CN110408696A - Rock2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对trail耐药药物中的应用 - Google Patents

Rock2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对trail耐药药物中的应用 Download PDF

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Abstract

一种ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。(1)首先采用荧光定量PCR、western blot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；(2)采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2‑OS及MG‑63，加入TRAIL，随后将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2‑OS，然后采用western blot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。具有逆转骨肉瘤细胞对TRAIL的耐药，为骨肉瘤治疗提供新的靶点，为更加有效地对抗TRAIL耐药提供科学依据的优点。

Description

ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及骨肉瘤细胞对TRAIL耐药影响因素研究技 术领域，具体的为一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对 TRAIL耐药药物中的应用。
背景技术
骨肉瘤(osteosarcoma,OS)，系以能够直接成骨和产生骨基质的梭形基质细胞为特征的 骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，易发生肺等器官转移，预后差，5年生存 率约为65％。由于OS的发生严重威胁着青少年的健康，尽管骨肉瘤化疗药物耐药机理的研 究已经进行了多年，但仍然没有取得重大突破，化疗耐药的骨肉瘤患者长期生存率仍然不到 20％。
临床上，骨肉瘤患者亟需传统手术+新辅助化疗之外的新的治疗手段。近年来，一种生物 治疗药物——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-RelatedApoptosis Inducing Ligand，TRAIL)在实体恶性肿瘤的临床试验中取得了令人瞩目的研究成果，它是一 种能诱导癌细胞凋亡而对机体正常组织无明显损伤的内源性细胞因子，对肺癌、宫颈癌、淋 巴瘤等众多肿瘤都有明显疗效。但是，有研究发现骨肉瘤细胞对TRAIL具有耐药性,使TRAIL 在骨肉瘤中的临床应用大大受限，然而其机制尚不清楚。
研究证实Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho associated coiled coilforming protein kinase 2，ROCK2)在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。ROCK2位于染色体2p24上， 包括33个外显子，可编码1338个氨基酸，ROCK2激酶结构域由氨基末端和羧基端组成， 并决定其催化活性。目前认为ROCK2是Rho/ROCK信号转导通路的关键信号分子，可以调 节细胞的收缩、粘附、迁移、增殖和凋亡。研究证实在许多不同肿瘤组织如肝癌、乳腺癌、 前列腺癌、肺癌等中均观察到ROCK2呈高表达，我们前期研究也证明ROCK2在肝癌、肾癌、结肠癌等组织中呈高表达；但是ROCK2在骨肉瘤组织中的表达，以及其对骨肉瘤细胞 对TRAIL耐药中的影响，目前还没有相关研究和报道。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，针对肿瘤治疗药物TRAIL在治疗过程中常产生耐药进 而导致化疗失败甚至疾病复发等现象，提供一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2) 在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，进而逆转骨肉瘤细胞对TRAIL的 耐药，为骨肉瘤治疗提供新的靶点，为更加有效地对抗TRAIL耐药提供科学依据。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激 酶2(ROCK2)在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术手段：
(1)首先采用荧光定量PCR、western blot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中 ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；
(2)然后采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2-OS 及MG-63，然后加入TRAIL，随后将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2-OS，然后采用western blot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL 的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。
具体的，技术手段如下：
(1)ROCK2在骨肉瘤的表达情况
收集骨肉瘤标本及癌旁组织并采用免疫组化、western blot及荧光定量PCR分析ROCK2 的表达情况；
(2)分析骨肉瘤中ROCK2的表达与骨肉瘤的预后关系；
(3)采用RNA干扰技术降低ROCK2的表达后分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性：
(3.1)提取RNA及细胞总蛋白，应用荧光定量PCR及western blot检测shNC及shROCK2 中ROCK2表达情况；
(3.2)利用稳定干扰ROCK2的骨肉瘤细胞并加入TRAIL，分析其对TRAIL的敏感性；
(4)采用CCK8及Edu分析稳定低表达ROCK2细胞的增殖能力，加入TRAIL后，进一步分析其增殖能力；
(5)采用流式凋亡实验及western blot检测凋亡相关蛋白表达情况分析骨肉瘤细胞对 TRAIL的敏感性；
(6)采用慢病毒转染技术建立稳定高ROCK2骨肉瘤细胞株：
(6.1)提取细胞总蛋白及RNA,荧光定量PCR及western blot检测ROCK2的表达情况；
(6.2)在此基础上加入TRAIL,分析稳定高表达ROCK2后骨肉瘤对TRAIL的敏感性；
(7)不同剂量的TRAIL处理骨肉瘤细胞，流式技术检测细胞凋亡情况；
(8)加入或者不加TRAIL，加入ROCK2抑制剂Y27632(Y-27632)，流式技术检测细胞凋亡情况，并检测Caspase3的表达情况。
通过上述研究，本发明人发现针对骨肉瘤中高表达的ROCK2基因与TRAIL耐药密切相关； 特意的抑制ROCK2基因表达，能够有效的增强TRAIL的敏感性，极大的促进的骨肉瘤细胞的 凋亡，从而显著提升TRAIL药物的疗效，降低耐药性。
因此，在上述研究的基础上本发明提出ROCK2抑制剂Y27632,及shROCK2,这两种抑制剂 可以实现在降低ROCK2蛋白表达水平后，显著提升TRAIL对骨肉瘤细胞的敏感性。
在本发明中我们采用的是骨肉瘤细胞系U2-OS及MG-63。
相对于现有的技术，本发明的有益效果是：
本发明的方法为TRAIL作为肿瘤的靶向治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤提供新的靶 向治疗依据，为进一步提高肿瘤的靶向治疗提供新科学依据。
附图说明：
图1是荧光定量PCR的统计图，表示ROCK2mRNA在骨肉瘤及表达显著高于癌旁组织。
图2是western blot图，表示ROCK2蛋白在骨肉瘤中表达显著高于癌旁组织。
图3是免疫组化图，表示在骨肉瘤标本中ROCK2表达显著提升。
图4是骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63中，干扰ROCK2后，mRNA及蛋白表达水平提示干扰成 功。
图5是CCK8图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。
图6是Edu图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。
图7是流式图，表示降低ROCK2表达后可显著提升TRAIL的敏感性
图8是western blot图，表示减弱ROCK2表达后，TRAIL对骨肉瘤凋亡的影响。
图9是U2-OS细胞用不同剂量的TRAIL治疗48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图10是U2-OS细胞在无TRAIL(500ng/mL)存在或不存在的情况下，用指定浓度的Y-27632处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图11是骨肉瘤细胞U2-OS用Y-27632与TRAIL 500ng/ml联合处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图12是western blot图，表示Y-27632与TRAIL 500ng/ml联合处理后Caspase3激活。
具体实施方案
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但是本发明不仅仅局限于以下实施例。
1.细胞培养
人骨肉瘤细胞U2-OS及MG-63在含10胎牛血清(含体积百分含量为10％的胎牛血清)的 DMEM高糖培养基中，并于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。
2骨肉瘤中ROCK2的表达
为了探讨骨肉瘤ROCK2在骨肉瘤组织中的表达情况，为此我们首先收集了62例骨肉瘤组 织及10例正常骨组织，western blot分析了62例骨肉瘤组织及10例正常骨组织的ROCK2 蛋白水平，与10例正常骨组织比较，发现ROCK2高表达有40例、低表达22例，其与临床数 据分析见表1.1，通过免疫组化方法检测骨肉瘤组织及骨组织中ROCK2表达情况。免疫组化 结果发现，骨肉瘤组织中ROCK2的表达明显高于正常骨组织(图1-3，p<0.001)。接下来我们又分析了骨肉瘤及其癌旁组织中ROCK2mRNA及蛋白表达水平。我们将收集的临床组织分成 两组，并且按上述方法提取总蛋白，利用western blot技术检测ROCK2蛋白表达水平(如图 4)，提取曝光后的ROCK2的灰度值，分析62例骨肉瘤组织及10例正常骨组织的灰度值，以正常骨组织的平均灰度值作为参考，将62例骨肉瘤组织中高于平均正常骨组织的定义为高 表达(+)，将62例骨肉瘤组织中低于正常骨组织平均值的定义为低表达(-)，如表3.1所示的结果再与临床随访的数据结合分析生存预后情况。将患者ROCK2表达分为ROCK2(+) 和ROCK2(-)，在该两种分类情况下，生存时间的差异具有统计学意义(Log Rank检验， P<0.05)，以上结果均显示ROCK2表达水平显著提升，且ROCK2高表达后，骨肉瘤患者预 后差。
3.shROCK2质粒的对应序列
3.1.首先在NCBI上查到ROCK2的基因序列，Homo sapiens Rho associatedcoiled-coil containing protein kinase 2(ROCK2)，mRNA NCBI Reference Sequence:NM_004850.3，设计4 对oligos退火到pSIREN-RetroQ-TetH中，测序验证。
表1.1 shROCK2oligo sequences
3.2构建质粒
(3.21)将RNA干扰基因连接至pSIREN-RetroQ-TetH载体，具体如表1.1所示，为pSIREN-RetroQ-TetH图谱。
①退火:将合成好的互补oligo DNA用ddH2O溶解成100μm，按给出体系进行退火。oligo 混合物在9低温4℃环境加热5分钟，然后30℃90分钟，形成双链DNA。
DNA退火体系Total volume 10μl:1μl sense oligo+1μl antisense oligo+1μlSTE Buffer+7 μl ddH2O。
②连接：将退火的双链DNA稀释成5μm浓度，室温反应30分钟。
酶连接体系Total volume 20μl:4μl 5×ligation buffer+2μl载体(0.5ng/μl)+1μl ds oligo(10nm)+1μl T4DNA ligase(1U/μl)+12μl ddH2O
(3.22)制备感受态细胞
①取-80℃中保存的大肠杆菌株DH5α50μl置于消毒后的Ep管中；
②用消毒的枪头在半固体的LB培养基平板上划线，37℃倒置培养过夜；
③用已经消毒好的枪头挑出单克隆菌落至含有3ml液体的LB培养基的摇菌管中，37℃ 100rpm高速，过夜；
④取上面过夜的大肠杆菌菌液100-150ul种到含10ml的LB培养基的培养瓶中，37℃摇 动孵育2～3h，立刻取出试管置于冰浴中10～15min，静置，勿动。
以下实验步骤需在已消毒的无菌超净工作台中操作
①将小摇获得的菌液加入至已经灭菌处理并预冷的50ml离心管中；
②离心，4000rpm高速，低温4℃环境，10min；
③弃离心下来的废液，将50ml的离心管倒置1-2min，直到培养液完全流干；
④加入预冷0.1mol/L CaCl2 10ml重悬离心下来的菌体，冰浴30min；
⑤4000rpm高速，低温4℃环境，10min，去废液，将管倒置于1-2min，直到培养液完全流干；
⑥低温4℃环境静置12～24h后可直接进行转化，如需要长期保存可每管加30％的甘油， -80℃保存3个月。
(3.23)转化
①取出感受态细胞，冰浴，至感受态细胞完全成液状，取1μl质粒与50ul的感受态DH5a混合均匀；
②冰浴30min；
③42℃放置90s后立刻放置冰中，静置；
④低温4℃环境，静置2min；
⑤加入约800μl无抗性LB，37℃，转速100-200rpm高速，1h，注意转速不应过快， 以免导致菌体的破裂
⑥取200μl上述菌液，均匀的涂到带有与质粒所带有的抗生素抗性的LB固体平板培养 板上；
⑦将上面涂好的LB培养板放置37℃，直到菌液完全的进入LB固体培养基中，倒置，过夜。
(4)质粒小量抽提
①用消毒后的小枪头挑取单个菌落接种到3ml含抗生素的溶液的LB液体培养基中， 37℃培养约12-14h；
②用8000rpm高速，1min离心菌液后，吸取上清保留细菌沉淀；
③用枪吸取250μl Solution I/RNase A到15ml试管中来悬浮细菌沉淀；
④再加入250μl Solution II，温和晃动，使试剂充分混合，注意不要过于激烈避免裂解不 够充分，室温静置2min，以致充分裂解细菌；
⑤再加入已经提前4度(或冰上)预冷的Buffer N3 125μl，颠倒15ml离心管充分使液体 混合均匀，在低温4℃环境条件下12000rpm高速，10min离心；
⑥离心后在冰上操作，将上清液吸取放入另一1.5ml EP管，按液体总体积的10％加入 ETR Solution，冰上再孵育10min(孵育过程中该温和颠倒EP管数次)；
⑦10min后再转移到37℃孵育5-10min后，12000rpm高速离心3min；
⑧离心后将上清液吸取转移入另一1.5ml EP管，加入液体总体积的50％无水乙醇，温和 的颠倒6-7次，将液体充分混合均匀，室温孵育1-2min；
⑨将液体转入吸附柱(一次700μl)，10000rpm高速离心1min；吸取废液，再加入500μl Buffer HB，8000grpm高速离心1min后再吸取弃废液，改加入700μl DNA Wash Buffer8000rpm 高速离心1min，重复加入DNA洗涤液两次且离心两次；第三次离心8000rpm高速离心2min 将残留无水乙醇去除，以免影响后面的连接过程；
⑩将吸附柱转入一干净EP管，于吸附柱中央加入30-50μl Endotoxin-FreeElution Buffer， 8000g离心2min，液体即质粒溶液。运用分光光度计检测质粒浓度和纯度。
(5)质粒酶切鉴定
反应体系：1μl KpnⅠ+1μl Xho I+2μl 10×NEB buffer+2μl质粒DNA+14μl灭菌水
①将反应体系中的混合物加入到1.5ml Ep管中，放置37℃水浴中2h；
②2小时后取出Ep管，为终止反应加入10×Loading buffer 2μl；
③吸取2μl的最终反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，跑完后在紫外灯下检测扩增片断
(6)重组质粒的测序鉴定
①PCR反应体系及扩增条件：
在ABI9700PCR仪上选用Touchdown程序：
②PCR产物纯化及序列测定：
PCR产物纯化体系及条件：
在ABI9700PCR仪上选用PCR产物纯化程序
③测序反应体系及条件：
在ABI9700PCR仪上选用测序反应程序
④测序反应产物纯化
使用美国ABI3130XL测序仪测序，采用BigDye Terminator Cycle Sequencing试剂盒经双脱氧链 终止法测序。
3.3无内毒素质粒大量提取
(1)加入2.5ml的平衡液BL至吸附柱CP5中，8000rpm高速，离心2min，倒掉收集管中的废液；
(2)将过夜培养出来的菌液加入离心管中，室温8000rpm高速离心2min，收集菌液，尽量 去除上清。菌液较多时可以通过多次离心将菌体全部收集到一个离心管中，但菌液过多也可 能会导致菌体裂解不充分从而影响质粒的提取浓度；
(3)吸除上清，将离心后的离心管倒置在吸水纸上，用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴；
(4)待管壁上水吸干净后，向离心管中加入7ml溶液P1(提前加好RNaseA)，使用涡旋振 荡器将细菌沉淀充分悬浮；
(注意：这步必须要使得细菌沉淀彻底悬浮，假如有未彻底混合均匀的菌体会直接导致菌体 不能充分裂解从而影响最终大提的浓度和纯度。此外，对于低拷贝质粒，应该加大菌体用量， 所以也必须按比例增加添加的P1、P2、P4的量)。
(5)向上述p1液中加入7ml溶液P2，立即温和的颠倒6-8次，不能过于激烈，室温静止5min；
(6)向P1和P2混合液中加入7ml溶液P4，同样立即温和的颠倒6-8次，使得p1、p2、p3充分混合均匀，加入p4后会出现白色絮状沉淀。然后室温放置10min左右。离心5min，8000rpm 高速；
(7)将离心获得的溶液倒入过滤器CS中，推动过滤器，使液体通过过滤器进入一个干净的 50ml的收集管中；
(8)向上述收集的液体中加入0.3倍体积的异丙醇，轻轻的上下颠倒，充分混合均匀后将混 合后的液体加入吸附柱CP5中。
注：加入异丙醇的量过多会容易导致RNA的污染
过滤收集的液体一般会损失，所以可以根据损失量的不同加入不同体积的异丙醇。此外， 吸附柱CP5的最大容积为15ml，需要分次过柱；
(9)8000rpm高速离心2min，倒掉离心后收集的废液；
(10)向吸附柱中加入10ml漂洗有PW(提前加入无水乙醇)。8000rpm高速离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(11)重复操作步骤10；
(12)加入3ml无水乙醇至吸附柱中，室温8000rpm高速离心2min，倒掉收集管中的废液；
(13)重新将吸附柱CP5放回收集管中，8000rpm高速离心5min，将吸附柱中残余的漂洗液 去除；残留的无水乙醇会影响酶促反应为确保实验不受残留无水乙醇的影响，必须将吸附柱 CP5置于通风处室温放置数分钟，彻底使得吸附柱中残余的漂洗液蒸发；
(14)将吸附柱CP5放置于一个消毒而且干净的收集管中，向吸附柱中间的膜部位悬空滴加 1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm高速离心2min。将获得的收集管 中的洗脱液全部移入一个消毒而且干净的1.5ml离心管，-20℃保存；
4，western blot分析蛋白的表达水平。
4.1细胞蛋白提取
(1)PBS洗涤后0.2％胰酶消化下细胞，1000rpm高速离心5min收集细胞，按每5～10×106细胞 数加入500ul蛋白裂解液，上下晃动剧烈震荡细胞使之充分裂解。
(2)按每500ul蛋白裂解液加1ml蛋白抽提剂，反复振荡混合均匀，低温4℃环境(或冰上)静 置10分钟。
(3)在低温4℃环境离心机内12000rpm高速离心10分钟，溶液会分为两相，中间为蛋白膜。 小心尽量吸除上层相和下层相液体，保留下中间饼状蛋白絮状物。
(4)再加入1ml无水乙醇洗涤蛋白沉淀，低温4℃环境离心机内12000rpm高速离心3分钟，蛋 白沉淀在管底。
(5)吸掉EP管中全部液体，并置于室温空气下干燥沉淀10～15分钟，风干无水乙醇。
(6)向EP管内加入于适量蛋白溶解缓冲液(4％SDS)，沸水中煮10min使之完全溶解变性， 再转移到新的EP管中(蛋白量较多时最好进行分装处理，避免反复冻融，损伤蛋白质)， 标记好后放置于－20℃储存备用。
4.2 SDS－PAGE凝胶电泳
(1)清洗实验物品并小心组装电泳槽：
用洗衣粉或者洗洁精轻柔擦洗玻璃板和梳子，擦洗过后用消毒后干净的水冲洗干净，再 用蒸馏水多冲洗干净，然后放37度温箱内烘干。
(2)制胶与上样
①小心对齐玻璃板后放入夹板中卡紧，并垂直固定在架子上准备灌胶。(操作时动作要 轻柔，并注意不要漏胶。)
②按照实验配方配制12％的分离胶，每加完一次样品都要混合均匀，加入TEMED后立即 摇匀进行灌胶(注意不要产生气泡)。灌胶时用1ml移液器小心将分离胶沿玻璃板缓慢均匀加 入至适当高度，避免形成气泡。加无水乙醇封胶，注意动作要缓慢轻柔，否则胶会被冲变形。
③当胶充分凝固后(此时胶和无水乙醇之间有一条折射线)，倒掉封胶的无水乙醇，并 用吸水纸将无水乙醇吸干。
④按实验配方配制5％的浓缩胶,加样要充分混合均匀，加入TEMED后立即摇匀灌胶(注 意不要产生气泡)。将玻璃板之间余下空间灌满浓缩胶，然后将梳子保持水平小心缓慢插入 浓缩胶中，注意避免气泡的产生，必要时可以补点浓缩胶冲走气泡。
⑤大约30分钟之后浓缩胶完全凝固，轻柔缓慢拔出梳子，注意要两边同时垂直向上均匀 用力。将其放入电泳槽中，并用电泳液轻轻冲洗加样孔，电泳液至少要漫过薄玻璃板。
⑥取40～80μg蛋白的溶液体积作为上样量。将上样样品加入到200μl的EP管中，稀释5× 上样缓冲液至终浓度为1×加入到样品中。上样样品须用4％SDS将体积配平至相同，上样前 样品须在沸水中煮5分钟,使蛋白完全溶解变性。注意煮沸过程中尽量避免EP管炸开，造成样 品丢失，导致实验结果不准确。并且要注意上样量不能太多，防止样品溢出，造成实验误差。
⑦用10μl移液器将样品加入到上样孔中，上样时枪头轻轻插至上样孔中并缓慢加入样 品。每加一个样品都要更换枪头，避免交叉污染。
(3)电泳
连接电泳仪并调节电泳参数至恒压模式，浓缩胶时用80V恒压电泳，当溴酚蓝到达浓缩 胶和分离胶交界时再将电压调高至120V，直至溴酚蓝跑至底部，关闭电源，结束电泳，准备 下一步进行转膜。
4.3转膜
(1)小心轻柔取出电泳后的玻璃板，用封条轻柔缓慢缓地撬开玻板，注意动作不要过大， 不可强行撬开，以免撬破薄玻璃板，可先在两个边上轻轻的反复撬。除去薄玻璃板后，将浓 缩胶轻轻刮除，动作要轻柔，注意不要把分离胶刮破。根据实验需要以Marker作为对照，切 取所需要目的分子量的胶。
(2)根据切下来的胶剪取适当大小的硝酸纤维素膜，以稍大于胶的面积为宜，并将其预先 在甲醇溶液中浸泡放置15秒左右，可见硝酸纤维素膜由不透明转变为透明，之后取出并置于 超纯水中3分钟，最后将其置于转膜缓冲液中平衡10分钟。进行该操作需要戴橡胶手套，尽量 避免手上的蛋白质污染膜，影响实验结果。
(3)翻开转膜所用夹子，将夹子黑色的一面朝下、透明的一面朝上(即负极朝下、正极朝 上)放入装有转膜液的托盘中。按照海绵垫-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-海绵垫的顺序依次 整齐叠放，注意转膜液的液面要超过最上层的海绵垫，也不可过多，过多膜容易移动位置， 造成蛋白不能完全转移至膜上，再用试管或注射器来回反复几次擀走里面的气泡，注意擀气 泡要充分，否则影响转膜效果。最后将透明板小心盖好卡住固定装入转膜槽中。转膜液含有 甲醇，要注意自己和周边安全防护。
(4)将转膜夹放入到转膜槽中，要使转膜夹的黑色面对着转膜槽的黑色面，转膜夹的透明 面对着转膜槽的红色面。由于转膜时产生热量，转膜过程中要持续将槽子放置于冰块中进行 降温。根据实验中蛋白质的分子量大小转膜条件和时间。转膜时要注意电极方向:膜正胶负， 转膜时间不可过长，防止蛋白质转过硝酸纤维素膜。
(5)转膜结束后，取下硝酸纤维素膜标记。将与胶面接触的一面(此面含有蛋白质)朝上 用1×丽春红染液染色5分钟，然后在超纯水下进行漂洗，之后观察膜上的蛋白条带情况。修剪 硝酸纤维素膜，去除没有蛋白质的区域。
4.4免疫反应
(1)封闭：将修剪好的硝酸纤维素膜完全浸泡在含有5％脱脂奶粉的封闭液中，于室温下 摇床上摇动封闭2h或37℃1h。
(2)一抗孵育：用1xTBST将膜漂洗3次，每次10分钟。漂洗完后用三蒸水洗去TBST，之 后将膜与一抗一起放入保鲜袋中并密封，(一抗的量要足量，要将膜浸透)注意要尽量赶走 气泡否则会影响一抗与膜充分接触，影响之后的曝光结果，低温4℃环境冰箱中静置过夜。
(3)二抗孵育：取出膜并回收一抗，用1xTBST将膜在室温下漂洗3次，每次10分钟。之后 将膜放入稀释好的二抗中，室温下孵育2h后，再用1xTBST在室温下漂洗3次，每次10分钟， 然后准备进行曝光，检测实验结果。(注意全过程要始终保持膜的湿润)
4.5蛋白检测
将A和B两种试剂按照发光试剂盒说明书将其在避光条件下等体积充分混合均匀，将沥干 的膜(去尽残液，但仍然要注意保持湿润)与混合液充分接触3-5分钟，然后将膜移至 ChemiDoc-It化学发光成像分析系统曝光。记录实验结果并保存。
5，流式检测细胞凋亡情况。
按照上述实验研究分组，处理好细胞后，PBS清洗细胞两边，采用不含EDTA的胰蛋白酶 消化细胞，待显微镜下观察到细胞形态发生改变时，用完全培养基终止消化，用枪头轻轻将 细胞吹下，1000rpm离心5min,弃上清，PBS重悬2遍，收集细胞，加入100μ的buffer,随后加 入对应的凋亡染料PI及FITC，避光孵育15min,再加入400μ的buffer,流式上机检测。
本发明附图对应的技术结果如下：
图1是荧光定量PCR的统计图，表示ROCK2mRNA在骨肉瘤及表达显著高于癌旁组织。
图2是western blot图，表示ROCK2蛋白在骨肉瘤中表达显著高于癌旁组织。
图3是免疫组化图，表示在骨肉瘤标本中ROCK2表达显著提升。
图4是骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63中，干扰ROCK2后，mRNA及蛋白表达水平提示干扰成 功。
图5是CCK8图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。
图6是Edu图，表示干扰ROCK2及加入TRAIL后增殖显著减弱。
图7是流式图，表示降低ROCK2表达后可显著提升TRAIL的敏感性
图8是western blot图，表示减弱ROCK2表达后，TRAIL对骨肉瘤凋亡的影响。
图9是U2-OS细胞用不同剂量的TRAIL治疗48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图10是U2-OS细胞在无TRAIL(500ng/mL)存在或不存在的情况下，用指定浓度的Y-27632处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图11是骨肉瘤细胞U2-OS用Y-27632与TRAIL 500ng/ml联合处理48小时，流式细胞术检测细胞凋亡。
图12是western blot图，表示Y-27632与TRAIL 500ng/ml联合处理后Caspase3激活。
通过上述实施例和检测的附图可知，本发明的方法为TRAIL作为肿瘤的靶向治疗药物且 易产生耐药性的恶性肿瘤提供新的靶向治疗依据，为进一步提高肿瘤的靶向治疗提供新科学 依据。
虽然本发明以较优的实施例公开如上，但并非用于限定本发明的实施范围。任何本领域 的普通技术人员，在不脱离本发明的范围内，可做少许改动，即凡是依照本发明所做的同等 改进，均为本发明的范围所覆盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学第二附属医院
<120> Rho
相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中
的应用
<130> 2019
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-1F
<400> 1
caccgcagct ggaatctaac aatagcgaac tattgttaga ttccagctgc 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-1R
<400> 2
aaaagcagct ggaatctaac aatagttcgc tattgttaga ttccagctgc 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-2F
<400> 3
caccgcagaa gaaacaggaa ttacacgaat gtaattcctg tttcttctgc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-2R
<400> 4
aaaagcagaa gaaacaggaa ttacattcgt gtaattcctg tttcttctgc 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-3F
<400> 5
caccgctaca tatggagctt aaatccgaag atttaagctc catatgtagc 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-3R
<400> 6
aaaagctaca tatggagctt aaatcttcgg atttaagctc catatgtagc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-4F
<400> 7
caccgccaca agggacatga gtttacgaat aaactcatgt cccttgtggc 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> shROCK2-4R
<400> 8
aaaagccaca agggacatga gtttattcgt aaactcatgt cccttgtggc 50

Claims (5)

1.一种ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：技术手段为：
(1)首先采用荧光定量PCR、western blot及免疫组化分析骨肉瘤标本及癌旁组织中ROCK2的表达，然后分析其与预后的关系；
(2)然后采用干扰技术，将阴性对照及干扰ROCK2的质粒分别导入骨肉瘤细胞U2-OS及MG-63，然后加入TRAIL，随后我们又将阴性对照及上调ROCK2的慢病毒导入骨肉瘤细胞系U2-OS，然后采用western blot、免疫荧光、CCK8、Edu、流式细胞术分析了骨肉瘤细胞中TRAIL的敏感性，通过以上实验，明确干扰ROCK2后抑制ROCK2激酶的活性能增强TRAIL的敏感性，从而为揭示新的治疗靶点，更有效的增强TRAIL的敏感性提供科学依据。
3.根据权利要求2所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：具体的技术手段如下：
(1)ROCK2在骨肉瘤的表达情况
收集骨肉瘤标本及癌旁组织并采用免疫组化、western blot及荧光定量PCR分析ROCK2的表达情况；
(2)分析骨肉瘤中ROCK2的表达与骨肉瘤的预后关系；
(3)采用RNA干扰技术降低ROCK2的表达后分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性：
(3.1)提取RNA及细胞总蛋白，应用荧光定量PCR及western blot检测shNC及shROCK2中ROCK2表达情况；
(3.2)利用稳定干扰ROCK2的骨肉瘤细胞并加入TRAIL，分析其对TRAIL的敏感性；
(4)采用CCK8及Edu分析稳定低表达ROCK2细胞的增殖能力，加入TRAIL后，进一步分析其增殖能力；
(5)采用流式凋亡实验及western blot检测凋亡相关蛋白表达情况分析骨肉瘤细胞对TRAIL的敏感性；
(6)采用慢病毒转染技术建立稳定高ROCK2骨肉瘤细胞株：
(6.1)提取细胞总蛋白及RNA,荧光定量PCR及western blot检测ROCK2的表达情况；
(6.2)在此基础上加入TRAIL,分析稳定高表达ROCK2后骨肉瘤对TRAIL的敏感性；
(7)不同剂量的TRAIL处理骨肉瘤细胞，流式技术检测细胞凋亡情况；
(8)加入或者不加TRAIL，加入ROCK2抑制剂Y27632，流式技术检测细胞凋亡情况，并检测Caspase3的表达情况。
4.根据权利要求3所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：所述的ROCK2采用的抑制剂为Y27632，干扰ROCK2的为shROCK2。
5.根据权利要求4所述的ROCK2在制备治疗逆转骨肉瘤细胞对TRAIL耐药药物中的应用，其特征在于：所述的shROCK2设计有4对oligos退火到pSIREN-RetroQ-TetH中的序列：
shROCK2-1F5'-CACCGCAGCTGGAATCTAACAATAGCGAACTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3'
shROCK2-1R5'-AAAAGCAGCTGGAATCTAACAATAGTTCGCTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3'；
shROCK2-2F5'-CACCGCAGAAGAAACAGGAATTACACGAATGTAATTCCTGTTTCTTCTGC-3'
shROCK2-2R5'-AAAAGCAGAAGAAACAGGAATTACATTCGTGTAATTCCTGTTTCTTCTGC-3'；
shROCK2-3F5'-CACCGCTACATATGGAGCTTAAATCCGAAGATTTAAGCTCCATATGTAGC-3'
shROCK2-3R5'-AAAAGCTACATATGGAGCTTAAATCTTCGGATTTAAGCTCCATATGTAGC-3'；
shROCK2-4F5'-CACCGCCACAAGGGACATGAGTTTACGAATAAACTCATGTCCCTTGTGGC-3'
shROCK2-4R5'-AAAAGCCACAAGGGACATGAGTTTATTCGTAAACTCATGTCCCTTGTGGC-3'。
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