CN105755045A - 一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途 - Google Patents

一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途。所述输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，由含纳豆激酶基因的NK?2A?eGFP基因片段插入慢病毒RNA干扰载体中获得，所述含纳豆激酶基因的NK?2A?eGFP基因片段序列如SEQ ID No.1所示。本发明构建了含有卵清蛋白启动子OV2基因与雌激素反应元件ERE和纳豆激酶的重组慢病毒表达载体，实现了纳豆激酶和绿色荧光蛋白双基因的表达，以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，可以用现有的EGFP或者FITC的滤光装置检测。为利用卵清蛋白启动子OV2研究外源基因在禽类输卵管组织细胞中特异表达提供了参考依据。同时为利用鸡卵清蛋白启动子构建输卵管生物反应器来生成药物蛋白奠定了理论和物质基础。

Description

一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途
(一)技术领域
本发明涉及一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途。
(二)背景技术
血栓和栓塞性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。纳豆激酶(Nattokinase，NK)具有很强的纤溶活性，能直接作用于纤溶蛋白，也能激活体内纤溶酶原。与其他溶栓类药物相比，NK具有安全性好、成本低、纤溶活性强、可口服、作用时间长等优点，正作为一个开发预防和治疗血栓药物的研究热点，有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。
长期以来人们对肿瘤的治疗一般都是以手术、放疗、药物为主。其在杀死肿瘤细胞的同时也使得正常细胞受到伤害，往往会导致病情地加剧。用慢病毒治疗肿瘤是继传统治疗方式之后出现的一种全新治疗方法。
慢病毒载体是通过联合RNA干扰技术(RNAi)来治疗肿瘤：由于慢病毒载体能够以其侵染广泛宿主、稳定转染复制及静止期的细胞等独特优势，在基因治疗肿瘤的研究中得到了广泛的应用。研究表明慢病毒载体能够高效率传递肿瘤相关基因的短发夹RNA(shRNA)，并进行转录后沉默，可以使目的基因的表达受到抑制，减少肿瘤相关基因在肿瘤发展以及肿瘤侵袭中的促进作用，因而起到治疗作用。
(三)发明内容
本发明目的是构建输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，为进一步研究禽输卵管生物反应器和抗血栓药物研究提供基础。
本发明采用的技术方案是：
一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，由含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入慢病毒RNA干扰载体中获得，所述含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段序列如SEQID No.1所示。
所述慢病毒RNA干扰载体为慢病毒载体pGFP-OV2-ERE，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQ ID No.2所示，所 述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还涉及构建所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体的方法，所述方法包括：
(1)构建含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒；
(2)NK-2A-eGFP目的基因克隆：设计NK-2A-eGFP基因引物，以步骤(1)构建的质粒为模板，PCR扩增获得NK-2A-eGFP目的基因产物；
所述NK-2A-eGFP基因引物序列如下：
NK-2A-eGFP-F：5'-CGCCCCGGGTTGTTGCGCCGCGGCTT-3'
NK-2A-eGFP-R：5'-CGCCTCGAGAAAGGAGAGGGTAAAGA-3'；
(3)用XmaI和XhoI对NK-2A-eGFP目的基因产物和慢病毒载体pGFP-OV2-ERE进行分别进行双酶切，获得NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，连接NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，获得所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体pGFP-2A-NK-OV2-ERE。
所述慢病毒载体(鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体)pGFP-OV2-ERE按如下方法进行构建：
(A)鸡卵清蛋白启动子OV基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启动子OV引物，分别采用PCR扩增获得OV目的基因产物和ERE目的基因产物；
所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：
OV-F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'
OV-R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；
所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：
ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'
ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3'；
(B)含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和AgeI分别双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获得含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE；
(C)鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE的构建：用SpeI和AgeI双酶切OV目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得OV目的基因片段及线性化载体pGFP-ERE，连接OV目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启 动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE。
本发明还涉及输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体在构建禽输卵管生物反应器中的应用。将输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体感染禽输卵管组织细胞，可用于研究外源基因在禽输卵管组织细胞上的表达水平。可作为外源基因在禽输卵管生物反应器分泌外源蛋白的一种基础载体，可用于鸡输卵管上皮细胞及鸡胚成纤维细胞上表达研究。
本发明的有益效果主要体现在：本发明构建了含有卵清蛋白启动子OV2基因与雌激素反应元件ERE和纳豆激酶的重组慢病毒表达载体pGFP-2A-NK-OV2-ERE，实现了纳豆激酶和绿色荧光蛋白双基因的表达，以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，可以用现有的EGFP或者FITC的滤光装置检测。卵清蛋白启动子在鸡输卵管上皮细胞具有一定部位表达特异性。为利用卵清蛋白启动子OV2研究外源基因在禽类输卵管组织细胞中特异表达提供了参考依据。同时为利用鸡卵清蛋白启动子构建输卵管生物反应器来生成药物蛋白奠定了理论和物质基础。
(四)附图说明
图1为本发明鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE质粒图谱；
图2为慢病毒载体pLVshRNA-eGFP质粒图谱；
图3为NK-2A-eGFP序列扩增图；M:DNA Mark 1000；Lane.1:PCR amplificationgof NK-2A-eGFP；
图4为pGFP-2A-NK-OV2-ERE质粒抽提PCR电泳结果；M:DNA Mark 1000；Lane1-2:PCR amplificationg of plasmid pGFP-2A-NK-OV2-ERE；
图5为质粒pGFP-2A-NK-OV2-ERE XmaI/XhoI双酶切结果；M:DNA Mark 2000；Lane1-2:Digestion of plasmid pGFP-2A-NK-OV2-ERE；
图6为组织块法培养的鸡胚成纤维细胞；A；原代培养2天的成纤维细胞(×100)：B：传2代培养的成纤维细胞(×100)；
图7为组织法分离培养的鸡输卵管上皮细胞；A:原代培养16h的输卵管上皮细胞(×100)；
B:原代培养2d的上皮细胞(×100)；C:原代培养5d的输卵管上皮细胞(×100)；
图8为转染细胞的荧光观察；A:纳豆激酶慢病毒转染鸡胚成纤维细胞48h；B:纳豆激酶慢病毒转染鸡输卵管上皮细胞48h；C:纳豆激酶慢病毒转染鸡输卵管上皮细胞72h；
图9为转染细胞的观察；A:鸡输卵管上皮细胞转染(荧光显微镜)，B:鸡输卵管上皮细胞(光镜)，C：293F细胞转染(荧光显微镜)，D:293F细胞(光镜)；
图10为纳豆激酶的mRNA相对表达量；
图11为阳性细胞克隆RT-PCR鉴定结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE的构建
一、实验材料
1.1实验动物：40周龄母鸡，购自于种鸡场。
1.2菌株及质粒：大肠杆菌菌株DH5a由浙江大学动科院遗传育种与繁殖实验室保存提供。
慢病毒载体图谱：慢病毒载体pLVshRNA-eGFP(简写pGFP)(图谱参见图2)由北京英茂盛业生物公司提供。
含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒(由上海生工生物工程公司合成提供)。
1.3主要试剂与工具酶：
Taq DNA聚合酶、割胶回收试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒、DNA Marker购自TaKaRa公司。血液基因组DNA提取试剂盒、普通质粒提取试剂盒购自TIAN GEN(天根)公司。实验中用到的所有限制性内切酶、T4DNA连接酶购自New England Biolabs(NEB.北京)公司。
1.4主要药品和溶液的配制
(1)LB液体培养基(按1L体积配制计算)
配制材料：细菌实验专用NaCl 10g
细菌实验专用胰蛋白胨 10g
细菌实验专用酵母提取物 5g
配制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约700μL 5mol/L NaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压下水蒸汽灭菌20min，4℃保存备用。
(2)LB固体培养基(按1L体积配制计算)
配制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约500μL 5mol/L NaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压下水蒸汽灭菌20min，待冷却至60℃，每mL加入0.5μL10mg/mL的Amp贮存液至终浓度为50μg/mL，旋动混匀培养基，取已灭菌好的Φ10mm玻璃培养皿，每个培养皿中加入适量培养基铺制平板，冷却后4℃保存备用。
(3)氨苄青霉素贮存液(Amp，100mg/mL)：溶解1g氨苄青霉素钠盐溶于去离子水后，最后定容至10mL，分装到1.5mL的Eppendorf试管中，4℃保存备用。常以50μg/mL终浓度添加于LB培养基中。
(4)1mol/L CaCl2:称取14.7g CaCl22H2O溶于足量的水中，定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。常用0.1mol/L CaCl2溶液。
(5)含15％甘油的0.1mol/L CaCl2溶液：在10mL 1mol/L CaCl2中加入15mL纯甘油，加水定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。
1.5实验主要仪器设备
二、实验方法
2.1鸡卵清蛋白启动子基因5'端序列OV2及ERE的克隆
2.1.1鸡基因组DNA的提取
将种鸡场购得的母鸡采用颈部放血，采集2mL新鲜鸡血。用TIANGEN(天根)公司的DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit(产品目录号：DP304)提取鸡血基因组DNA作为DNA模板。将获得的鸡基因组DNA溶液保存在-20℃的低温冰箱中。
2.1.2 OV2、ERE引物设计
根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白启动子基因序列OV2(GenBank登入号码：J00895.1)和ERE(GenBank登入号码：S82572.1)。设计引物扩增鸡卵清蛋白启动子OV2和ERE序列片段。其中在OV2引物上游F加上SpeI酶切位点、下游R加上AgeI酶切位点(表1)。在ERE引物上游F加上EcoRI酶切位点、下游R加上SpeI和AgeI酶切位点(表2)。
表1：OV2引物序列
表2：ERE引物序列
引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行合成。
2.1.3 OV2、ERE的扩增
在PCR反应管中加入以下试剂，加样过程在超净台操作。
(1)OV2的PCR反应体系：
(2)OV2的PCR反应程序：94℃变性5min，进入循环(94℃变性1min、54℃退火45sec、72℃延伸3min)，共35个循环。最后72℃延伸10min，4℃保存。
(3)ERE的PCR反应体系：
(4)ERE的PCR反应程序：94℃变性5min，进入循环(94℃变性30sec、56℃退火45sec、72℃延伸1min)，共35个循环。最后72℃延伸10min，4℃保存。
2.1.4扩增产物凝胶电泳观察结果，拍照
将上述步骤获得的扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果，拍照。琼脂糖凝胶大体流程如下：
(1)称量：通常所说的0.8％、1％的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量(g)比所加的TAE缓冲液的体积(mL)即胶的浓度。0.8％的胶需要琼脂粉0.104g，13mL的TAE。
(2)熔胶：将所称量的琼脂粉与TAE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2～3次至琼脂粉溶解并无气泡。
(3)倒胶：在干净的胶槽内摆好梳子，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。
(4)拔梳：待大约20min后，轻轻拔掉梳子(若不好拔，可以滴加适量的TAE缓冲液)。
2.1.5 OV2、ERE的PCR产物纯化与回收
从PCR反应液中回收纯化DNA片段，采用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒(产品号：AK901)来回收DNA片段。
2.2含有雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建
2.2.1慢病毒载体pGFP和ERE基因片段双酶切
(1)将上文得到的回收产物ERE基因片段利用引物中添加的EcoRI和AgeI进行双酶切，反应总体积20μL，反应温度37℃，酶切1h。用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒方法进行回收ERE基因酶切产物。
(2)慢病毒载体pGFP酶切反应体系
酶切掉慢病毒载体pGFP上原有的CMV promoter元件，暴露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。反应温度为37℃，酶切时间1h。
2.2.2载体pGFP酶切产物回收
载体pGFP双酶切反应结束，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果。从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒大片段，采用TaKaRa割胶回收质粒DNA试剂盒(产品目录号：D823A)方法进行。
2.2.3 ERE克隆载体连接反应
将回收产物按适当比例混合，采用T4DNA连接系统连接
(1)加样
(2)混匀，于恒温水浴锅16℃连接过夜。
2.2.4连接产物转化DH5a型感受态细胞
(1)从本实验-70℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，解冻后立即放于冰上。
(2)在超净台上，将10μL连接产物加入150μL感受态细胞，轻缓转动以混匀内容物，冰浴30min，立即放42℃水浴热激90sec，快速转至冰浴中5min。
(3)加入850μL不含抗生素的液体培养基，摇匀，放恒温摇床摇动复苏(200rpm)，37℃保温60min。
(4)12000rpm离心10sec，吸去上清液900μL，剩余100μL悬浮菌液，涂布于LB固体培养基(已加入50μg/mL的Amp)，待涂布的菌液被培养基吸干后，倒置培养基，于37℃培养过夜(14～16h)。次日，取板，放4℃冰箱备用。
(5)用灭菌过的10μL的枪头挑出单菌落，放入5～10mL已加Amp的液体LB培养液中，放恒温摇床(200rpm)37℃摇菌过夜培养。
2.2.5重组质粒DNA的小量提取
采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒(目录号：DP103)方法进行。
2.2.6 重组质粒载体PCR和酶切鉴定
将获得的重组质粒作为模板DNA基因组，以ERE的PCR扩增条件用PCR法进行鉴定。并根据ERE引物设计时对其添加的特定酶切位点EcoRI和AgeI进行双酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-ERE。
(1)双酶切鉴定体系
置于37℃水浴中消化酶切1h，凝胶电泳观察拍照。
(2)PCR鉴定体系
重组质粒的PCR反应程序设置与ERE的PCR扩增程序相同，凝胶电泳观察拍照。
2.3鸡卵清蛋白启动子5'端序列OV2的慢病毒表达载体pGFP-OV2-ERE的构建
2.3.1慢病毒载体pGFP和OV2基因片段双酶切
(1)将上步得到的回收产物OV2基因片段和构建好的重组质粒pGFP-ERE分别利用SpeI和AgeI进行双酶切，反应总体积20μL。反应温度为37℃，消化酶切1h。
2.3.2酶切产物的回收
用TaKaRa反应液DNA快速回收试剂盒方法分别回收重组质粒pGFP-ERE的酶切产物线状大片段和OV2酶切产物小片段。
2.3.3 OV2片段定向连接
混匀，于恒温水浴锅16℃连接过夜。
2.3.4连接产物转化DH5a细胞及重组质粒的提取鉴定
连接产物转化至DH5a感受态细胞，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，倒置培养，37℃培养12～16h，挑取单个阳性菌落摇菌过夜培养，提取重组质粒。将重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送往生物公司进行测序。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-OV2-ERE。
三、实验结果
3.1卵清蛋白启动子5'端序列OV2和ERE的克隆结果
取卵清蛋白启动子5'端序列OV2和雌激素反应元件ERE的PCR扩增产物4μL于0.8％琼脂糖凝胶上电泳显示，约在3000bp和600bp的位置出现一条特异性条带，这与OV2片段大小约2.8kb及ERE片段大小666bp相符。
3.2含有雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建鉴定
(1)将重组质粒以ERE设计的引物，以质粒为DNA模板，进行PCR鉴定。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳显示。得到大小约为600bp的特异性条带，与ERE片段666bp大小相符。
(2)重组质粒pGFP-ERE进行EcoRI和AgeI双酶切鉴定，得到一条约为7.2kb的大条带和666bp的目的基因小条带，与预期结果一致。
(3)重组质粒pGFP-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上ERE片段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。
根据测序结果，其中的666bp的ERE序列与公布的序列有99％的同源性，以及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可以认定ERE基因片段已成功插入表达载体中，获得有雌激素反应元件ERE的慢病毒表达载体pGFP-ERE。说明可以用重组质粒pGFP-ERE进行下一步载体的构建。
3.3鸡卵清蛋白启动子5'端序列OV2表达载体pGFP-OV2-ERE构建鉴定
(1)将重组质粒进行OV2片段的PCR鉴定。得到大小约为2.8kb的特异性，与片段OV2的2.8kb大小相符。
(2)重组质粒pGFP-OV2-ERE进行和AgeI双酶切鉴定，得到一条约为7.8kb的线状条带和约2.8kb的条带。双酶切结果与预期结果一致。
(3)重组质粒pGFP-OV2-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上OV2片段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。
结果显示，其中约2.8kb(2795bp)的OV2序列与公布的序列有99％的同源性，以及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可以认定启动子5'端序列OV2基因片段已成功插入表达载体中，获得OV2的慢病毒表达载体pGFP-OV2-ERE。说明可以用重组质粒pGFP-OV2-ERE 进行下一步载体的构建。
四、讨论
pLV-eGFP载体是基于HIV1的慢病毒RNA干扰载体，大小为7.8kb，包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。载体结构紧凑，具有包装效果稳定，病毒滴度高等优点。并且pLV-eGFP载体表达EGFP荧光蛋白，可以方便地观测病毒感染效率以及用流式荧光分选的方法筛选出阳性细胞。
为了实现纳豆激酶外源基因慢病毒表达载体在禽类输卵管组织中的特异性表达必须有组织特异性启动子的参与。鸡卵清蛋白启动子慢病毒表达载体的构建，为纳豆激酶克隆载体提供慢病毒启动子载体。
本发明实验以新鲜鸡血为材料，根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白5'端序列启动子OV2和ERE，其中ERE是启动子OV2序列的调控元件，提高OV2表达量。用Primer 5.0软件设计OV2和ERE序列片段引物，PCR扩增得到卵清蛋白启动子大小约为2.8kb的5'端OV2序列，和大小为666bp的ERE片段。回收ERE基因片段，利用引物中添加的EcoRI和AgeI内切酶对ERE基因和慢病毒载体pLV-eGFP上进行双酶切。切掉慢病毒载体pLV-eGFP上原有的CMVpromoter元件，暴露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。将双酶切回收产物按适当比例混合，进行ERE克隆载体连接。连接产物转化DH5a型感受态细胞摇菌过夜培养，小量提取重组质粒DNA。对重组质粒载体进行PCR及EcoRI、AgeI双酶切鉴定，结果与预期结果一致。将PCR及双酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。根据测序结果中的666bp的ERE序列与GenBanK公布的序列有99％的同源性，可以认定ERE基因片段已成功插入表达载体中。将测序正确的重组质粒命名为pLV-ERE-eGFP。
再将OV2的PCR克隆产物回收片段插入载体pLV-ERE-eGFP中。同样经PCR和SpeI、AgeI双酶切、测序鉴定。根据测序结果中的2.8kb的OV2序列与GenBanK公布的序列有99％的同源性可以认定启动子5'端序列OV2基因片段已成功插入表达载体中，获得OV2的慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-eGFP。为纳豆激酶慢病毒载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP构建提供慢病毒启动子载体。可用重组质粒pLV-OV2-ERE-eGFP进行下一步载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP的构建。
实施例2：纳豆激酶基因慢病毒表达载体的构建
一、实验材料
1.1菌株及质粒：
大肠杆菌菌株DH5a由浙江大学动科院遗传育种与繁殖实验室保存提供。慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-eGFP为实施例构建。含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒(由上海生工生物工程公司合成提供)。
1.2主要试剂与工具酶：
Taq DNA聚合酶、割胶回收试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒、DNA Marker购自TaKaRa公司。血液基因组DNA提取试剂盒、普通质粒提取试剂盒购自TIAN GEN(天根)公司。限制性内切酶XhoI和XmaI，T4DNA连接酶购自New England Biolabs(NEB.北京)公司。
1.3主要药品和溶液的配制
同实施例1。
1.4实验主要仪器设备
同实施例1。
二、实验方法
2.1含纳豆激酶(NK)基因的NK-2A-eGFP基因片段克隆
2.1.1 NK-2A-eGFP基因引物设计
根据GenBanK中已发表纳豆激酶基因序列，将纳豆激酶基因NK(1143bp)序列和2A肽(69bp)及绿色荧光蛋白EGFP(696bp)序列连接组合成大小为1908bp的NK-2A-eGFP基因片段(SEQ ID No.1，将重组基因序列送上海生工生物工程公司合成含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒。
用Primer5.0软件设计引物扩增NK-2A-eGFP序列片段，其中在引物上游F端加上XmaI酶切位点、下游R端加上XhoI酶切位点(表3)。
表3：NK-2A-eGFP引物序列
2.1.2 NK-2A-eGFP基因的扩增
以pUC57质粒为DNA模板，PCR扩增NK-2A-eGFP序列片段。在PCR反应管中加入以 下试剂，加样过程在超净台操作。
(1)NK-2A-eGFP的PCR反应体系：
(2)NK-2A-eGFP的PCR反应程序：94℃变性5min，进入循环(94℃变性1min、60℃退火30sec、72℃延伸2min)，共35个循环。最后72℃延伸10min，4℃保存。
(3)NK-2A-eGFP的PCR产物纯化与回收，方法同第二章。
2.2纳豆激酶基因慢病毒载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP构建
2.2.1 pLV-OV2-ERE-eGFP载体和NK-2A-eGFP基因片段双酶切
将回收产物NK-2A-eGFP基因片段和构建好的重组质粒pLV-OV2-ERE-eGFP用XmaI和XhoI进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段。
2.2.2 pLV-OV2-ERE-eGFP载体和NK-2A-eGFP基因双酶切产物纯化回收按TaKaRa割胶回收质粒DNA试剂盒方法进行。
2.2.3 NK-2A-eGFP片段与pLV-OV2-ERE-eGFP载体连接
将回收产物按适当比例混合，采用T4DNA连接系统进行连接。
(1)加样
(2)混匀，于恒温水浴锅16℃连接过夜。
2.2.4 连接产物转化DH5a细胞及重组质粒的提取鉴定
连接产物转化至DH5a感受态细胞，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，倒置培养，37℃培养12～16h，挑取单个阳性菌落摇菌过夜培养，提取重组质粒。将重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送往生物公司进行测序。将测序正确的重组质粒命名为pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP，即纳豆激酶基因慢病毒载体。
2.2.5 重组质粒载体包装滴定
将构建好的纳豆激酶慢病毒载体送上海汉恒生物科技公司进行慢病毒包装，滴定。采用实时荧光定量PCR(QPCR)技术测定慢病毒载体滴度最终测得病毒滴度约为1.6×107IU/mL。
三、实验结果
3.1 NK-2A-eGFP基因片段克隆结果
取PCR扩增产物4μL于0.8％琼脂糖凝胶上电泳显示，约在2000bp的位置出现一条特异性条带，这与片段NK-2A-eGFP大小相符(图3)。
3.2 纳豆激酶基因慢病毒载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP构建鉴定
(1)将重组质粒进行NK-2A-eGFP片段的PCR鉴定。得到大小约为2kb的特异性，与片段NK-2A-eGFP大小相符(图4)。
(2)重组质粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP进行XmaI和XhoI双酶切鉴定，得到一条约为10.6kb的线状条带和2kb的条带(图5)，双酶切结果与预期结果一致。
(3)重组质粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP送上海汉恒生物技术有限公司进行NK片段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。
根据测序结果中序列与GenBank公布的序列(GenBank：Ay219901)有99％的同源性，以及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可以认定NK基因片段已成功插入表达载体中，获得纳豆激酶慢病毒表达载体。
四、讨论
为了提高纳豆激酶慢病毒表达载体在输卵管的表达特异性，本发明在实验设计当中选用实施例1构建好的pLV-OV2-ERE-eGFP载体。重组质粒载体以eGFP作为报告基因，可以用现有绿色荧光蛋白的eGFP或者FITC的滤光装置检测。
为了便于观察纳豆激酶的表达水平，用大小为54bp的2A肽序列连接纳豆激酶(NK)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因编码，实现纳豆激酶和绿色荧光蛋白双基因表达。
4.1 2A肽序列
2A肽最早被研究鉴定的自剪切2A肽源于口蹄疫病毒(FMDV)。2A肽平均长度为18～22氨基酸。“2A”代表小RNA病毒多蛋白中的一段特异区域，源于研究者所采用的学术命名系统。在FMDV中，它可以在自己的C-端自动裂解，即核糖体跳跃，N-端被3C/3CD蛋白酶裂解或从上游壳蛋白1D处起修整的一小段肽。
现有的多基因共载体构建策略包括mRNA剪切策略、内部启动子策略、融合蛋白策略及蛋白酶策略等。这些策略最主要的不足之处在于载体容纳能力有限，一般只适合两个基因共表达。另外，多基因在同一载体上表达时其蛋白活性及表达效率不及单基因表达载体。
2A肽是近年使用较多的一种构建多基因载体的工具，2A肽的多基因载体构建策略规避了多基因表达时蛋白活性不高或下游基因表达量低等缺点，成为目前较为理想的多基因表达策略，其对双基因的共同表达具备明显的优势。
4.2纳豆激酶基因慢病毒载体构建分析
本章实验根据GenBanK中已发表的纳豆激酶序列，与2A肽和绿色荧光蛋白序列eGFP经优化后设计NK-2A-eGFP序列片段，由上海生工生物工程公司进行基因合成NK-2A-eGFP的DNA片段克隆在pUC57质粒上。用Primer 5.0软件进行引物设计，PCR扩增得到大小为2077bp的含NK基因的NK-2A-eGFP序列片段。
将PCR扩增的NK-2A-eGFP基因片段回收纯化，利用引物中添加的XmaI和XhoI对NK-2A-eGFP基因和慢病毒载体pLV-OV2-ERE-eGFP进行双酶切。酶切掉慢病毒载体pLV-OV2-ERE-eGFP上原有的eGFP元件，暴露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。将双酶切回收产物按适当比例混合，进行载体连接。连接产物转化DH5a型感受态细胞摇菌过夜培养，小量提取重组质粒DNA。
对重组质粒载体进行PCR及双酶切鉴定，结果与预期结果一致。鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行NK基因测序。根据测序结果中的1327bp的NK序列与GenBanK公布的序列有99％的同源性，可以认定NK基因片段插入表达载体中，成功纳豆激酶慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP，并且可用于下一步细胞转染试验。
实施例3：纳豆激酶基因在鸡输卵管上皮细胞和成纤维细胞中的表达
一、实验材料
1.1质粒：
实施例2获得的纳豆激酶慢病毒表达载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP。
1.2实验动物及细胞：
8-10日龄受精蛋由浙江大学实验动物中心提供，原代输卵管上皮细胞购自上海赛百慷生物技术有限公司。
1.3主要试剂
胎牛血清、DMEM培养液、胰蛋白酶、培养瓶和12孔培养板为Gibco公司产品，反转录试剂盒、RNA提取试剂盒、qPCR试剂盒购自TaKaRa公司，SYBR GreenERTM qPCR SuperMixUniversal购自Invitrogen公司。
1.4主要药品和溶液的配制
(1)DMEM培养液：超纯水溶解13.4gDMEM，3.7gNaHCO3，3.57gHEPES，加水定容至1L，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃贮存。
(2)PBS缓冲溶液：NaCl 8.00g，KCl 0.2g，NaHPO4 2.16g，KH2PO4 0.2g，超纯水定容至1L，pH调节为7.2，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存。
(3)青霉素/链霉素双抗溶液(100倍浓度)：青霉素0.625g，链霉素1g，0.9％生理盐水100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，置于-20℃贮存。
(4)0.25％胰蛋白酶溶液：2.5g胰蛋白酶干粉溶于PBS溶液中，定容至1L，pH调节为7.2-7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，置于-20℃贮存。
(5)细胞冻存液：按照DMEM：FBS：DMSO比例为7:2:1配制冻存液。要求现用现配，配制完成后4℃贮存。
(6)5％胎牛血清DMEM培养液：DMEM培养液中加入终浓度为5％(体积比)的FBS，4℃贮存。
1.5实验主要仪器设备
4％CO2恒温细胞培养箱，荧光倒置显微镜，超净工作台，12孔培养板，培养瓶，注射器。手术器械，量筒，烧杯，酒精灯，压力蒸汽灭菌器，双蒸水装置。其余实验仪器与实施例1相同。
二、实验方法
2.1鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的培养包括细胞原代培养、细胞传代培养、细胞冻存与复苏。
2.1.1细胞原代培养
(1)用75％酒精浸泡过的棉球对受精蛋进行消毒，将鸡蛋气室向上固定在底座后，在气室敲开一个大小合适的开口，用镊子轻轻夹起鸡蛋中的鸡胚，用加入1％青-链霉素(双抗)的PBS溶液反复多次清洗。
(2)将鸡胚四肢、内脏和头部剪掉，再将剩余组织剪碎。
(3)将剪碎的组织贴在培养瓶管壁上，倒置放入CO2培养箱10min左右。
(4)再向培养瓶中加入5mL完全培养液，轻轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润组织块。放入CO2培养箱中培养。
2.1.2细胞传代培养
(1)先将培养瓶中旧的培养液弃除，用事先预热至37℃的PBS缓冲液漂洗细胞2-3次，使培养液完全去除。
(2)向培养瓶中加入2-3mL的0.25％胰蛋白酶溶液，在培养箱中翻转消化3min左右，在显微镜中观察到细胞回缩变圆，分散成单个细胞时加入完全培养液终止消化。
(3)按1:2的比例分装成两瓶，放入培养箱中继续培养。
2.2细胞冻存与复苏
(1)待细胞生长至90％左右时准备冻存，冻存24h前换新鲜培养液。
(2)用常规法消化细胞，加培养液终止反应。
(3)台式离心机离心(1200rpm，5min)去上清液。加入4℃预冷的细胞冻存液，吹打混匀，用移液枪转移到冻存管中，用棉花包住冻存管。
(4)将冻存管立即放入-70℃冰箱中保存过夜。再用小布袋装好放入液氮罐中冷冻，在小布袋贴上细胞标签。长期保存液氮罐中。
(5)将冻存管从液氮中取出，迅速投入42℃水浴中，不停地晃动，见冻存管中出现小冰团黄豆粒大小时放入超净工作台内。
(6)用吸管将细胞转入加有全培养液的培养瓶中，轻轻吹打均匀，放置于CO2培养箱中培养。
2.3纳豆激酶慢病毒载体转染
在传代后的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞密度生长至80％左右时，将纳豆激酶慢病毒表达载体进行细胞转染。转染步骤如下：
(1)铺板：将培养瓶中的细胞消化重悬后，按1×105/mL细胞浓度标准接种于12孔平板，生长过夜。
(2)感染：将第二天50-70％细胞汇合率的12孔板中的培养液吸除，换1/2体积新鲜的培养液，再将病毒原液加入细胞中，轻轻8字混合均匀放入CO2培养箱中培养4小时，4小时后补齐培养液至正常体积。
(3)检测：感染后24小时，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。感染48小时，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率。
2.4纳豆激酶慢病毒载体mRNA水平表达检测
利用实时荧光定量PCR方法，以GAPDH作为内参，检测纳豆激酶在鸡输卵管上皮细胞中的mRNA表达水平。利用Primer5.0软件设计引物序列，由华大基因公司合成。
2.4.1 RNA定量提取
样本按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。将提取的总RNA样本分别取5μL至EP管中，加入RNase-Free ddH2O至200μL，混匀。以RNase-Free ddH2O为对照，选取仪器中测定RNA浓度的功能，输入稀释倍数，测定RNA浓度。
2.4.2反转录PCR
总RNA抽提产物用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。将试剂盒各组分融化后置于冰上。
(1)反转录各样品添加量：2×RT Reaction Mix 10μL，RT Enzyme Mix 2μL，RNA样本5μL，H2O(RNase-Free)3μL。
(2)轻轻混匀，室温放置10分钟。50℃孵育30分钟。
(3)于85℃放置5分钟，终止反应，随即置于冰上。加入1μL的E.coli RNase H，37℃孵育20mins。
(4)逆转录cDNA产物-20℃保存。
2.4.3荧光定量PCR
反转录得到的产物作为模板进行PCR反应。
(1)PCR反应体系为：SYBRGreenERqPCR SuperMix Universal 12.5μL，10μM引物P1和P2各0.5μL，cDNA 0.5μL，DEPC-treated water，11μL。反应条件为：90℃，2min；40cycles；95℃，15sec，60℃，60sec。75℃延伸10min；
(2)将各成分添加到PCR管完成后，小心封闭板膜，混合均匀，简单离心使溶液聚于管底。
(3)荧光定量PCR的产物经反应后，将3复孔中的产物合并，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。 收集数据，分析结果。
三、实验结果
3.1鸡胚成纤维细胞
鸡胚成纤维细胞为贴壁生长型细胞，原代培养1天，组织块边缘开始游离出少量细胞，细胞间隙较大。原代培养2天，细胞生长密度可以达到70％-80％(图6A)。细胞在传代过程中得到纯化(图6B)，且生长旺盛，形态良好。
3.2鸡输卵管上皮细胞
用组织块分离法培养鸡输卵管上皮细胞原代，获得的鸡输卵管上皮细胞为贴壁生长型细胞。图7A为原代培养16h后，细胞开始贴壁生长，团块周围细胞分散而透明，细胞增殖速度比成纤维细胞慢。图7B为原代培养2d后，细胞增多，贴壁上皮细胞蔓延生长，呈梭长型或圆形，细胞生长密度可达70％左右。图7C为培养5d的输卵管上皮细胞，随着培养时间的延长，细胞形态变圆，大多数细胞胞质回缩，杂质增多，细胞生长速度明显减慢，死亡数增多。
3.3纳豆激酶慢病毒载体转染细胞的检测
待12孔平板传代培养的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞密度生长至80％左右时，将纳豆激酶慢病毒载体转染上皮细胞和成纤维细胞。感染48小时后，通过荧光显微镜观测GFP表达效率。发现转染的输卵管上皮细胞48h后(图8B)出现绿色荧光细胞，随着转染时间的延长，具有绿色荧光细胞的细胞数越来越多，到72h后(图8C)，达到最高转染水平。转染的成纤维细胞48h(图8A)后没有发现绿色荧光，说明卵清蛋白启动子在成纤维细胞中不表达绿色荧光蛋白，在鸡输卵管上皮细胞具有表达特异性。
以放大100倍的显微镜视野为标准，每孔挑5个视野拍照，统计5个显微镜中总细胞数和表达绿色荧光的细胞，结果取其平均值，计算转染效率。公式如下：转染效率(％)＝绿色荧光细胞数/细胞总数×100％。可得出纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细胞最高转染效率约为10％。
3.4纳豆激酶慢病毒载体mRNA水平表达分析
3.4.1细胞荧光表达
利用实时荧光定量PCR方法，以GAPDH作为内参，检测纳豆激酶在鸡输卵管上皮细胞表达水平。将纳豆激酶慢病毒分别感染鸡输卵管上皮细胞和常用对照的293F细胞(图9A，B，C，D)。结合EGFP基因的荧光观察，初步表明纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细胞中转录表达，而对照组293F细胞基本未检测到目的基因，有待于进一步检测纳豆激酶蛋白的mRNA相对表达量。
3.4.2纳豆激酶的mRNA表达量
荧光定量PCR机器输出Ct值，通过2-ΔΔCt法计算得到纳豆激酶相对表达量(图10)。得出鸡输卵管上皮细胞未感染组与293F对照组差异极显著(P<0.01)，而上皮细胞感染组差异不显著(P>0.01)，说明纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细胞中的mRNA表达量不高。
3.4.3纳豆激酶的RT-PCR电泳
常规方法制备细胞悬浮液，提取细胞总RNA，利用目的基因特异引物进行PCR扩增。PCR应后产物，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳(图11)。结果显示，转染纳豆激酶慢病毒的细胞扩增出目的片段。而对照组293F细胞未扩增出目的条带，说明纳豆激酶在鸡输卵管上皮细胞中转录表达。
四、讨论
大多数输卵管生物反应器的研究一般是从输卵管上皮细胞的培养开始，以及在培养的输卵管细胞内和在活禽内的输卵管里来研究外源基因表达效率。Christman等人对鸡输卵管细胞进行体外的培养，他们发现鸡输卵管细胞虽然在生长过程中能形成单层的贴壁细胞，但是细胞生长速度并不理想。研究发现，用雌激素处理过的鸡血清添加到培养液中可以使输卵管细胞增殖速率大幅提升。并且在雌激素的作用下，血清中的其他因子也可能会对输卵管细胞的生长产生一定的影响。本发明中构建的纳豆激酶慢病毒载体上插入的雌激素反应元件ERE基因中含有四个呈回文结构的雌激素半反应应答元件，起到增强卵清蛋白5’调控区启动子的功能，来提高体外源基因的表达效果。但是我们对纳豆激酶进行mRNA表达水平分析发现，外源基因纳豆激酶的表达效率比较低，与293F细胞对照组相比差异不显著，因此卵清蛋白启动子OV2和ERE的作用有待于进一步研究。
在本发明实验中，我们用组织块分离法培养原代鸡输卵管上皮细胞和原代鸡胚成纤维细胞。待传代培养到12孔平板上的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞生长至合适密度时，将纳豆激酶慢病毒表达载体分别转染输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞。感染48小时后，通过荧光显微镜观测EGFP表达效率。发现转染的输卵管上皮细胞48h后出现绿色荧光细胞，随着转染时间的延长，具有绿色荧光细胞的细胞数越来越多，到72h后达到最高转染水平。转染的成纤维细胞48h后没有发现绿色荧光。细胞计数法得出纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细 胞最高转染效率约为10％，转染效率水平比较低。Dierich等用纤维注射的方法将含有卵清蛋白启动子OV2的5’调控区序列的质粒表达载体转染其他多种细胞：包括肾细胞，鸡胚成纤维细胞和其他非鸡源细胞中发现外源基因也不表达，这与本实验结果是一致的，验证卵清蛋白在鸡输卵管上皮细胞具有一定的表达特异性，表达效率低。
在本发明试验中我们利用利用实时荧定量PCR，以GAPDH作为内参，检测纳豆激酶在细胞中的mRNA表达水平。荧光定量PCR机器输出Ct值，通过2-ΔΔCt法计算得到纳豆激酶相对表达量。得出鸡输卵管上皮细胞未感染组与293F对照组差异极显著(P<0.01)，而上皮细胞感染组差异不显著(P>0.01)，纳豆激酶慢病毒载体在鸡输卵管上皮细胞中的mRNA表达量较低，表明组病毒卵清蛋白启动子OV2的效率较低。杨鹏翔[94]等以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因，构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体，转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞，通过荧光和酶活性检测发现基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达，而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。Ochiai等采用卵清蛋白基因5’侧翼1.35kb片段和3种不同的病毒启动子分别构建载体，通过基因枪的方法注射到产蛋母鸡的输卵管部位，结果发现病毒启动子的启动效率远远高于卵清蛋白调控区。这些都与本实验结果是一致的，验证卵清蛋白在鸡输卵管上皮细胞表达效率低。
Kwon等缩短了卵清蛋白启动子长度至1.35kb用于转基因鹌鹑研究，虽然在卵白中检测到表达重组人白细胞介素-1受体拮抗蛋白含量仅为88.7～233.8pg/L，但却具有输卵管的组织特异性。宇丽等的研究中，采用卵清蛋白启动子基因5’端1.2kb大小的调控序列，实现了组织特异性表达。而Zhu等分别用卵清蛋白基因5’侧翼7.5kb和15kb片段以及3’侧翼15.5kb片段作为鸡输卵管组织特异性表达启动子，以抗肿瘤的单克隆抗体和人干扰素基因为目的基因，制作出的转基因嵌合体家鸡所产的鸡蛋蛋清中外源蛋白的含量达到3mg，不过，未能实现组织特异性表达，推断可能所采用的调控序列还不足以实现输卵管组织特异性表达。
本发明的转染方案，转染浓度和时间等是由实验中鸡输卵管上皮细胞的生长状态和转染环节共同决定的。这为研究其他外源基因利用卵清蛋白启动子OV2在禽类输卵管组织细胞中表达提供了参考依据。同时为利用鸡卵清蛋白启动子构建输卵管生物反应器来生成药物蛋白奠定了理论和坚实的实验基础，期望生产出携带具有生物功能的外源基因的转基因禽类，一定程度上提高生物反应器的利用效率，具有极大的潜力和广阔的前景。

Claims (5)

1.一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，由含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入慢病毒RNA干扰载体中获得，所述含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段序列如SEQ IDNo.1所示。
2.如权利要求1所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，其特征在于所述慢病毒RNA干扰载体为慢病毒载体pGFP-OV2-ERE，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMV promoter元件获得，其质粒图谱见图1；所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQ ID No.2所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQ ID No.3所示。
3.构建如权利要求2所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体的方法，所述方法包括：
(1)构建含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒；
(2)NK-2A-eGFP目的基因克隆：设计NK-2A-eGFP基因引物，以步骤(1)构建的pUC57质粒为模板，PCR扩增获得NK-2A-eGFP目的基因产物；
所述NK-2A-eGFP基因引物序列如下：
NK-2A-eGFP-F：5'-CGCCCCGGGTTGTTGCGCCGCGGCTT-3'
NK-2A-eGFP-R：5'-CGCCTCGAGAAAGGAGAGGGTAAAGA-3'；
(3)用XmaI和XhoI对NK-2A-eGFP目的基因产物和慢病毒载体pGFP-OV2-ERE进行分别进行双酶切，获得NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，连接NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，获得所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体pGFP-2A-NK-OV2-ERE。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述慢病毒载体pGFP-OV2-ERE按如下方法进行构建：
(1)鸡卵清蛋白启动子OV基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启动子OV引物，分别采用PCR扩增获得OV目的基因产物和ERE目的基因产物；
所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：
OV-F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'
OV-R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；
所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：
ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'
ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3'；
(2)含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和AgeI分别双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获得含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE；
(3)鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE的构建：用SpeI和AgeI双酶切OV目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得OV目的基因片段及线性化载体pGFP-ERE，连接OV目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE。
5.如权利要求1或2所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体在构建禽输卵管生物反应器中的应用。
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