repair，HR)是其中较为精确的修复机制。因此，HR的异常表达可能会影响肿瘤细胞中基因扩增的程度。
HR的主要参与蛋白包括：PI3K家族成员ATM、剪切酶复合体MRN(MRE11/RAD50/NBS1)、BRCA1、BRCA2、RAD51及其类似物家族、RAD52、RAD54、RecQ解旋酶等。其中，BRCA1是重要的核心分子之一。研究发现，BRCA1不仅可竞争性抑制53BP1，启动HR；它还能与MRN复合体相结合完成DNA末端的剪切；促进RAD51的募集以保证链入侵的顺利进行；此外，它还能够影响细胞周期检查点，是细胞周期的重要调控因子。本研究针对BRCA1进行干扰后发现，细胞内DSB累积急剧增加；研究还发现，干扰BRCA1能够加快细胞周期进程，使含有DHFR扩增基因的微核外排增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转肿瘤细胞的耐药情况，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。
发明内容
针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复发的现象，本发明提供了BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。
本发明中，优选的，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为10-4mol/LMTX的人结肠癌细胞。
本发明的技术方案是构建人结肠癌细胞系HT29MTX耐药的进化模型，检测BRCA1在肿瘤细胞耐药过程中是否发挥作用，然后，将BRCA1shRNA和ControlshRNA分别转入含DMs的耐药细胞中，获得稳定克隆，应用MTT，IC50分析，流式细胞术，Real-time PCR，FISH，Western Blot等技术方法，检测细胞转染前后的生长、耐药、周期、DSB、DSB修复通路功能和扩增基因外排等情况，明确BRCA1是否通过参与同源重组修复及细胞周期调控维持基因扩增，参与细胞耐药。抑制BRCA1后可否外排细胞中的耐药扩增基因，进而逆转肿瘤耐药。
我们通过稳定干扰BRCA1，阻断HR修复途径也同时影响了细胞周期，以探究BRCA1与基因扩增之间的关系。从而为揭示新的治疗靶点、更加有效对抗MTX耐药提供科学的依据。
1.细胞培养构建进化模型
人结肠癌细胞系HT29在含有15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于5％CO2、37℃条件下，用浓度梯度递增的MTX连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT2910-7mol/L MTX，HT2910-6mol/L MTX，HT2910-5mol/L MTX，HT2910-4mol/L MTX。将HT29MTX敏感细胞命名为HT29MTX S。待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药，然后再用其做后续实验。
2.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化
(1)应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞系基因组DNA的提取，应用Real-time PCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因的扩增程度。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX耐药浓度升高而增加。
(2)细胞中期核型标本制备，FISH检测DHFR基因扩增形式的变化
与HT29MTX敏感细胞相比，基因扩增的形式由HSRs逐步转变为以DMs为主的方式，尤其当耐药浓度达到10-4mol/L时，细胞系中出现以DMs为主的基因扩增形式。因此，我们选取HT2910-4mol/L MTX耐药细胞作为含DMs的耐药细胞进行后续研究，并命名为HT29MTX DMs。
3.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化
提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平随着MTX耐药浓度升高而增加。
4.BRCA1表达分析
提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测BRCA1在HT29MTX敏感及含DMs的耐药细胞中的表达变化。与HT29MTX敏感细胞相比，含DMs的耐药细胞中BRCA1过表达。
5.HT29含DMs的MTX耐药细胞稳定干扰BRCA1克隆的建立
确定HT29含DMs的MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的HT29含DMs的MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞3×105个。待细胞长至80％时，进行稳定转染。细胞转染分两组进行：第一组转染质粒BRCA1shRNA；第二组转染质粒Control shRNA。培养24小时后，加入适当浓度的嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。HT29含DMs的耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-BRCA1。
6.检测BRCA1蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
对细胞进行饥饿同步化处理后提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测BRCA1在HT29含DMs的MTX耐药细胞的对照克隆及干扰BRCA1的克隆中的表达情况。经检测，干扰克隆中BRCA1的表达量明显低于对照克隆中的表达量，证明所挑选的克隆为有效克隆。
7.稳定干扰BRCA1对DSB的产生及细胞功能的影响
(1)应用Western Blot检测稳定干扰BRCA1前后细胞中γH2AX的表达量，以确定干扰BRCA1对DSB产生的影响。在HT29含DMs的耐药细胞中，稳定干扰BRCA1后，细胞内γH2AX的表达量明显增加。即干扰BRCA1后细胞内的DSB大量累积，说明细胞中DSB修复通路功能障碍。
(2)MTT法检测干扰BRCA1对细胞耐药性的影响。通过MTT法检测药物半数抑制浓度(IC50)并计算细胞耐药指数，分析干扰BRCA1对耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。与sh-control相比，MTX对sh-BRCA1的IC50降低了2.58倍，即稳定干扰BRCA1的表达导致HT29含DMs的耐药细胞对MTX的药物敏感性升高。
8.稳定干扰BRCA1对DSB修复通路产生的影响
(1)细胞进行同步化处理后，利用western blot法检测HR通路中关键修复因子的表达，确定干扰BRCA1后对HR通路造成的影响。与sh-control相比，sh-BRCA1中MRE11的表达量明显减少，RAD50的表达量未发生明显变化，NBS1的表达量有所增加。而在MRN复合体中，MRE11的主要作用是识别、结合损伤DNA末端，随后募集RAD50和NBS1组成复合体。因此，MRE11的表达减少直接影响MRN复合体的功能。在提取的细胞总蛋白中RAD51的表达量升高，而核蛋白中RAD51的表达量却明显降低，这说明，BRCA1能够通过抑制RAD51入核来抑制其功能，进而影响HR通路的修复。利用免疫荧光方法对RAD51在核内形成灶点情况进行了检测。与sh-control相比，sh-BRCA1中RAD51灶点数明显减少，证明稳定干扰BRCA1能够影响RAD51灶点的形成。由此可见，干扰BRCA1能够严重影响HR通路的功能。
(2)细胞进行同步化处理后，利用western blot法检测NHEJ通路中关键分子的表达情况，确定干扰BRCA1后对NHEJ修复通路造成的影响。与sh-control相比，sh-BRCA1中Ku70、DNA-PKcs、XRCC4和Ligase4的表达量明显升高，证明干扰BRCA1导致NHEJ通路的功能增强。
9.稳定干扰BRCA1对细胞周期的影响
(1)流式细胞术检测同步化处理后的sh-control及sh-BRCA1，反映干扰BRCA1对细胞周期进程的影响。在G1期和S期，sh-BRCA1与sh-control的细胞分布比例无显著差异，而在G2期，sh-BRCA1的细胞分布却明显少于sh-control，因此，干扰BRCA1可导致细胞周期G2期缩短，使细胞周期进程加快。
(2)细胞在无血清培养基中进行同步化处理后，分别在有血清培养基中释放不同时间，并利用western blot检测G2/M期检查点相关蛋白cyclinB，CDK1的表达情况，确定BRCA1对周期检查点功能的影响。在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1后，随释放时间的增加，cyclinB和CDK1的表达量显著增加，表明干扰BRCA1使G2/M期检查点功能缺失，细胞周期由G2期加快进入M期。
10.稳定干扰BRCA1对微核外排的影响
将sh-control和sh-BRCA1进行同步化处理后，取得释放24小时的中期核型标本，FISH检测微核外排DHFR情况，确定干扰BRCA1后细胞是否因细胞G2/M期进程加快而改变微核外排的情况。当sh-control和sh-BRCA1释放24小时后，sh-BRCA1的微核形成数量要显著高于sh-control，而sh-BRCA1外排的含有DHFR基因的微核数量也显著高于sh-control，由此可知，在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，干扰BRCA1可导致细胞M期的微核形成率增加，导致含有DHFR的微核外排量增加。
11.稳定干扰BRCA1对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响
(1)对sh-control和sh-BRCA1进行同步化后，以其DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰BRCA1对DHFR基因扩增程度的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。在sh-BRCA1中，DHFR的基因扩增程度显著降低。
(2)sh-control和sh-BRCA1中期核型标本制备，FISH检测干扰BRCA1对DHFR基因扩增形式的影响，并进一步验证Real-time PCR结果。与sh-control相比，sh-BRCA1含有DHFR的双微体的数目显著降低。
(3)以sh-control和sh-BRCA1的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰BRCA1对5号染色体上与DHFR基因位于同一扩增子上其它基因扩增程度的影响。根据实验室前期aCGH芯片结果可知：MSH3基因同DHFR基因一样，位于DMs和HSRs扩增子上；CCNH、GLRX和CAST等基因位于HSRs扩增子上；RAD1和PLK2基因既不位于DMs也不位于HSRs扩增子上，在细胞耐药过程中不发生扩增，为该实验的阴性对照。Real-time PCR结果显示，与sh-control相比，sh-BRCA1中MSH3基因扩增程度明显降低，而其他基因扩增程度均无明显变化。因此，干扰BRCA1仅影响DMs形式而不影响HSRs形式的基因扩增。
(4)提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测sh-BRCA1及sh-control中DHFR蛋白的表达情况。HT29含DMs的MTX耐药细胞中，与sh-control相比，sh-BRCA1中DHFR蛋白表达水平明显降低。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制HR通路及细胞周期调控关键分子BRCA1，能够降低基因扩增程度、减少细胞内的DMs，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。更重要的是，这种基因扩增去除机制可能适用于多种不同药物引起的以基因扩增为基础的耐药，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点都有非常积极的意义。
附图说明
图1是HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度变化的实时定量PCR柱状图；
图2是HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增形式变化的荧光原位杂交图，其中，A.HT29MTX S，B.HT2910-7mol/L MTX，C.HT2910-6mol/L，D.HT2910-5mol/L MTX，E.HT2910-4mol/L MTX；
图3是HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平变化的WesternBlotting图，其中，A.HT29MTX S，B.HT2910-7mol/L MTX，C.HT2910-6mol/L，D.HT2910-5mol/L MTX，E.HT2910-4mol/L MTX；
图4是BRCA1在HT29MTX敏感及HT29含DMs的MTX耐药细胞中的表达情况的Western Blotting图；
图5是鉴定HT29含DMs的MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的Western Blotting图；
图6是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1导致γH2AX表达增多的Western Blotting图；
图7是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使HR通路功能减弱的Western Blotting图；
图8是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使HR通路关键分子RAD51在细胞核内的表达量减少的免疫荧光图；
图9是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使NHEJ通路功能代偿性增加的Western Blotting图；
图10是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使细胞周期调节因子异常表达的Western Blotting图；
图11是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使细胞内DHFR基因扩增量下降的实时定量PCR柱状图；
图12是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使细胞内DHFR基因扩增量下降的荧光原位杂交图及统计图；
图13是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1对5号染色体同一扩增子内其他基因扩增程度影响的实时定量PCR柱状图；
图14是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCA1使细胞内DHFR表达量下降的Western Blotting图。
具体实施方式
下面通过实验并结合实例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
试验材料：人结肠癌细胞系HT29购自上海细胞库；BAC克隆：RP11-90A9和RP11-91I22。
试验试剂：氨甲蝶呤、DMSO、秋水仙胺、NP-40等试剂均为市售。
试验例1
1.细胞培养
将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT2910-7mol/L MTX，HT2910-6mol/L MTX，HT2910-5mol/L MTX，HT2910-4mol/L MTX。HT29MTX敏感细胞则命名为HT29MTX S。待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验。
用含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养HT29MTX S，用加入相应浓度MTX的培养基培养耐药细胞系。所有细胞均培养在5％CO2、37℃细胞培养箱中。
2.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化
(1)细胞基因组DNA提取
应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞系基因组DNA的提取。将处于对数期生长期的细胞，用胰酶消化收集细胞(细胞数量不超过5×106个)，600转/分钟离心5分钟收集细胞沉淀。PBS冲洗，1000转/分钟离心5分钟。弃上清，然后将细胞沉淀弹开，加入200μL PBS混匀，再加入20μL蛋白酶K及200μL Buffer AL，涡旋15秒混匀。56℃水浴10分钟后瞬时离心，然后加入200μL无水乙醇，涡旋15秒，8000转/分钟离心1分钟。转移混合物至QIAmpmini离心柱中，8000转/分钟离心1分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500μL Buffer AW1，8000转/分钟离心1分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500μL Buffer AW2，14000转/分钟离心3分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，14000转/分钟离心1分钟。将离心柱置于1.5mL Eppendorf管上，加200μL Buffer AE，室温孵育1分钟，8000转/分钟离心1分钟，其中1.5mL Eppendorf管中收集到的液体即为基因组DNA。应用Nature Gene紫外光分光光度计测定所提取DNA的浓度，放入-20℃冰箱储存备用。
(2)应用Real-time PCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因的扩增程度。
20μL PCR反应体系：480SYBR Green Master 10μL，上下游引物各为1μL(即终浓度为50μmol/L)，cDNA模板为2μL(即终浓度为100ng/μL)，ddH2O 7μL。
PCR的反应条件为：95℃6分钟；95℃20s，Tm 20秒，72℃20秒，进行45个循环的反应；融解曲线95℃5秒，65℃，97℃。
每个样本中目的基因的结果均利用内参对照基因β-ACTIN进行归一化处理，然后应用配对t检验统计学方法，将目的基因在HT29MTX敏感及耐药细胞中的结果进行比较，得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P≤0.05时，差异具有显著的统计学意义，用*表示；当P≤0.01时，差异具有极显著的统计学意义，用**表示。
(3)细胞中期核型标本制备
挑选处于有丝分裂旺盛期的HT29各浓度梯度MTX耐药细胞制备染色体标本。向培养于50mL培养瓶中处于生长旺盛期的细胞加入10μL秋水仙胺(10μg/μL)，作用1小时后收获细胞。PBS冲洗，胰酶消化收集细胞，1000转/分钟离心6分钟使细胞沉淀。弃上清，将细胞沉淀弹开成为细胞悬液，加入9mL37℃预热的KCl低渗液(0.075mol/L)，37℃低渗12分钟后，加入1mL新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)预固定1分钟，1620转/分钟离心7分钟。弃上清，弹开细胞沉淀，10mL固定液，固定1小时后1620转/分钟离心7分钟，弃上清，弹匀，加10mL固定液固定40分钟后1620转/分钟离心7分钟。弃上清，加入2mL新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝2:1)，吹匀细胞。
取预冷的载玻片，将吹匀的细胞悬液滴片。空气中干燥后，镜检，检测是否可做FISH。
(4)FISH检测DHFR扩增程度及形式的改变
a.FISH探针制备及探针沉淀
应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，按说明书提供方法提取BAC克隆(RP11-90A9：DHFR；RP11-91I22：5号染色体着丝粒)DNA，以所提取的DNA为模板，应用BioPrime DNA Labeling System试剂盒通过随机引物法标记FISH探针。反应体系：先配制总体系5μL的反应液，其中Random Primer占80％，BAC DNA模板浓度为8μg/mL，其余以H2O补齐。反应液95℃反应10分钟后，立刻置于冰上静置2分钟，之后加入终浓度为0.25mmol/L缺T的dNTP，2％的Klenow和终浓度为125μmol/L的dNTP，37℃水浴3小时，加入10％的终止Buffer。用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
反应结束后，进行探针沉淀。反应体系为：Labeled BAC DNA 3μL，ssDNA 6μL，Human CotI 6μL，H2O补齐至50μL，醋酸钠(3mol/L)5μL，冷的无水乙醇(-20℃冰箱冷藏)110μL。然后将探针放置-80℃冰箱沉淀20分钟后12000rpm离心10分钟，吸去上清(200μL枪头，勿碰到探针沉淀)，110μL75％冷乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心10分钟，吸去上清，避光干燥5分钟～10分钟。加9μL杂交液，37℃水浴1～2小时，使探针溶解。随后75℃水浴8分钟进行探针变性，立即置冰上2分钟。最后，37℃水浴30分钟进行探针预复性。
b.FISH玻片处理流程
用钻石笔将之前滴好的片子标出目标区域(约一个20×20盖玻片大小)，随后加100μL RNase工作液于目标区域，盖上PE手套(剪成小块)，放在湿盒里，37℃孵育40分钟。孵育结束后，在室温条件下，用2×SSC洗3分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟并用吹风机吹干。每个目标区域加100μL胃蛋白酶工作液，盖上手套，放在湿盒里，37℃孵育15分钟。孵育结束，1×PBS洗5分钟后用1％多聚甲醛处理10分钟，1×PBS洗5分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟，吹风机吹干。将玻片放入预热的70％甲酰胺，75℃水浴3分钟。最后将玻片放入4℃预冷的2×SSC I、2×SSC II中各洗3分钟，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟。
c.FISH杂交流程
每个目标区域加9μL探针，盖上盖玻片(20×20)，rubber cement封片；放入湿盒37℃孵育，隔天收。
隔天，揭去Rubber Cement封片剂，将玻片放入44℃水浴预热的50％甲酰胺中，夹住玻片晃动，使盖玻片脱落，计时15分钟。2×SSC I、2×SSC II各3分钟，75％、85％、100％乙醇脱水各3分钟，吹干。5μL DAPI复染，24×32盖玻片封片。荧光显微镜下观察。
在应用Real-time PCR及FISH技术对HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式检测时，发现与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX耐药浓度升高而增加(图1)、基因扩增的形式由HSRs逐步转变为以DMs为主的方式。其中，当MTX耐药浓度达到10-4mol/L时，细胞内开始出现以DMs为主的扩增形式(图2)。
3.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化
提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29MTX敏感及各浓度梯度MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化。
a.细胞总蛋白的提取
将细胞用预冷的PBS冲洗3次，以去除细胞表面附着的蛋白成份。将细胞培养瓶放在冰上，吸净残余的PBS。加入适量的细胞裂解液(蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂:RIPA buffer的体积比为1:1:10)，用细胞刮刮下细胞并收集于1.5mL Eppendorf管中，冰上静置，每10分钟涡旋1次，涡旋3次后，4℃、12000转/分钟离心40分钟，取上清，应用Nature Gene紫外分光光度计测定所提取细胞总蛋白浓度并分装，-80℃保存备用。
b.SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质
应用30％的凝胶储备液(甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺＝1：29)制备浓度分别为10％和5％的SDS-聚丙烯酰胺分离胶及积层胶(表1)。
表1 聚丙烯酰胺凝胶成分
取等量蛋白样品，加入5×loading buffer、RIPA buffer将体系调平、混匀，加热煮沸5～10分钟进行变性后，立即放在冰上，待完全冷却后，瞬时离心后上样。
先以80伏特电压电泳至分离胶中出现蛋白质marker的第一条带后，再以110伏特电压电泳至与待测蛋白分子量相近的蛋白质marker条带达到分离胶中1/3处。
c.转膜
剪取1张与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于甲醇中30秒后备用。同时，将凝胶转移用滤纸、纤维垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按如下顺序组装转移装置：阳极→纤维垫→3张3M滤纸→PVDF膜→凝胶→3张3M滤纸→纤维垫→阴极，确定排出气泡后封闭转移装置，放入转移槽中并在槽中放置冰盒降温，以300毫安室温转移1～2小时。
d.免疫反应
转膜结束后，取出PVDF膜并作标记，放入TBS-T洗涤10分钟，然后放入适量TBS-T溶解的5％脱脂奶粉中，室温封闭1小时。
将封闭好的PVDF膜，加入稀释的一抗(DHFR，1:1000。GAPDH，1:10000)4℃震荡过夜。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10分钟，然后加入以1:10000比例稀释的二抗，室温下避光杂交1小时。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10分钟。最后用Odyssey Infrared Imaging System扫膜，获取图像。
结果显示，与HT29MTX S相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平随着MTX耐药浓度升高而增加(图3)。
综上所述，我们选取具有双微体扩增结构并且DHFR高表达的HT2910-4mol/LMTX耐药细胞系作为后续研究对象，并命名为HT29MTX DMs。
4.BRCA1蛋白的表达分析
应用Western Blotting方法检测BRCA1蛋白在HT29MTX S及HT29MTXDMs中的表达变化。
由于BRCA1为周期相关蛋白，在细胞周期各个时相的表达量有所差异，因此在提取细胞之前，先用无血清培养基培养24小时，对细胞进行同步化处理，使95％以上的细胞处于G1/G0期后，提取细胞总蛋白、Western Blotting具体实验步骤同前。一抗稀释比例(BRCA1，1:50；GAPDH，1:10000)。
与HT29MTX S相比，HT29MTX DMs中BRCA1过表达(图4)。
5.稳定干扰BRCA1的HT29含DMs的MTX克隆的建立
a.细胞转染分组
细胞转染分两组进行：第一组转染质粒CSHCTR001(购自复能公司)，用于转染对照组；第二组转染质粒HSH017715-CU6(购自复能公司)，用于转染BRCA1干扰克隆组。
b.确定HT29含DMs的MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性
取状态良好的HT29含DMs的MTX耐药细胞，制备成单细胞悬液，计数种板，六孔板每孔种3×105个细胞，种六个孔。第二天，待细胞贴壁后，换新鲜培养基，每孔加入终浓度分别为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL的嘌呤霉素，连续培养7天，观察到，嘌呤霉素浓度为0.6μg/mL时HT2910-4mol/L MTX耐药细胞恰好全部死亡，故选此浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。
c.稳定转染
将处于对数生长期的HT29含DMs的MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞3×105个。待细胞长至70％～80％时，进行转染。第一步配制溶液①：10μL Lipo2000加入到240μL Opti-MEM培养基中，室温静置15分钟。第二步配制溶液②:8μL(4ng)质粒加入到242μL Opti-MEM培养基中。第三步将溶液②加入到溶液①中，缓缓混匀，室温放置20分钟。同时，将6孔板中的细胞用Opti-MEM培养基清洗两遍，再加入1.5mLOpti-MEM培养基。最后将混合液逐滴加入细胞中，培养在37℃，5％CO2培养箱中。培养5～6h后，更换含血清的DMEM高糖培养基。
d.转染细胞及克隆筛选
培养24小时后，加入嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。
当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。将HT29含DMs的MTX耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-BRCA1。
6.检测BRCA1蛋白表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
将细胞进行同步化处理后提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测BRCA1在sh-control及sh-BRCA1中的表达情况。同步化方法和Western Blotting具体实验条件及步骤同前。
HT29含DMs的MTX耐药细胞的BRCA1干扰效果如图5所示，干扰克隆中BRCA1的表达量明显低于对照组，证明所挑选的克隆为有效克隆。
7.稳定干扰BRCA1对DSBs的产生及细胞功能的影响
(1)应用Western Blot检测γH2AX在稳定干扰BRCA1的克隆组及对照组中的表达量，以确定干扰BRCA1对DSBs的产生的影响
取生长旺盛的稳定干扰BRCA1的克隆细胞及对照组细胞，并提取总蛋白。依据前述方法进行Western Blot，以检测γH2AX的表达量。抗体稀释比例1:1000。
在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，稳定干扰BRCA1后，细胞内γH2AX的表达量明显增加(图6)。即干扰BRCA1后细胞内的DSB大量累积，说明细胞中DSB修复通路功能障碍。
(2)MTT法检测干扰BRCA1对细胞耐药性的影响
通过MTT法检测药物半致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰BRCA1对MTX耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。
收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔约4500个细胞的密度接种到96孔板，并加浓度梯度连续的MTX。培养96小时后读数，吸出培养基，小心用PBS冲洗一遍后每孔加入100μL新鲜培养基，并加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时后终止培养。小心吸出孔内培养液，每孔加150μL DMSO，将96孔板置于摇床上低速摇10分钟以上直至沉淀完全溶解。在酶标仪OD 492nm处测量各孔吸光值。
计算每个浓度吸光值的平均值。
根据对照孔(未加药)计算MTX对细胞的生长抑制率，根据各个浓度对细胞的生长抑制率计算得出MTX对细胞的药物半致死浓度。
在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，与sh-control相比，MTX对sh-BRCA1的IC50值降低了2.58倍，即降低BRCA1的表达导致HT29含DMs的MTX耐药细胞对MTX的药物敏感性升高(表2)。
表2 HT29含DMs的MTX耐药细胞对照及稳定干扰BRCA1克隆对MTX的IC50值
8.稳定干扰BRCA1对DSB修复通路产生的影响
(1)利用western blot法和免疫荧光法检测HR通路中关键修复因子的表达，以确定干扰BRCA1后对HR通路造成的影响。
细胞进行同步化处理后，于有血清培养基中释放20小时，提取总蛋白进行western blot，以检测HR通路关键因子MRE11，RAD50和NBS 1的表达量。抗体稀释比例如下：MRE11，1:100；RAD50，1:200；NBS 1，1:1000；GAPDH，1:10000。
与sh-control相比，sh-BRCA1中MRE11的表达量明显减少，RAD50的表达量未发生明显变化，而NBS1的表达量有所增加(图7)。有文献报道，由MRE11、NBS1和RAD50组成的MRN复合体具有对DNA损伤双链的剪切功能，MRE11在复合体中起着最为主要的附着DNA的作用。当其表达降低时，会导致MRN复合体因无法附着DNA而失去功能。由此可见，干扰BRCA1会严重影响MRN复合体的功能。
细胞进行同步化处理后，于有血清培养基中释放20小时后，分别提取总蛋白与核蛋白。提取核蛋白具体方法是，收取5×105个生长良好的细胞沉淀，用PBS缓冲液重悬并以1000转/分钟离心后，弃去上清。加入400μL试剂盒的缓冲液A将细胞重悬，置于冰上15分钟。加入25μL 10％的NP-40剧烈震荡15秒，并以13000转/分钟离心1分钟。吸取上清，加入50μL的缓冲液C。冰上静置30分钟后剧烈震荡15秒。再以12000转/分钟4℃离心10分钟后，提取上清，即为核蛋白。利用western blot检测HR通路标志性功能单位RAD51的总蛋白及核内蛋白表达情况。抗体稀释比例如下：RAD51，1：50；GAPDH，1:10000。
与sh-control相比，sh-BRCA1中RAD51的总蛋白表达量升高，而核蛋白表达量却明显降低(图7)。这说明，BRCA1能够影响RAD51入核，进而影响其在HR通路中发挥作用。
将105个细胞接种于铺好盖玻片的六孔板中，待其贴壁后，换成无血清培养基同步化培养24小时。利用免疫荧光方法检测RAD51灶点数目情况。
与sh-control相比，sh-BRCA1中RAD51灶点数明显减少(图8)，证明干扰BRCA1能够影响RAD51灶点的形成。
由此可见，干扰BRCA1能够严重影响HR通路的功能。
(2)利用western blot法检测NHEJ通路中关键分子的表达情况，以确定干扰BRCA1后对NHEJ修复通路造成的影响。
对细胞进行饥饿处理同步化之后，于有血清培养基中释放20小时，使细胞进入S/G2期发挥作用。提取细胞总蛋白。利用western blot法对NHEJ通路的关键分子Ku70，Ku86，DNA-PKcs，XRCC4和Ligase4的蛋白表达情况进行分析(抗体稀释浓度分别为：Ku70，1:1000；Ku86，1:100；DNA-PKcs，1:100；XRCC4，1:100；Ligase4，1:100；GAPDH，1:10000)。
与sh-control相比，sh-BRCA1中Ku70、DNA-PKcs、XRCC4和Ligase4的表达量明显升高(图9)，证明干扰BRCA1可以使NHEJ通路的功能增强。
9.干扰BRCA1对细胞周期的影响
(1)流式细胞仪检测同步化处理后的sh-control和sh-BRCA1，以反映干扰BRCA1对细胞周期进程的影响。
细胞饥饿处理24小时后，在有血清培养基中释放24小时。收集约107个细胞，用PBS缓冲液清洗两次后，将75％预冷的乙醇震荡悬滴加入离心管中。用FACS和PI对细胞进行染色后，于37℃孵育30分钟。过滤细胞，上流式细胞仪检测细胞在细胞周期每一时相所占比例。
从四次平行试验得到的数据可知，在G1期和S期，干扰克隆组细胞的分布与对照组相比均无差异，而在G2期，干扰克隆组细胞的分布却明显少于对照组，如表3所示。利用Χ2检验进行统计，P<0.001，具有显著的统计学意义，用***表示。因此，干扰BRCA1可导致细胞周期内G2期的分布降低，使细胞周期进程加快。
表3 HT29含DMs的MTX耐药细胞对照及稳定干扰克隆的周期分布
(2)利用western blot检测细胞周期G2/M期检查点相关蛋白的表达情况，以确定BRCA1对细胞周期检查点功能的影响。
细胞同步化处理后，分别释放不同时间提取总蛋白，利用western blot方法检测细胞周期G2/M期检查点相关蛋白cyclinB，CDK1等的表达情况。抗体稀释比例：cyclinB，1:100；CDK1，1:100；GAPDH，1:10000。
实验发现，随着释放时间的增加，与sh-control相比，sh-BRCA1中cyclinB和CDK1的表达量显著增加，如图10所示。文献报道，细胞周期G2/M期检查点主要由cyclinB、CDK1调控，当二者表达量增加并相互结合后，可抑制G2/M期检查点功能，从而促进细胞由G2期进入M期。因此，干扰BRCA1可抑制G2/M期检查点功能，从而使细胞进程加快。
10.干扰BRCA1对微核外排的影响
文献报道，微核外排扩增基因具有明显的细胞周期依赖性，且主要发生在M期。因此，周期进程的加快可能会影响细胞的微核外排。我们将HT29含DMs的MTX耐药细胞干扰BRCA1克隆及对照克隆微核形成及微核外排DHFR基因的情况进行统计，以确定干扰BRCA1所引起的细胞周期进程加快是否会影响细胞的微核外排。。
对细胞进行24小时饥饿同步化处理后，取得释放24小时的中期核型标本，将RP11-90A9BCA探针标记上GFP后，利用FISH方法检测500个细胞中有微核形成的细胞数以及微核外排DHFR基因的细胞数。利用Χ2检验进行统计学分析。
在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，释放24小时后，sh-BRCA1的微核形成率显著高于sh-control，如表4所示，P<0.05，具有统计学意义，用*表示。而sh-BRCA1中含有DHFR基因的微核外排率也显著高于sh-control，如表5所示，P<0.05，具有统计学意义，用*表示。由此可知，在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，干扰BRCA1可导致细胞M期的微核外排量增加，也可导致含有DHFR的微核外排量增加。这可能是干扰BRCA1后导致DHFR扩增数目降低的主要原因。
表4 HT29含DMs的耐药细胞对照及稳定干扰克隆部分进入M期后的微核形成情况
*P<0.05
表5 HT29含DMs的耐药细胞细胞对照及稳定干扰克隆部分进入M期后的含有DHFR的微核外排情况
*P<0.05
11.干扰BRCA1对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响
(1)对sh-BRCA1和sh-control进行同步化后，以其DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰BRCA1对DHFR基因扩增程度的影响，β-ACTIN作为内参对照基因。
收集105个生长良好的细胞，提取DNA，作为反应模板，设计DHFR基因对应引物，并按照之前所述步骤进行Real-time PCR。
结果如图11所示，在HT29含DMs的MTX耐药细胞干扰BRCA1克隆中，DHFR的基因扩增程度显著降低。
(2)sh-BRCA1和sh-control的中期核型标本制备，FISH检测干扰BRCA1对DHFR基因扩增形式的影响，并进一步验证Real-time PCR的结果。
对细胞收取中期核型，并将RP11-90A9BCA标记绿色荧光，按之前所述步骤处理玻片，并进行探针杂交。隔天收片，利用DAPI复染后于镜下观察并统计约50个核型的双微体数量，并进行t检验。
如图12所示，在sh-BRCA1中，含有DHFR的双微体的数目显著降低。
(3)以sh-BRCA1和sh-control的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰BRCA1对5号染色体同一扩增子上其它基因扩增程度的影响。
在前期的研究中发现，MSH3、CCNH、CAST、GLRX几个基因与DHFR位于5号染色体同一扩增子中：MSH3、CCNH、CAST、GLRX和DHFR共同位于5号染色体的HSR扩增子上；其中，MSH3与DHFR还共同位于5号染色体的DMs扩增子上；而RAD1、PLK2基因不随MTX药物浓度的升高而扩增，作为本实验的阴性对照。本研究显示，干扰BRCA1后DHFR基因拷贝数降低，那么干扰BRCA1是仅影响了DHFR基因的拷贝数还是对同一扩增子上其他基因拷贝数也产生影响？对此我们选取了以上几个基因进行了Real-time PCR检测。Real-time PCR结果如图13所示，与sh-control相比，sh-BRCA1中MSH3基因扩增程度明显降低。此结果与前面DHFR基因扩增程度变化的结果一致，证明了干扰BRCA1的表达可导致HT29含DMs的MTX耐药细胞内，DMs形式的基因扩增程度降低。
(4)提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测sh-BRCA1和sh-control中DHFR蛋白的表达情况。
与sh-control相比，sh-BRCA1中DHFR蛋白表达水平明显降低(图14)。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物是通过下调DHFR基因扩增而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为10-4mol/LMTX的人结肠癌细胞。
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