CN105331637A

CN105331637A - 一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途

Info

Publication number: CN105331637A
Application number: CN201510908542.3A
Authority: CN
Inventors: 郭晓令; 吴志鹏; 蒋梅
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2016-02-17

Abstract

本发明涉及一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途。所述慢病毒载体由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQ？ID？No.1所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQ？ID？No.2所示。本发明构建的慢病毒载体pGFP-OV2-ERE具有特异性的启动子——鸡卵清蛋白启动子，以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，可以用现有的EGFP或者FITC的滤光装置检测，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供了实验基础。

Description

一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途

(一)技术领域

本发明涉及一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途。

(二)背景技术

在21世纪，随着基因组时代的到来，蛋白质组学既将得到迅速发展，可以预料必有大量人体蛋白质和多肽活性分子发现，为了大规模制备其中许多新发现的具有医学和工业价值的蛋白质物质，基因工程表达系统现已再次成为新的研究热点，细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后，才能成为有效的药物，而且细胞基因工程又因为动物细胞的培养条件要求相当苛刻，成本太高，限制了规模生产，而动物生物反应器由具有低成本、短周期、高效益的特点，能很好的满足以上要求，因此科学家们想通过借助高等动物个体作为生物反应器来生产外源蛋白，特别是具有高价值的药物蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、人血红蛋白(硒)、纤维蛋白原(fibrinogen)等。

目前世界上许多公司在从事大型哺乳动物生物反应器研制的同时，又将研发目标瞄准了转基因家禽，利用母鸡输卵管制作生物反应器，以求大规模生产人类药物。对输卵管生物反应器的研究是从输卵管上皮细胞的培养，以及在培养的输卵管细胞内和在活鸡的输卵管内研究外源基因的表达开始的。

卵清蛋白基因在鸡输卵管中受到卵清蛋白特异性启动子的调控特异性的表达。卵清蛋白在输卵管中高效特异性表达的特点是制作转基因鸡输卵管生物反应器的基本条件。在鸡基因组中扩增出卵清蛋白基因的调控序列，并且将之与所要表达的目的蛋白相结合，构建出能够在鸡输卵管细胞中特异性表达的表达载体。之后，通过一些生物学技术与手段，将这样的表达载体整合到鸡基因组中，即可得到转基因鸡。转基因鸡生物反应器可以使目的蛋白在鸡输卵管中特异性的表达，并且随着鸡蛋排出体外。因为转基因鸡生物反应器主要应用于目的蛋白的生产，因此，如何保证目的蛋白表达的高效性和特异性是转基因鸡生物反应器相关研究的重要方向。

(三)发明内容

本发明目的是构建含有雌激素反应元件ERE的卵清蛋白OV与绿色荧光蛋白eGFP融合基因的慢病毒载体，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供实验基础。

本发明采用的技术方案是：

一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQIDNo.1所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQIDNo.2所示。

本发明还涉及构建所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体的方法，所述方法包括：

(1)鸡卵清蛋白启动子OV基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启动子OV引物，分别采用PCR扩增获得OV目的基因产物和ERE目的基因产物；

所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：

OV_F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'

OV_R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；

所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：

ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'

ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAAT

CTTCT-3'；

(2)含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和AgeI分别双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获得含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE；

(3)鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE的构建：用SpeI和AgeI双酶切OV目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得OV目的基因片段及线性化载体pGFP-ERE，连接OV目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE。

本发明还涉及所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建禽输卵管生物反应器中的应用。构建获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，可以与其它外源基因进行基因重组形成外源基因慢病毒载体，将外源基因慢病毒载体感染禽输卵管组织细胞，研究外源基因在禽输卵管组织细胞上的表达水平。可作为外源基因在禽输卵管生物反应器分泌外源蛋白的一种基础载体。

本发明还涉及所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建纳豆激酶基因慢病毒载体中的应用。构建获得纳豆激酶慢病毒载体，可用于鸡输卵管上皮细胞及鸡胚成纤维细胞上表达研究。

本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的慢病毒载体pGFP-OV2-ERE具有特异性的启动子——鸡卵清蛋白启动子，以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，可以用现有的EGFP或者FITC的滤光装置检测，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供了实验基础。

(四)附图说明

图1为本发明载体质粒图谱；

图2为慢病毒载体pLVshRNA-eGFP质粒图谱；

图3为卵清蛋白5'端序列OV2扩增结果图；M:DNAMark1000，Lane1-4:PCRamplificationgofOV2；

图4为雌激素反应元件ERE序列扩增结果图；M:DNAMark100，Lane1-2:PCRamplificationgofERE；

图5为pGFP-ERE质粒抽提PCR电泳结果图；M:DNAMark100，Lane1-2:PCRamplificationgofplasmidpGFP-ERE；

图6为质粒pGFP-EREEcoRI/AgeI双酶切凝胶回收结果；M:DNAMark1000，Lane1-2:DigestionofplasmidpGFP-ERE；

图7为pGFP-OV2-ERE质粒抽提PCR电泳结果；M:DNAMark1000，Lane1-2:PCRamplificationgofplasmid；

图8为质粒pGFP-OV2-ERESpeI/AgeI双酶切凝胶回收结果；M:DNAMark2000，Lane1-2:DigestionofplasmidpGFP-OV2-ERE；

图9为豆激酶慢病毒载体分别转染输卵管上皮细胞和成纤维细胞后，绿色荧光在细胞中的表达结果；A为成纤维细胞原代细胞；B为慢病毒感染成纤维细胞(隐性对照48小时)；C为慢病毒感染鸡胚成纤维细胞(隐性对照72小时)；D为慢病毒感染输卵管上皮细胞(48小时)；E为慢病毒感染输卵管细胞(72小时)；F为输卵管上皮细胞原代细胞。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一、实验材料

实验动物：40周龄母鸡，购自于种鸡场。

菌株及质粒：大肠杆菌菌株DH5a由浙江大学动科院遗传育种与繁殖实验室保存提供。

慢病毒载体图谱：慢病毒载体pLVshRNA-eGFP(简写pGFP)(图谱参见图2)由北京英茂盛业生物公司提供。

主要试剂与工具酶

TaqDNA聚合酶、割胶回收试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒、DNAMarker购自TaKaRa公司。血液基因组DNA提取试剂盒、普通质粒提取试剂盒购自TIANGEN(天根)公司。实验中用到的所有限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs(NEB.北京)公司。

2.5主要药品和溶液的配制

(1)LB液体培养基(按1L体积配制计算)

配制材料：细菌实验专用NaCl10g

细菌实验专用胰蛋白胨10g

细菌实验专用酵母提取物5g

配制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约700μL5mol/LNaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压下水蒸气灭菌20min，4℃保存备用。

(2)LB固体培养基(按1L体积配制计算)

配制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约500μL5mol/LNaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压下水蒸气灭菌20min，待冷却至60℃，每mL加入0.5μL10mg/mL的Amp贮存液至终浓度为50μg/mL，旋动混匀培养基，取已灭菌好的Φ10mm玻璃培养皿，每个培养皿中加入适量培养基铺制平板，冷却后4℃保存备用。

(3)氨苄青霉素贮存液(Amp，100mg/mL)：溶解1g氨苄青霉素钠盐溶于去离子水后，最后定容至10mL，分装到1.5mL的Eppendorf试管中，4℃保存备用。常以50μg/mL终浓度添加于LB培养基中。

(4)1mol/LCaCl₂:称取14.7gCaCl₂2H₂O溶于足量的水中，定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。常用0.1mol/LCaCl₂溶液。

(5)含15％甘油的0.1mol/LCaCl₂溶液：在10mL1mol/LCaCl₂中加入15mL纯甘油，加水定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。

2.6实验主要仪器设备

3实验方法

3.1鸡卵清蛋白启动子基因5'端序列OV2及ERE的克隆

3.1.1鸡基因组DNA的提取

将种鸡场购得的母鸡采用颈部放血，采集2mL新鲜鸡血。用TIANGEN(天根)公司的DNA提取试剂盒TIANampGenomicDNAKit(产品目录号：DP304)提取鸡血基因组DNA作为DNA模板。将获得的鸡基因组DNA溶液保存在-20℃的低温冰箱中。

3.1.2OV2、ERE引物设计

根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白启动子基因序列OV2(GenBank登入号码：J00895.1)和ERE(GenBank登入号码：S82572.1)。设计引物扩增鸡卵清蛋白启动子OV2和ERE序列片段。其中在OV2引物上游F加上SpeI酶切位点、下游R加上AgeI酶切位点(表1)。在ERE引物上游F加上EcoRI酶切位点、下游R加上SpeI和AgeI酶切位点(表2)。

表1：OV2引物序列

引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行合成。

3.1.3OV2、ERE的扩增

在PCR反应管中加入以下试剂，加样过程在超净台操作。

(1)OV2的PCR反应体系：

(2)OV2的PCR反应程序：94℃变性5min，进入循环(94℃变性1min、54℃退火45sec、72℃延伸3min)，共35个循环。最后72℃延伸10min，4℃保存。

(3)ERE的PCR反应体系：

(4)ERE的PCR反应程序：94℃变性5min，进入循环(94℃变性30sec、56℃退火45sec、72℃延伸1min)，共35个循环。最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.1.4扩增产物凝胶电泳观察结果，拍照

将上述步骤获得的扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果，拍照。琼脂糖凝胶大体流程如下：

(1)称量：通常所说的0.8％、1％的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量(g)比所加的TAE缓冲液的体积(mL)即胶的浓度。0.8％的胶需要琼脂粉0.104g，13mL的TAE。

(2)熔胶：将所称量的琼脂粉与TAE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2～3次至琼脂粉溶解并无气泡。

(3)倒胶：在干净的胶槽内摆好梳子，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。

(4)拔梳：待大约20min后，轻轻拔掉梳子(若不好拔，可以滴加适量的TAE缓冲液)。

3.1.5OV2、ERE的PCR产物纯化与回收

从PCR反应液中回收纯化DNA片段，采用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒(产品号：AK901)来回收DNA片段。

3.2含有雌激素反应元件(estrogenresponseelement，ERE)的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建

3.2.1慢病毒载体pGFP和ERE基因片段双酶切

(1)将上文得到的回收产物ERE基因片段利用引物中添加的EcoRI和AgeI进行双酶切，反应总体积20μL，反应温度37℃，酶切1h。用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒方法进行回收ERE基因酶切产物。

(2)慢病毒载体pGFP酶切反应体系

酶切掉慢病毒载体pGFP上原有的CMVpromoter元件，暴露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。反应温度为37℃，酶切时间1h。

3.2.2载体pGFP酶切产物回收

载体pGFP双酶切反应结束，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果。从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒大片段，采用TaKaRa割胶回收质粒DNA试剂盒(产品目录号：D823A)方法进行。

3.2.3ERE克隆载体连接反应

将回收产物按适当比例混合，采用T4DNA连接系统连接

(1)加样

(2)混匀，于恒温水浴锅16℃连接过夜。

3.2.4连接产物转化DH5a型感受态细胞

(1)从本实验-70℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，解冻后立即放于冰上。

(2)在超净台上，将10μL连接产物加入150μL感受态细胞，轻缓转动以混匀内容物，冰浴30min，立即放42℃水浴热激90sec，快速转至冰浴中5min。

(3)加入850μL不含抗生素的液体培养基，摇匀，放恒温摇床摇动复苏(200rpm)，37℃保温60min。

(4)12000rpm离心10sec，吸去上清液900μL，剩余100μL悬浮菌液，涂布于LB固体培养基(已加入50μg/mL的Amp)，待涂布的菌液被培养基吸干后，倒置培养基，于37℃培养过夜(14～16h)。次日，取板，放4℃冰箱备用。

(5)用灭菌过的10μL的枪头挑出单菌落，放入5～10mL已加Amp的液体LB培养液中，放恒温摇床(200rpm)37℃摇菌过夜培养。

3.2.5重组质粒DNA的小量提取

采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒(目录号：DP103)方法进行。3.2.5重组质粒载体PCR和酶切鉴定

将获得的重组质粒作为模板DNA基因组，以ERE的PCR扩增条件用PCR法进行鉴定。并根据ERE引物设计时对其添加的特定酶切位点EcoRI和AgeI进行双酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-ERE。

(1)双酶切鉴定体系

置于37℃水浴中消化酶切1h，凝胶电泳观察拍照。

(2)PCR鉴定体系

重组质粒的PCR反应程序设置与ERE的PCR扩增程序相同，凝胶电泳观察拍照。

3.3鸡卵清蛋白启动子5'端序列OV2的慢病毒表达载体pGFP-OV2-ERE的构建

3.3.1慢病毒载体pGFP和OV2基因片段双酶切

(1)将上步得到的回收产物OV2基因片段和构建好的重组质粒pGFP-ERE分别利用SpeI和AgeI进行双酶切，反应总体积20μL。反应温度为37℃，消化酶切1h。

3.3.2酶切产物的回收

用TaKaRa反应液DNA快速回收试剂盒方法分别回收重组质粒pGFP-ERE的酶切产物线状大片段和OV2酶切产物小片段。

3.3.3OV2片段定向连接

混匀，于恒温水浴锅16℃连接过夜。

3.3.4连接产物转化DH5a细胞及重组质粒的提取鉴定

连接产物转化至DH5a感受态细胞，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，倒置培养，37℃培养12～16h，挑取单个阳性菌落摇菌过夜培养，提取重组质粒。将重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送往生物公司进行测序。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-OV2-ERE。

4实验结果

4.1卵清蛋白启动子5'端序列OV2和ERE的克隆结果

取卵清蛋白启动子5'端序列OV2和雌激素反应元件ERE的PCR扩增产物4μL于0.8％琼脂糖凝胶上电泳显示，约在3000bp和600bp的位置出现一条特异性条带，这与OV2片段大小约2.8kb及ERE片段大小666bp相符。(参见图3和图4)

4.2含有雌激素反应元件(estrogenresponseelement，ERE)的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建鉴定

(1)将重组质粒以ERE设计的引物，以质粒为DNA模板，进行PCR鉴定。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳显示。得到大小约为600bp的特异性，与ERE片段666bp大小相符(参见图5)。

(2)重组质粒pGFP-ERE进行EcoRI和AgeI双酶切鉴定，得到一条约为7.2kb的大条带和666bp的目的基因小条带(参见图6)。质粒pGFP-ERE双酶切结果与预期结果一致。

(3)重组质粒pGFP-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上ERE片段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。

根据测序结果，其中的666bp的ERE序列与公布的序列有99％的同源性，以及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可以认定ERE基因片段已成功插入表达载体中，获得有雌激素反应元件ERE的慢病毒表达载体pGFP-ERE。说明可以用重组质粒pGFP-ERE进行下一步载体的构建。4.3鸡卵清蛋白启动子5'端序列OV2表达载体pGFP-OV2-ERE构建鉴定(1)将重组质粒进行OV2片段的PCR鉴定。得到大小约为2.8kb的特异性，与片段OV2的2.8kb大小相符(参见图7)。

(2)重组质粒pGFP-OV2-ERE进行和AgeI双酶切鉴定，得到一条约为7.8kb的线状条带和约2.8kb的条带(参见图8)。双酶切结果与预期结果一致。

(3)重组质粒pGFP-OV2-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上OV2片段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。

结果显示，其中约2.8kb(2795bp)的OV2序列与公布的序列有99％的同源性，以及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可以认定启动子5'端序列OV2基因片段已成功插入表达载体中，获得OV2的慢病毒表达载体pGFP-OV2-ERE。说明可以用重组质粒pGFP-OV2-ERE进行下一步载体的构建。

利用重组质粒pGFP-OV2-ERE构建纳豆激酶慢病毒载体，分别转染输卵管上皮细胞和成纤维细胞，可通过观察绿色荧光在细胞中的表达验证卵清清蛋白启动子的特异性。构建得到纳豆激酶慢病毒载体转染在成纤维细胞上基本没有荧光，而在输卵管细胞上发现荧光(参见图9)，说明本发明设计的卵清蛋白启动子具有特异性表达性。

5讨论

pLVshRNA-eGFP载体是基于HIV1的慢病毒RNA干扰载体，大小为7.8kb，包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。载体结构紧凑，具有包装效果稳定，病毒滴度高等优点。并且pLVshRNA-eGFP载体表达EGFP荧光蛋白，可以方便地观测病毒感染效率以及用流式荧光分选的方法筛选出阳性细胞。

为了实现纳豆激酶外源基因慢病毒表达载体在禽类输卵管组织中的特异性表达必须有组织特异性启动子的参与。鸡卵清蛋白启动子慢病毒表达载体的构建，为纳豆激酶克隆载体提供慢病毒启动子载体。

本章发明以新鲜鸡血为材料，根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白5'端序列启动子OV2和ERE(其中ERE是启动子OV2序列的调控元件，提高OV2表达量)，设计OV2和ERE序列片段引物，PCR扩增得到卵清蛋白启动子大小约为2.8kb的5'端OV2序列，和大小为666bp的ERE片段。回收ERE基因片段，利用引物中添加的EcoRI和AgeI内切酶对ERE基因和慢病毒载体pGFP进行双酶切。切掉慢病毒载体pGFP上原有的CMVpromoter元件，暴露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。将双酶切回收产物按适当比例混合，进行ERE克隆载体连接。连接产物转化DH5a型感受态细胞摇菌过夜培养，小量提取重组质粒DNA。对重组质粒载体进行PCR及EcoRI、AgeI双酶切鉴定，结果与预期结果一致。将PCR及双酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。根据测序结果中的666bp的ERE序列与GenBanK公布的序列有99％的同源性，可以认定ERE基因片段已成功插入表达载体中。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-ERE。

再将OV2的PCR克隆产物回收片段插入载体pGFP-ERE中。同样经PCR和SpeI、AgeI双酶切、测序鉴定。根据测序结果中的2.8kb的OV2序列与GenBanK公布的序列有99％的同源性可以认定启动子5'端序列OV2基因片段已成功插入表达载体中，获得OV2的慢病毒表达载体pGFP-OV2-ERE，为纳豆激酶慢病毒载体构建提供了慢病毒启动子载体。

Claims

1.一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQIDNo.1所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQIDNo.2所示。

2.构建如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体的方法，所述方法包括：

所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：

OV-F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'

OV-R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；

所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：

ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'

ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3'；

3.如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建禽输卵管生物反应器中的应用。

4.如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建纳豆激酶基因慢病毒载体中的应用。