CN111411088A - 一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用 - Google Patents

一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用。本发明发现TcpC具有泛素化功能，不仅能在体外发生泛素化，而且能在体内发生泛素化。本发明研究表明，尿路致病性大肠埃希菌CFT073菌株分泌的一种含有Toll/白细胞介素1受体结构域蛋白TcpC能增强TLR信号通路中MyD88的泛素化降解，阻断TLR信号通路，抑制巨噬细胞介导的固有免疫功能，与UPEC所致肾盂肾炎等尿路感染的发生密切相关。本发明发现，原核表达重组蛋白rTcpC能剂量依赖性地引起巨噬细胞MyD88蛋白减少，但不影响myd88mRNA转录，rTcpC能够在细胞内及体外显著增强MyD88的泛素化水平。应用本发明可将TcpC作为制备尿路感染治疗药物的靶点，也是临床上尿路感染患者实验室检查的分子标志物。

Description

一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用
技术领域
本发明属于分子生物技术和医学领域，具体涉及一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用。
背景技术
尿路感染(urinary tract infection,UTI)是由各种病原体入侵泌尿系统、侵犯尿路黏膜或者尿路组织而引起的尿路炎症，部分严重患者可导致肾功能衰竭。据估计，全球每年约有1.5亿UTI患者，医疗费用超过60亿美元。因此，若能控制尿路感染的发生，对人类健康及社会经济发展具有重要意义。尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic E.coli,UPEC)可以特异性地粘附、植入尿路黏膜上皮细胞，导致尿路上行感染。针对尿路感染目前多采用抗生素类药物进行治疗，但随着病原菌耐药性的增加，给尿路感染的治疗带来了极大挑战。因此，深入研究UPEC的致病机制，将对尿路感染的控制和治疗产生重大影响。
UPEC CFT073菌株可分泌一种含有Toll/白细胞介素1受体(Toll/interleukin 1receptor,TIR)结构域的蛋白(TIR containing protein encoded by E.coli,TcpC)，它可以通过C端的TIR结构域直接与Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路中的关键接头蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)结合，阻断TLR介导的信号途径，从而抑制巨噬细胞的活化和杀菌功能，利于UPEC在体内的存活，与UPEC所致肾盂肾炎等UTI的发生、发展密切相关。因此，TcpC作为UPEC重要的毒力因子，在UPEC逃逸人体固有免疫应答中发挥重要作用。
泛素是含有76个氨基酸的蛋白质，广泛存在于真核细胞和组织中。泛素化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一，在蛋白质降解、应激反应、细胞周期调节、蛋白质运输、信号转导和转录调节等过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明泛素化与细胞免疫和炎症反应、细胞的转化和肿瘤的发生等密切相关。泛素化过程由一个或多个泛素分子在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的共同作用下与其它蛋白质分子共价结合并通常降解这些蛋白质。该过程首先起始于E1利用ATP在Mg2+的存在下催化泛素C末端的甘氨酸，形成泛素-腺苷酸中间产物，然后激活的泛素被转移至E1的半胱氨酸残基上；活化的泛素通过转酰基作用进一步转移到E2上形成E2-泛素巯基酯；之后泛素再被转移到与E2结合的E3上，E3特异性结合底物蛋白，从而使泛素链与底物连接，最终在蛋白酶体的作用下，导致底物蛋白降解。
在蛋白质泛素化过程中，E3不仅要与E2结合，还需特异地结合底物蛋白，具有十分关键的作用。迄今，已发现2种E1、约50种E2和600种E3。其中E3可分为含有RING(ReallyInteresting New Gene)、HETC(Homologous to EA6P C-Terminus)和RBR(RING-between-RING)三种结构域类型。RING结构域一般由半胱氨酸和组氨酸通过两个锌离子交叉支撑排列；HETC结构域包括N末端底物结合结构域和C末端HETC结构域，HETC结构域在泛素化过程中是必需的，其中半胱氨酸起着关键作用，若该位点发生突变，酶活性就会完全失活；而根据HETC与底物作用的结构域，HETC又可分为包含RCC1类似结构域(RLDs)的HERC E3、包含色氨酸-色氨酸结构域(WW)的能与含有PY基序的底物结合的Nedd4/Nedd4样E3、不包含RLDs和WW结构域的SI(ngle)-HETC E3；RBR结构域包含RING1-IBR-RING2基序。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种新的E3泛素连接酶TcpC，所述泛素连接酶TcpC为如下a)或b)所述的蛋白：
a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。
另一方面，一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
c)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
另一方面，提供根据第一方面中a)或b)所述的蛋白作为泛素连接酶TcpC的应用。
另一方面，提供一种新的E3泛素连接酶TcpC活性鉴定方法，所述泛素连接酶TcpC的氨基酸序列为SEQ ID No.2，该氨基酸序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点，通过检测该关键位点来判断E3泛素连接酶TcpC的活性。
进一步地，所述TcpC的核苷酸序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点Cys12与关键功能结构域WW结构域。
另一方面，提供一种制剂或试剂盒，该制剂或试剂盒含有第一方面所述的泛素连接酶。
另一方面，提供根据第一方面所述的E3泛素连接酶TcpC作为尿路感染治疗药物作用靶位点的应用。
另一方面，提供根据第一方面所述的E3泛素连接酶TcpC在筛选尿路感染治疗药物中的应用。
进一步地，通过体外检测TcpC的E3泛素连接酶活性来对尿路感染治疗药物进行筛选。
本发明取得的有益效果：
本发明分析了野生型UPEC分泌的TcpC对巨噬细胞中MyD88蛋白水平与mRNA转录水平的影响，发现与空白对照组相比，TcpC可明显促进MyD88降解却不影响其转录。我们构建了TcpC重组表达工程菌E.coli BL21DE3pET42a-tcpc表达目的重组蛋白rTcpC，rTcpC处理巨噬细胞系后，发现去除LPS影响的rTcpC可剂量依赖性地抑制胞内MyD88蛋白水平，却对myd88mRNA水平无显著影响；利用CO-IP与WB检测rTcpC对胞内MyD88泛素化水平的影响，发现rTcpC可显著增强MyD88泛素化水平并促进其降解。生物信息学分析表明TcpC包含E3泛素连接酶的关键活性位点，并且人或小鼠的MyD88含有E3泛素连接酶底物的PY基序。体外泛素化试剂盒检测结果显示TcpC具有E3泛素连接酶活性。上述结果提示TcpC作为UPEC的毒力因子，通过发挥自身E3泛素连接酶功能，增强巨噬细胞中MyD88的泛素化水平促进其降解，阻断了TLR信号通路，从而抑制巨噬细胞发挥免疫杀菌功能，利于UPEC在体内的存活与繁殖。本发明阐明了UPEC感染机体后TcpC的致病机制，提供了一种新的尿路感染治疗的药物作用靶点，为筛选尿路感染治疗药物与制定尿路感染治疗方案提供新的方向与策略。
附图说明
图1：野生型CFT073诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾脏巨噬细胞内MyD88水平下降。(A)肾盂肾炎模型小鼠肾脏大体观察。分泌TcpC的野生型CFT073(CFT073wt)感染组肾脏可见明显的脓肿，而tcpc基因敲除的CFT073(CFT073Δtcpc)感染组未见脓肿发生。(B)肾盂肾炎模型小鼠肾脏组织学检查。CFT073wt感染组肾组织可见显著的中性粒细胞浸润。(C)Westernblot检测肾盂肾炎模型小鼠肾脏巨噬细胞内MyD88蛋白水平。与CFT073Δtcpc感染组相比，CFT073wt感染组肾脏巨噬细胞内MyD88蛋白水平显著下降。(D)ImageJ软件对3次(C)实验中MyD88条带灰度分析统计。*：p<0.05。
图2：Western blot检测CFT073wt对巨噬细胞MyD88蛋白水平的影响。(A)Westernblot检测CFT073wt处理的巨噬细胞MyD88蛋白水平。(B)ImageJ软件对3次(A)实验中MyD88条带灰度分析统计。*：p<0.05，**：p<0.01。
图3：rTcpC的表达及提纯。(A)rTcpC表达及纯化的SDS-PAGE分析；M:maker，1：E.coli BL21DE3总蛋白，2：E.coli BL21DE3pET42a-tcpc诱导表达蛋白，3：提纯的rTcpC。(B)rTcpC纯化曲线。(C)提纯的rTcpC LPS检测为阴性。
图4：rTcpC对巨噬细胞胞内MyD88蛋白水平及mRNA水平的影响。(A)rTcpC剂量依赖性地抑制J774A.1胞内MyD88蛋白水平。(B)rTcpC剂量依赖性地抑制RAW264.7胞内MyD88蛋白水平。(C)rTcpC处理J774A.1后胞内MyD88表达条带灰度值的定量统计学分析，*：p<0.05反映与rTcpC未处理的J774A.1胞内MyD88表达条带的灰度值比较。(D)rTcpC处理RAW264.7后胞内MyD88表达条带灰度值的定量统计学分析，*：p<0.05反映与rTcpC未处理的RAW264.7胞内MyD88表达条带的灰度值比较。(E)qRT-PCR检测rTcpC对J774A.1胞内myd88 mRNA水平的影响。(F)qRT-PCR检测rTcpC对RAW264.7胞内myd88 mRNA水平的影响。
图5：rTcpC对巨噬细胞胞内MyD88泛素化水平的影响。(A)rTcpC处理J774A.1后增强MyD88的泛素化并促进其降解。(B)rTcpC处理RAW264.7后增强MyD88的泛素化并促进其降解。
图6：TcpC和人及小鼠MyD88氨基酸序列的生物信息学分析。(A)TcpC序列包含泛素化及TIR结构域。(B)TcpC序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点Cys12及WW结构域。(C)人MyD88序列含有E3泛素连接酶底物的PY基序。(D)小鼠MyD88序列含有E3泛素连接酶底物的PY基序。
图7：TcpC的E3泛素连接酶活性鉴定。(A)rTcpC在体外能够增强J774A.1胞内MyD88或rMyD88的泛素化。(B)rTcpC在体外能够增强RAW264.7胞内MyD88或rMyD88的泛素化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：GenBank(GQ903014.1)TcpC的核苷酸(SEQ ID No.1)和氨基酸序列(SEQID No.2)。
实施例2：肾盂肾炎模型小鼠的构建和验证以及肾脏巨噬细胞MyD88蛋白水平检测。
我们在已有分泌TcpC的CFT073野生株(CFT073wt)的基础上，通过基因同源重组技术构建了敲除tcpc基因的CFT073突变株(CFT073Δtcpc)。
1.肾盂肾炎模型小鼠的构建和验证
1)将CFT073wt、CFT073Δtcpc于LB液体培养基中培养至对数生长期，5500rpm/min，4℃离心30min，弃上清，用LB培养基洗涤细菌3次后重悬至1×1010CFU/mL。
2)选取SPF级，6-8周的雌性C57BL/6小鼠24只，分为空白对照组、CFT073wt组与CFT073Δtcpc组，每组8只小鼠。
3)用Avertin(40mg 2,2,2-三溴乙醇溶于1mL叔丁醇)麻醉小鼠(腹膜内0.01mL/g)，0.61mm软聚乙烯导管从小鼠的尿道至膀胱滴注0.1mL(1×109CFU)的细菌悬液或LB培养基，3天处死小鼠取肾脏观察大体形态变化。
4)将新鲜肾脏于4％多聚甲醛中固定24h，将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
5)将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II30min-醇苯5-10min-二甲苯I5-10min-二甲苯II5-10min-蜡I1h-蜡II1h-蜡III1h。
6)将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冰箱冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
7)将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片，制成石蜡切片。
8)依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
9)切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
10)切片入伊红染液中染色1-3min。
11)将切片依次放入95％酒精I5min-95％酒精II5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。12)显微镜下观察切片的病理变化。
2.肾脏巨噬细胞MyD88蛋白水平检测
1)上述方法取小鼠肾脏后，除去外包膜，用2mL PBS浸泡于培养皿中(冰上操作)。
2)用PBS灌注肾脏，除去肾小球中的血细胞。
3)剪碎肾脏，用配制好的消化液(0.5mg/mL的胶原酶和100μg/mL的DNA酶)在37℃条件下消化25min。预冷的PBS停止消化，过70μm滤网，1000rpm，离心5min。
4)破红，加入5mL Tris-NH4Cl，常温5-10min。1000rpm，离心5min。
5)重悬后过40μm滤网。滤液即为肾脏细胞悬液。
6)细胞计数后于细胞悬液中加入少许Buffer(2mM EDTA、0.5％BSA溶于PBS)，洗涤，800rpm/min，离心10min后，弃上清。
7)每108个细胞用100μl Buffer重悬，加入100μl的CD11b+磁珠，4℃孵育20min。
8)每107个细胞加入1-2ml Buffer，离心10min，弃去上清，500μl Buffer重悬。
9)磁珠分选：将MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上，并将MS分选柱放到磁铁中，用预冷的0.5ml MACS缓冲液润洗分选柱，将细胞悬液上样到分选柱上，用缓冲液冲洗分离柱，每次0.5ml，洗3次，从磁铁上取下分选柱，用1ml Buffer洗脱柱子内的细胞，即为肾脏CD11b+细胞。采用CD11b和F4/80流式抗体标记，流式细胞仪分选CD11b+和F4/80+的细胞即为肾脏巨噬细胞。
10)收集上述各组肾脏巨噬细胞，RIPA冰上裂解30min后，12000r/min，4℃，离心30min后收集上清，BCA试剂测定蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液沸水浴3-5min后进行WB检测。
SDS-PAGE的操作步骤
1)安装SDS-PAGE电泳装置：用两块干净电泳玻璃板和封条制成垂直板槽，垂直放置。
2)配制5mL 12％分离胶：水1.6mL，30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺2.0mL，pH 8.8 Tris1.3mL，10％(W/V)SDS 50μL，10％(W/V)过硫酸铵50μL，TEMED 4μL。灌注分离胶，留出灌注浓缩胶所需空间，并用蒸馏水封闭。
3)室温放置30-60min待分离胶凝固后，倒去用于封闭的蒸馏水，再用滤纸的边缘吸净残留液体。
4)配制2mL 5％浓缩胶：水1.4mL，30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺0.33mL，pH 6.8 Tris0.25mL，10％(W/V)SDS 20μL，10％(W/V)过硫酸铵20μL，TEMED 2μL。在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的10孔梳子，室温放置30min左右待凝固。
5)浓缩胶聚合完全后，卸去封条，用滤纸擦去电泳板底部和边缘多余液体，在电泳槽中加入适量1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，把电泳板放入电泳槽中，放置电泳板底部避免产生气泡，以免影响电流通过。
6)分别在电泳板内外侧加入适量1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，并小心移出Teflon梳子，电泳缓冲液需灌满每个加样孔。
7)分别各组蛋白样品80μL，并加入20μL 5×上样缓冲液，混匀，沸水浴中煮沸3-5min，每孔10-20μL上样。
8)接通电源，80V恒压电泳，当溴酚蓝指示剂前缘进入分离胶后，调整电压至120V，恒压电泳至溴酚蓝指示剂至凝胶下端，关闭电源。
WB步骤如下：
1)将蛋白分别进行12％SDS-PAGE电泳。
2)电泳完成后，将带有重组白的SDS-PAGE胶浸泡于膜转移缓冲液中，同时把两张3mm厚滤纸浸于膜转移缓冲液中。
3)剪一张与胶同样大小的PVDF膜，依次进行如下处理：浸于100％甲醇溶液中10s；浸于去离子水中3min；浸于膜转移缓冲液中3min。
4)电转三明治顺序如下：阴极(-)-厚滤纸-SDS-PAGE胶-PVDF膜-厚滤纸-阳极(+)。
5)将三明治放入装有适量转膜缓冲液的电泳槽中，注意各接触面不应有气泡，加盖，接通电源，恒压25V，25min。
6)将电转后的PVDF膜取下，用TBST短暂冲洗后，于封闭液中4℃过液。用TBST洗涤PVDF膜三次，每次5min。
7)将PVDF膜浸入1：5000稀释的一抗(兔抗MyD88 IgG)稀释液中，4℃摇床孵育过夜，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次5min。
8)将PVDF膜浸入1：2500稀释的羊抗兔IgG-HRP(酶标二抗)中，37℃摇床反应1h，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次5min。
9)ECL显色：A液和B液按40：1混匀后加到膜上，温育1min后进行曝光检测。
本发明发现CFT073wt诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾脏巨噬细胞内MyD88水平下降(图1)。
实施例3：CFT073wt对巨噬细胞MyD88蛋白水平的抑制作用。
1.小鼠骨髓巨噬细胞(BMDM)的制备：无菌取SPF级C57BL/6小鼠骨髓，用DMEM培养基制备骨髓细胞悬液。以淋巴细胞分离液密度梯度离心，吸取单个核细胞层，PBS洗涤后悬于含有M-CSF(10ng/mL)的DMEM培养基中，调整细胞的浓度为1×107/mL，接种至6孔板中。37℃，5％CO2培养3d后用新鲜培养基补充贴壁细胞，并在第7d收集贴壁的细胞。经CD11b免疫磁珠分选获得BMDM，然后流式检测CD11b+和F4/80+细胞纯度。
2.将BMDM、巨噬细胞系(J774A.1、RAW264.7)(5×105)分别与CFT073wt或CFT073Δtcpc用Transwell隔开共培养(感染复数MOI＝100)4、8、12h。
3.收集上述各组细胞RIPA冰上裂解30min后，12000r/min，4℃，离心30min后收集上清，BCA试剂测定蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液沸水浴3-5min后进行WB检测。WB步骤如上所述。
本发明发现CFT073wt能够显著抑制BMDM、J774A.1和RAW264.7胞内MyD88水平(图2)。
实施例4：重组TcpC蛋白的表达及纯化
我们已构建了UPEC CFT073 tcpc基因原核重组表达系统。采用0.1mmol/L IPTG诱导E.coli BL21DE3pET42a-tcpc表达目的重组蛋白rTcpC。采用全自动蛋白纯化仪分离纯化rTcpC，SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统观察表达及提纯效果(图3)。
1.目的蛋白的诱导表达
1)从平板上挑取单个分离良好，直径约2-3mm的E.coli BL21DE3pET42a-tcpc半透明白色菌落于10mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养过夜。
2)吸取过夜培养的菌液1mL于新鲜的含50μg/mL卡那霉素500mL LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD值为0.6-0.8，约2.5h。
3)加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃220rpm振荡诱导培养6h。
4)4℃12000×g，15min收集菌体。
5)PBS洗三次，洗涤时间5min，每次洗涤后4℃，12000×g，15min。
6)加入1/20细菌生长体积的GuNTA-0Buffer和125μL 200mM的PMSF。
7)悬浮细胞，冰上超声破碎细胞。
8)室温放置30min，间或混匀或用磁力搅拌。
9)4℃12000×g，20min，取上清，置于冰上备用。
2.将样品经全自动蛋白纯化仪，通过Ni柱结合目的蛋白，不同浓度咪唑洗脱目的蛋白。
3.利用超滤管8000r/min，20min，4℃离心超滤浓缩获得纯化目的蛋白。
4.按照BCA蛋白浓度定量试剂盒说明操作，测定重组蛋白浓度。
5、SDS-PAGE确定目标蛋白的纯化效果。
6、染色：小心剥下电泳板的SDS-PAGE凝胶，并用新配的考马斯亮蓝R250染色液染色15min，再用脱色液脱色2-3h。
实施例5：用Detoxi-Gel层析柱法去除rTcpC中可能存在的微量LPS
1.将5倍柱体积1％的脱氧胆酸钠加入到层析柱中，然后用5倍柱体积的超纯水去除多余的脱氧胆酸钠。
1)用5倍柱体积的超纯水平衡层析柱。
2)将rTcpC加入到层析柱中，封住出液口，静置1h后收集样品。
用内毒素定量试剂盒测定rTcpC中LPS含量。
2.内毒素标准曲线的制作：
1)制备200μL 1.0EU/mL的内毒素溶液。
2)将100μL LAL水加入到3个试管中，设3个重复。
3)将100μL内毒素溶液按照2倍稀释法依次加到3个试管中，使4个试管中的内毒素浓度分别为1.0、0.5、0.25、0.1EU/mL。
3.内毒素的定量测定：
1)将检测试剂于37℃孵育10min。
2)加入底物溶液与待测样品混匀后37℃孵育6min。设LAL水及0.5ng E.coli LPS为对照。
3)加入终止试剂。
4)测定样品在405nm处的吸光值。
本发明构建可表达重组TcpC蛋白的工程菌，通过全自动蛋白纯化仪及LPS去除层析柱获得LPS检测为阴性的rTcpC蛋白，并用SDS-PAGE检测蛋白纯度，获得的rTcpC可用于后续实验(如图3)。
实施例6：rTcpC处理J774A.1与RAW264.7后胞内MyD88表达水平的检测将1、2、4、8μg/mL rTcpC与J774A.1或RAW264.7(5×105/mL)孵育0、1、2、4、8、12、16、20、24h后，收集细胞RIPA冰上裂解30min后，12000r/min，4℃，离心30min后收集上清，BCA试剂测定蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液沸水浴3-5min后进行WB检测。WB步骤如上所述。结果显示，rTcpC以剂量和时间依赖的方式抑制巨噬细胞MyD88蛋白水平(图4)。
实施例7：rTcpC处理J774A.1与RAW264.7后胞内myd88转录水平的检测
RT-PCR操作步骤如下：
1.获取细胞总RNA
1)收集上述各时间点rTcpC孵育的细胞，彻底去除上清，每份样品加入1mL Trizol试剂，充分混匀。
2)将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。
3)加入200μL氯仿，充分剧烈振荡15s后于15-30℃静置3-5min，使其自然分层。
4)4℃12000×g，15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。
5)取上层水相，加入500μL异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。
6)4℃12000×g，10min后弃上清。
7)向沉淀中加入1mL 75％乙醇(用RNase-free水配制)，轻轻混匀，悬浮沉淀。
8)4℃7500×g，5min后弃上清。
9)将RNA样品凉干，加入适量DEPC水溶解，-70℃保存备用。
2.参照Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书，首先采用基因组DNA的去除反应体系(表1)进行基因组DNA的去除，然后用逆转录反应体系(表2)再进行逆转录反应。
表1 总RNA中基因组DNA去除反应体系
Figure BDA0002397261750000101
反应条件：42℃2min。
表2 总RNA反转录反应体系
Figure BDA0002397261750000102
反应条件：37℃15min，85℃5s。
荧光定量PCR
按表3配制qRT-PCR反应液(反应体系配制在冰上进行)。
表3 cDNA qRT-PCR反应体系
Figure BDA0002397261750000103
应用CFX96荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应，反应采用二步法，参数为：Stage 1：预变性(Reps：95℃，30s)；Stage 2：PCR反应(Reps：40；95℃，5s；60℃，34s；设DissociationStage(熔解曲线))。反应完成后确认qRT-PCR反应的扩增和熔解曲线，以β-actin为内参，并用2-ΔΔCT法计算CQ值。
qRT-PCR引物如下：
myd88:上游引物:GGCTGCTCTCAACATGCGA
下游引物:CTGTGTCCGCACGTTCAAGAβ-actin:上游引物:ATGGATGACGATATCGCTG
下游引物:AACACCCATTCCCTTCACAG
结果显示，rTcpC不影响巨噬细胞MyD88的mRNA水平(图4)。
实施例8：ImageJ软件分析WB条带灰度
采用ImageJ软件对WB条带灰度值进行分析，以孵育0小时的条带灰度值为1，处理后的蛋白条带灰度值采用倍数呈现。
该发明验证了rTcpC与J774A.1或RAW264.7共孵育后可促进MyD88降解但对MyD88的转录水平没有显著影响。
实施例9：免疫共沉淀检测rTcpC对巨噬细胞MyD88泛素化水平的影响
4μg/mL rTcpC处理J774A.1或RAW264.7(5×105/mL)16h后4℃1000×g，10min，收集细胞，PBS洗涤三次。PBS重悬细胞，冰上RIPA裂解，4℃10000×g，30min，收集细胞总蛋白上清，用BCA试剂盒测定其浓度。将稀释于500μL PBS中的鼠抗MyD88-IgG与100μL 6mg/mL蛋白A包被的琼脂糖珠子于4℃90rpm旋转混匀2h，200μg细胞总蛋白与稀释于500μL PBS中的鼠抗MyD88-IgG于4℃90rpm旋转混匀2h。上述两种混合物于4℃90rpm旋转混匀1h，4℃14000×g，10min，PBS洗涤珠子三次，将珠子重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中，100℃煮沸5min，离心取上清后SDS-PAGE电泳后转膜检测珠子上释放的蛋白。WB操作步骤参照实施例2。
该发明检测了rTcpC具有增强巨噬细胞胞内MyD88泛素化水平的功能，并可与MyD88结合(图5)。
实施例10：NCBI在线软件分析TcpC功能结构域与MyD88氨基酸序列
在NCBI nucleotide数据库中搜索UPEC CRT073 TcpC核苷酸序列并在线分析核苷酸序列中的功能结构域，将TcpC的核苷酸序列的Fasta格式复制粘贴至EBI开发的EMBOSS数据库中，在线翻译分析TcpC氨基酸序列中的结构域。同样的操作步骤分析人或小鼠MyD88氨基酸序列中含有的基序结构。
生物信息学分析发现，TcpC基因序列中含有TIR结构域(如图6A)，TcpC的核苷酸序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点Cys12与关键功能结构域WW结构域(如图6B)，人或小鼠的MyD88氨基酸序列中含有可以与HECT型E3泛素连接酶结合且相互作用的PY基序(如图6C-D)。
实施例11：体外泛素化试剂盒鉴定rTcpC E3泛素连接酶活性
1.将4μg/mL的rTcpC替代试剂盒中的E3泛素连接酶，人重组MyD88或J774A.1或RAW264.7细胞裂解物替代试剂盒中的底物S5a。
2.按照Boston体外泛素化试剂盒说明操作。
3.反应结束后加5×loading混匀，沸水浴10min。
4.将蛋白样品进行WB。WB操作步骤参照实施例4。
5.封闭后的PVDF膜孵1：10000稀释比兔抗人Ub一抗，4℃过夜，摇床孵育。
6.过夜孵育一抗后TBST洗6次，每次5min。
7.将PVDF膜浸入1：5000的羊抗兔荧光二抗中，常温摇床孵育2h，用TBST洗6次，每次5min。用扫膜仪的700通道进行扫膜观察rTcpC对MyD88的泛素化作用。
WB的结果表明TcpC具有E3泛素连接酶的功能，可在体外增强MyD88的泛素化水平(图7)。
本发明发现，来源于CFT073wt诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾脏的巨噬细胞和CFT073wt处理的巨噬细胞，其胞内MyD88显著下降(图1、图2)。为了研究TcpC抑制巨噬细胞MyD88蛋白水平的机制，我们通过基因重组技术，制备了无LPS污染的rTcpC蛋白(图3)。用所制备的rTcpC处理巨噬细胞，发现能剂量依赖性地抑制胞内MyD88的蛋白水平(图4A-D)，但是胞内myd88mRNA水平却没有显著变化(图4E-F)，提示TcpC具有促进胞内MyD88降解的功能；为进一步验证TcpC是否具有增强MyD88泛素化的生物活性，我们利用免疫共沉淀实验证实rTcpC对巨噬细胞MyD88泛素化水平的增强作用(图5)，并且用体外泛素化实验证实了TcpC的E3泛素连接酶活性(图7)。该发明发现了TcpC的一种新的致病机制，即通过促进MyD88泛素化降解，阻断TLR信号途径，抑制机体固有免疫功能。本发明提示，可体外检测TcpC的E3泛素连接酶功能活性，作为尿路感染患者实验室检查的分子靶标，辅助诊断尿路感染患者，也可作为尿路感染治疗药物新的作用靶点，在新药研发中发挥作用，为阐明尿路感染的发病机制和尿路感染的治疗提供新的策略与方向。
序列表
<110> 浙江大学城市学院
<120> 一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
gtgatagcat atgaaaacat agaatttttt atatgcttgg tgaatgtttt gggcaacaat 60
atgtataata tccttttctt catctttctt tcaatagcaa ttccattcct tttattcctc 120
gcatggaaac agcacctaaa aaccaaagag attcgttcat atctattgaa agagggatat 180
aatattattt tcaacggaga aggtaactca tatctcgcgt ttaatattag taatgcgaca 240
tttcgcgcag gtaatttaac ttccaatgat tattttcaag catcaatttc ttatatccac 300
gattatagat gggagtggaa ggaggttgag gcaaagaaaa taaataatat atttattatt 360
tacatttcga atattgattt cccttcccaa aaactatttt atcgcaataa taaatcttta 420
gcagaaatag actgggcaaa attacaagca atttttcatc aaccatatga aatacagaat 480
gacgtcatgc aagataacaa taatacgcac tatgattttt tcatatccca tgcaaaagag 540
gataaagata cttttgtcag accactggta gacgagttaa atagacttgg tgtaattatt 600
tggtatgatg aacagacact tgaagtcggc gatagcttaa ggagaaatat tgatttaggc 660
ctaagaaaag caaattatgg catagtcata ctttctcata actttctaaa caagaaatgg 720
acacaatacg aattagatag tttaattaat cgtgcagtgt atgatgataa taagattata 780
ttgccaatct ggcataatat caatgctcaa gaggtatcta aatacagcca ttatttggcg 840
gataaaatgg cactgcaaac ttctttatat agcgttaagg aaatagcaag agagttggct 900
gaaatagcat acaggagaag ataa 924
<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Met Ile Ala Tyr Glu Asn Ile Glu Phe Phe Ile Cys Leu Val Asn Val
1 5 10 15
Leu Gly Asn Asn Met Tyr Asn Ile Leu Phe Phe Ile Phe Leu Ser Ile
20 25 30
Ala Ile Pro Phe Leu Leu Phe Leu Ala Trp Lys Gln His Leu Lys Thr
35 40 45
Lys Glu Ile Arg Ser Tyr Leu Leu Lys Glu Gly Tyr Asn Ile Ile Phe
50 55 60
Asn Gly Glu Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Phe Asn Ile Ser Asn Ala Thr
65 70 75 80
Phe Arg Ala Gly Asn Leu Thr Ser Asn Asp Tyr Phe Gln Ala Ser Ile
85 90 95
Ser Tyr Ile His Asp Tyr Arg Trp Glu Trp Lys Glu Val Glu Ala Lys
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Ile Phe Ile Ile Tyr Ile Ser Asn Ile Asp Phe Pro
115 120 125
Ser Gln Lys Leu Phe Tyr Arg Asn Asn Lys Ser Leu Ala Glu Ile Asp
130 135 140
Trp Ala Lys Leu Gln Ala Ile Phe His Gln Pro Tyr Glu Ile Gln Asn
145 150 155 160
Asp Val Met Gln Asp Asn Asn Asn Thr His Tyr Asp Phe Phe Ile Ser
165 170 175
His Ala Lys Glu Asp Lys Asp Thr Phe Val Arg Pro Leu Val Asp Glu
180 185 190
Leu Asn Arg Leu Gly Val Ile Ile Trp Tyr Asp Glu Gln Thr Leu Glu
195 200 205
Val Gly Asp Ser Leu Arg Arg Asn Ile Asp Leu Gly Leu Arg Lys Ala
210 215 220
Asn Tyr Gly Ile Val Ile Leu Ser His Asn Phe Leu Asn Lys Lys Trp
225 230 235 240
Thr Gln Tyr Glu Leu Asp Ser Leu Ile Asn Arg Ala Val Tyr Asp Asp
245 250 255
Asn Lys Ile Ile Leu Pro Ile Trp His Asn Ile Asn Ala Gln Glu Val
260 265 270
Ser Lys Tyr Ser His Tyr Leu Ala Asp Lys Met Ala Leu Gln Thr Ser
275 280 285
Leu Tyr Ser Val Lys Glu Ile Ala Arg Glu Leu Ala Glu Ile Ala Tyr
290 295 300
Arg Arg Arg
305

Claims (9)

1.一种新的E3泛素连接酶TcpC，其特征在于，所述泛素连接酶TcpC为如下a)或b)所述的蛋白：
a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
c)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求1中a)或b)所述的蛋白作为泛素连接酶TcpC的应用。
4.一种新的E3泛素连接酶TcpC活性鉴定方法，其特征在于，所述泛素连接酶TcpC的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，该氨基酸序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点，通过检测该关键位点来判断E3泛素连接酶TcpC的活性。
5.根据权利要求4所述的一种新的E3泛素连接酶TcpC活性鉴定方法，其特征在于，所述TcpC的核苷酸序列中含有E3泛素连接酶功能的关键位点Cys12与关键功能结构域WW结构域。
6.一种制剂或试剂盒，其特征在于，该制剂或试剂盒含有权利要求1所述的泛素连接酶。
7.根据权利要求1所述的E3泛素连接酶TcpC作为尿路感染治疗药物作用靶位点的应用。
8.根据权利要求1所述的E3泛素连接酶TcpC在筛选尿路感染治疗药物中的应用。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过体外检测TcpC的E3泛素连接酶活性来对尿路感染治疗药物进行筛选。
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