CN103205400B - 含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒及其应用 - Google Patents

含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒及其应用，本发明经试验证明USP39在乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织，免疫组织化学检测证实乳腺癌肿瘤组织中USP39蛋白比癌旁组织表达明显升高；在乳腺癌细胞系中设计siRNA干扰USP39的表达，发现USP39下调后乳腺癌细胞的增殖被显著抑制，细胞凋亡比例明显增高，G1期的细胞比例增多，S期细胞比例减少，细胞的克隆形成能力显著降低，本发明经试验证明USP39在促进乳腺癌发生发展中具有重要作用。为利用含有USP39-shRNA的慢病毒制备防治乳腺癌的药物提供了理论与实验依据。

Description

含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA重组慢病毒及其应用。
背景技术
泛素特异性蛋白酶家族(ubiquitin-specific proteases,USPs)是去泛素化酶家族的主要成员，可以识别泛素和底物的特异性序列，破坏底物蛋白与泛素链之间的链接，起到去泛素化的作用。去泛素化酶参与了细胞周期进程的调控、细胞信号转导的调节，影响生物体的生长发育等。越来越多的研究发现USP家族的异常表达与多种病理变化密切相关，如各类肿瘤的发生。虽然目前在人类基因组中已发现USP家族有60多个成员，但目前绝大多数USP的作用及机制还不甚明了。
人泛素特异性蛋白酶39（USP39）基因位于染色体2p11.2，迄今为止对USP39的研究还很少，有限的研究揭示了其在以下三个方面的作用：（1）RNA剪切：1999年，Lygerou Z等在酵母中进行筛选，发现USP39的同源蛋白sad1在RNA剪切中具有重要作用，之后Makarova OV等在人HeLa细胞中发现USP39参与介导成熟的RNA剪切小体的形成，最近的研究显示在斑马鱼中USP39突变导致细胞周期调控因子rb1mRNA剪切异常；（2）维持纺锤体监测点的功能：纺锤体监测点是保证细胞有丝分裂过程中姊妹染色体正常分离的关键机制，RNA干扰USP39引起纺锤体监测点功能异常，然而其作用机制尚未阐明；（3）调节其他去泛素化酶的活性：USP39由于其催化区的三个重要活性位点易变，其在体内的去泛素化酶活性还有待于研究证实；然而其可以通过与USP4的Ubl结构域结合，解除Ubl对USP4自身催化活性的抑制，而激活USP4的去泛素化酶活性。
通过对这些已有研究的分析发现USP39的功能还远未阐明，其如何参与乳腺癌的发生发展迄今为止还未有人研究过。
发明内容
本发明提供了含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA重组慢病毒及其应用，本发明具体利用基因表达谱芯片分析去泛素化酶USP39在乳腺癌组织中的高表达，并经免疫组织化学验证，进一步的细胞学实验结果表明USP39RNA干扰后癌细胞的生物学活性受到明显抑制，这表明USP39在乳腺癌发生发展中起重要作用，所述USP39-shRNA重组慢病毒可以用于制备防治乳腺癌的药物。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒，所述shRNA中含有干扰USP39表达的siRNA序列，所述siRNA序列为：ACCAAGTTGCCTCCATATCTA。
对上述技术方案的进一步改进：所述重组慢病毒为LV-USP39-shRNA，它由含有骨架质粒pGCSIL-USP39-shRNA的包装系统在293T细胞中包装获得。
对上述技术方案的进一步改进：所述骨架质粒pGCSIL-USP39-shRNA的USP39-shRNA双链序列如下：
USP39-1:5’-CcggACCAAGTTGCCTCCATATCTATTCAAGAGATAGATATGGAGGCAACTTGGTTTTTTg-3’；
USP39-2:5’-aattcaaaaaACCAAGTTGCCTCCATATCTATCTCTTGAATAGATATGGAGGCAACTTGGT-3’。
对上述技术方案的进一步改进：所述骨架质粒为pLenti-GFP或pLVshRNA-GFP。
本发明还提供了所述的含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒在制备防治乳腺癌药物中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述重组慢病毒的滴度为5.0×106-1.0×108TU/mL。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
本发明在临床资料齐全、病理特征清晰的乳腺癌组织样本库的基础上，通过对临床病理资料的详细分析，结合乳腺癌组织的基因表达谱芯片检测，通过半定量RT-PCR试验发现USP39mRNA在乳腺癌细胞和乳腺癌组织样本中均高表达，通过免疫组织化学检测证实在蛋白水平上乳腺癌肿瘤组织中USP39蛋白比癌旁组织表达明显升高。
本发明从组织标本到细胞学水平上经过各种实验详细验证后，结合实验结果可以明确USP39在乳腺癌发生发展中具有重要作用。为进一步验证USP39在乳腺癌发生发展中的具体作用，本发明在乳腺癌细胞系MCF-7细胞中RNA干扰USP39的表达，通过构建USP39-shRNA慢病毒干扰载体pGCSIL-USP39-shRNA，包装成慢病毒LV-USP39-shRNA，所述重组慢病毒LV-USP39-shRNA对MCF-7细胞的靶基因的干扰作用以下实验证实：通过收集重组及对照慢病毒感染后的MCF-7细胞，提取细胞中的总RNA及总蛋白，通过荧光定量PCR（Q-PCR）检测细胞中目的基因USP39的表达，采用Western blot检测USP39蛋白的表达；发现USP39-shRNA实验组细胞USP39在mRNA水平及蛋白水平均显著降低了，设计的shRNA靶点对USP39有显著的敲减作用。
所述重组慢病毒LV-USP39-shRNA对MCF-7细胞生物学活性的影响是通过高内涵筛选系统连续5天观测荧光细胞数，研究重组病毒感染后对细胞增殖能力的影响，结果显示USP39敲减后乳腺癌细胞株MCF-7增殖抑制90%以上，乳腺癌细胞的增殖被显著抑制；通过碘化丙啶染色，流式细胞仪检测重组病毒感染后各组细胞细胞周期进程的改变；通过Annexin V染色，流式细胞仪检测重组病毒感染后细胞凋亡的改变，细胞凋亡比例明显增高，细胞周期G1期的细胞比例增多，S期细胞比例减少；通过细胞克隆形成能力实验检测重组病毒感染后细胞克隆形成能力的改变，细胞的克隆形成能力显著降低。通过上述实验结果证明USP39具有促进乳腺癌发生发展的重要作用。本发明的含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA重组慢病毒可以用于制备防治乳腺癌的药物，用于治疗乳腺癌。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表示Q-PCR检测不同乳腺癌细胞株中USP39的表达。
图2表示免疫组化检测乳腺癌组织及癌旁组织中USP39的表达。
图3表示shRNA工具对USP39敲减效率的Western blot检测。
图4表示慢病毒介导的RNA干扰病毒感染效率检测。
图5表示shRNA工具对USP39敲减效率的Q-PCR检测。
图6A表示感染病毒的细胞Cellomics高内涵筛选系统荧光显微镜下的成像。
图6B表示感染病毒的细胞生长曲线图。
图7表示USP39敲减后MCF-7细胞周期的改变。
图8表示USP39敲减上调MCF-7细胞凋亡比例。
图9表示USP39敲减抑制MCF-7细胞克隆形成能力。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明所用RNA提取、逆转录及荧光定量试剂购自宝生物工程（大连）有限公司、抗体购自Abcom公司，各种细胞株购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)和中科院上海细胞库（http://www.cellbank.org.cn/mulu.asp），各种限制性内切酶购自NEB公司，所用质粒及基因芯片购自上海吉凯生物技术公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司，Plus-20离心超滤装置购自Millipore公司，各种生化试剂购自sigma公司，琼脂糖购买于HydraGene公司，Alexa Fluor488annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit、lipofectamine2000购自invitrogen公司，ECL发光底物检测试剂盒购自millipore公司，DAB显示试剂盒购自北京中杉公司。
本发明通过以下具体实验步骤证明USP39在乳腺癌发生发展中具有重要作用：
1．在mRNA水平上检测USP39在多个乳腺癌细胞株中的表达
(1)生长状态良好的SK-BR-3、MCF-7、T-47D、HCC1937和MDA-MB-231肿瘤细胞株在6-well培养板于37℃、5%CO2培养箱常规传代培养。
(2)根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书抽提细胞总RNA，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
(3)根据TaKaRa公司的RT操作说明书把提取的总RNA逆转录获得cDNA。
(4)半定量RT-PCR检测PCR目的基因的mRNA水平表达情况，确认目的基因在肿瘤细胞中是否有表达。
根据GenBank公布的GAPDH和USP39序列（USP39的Genbank登录号为：NM_006590），采用软件Beacon designer2设计其上下游基因序列如下：
GAPDH-F：TGACTTCAACAGCGACACCCA；
GAPDH-R：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA；
USP39-F：TTTTCCTCAACCTCCACA；
USP39-R：ATTCAGTCCCACAATACCC。
PCR程序为：预变性95℃，3min；之后每一步变性95℃，15S；退火60℃，30S，延伸72℃，30S；GAPDH，22个循环，USP39，29个循环。
(5)PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察样品电泳结果，对胶图进行拍照分析，电泳图谱如图1所示。通过半定量RT-PCR检测发现SK-BR-3、MCF-7、T-47D、HCC1937和MDA-MB-231等多株乳腺癌细胞中存在目的基因USP39的表达。
通过提取乳腺肿瘤组织及其配对的乳腺正常组织中的总RNA，逆转录成cDNA，应用基因表达谱芯片检测基因的差异表达，将获得的高通量的基因信息结合文献检索和生物信息数据库进行聚类分析，初步认为USP39是在乳腺肿瘤进程中表达改变的重要基因。
2．在蛋白水平上检测USP39在乳腺肿瘤组织及其配对的乳腺正常组织中的表达
(1)将新鲜乳腺肿瘤组织及乳腺正常组织在福尔马林中固定24h。
(2)脱蜡、水化，PBS洗涤2-3次各5min。
(3)3%H2O2处理10min，PBS洗涤3次各5min。
(4)高压热修复抗原，PBS洗涤2-3次各5min。正常山羊血清室温封闭液20min，去多余液体。
(5)加Ⅰ抗50μl（1：50稀释），4℃过夜。在37℃复温45min后PBS洗涤3次各5min。
(6)加Ⅱ抗50μl（1：1000稀释），37℃1h。PBS洗涤3次各5min。
(7)DAB显色5-10min，PBS洗涤10min，苏木素复染2min，盐酸酒精分化，自来水冲洗15min。
(8)脱水、透明、封片，显微镜下观察，拍照。
上述将乳腺癌组织及其配对的乳腺正常组织经石蜡包埋、切片，常规脱蜡、水化，抗原修复、抗体孵育，以DAB显色，HE复染，显微镜下镜检、拍照。实验结果如图2所示，图2结果显示发现USP39主要在核内表达，并且通过免疫组织化学检测发现USP39在乳腺癌癌组织中相比较癌旁正常乳腺组织表达显著上调。
3、构建USP39-shRNA慢病毒干扰载体
根据USP39基因序列利用设计软件进行评估确定USP39的siRNA序列为：ACCAAGTTGCCTCCATATCTA，构建靶向USP39的重组慢病毒shRNA干扰载体pGCSIL-USP39-shRNA。
根据病毒载体pGCSIL-GFP的构建框架设计合成USP39shRNA双链序列如下：
USP39-1:
5’-CcggACCAAGTTGCCTCCATATCTATTCAAGAGATAGATATGGAGGCAACTTGGTTTTTTg-3’
USP39-2:
5’-aattcaaaaaACCAAGTTGCCTCCATATCTATCTCTTGAATAGATATGGAGGCAACTTGGT-3’。
把合成的上述引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温。
Age I和EcoR I酶切pGCSIL-GFP载体（购于吉凯基因公司）以使其线性化。
退火后的双链与线性化的载体于16℃下连接过夜。
按照分子克隆实验指南第二版55-56页要求转化感受态大肠杆菌DH5α。
挑选阳性克隆按照1.4方法进行PCR鉴定，挑选阳性克隆为pGCSIL-USP39-shRNA。
4．Western Blot外源验证靶点有效性实验
(1)转染前1天将生长良好的293T细胞按5×104/ml接种于24孔板中。
(2)根据Invitrogen公司的Lipofectamine2000使用说明把重组慢病毒质粒转染293T细胞，转染后48h收集细胞。
(3)BCA Protein Assay Kit提取细胞总蛋白并定量。
(4)常规SDS-PAGE电泳。
(5)电泳结束后，在4℃，300mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上，ECL发光显色。
实验结果如图3所示。图3结果显示设计的靶向USP39的shRNA对USP39目的蛋白的表达有显著的敲减作用。
5．重组慢病毒LV-USP39-shRNA的包装
重组慢病毒的包装按照吉凯生物慢病毒包装手册进行，主要步骤如下：
(1)大量提取质粒pGCSIL-USP39-shRNA及病毒包装质粒Helper1.0和Helper2.0（购于吉凯基因公司）。
(2)培养293T细胞，并接种于15cm培养皿中，24h后细胞密度达75%左右时用于转染。
(3)转染前2h无血清培养基换液，按照Lipofectamin2000转染说明进行转染。
(4)转染8h后换液正常培养。
(5)收集转染后48h的293T细胞上清液，4℃，4000g离心10min去除细胞碎片。
(6)上清液过0.45μm滤器过滤。病毒粗提物经离心超滤装置浓缩。
(7)收获的病毒经10倍梯度稀释，感染96孔板中的293T细胞，测定病毒的滴度。
将重组慢病毒质粒与其辅助包装质粒共转染至包装细胞293T中，成功包装出高滴度的重组慢病毒LV-USP39-shRNA（Lentiviral vector，LV）。收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并测定其病毒滴度为1.7x107TU/mL。所述重组慢病毒载体是pGCSIL-GFP（购于吉凯基因公司），也可使用pLenti-GFP或pLVshRNA-GFP等慢病毒载体，只是所用的病毒包装系统不同。
6．重组慢病毒对乳腺癌细胞MCF-7的感染效率
(1)对数生长期的MCF-7细胞5×104接种6孔板，使24h后细胞融合达30%。
(2)各孔内加入适宜量的病毒（感染复数MOI为20），24h后更换成正常培养液。
(3)感染3d后荧光显微镜下观察报告基因（绿色荧光蛋白GFP）的表达，感染5d后收集细胞用于后续检测。
实验结果如图4所示。感染3d后，在相差显微镜明视野下及荧光下随机选取5个视野计算阳性细胞数（荧光细胞数/明视野下细胞数），可见对照和重组慢病毒对乳腺癌细胞MCF-7的感染效率可高达95%以上。
7．荧光定量PCR（Q-PCR）检测干扰效率：
(1)提取慢病毒感染5d后收集细胞的总RNA，逆转录成cDNA，方法见1.2-1.3。
(2)按照TaKaRa公司的SYBR green荧光定量试剂盒操作说明进行Q-PCR。
(3)反应程序为：预变性95℃，15s；然后95℃，5s变性，60℃，30s退火，45个循环，在延伸阶段读取吸光值；溶解曲线程序95℃变性1min,冷却至55℃，从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s并读取吸光值。
(4)记录反应结束后各反应孔的CT值，按照2-ΔΔCt方法分析统计结果。，结果如图5所示。
图5表明LV-USP39-shRNA重组慢病毒感染MCF-7细胞后，通过Q-PCR检测发现细胞内USP39目的基因mRNA水平显著降低了，证明本发明所述USP39基因操作工具有效且高效，可对USP39有显著的敲减作用。
8．Cellomics高内涵筛选系统细胞计数检测细胞生长：
感染病毒的细胞通常带有绿色荧光，Cellomics仪器可以读取带荧光的细胞并拍照，计算出孔板中不同组别含有的细胞数目。连续检测5d后，可以绘制出细胞生长曲线图。
(1)阴性对照慢病毒及USP39-shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后的细胞经胰酶消化后，将细胞悬液接种于96孔板，每孔2×103个细胞，设3-5个复孔。
(2)从第二天开始，每天用Cellomics高内涵筛选系统检测读板一次，连续检测5d（图6A）。
(3)用软件准确计算各孔中带绿色荧光的细胞的数量。
(4)对数据进行统计绘图（图6B）。
实验结果如图6A和图6B所示，用高内涵筛选系统连续检测5天，并用软件计算荧光细胞数，统计发现USP39-shRNA实验组细胞增殖能力显著下降，USP39敲减后可明显抑制MCF-7细胞增殖。
9．碘化丙啶（PI）染色检测细胞周期：
(1)阴性对照慢病毒及USP39-shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后，接种6cm小皿，待细胞生长约80%融合时，胰酶消化，收集细胞。每组设3个复孔。
(2)1200rpm离心5min，弃去上清。
(3)4℃预冷的PBS（PH=7.2-7.4）洗涤细胞沉淀，1500rpm离心5min，收集细胞。
(4)4℃预冷的70%乙醇固定细胞至少1h。1500rpm离心5min，弃固定液。
(5)PBS洗涤细胞沉淀，加入PI染液（PI为0.05mg/ml，RNase为0.1mg/ml）1.5ml重悬细胞，将培养板常温避光反应15min。
(6)经300目筛网过滤后于流式细胞仪检测。（图7）
实验结果如图7所示，碘化丙啶染色后经流式细胞仪检测发现，相对于对照病毒感染的细胞，USP39-shRNA实验组细胞中处于G1期的细胞显著减少，处于S期和G2/M期的细胞显著增多。
10．Annexin V单染法流式细胞仪检测细胞凋亡：
(1)同9(1)-9(3)。
(2)1×binding buffer洗涤细胞沉淀，1500rpm离心5min，收集细胞。
(3)1ml1×staining buffer重悬细胞沉淀。
(4)取细胞悬液100μl（1×105-1×106细胞），加入5μl annexin V染色，室温避光15min，转移至流式上机管中，流式细胞仪上机检测。
实验结果如图8所示，annexin V染色后经流式细胞仪检测发现，相对于对照病毒感染的细胞，USP39-shRNA实验组细胞凋亡比例显著提高。
11．细胞克隆形成检测：
(1)阴性对照慢病毒及USP39-shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后，接种12孔板，每孔400个细胞。每组设3个复孔。
(2)置于37℃、5%CO2培养箱连续培养14d，其中每隔2d换液一次。
(3)实验终止时PBS洗涤细胞一次，每孔加入1ml多聚甲醛固定细胞1h。
(4)PBS洗涤细胞一次，加入GIEMSA染液500μl，染色20min。
(5)双蒸水洗涤细胞3-5次，直至背景干净，晾干。
(6)显微镜下拍照单克隆斑点，数码相机拍照整个板，克隆计数。
实验结果如图9所示，经GIEMSA染液染色并计数细胞形成的克隆数发现，对照病毒感染细胞还保持着其本身的高克隆形成能力，而USP39-shRNA实验组细胞克隆形成能力显著下降。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒，其特征在于所述shRNA中含有干扰USP39表达的siRNA序列，所述siRNA序列为：ACCAAGTTGCCTCCATATCTA。
2.根据权利要求1所述的含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒，其特征在于所述重组慢病毒为LV-USP39-shRNA，它由含有骨架质粒pGCSIL-USP39-shRNA的包装系统在293T细胞中包装获得；
所述骨架质粒pGCSIL-USP39-shRNA的构建方法如下：用Age I和EcoR I 酶切pGCSIL-GFP载体使其线性化，将线性化的载体与USP39-shRNA双链于16℃下连接过夜，后转化感受态大肠杆菌DH5α，进行PCR鉴定，挑选的阳性克隆为pGCSIL-USP39-shRNA；
所述重组慢病毒为LV-USP39-shRNA的构建方法如下：将质粒pGCSIL-USP39-shRNA和病毒包装质粒Helper1.0和Helper2.0共转染至293T细胞中，包装出重组慢病毒LV-USP39-shRNA； 
所述重组质粒pGCSIL-USP39-shRNA的USP39-shRNA双链序列如下：
USP39-1:5’-CcggACCAAGTTGCCTCCATATCTATTCAAGAGATAGATATGGAGGCAACTTGGTTTTTTg-3’；
USP39-2:5’-aattcaaaaaACCAAGTTGCCTCCATATCTATCTCTTGAATAGATATGGAGGCAACTTGGT-3’。
3.根据权利要求1-2任一项所述的含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒在制备防治乳腺癌药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的含有人泛素特异性蛋白酶基因USP39-shRNA的重组慢病毒在制备防治乳腺癌药物中的应用，其特征在于所述重组慢病毒的滴度为5.0×106-1.0×108 TU/mL。
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