CN116837105A - 复发性流产的分子标志物及诊断应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复发性流产的分子标志物及其诊断应用，涉及生物医药技术领域。本发明公开了JAZF1基因在制备流产诊断或辅助诊断的产品中的应用。本发明首次发现JAZF1的表达量与复发性流产紧密相关，表明为在复发性流产蜕膜组织和内膜组织中JAZF1表达下调，说明JAZF1作为复发性流产诊断标志物的潜在可能性，有助于临床诊断和预防复发性流产。并且本发明首次提出JAZF1能够促进子宫内膜基质细胞的存活以及正常的蜕膜化，从而维持正常妊娠。

Description

复发性流产的分子标志物及诊断应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种复发性流产的分子标志物及诊断应用。
背景技术
复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)，也称为反复妊娠丢失(recurrent pregnancy loss，RPL)，是一种高度异质性的疾病，定义为2次及2次以上自然流产，包括连续发生的生化妊娠(通过超声检查或组织病理学检查记录)。除了染色体异常、免疫系统异常和子宫畸形，子宫内膜功能障碍也被认为是RSA的重要原因。此外，复发性流产还会增加后续妊娠不良结局的发生率，如早产、胎膜早破、低出生体重儿。
子宫内膜的蜕膜化是妊娠建立和维持的核心关键。在妊娠建立和维持期间，子宫内膜基质细胞(Endometrial stromal cells，EnSC)的蜕膜化是指EnSC转化为具有分泌功能的蜕膜基质细胞(Decidual stromal cells，DSC)的多步骤的重编程过程，以催乳素(PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)的分泌为蜕膜化的经典标志。蜕膜化过程既能限制滋养层细胞的过度浸润，也能通过分泌生长因子和细胞因子等对免疫细胞募集分布和功能、螺旋动脉重铸以及胎盘形成等具有直接或间接影响。蜕膜化的功能缺陷会导致多种妊娠并发症，包括RSA、反复着床失败(Recurrent implantation failure，RIF)和先兆子痫。但是RSA患者子宫内膜功能缺陷的发病机制仍然是不清楚的。
中国专利CN202210073849.6中公开了LILRB1在制备预测自然流产的检测产品中的应用，该发明研究发现，自然流产患者存在LILRB1在外周血及蜕膜NK细胞表达比例的下降，并且外周血NK细胞LILRB1表达比例与蜕膜NK细胞LILRB1表达比例呈正相关。将表达LILRB1的外周血NK细胞、表达LILRB1的蜕膜NK细胞作为生物标记物用于预测自然流产，预测孕妇的子宫局部与全身的免疫耐受状态，可及早识别自然流产。
中国专利CN202210302503.9中公开了BBOX1-AS1作为复发性流产诊断标志物和治疗靶点的应用，该发明首次发现BBOX1-AS1的表达量与复发性流产紧密相关，表明在复发性流产绒毛组织上调的BBOX1-AS1在体外调控滋养细胞的增殖、迁移和侵袭，并参与激活P38/JNK MAPK信号通路。另外，该发明还研究了BBOX1-AS1通过结合蛋白hnRNPK来促进GADD45A表达，最终引起滋养细胞功能的改变，促进复发性流产的发生。最后在复发性流产患者血清中BBOX1-AS1表达升高，说明BBOX1-AS1作为反复妊娠丢失早期诊断标志物的潜在可能性。
大量研究发现在早期流产以及复发性流产患者的DSCs中存在过度凋亡的现象。现有技术研究表明丙烯酰胺(Acrylamide，ACR)通过抑制细胞周期蛋白D3和p21，同时上调细胞凋亡相关分子BAX、cleaved-caspase 3，进而损害蜕膜化，引起小鼠胚胎数量减少(YuD.,Liu Q.,Qiao B.,et al.Exposure to acrylamide inhibits uterinedecidualization via suppression of cyclin D3/p21 and apoptosis in mice.JHazard Mater 388:121785,2020.)。另有研究发现BAX水平异常上升通过诱导细胞凋亡，从而损害基质细胞蜕膜化，引起复发性流产(Al-Rubaye S.,Ghaderian S.M.H.,SalehpourS.,et al.Aberrant expression of BAX,MEG3,and miR-214-3P genes in recurrentpregnancy loss.Gynecol Endocrinol 37(7):660-664,2021.；Lv X.,Cai Z.and LiS.Increased apoptosis rate of human decidual cells and cytotrophoblasts inpatients with recurrent spontaneous abortion as a result of abnormalexpression of CDKN1Aand Bax.Exp Ther Med 12(5):2865-2868,2016.)。
目前复发性流产的发病机制尚不明确，提供一种复发性流产的分子标志物以及提供相应的防治策略具有重要的理论和临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供JAZF1基因在制备流产诊断或辅助诊断的产品中的应用，通过对待测样本中的JAZF1基因的表达水平进行检测，为复发性流产的诊断及预防提供参考。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了JAZF1基因在制备流产诊断或辅助诊断的产品中的应用。
优选地，所述的流产为复发性流产。
优选地，所述的诊断产品中包含检测JAZF1基因表达水平的试剂。
进一步优选地，所述的试剂检测JAZF1基因mRNA表达水平或蛋白表达水平。
优选地，所述的诊断产品选自试剂盒、基因芯片、蛋白质芯片、制剂、试剂盒质控品、试剂盒标准品中的一种或多种。
优选地，所述的检测样本选自蜕膜组织、内膜组织、蜕膜基质细胞中的一种或多种。
进一步优选地，所述的检测样本选自蜕膜组织、蜕膜基质细胞中的一种或多种。
优选地，所述的JAZF1基因在复发性流产患者的样本中差异表达。
进一步优选地，相对于正常健康人，复发性流产患者的JAZF1基因的表达下降。
优选地，所述的诊断产品包括：用qRT-PCR、免疫检测、Western blot检测、免疫组织化学检测、免疫荧光、流式细胞检测、单细胞测序诊断复发性流产的产品。
进一步优选地，所述的通过qRT-PCR诊断复发性流产的产品至少包括一对特异性扩增JAZF1基因的引物。
优选地，所述的应用步骤如下：
(1)检测待测样本中JAZF1基因的表达水平；
(2)将待测样本中JAZF1基因的表达水平与对照组进行比较；
(3)与对照组的水平相比，待测样本中JAZF1基因表达下调，表明受试者为流产患者，反之，则受试者不为流产患者。
又一方面，本发明提供了检测JAZF1基因的试剂在制备流产的诊断或辅助诊断产品中的应用。
优选地，所述的试剂检测JAZF1基因mRNA表达水平或蛋白表达水平。
又一方面，本发明提供了一种诊断或辅助诊断流产的产品，所述的产品中包括检测待测样本中JAZF1基因表达水平的试剂。
优选地，所述的试剂选自探针组、引物组或基因芯片。
优选地，所述的产品选自试剂盒、基因芯片、蛋白质芯片、制剂、试剂盒质控品、试剂盒标准品中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述的产品为试剂盒，所述的试剂盒包括扩增JAZF1基因的引物对、PCR缓冲液、dNTPs、逆转录体系和RNA提取试剂。
优选地，所述的逆转录体系包括逆转录反应液、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
优选地，所述的RNA提取试剂包括Trizol、氯仿、异丙醇和乙醇。
优选地，所述的检测样本选自蜕膜组织、内膜组织、蜕膜基质细胞中的一种或多种。
进一步优选地，所述的检测样本选自蜕膜组织、蜕膜基质细胞中的一种或多种。
又一方面，本发明提供了增强JAZF1基因含量或活性的物质在制备治疗或预防流产的药物中的应用。
优选地，所述的流产为复发性流产。
优选地，所述的药物中还包括药学上可接受的载体。
进一步优选地，所述的药学上可接受的载体选自赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂中的一种或多种。
进一步优选地，所述的药物剂型选自粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂中的一种或多种。
优选地，所述的应用的功能为如下中的任意一种或多种：
(1)促进子宫内膜基质细胞增殖；
(2)抑制子宫内膜基质细胞凋亡；
(3)维持子宫内膜基质细胞的正常蜕膜化。
本发明的有益效果为：
(1)本发明首次发现JAZF1的表达量与复发性流产紧密相关，表明为在复发性流产蜕膜组织和内膜组织中JAZF1表达下调，说明JAZF1作为复发性流产诊断标志物的潜在可能性，有助于临床诊断和预防复发性流产。
(2)本发明首次提出JAZF1能够促进子宫内膜基质细胞的存活以及正常的蜕膜化，从而维持正常妊娠。
附图说明
图1A为Feature plot显示DS细胞中JAZF1的mRNA表达水平图。
图1B为通过使用单细胞测序R工具包Seurat中的boxPlot功能，对来自RSA患者(n＝6)和匹配孕周的正常早期妊娠(n＝5)的蜕膜基质细胞中JAZF1表达scRNA-seq分析结果图。
图1C为scRNA-seq分析JAZF1在DS1、DS2和DS3的表达结果图。
图2A为qRT-PCR检测JAZF1在蜕膜组织中的表达情况图。
图2B为Western blot检测JAZF1在蜕膜组织中的表达情况图。
图2C为qRT-PCR检测JAZF1在原代蜕膜基质细胞中的表达情况图。
图2D为Western blot检测JAZF1在原代蜕膜基质细胞中的表达情况图。
图3A为免疫组织化学法检测JAZF1在蜕膜组织中的表达情况图。
图3B为免疫组织化学法检测JAZF1在蜕膜组织中的表达情况统计图。
图3C为免疫荧光法检测JAZF1在蜕膜组织中的表达情况图。
图4A为Western blot检测已诱导蜕膜化的HESCs中FOXO1、IGFBP1、JAZF1的蛋白水平。
图4B为Western blot检测已诱导蜕膜化的HESCs中FOXO1、IGFBP1、JAZF1的蛋白水平统计图。
图4C为免疫荧光法检测已诱导蜕膜化的HESCs中JAZF1的表达水平图。
图5A为免疫组织化学法检测JAZF1在RSA和正常组增殖期和分泌早期子宫内膜的表达水平图。
图5B为JAZF1在增殖期和分泌中期子宫内膜组织的表达，数据来自于存放在基因表达总库中的微阵列数据(GDS2052)。
图5C为使用公共数据库中不同时期子宫内膜10×单细胞测序转录组测序(scRNA-seq)分析JAZF1的表达模式，数据来自于存放在基因表达总库中的微阵列数据(GSE111976)。
图6A为qRT-PCR检测siRNA敲降、敲除以及过表达处理后JAZF1表达水平图。
图6B为Western blot检测siRNA敲降、敲除以及过表达处理后JAZF1表达。
图6C为人JAZF1基因及其CRISPR/Cas9靶向突变形式(KO)的结构示意图。
图7A为qRT-PCR检测敲降以及敲除JAZF1后凋亡相关基因以及蜕膜化相关基因的表达水平图。
图7B为Western blot检测敲降以及敲除JAZF1后凋亡相关基因以及蜕膜化相关基因的表达水平。
图7C为Western blot检测敲降以及敲除JAZF1后凋亡相关基因以及蜕膜化相关基因的表达水平统计图。
图7D为流式细胞术检测敲降、敲除以及过表达JAZF1后细胞凋亡水平图。
图7E为流式细胞术检测敲降、敲除以及过表达JAZF1后细胞凋亡水平统计图。
图7F为CCK8检测敲降、敲除以及过表达JAZF1后细胞情况。
图8A为qRT-PCR检测过表达JAZF1后BAX、BCL2、IGFBP1和PRL的表达水平。
图8B为Western blot检测过表达JAZF1后BCL2、cyt c、IGFBP1的蛋白表达水平统计图。
图8C为Western blot检测过表达JAZF1后BCL2、cyt c、IGFBP1的蛋白表达水平图。
图8D为Western blot检测过表达JAZF1后BAX、cleaved-caspase3的蛋白表达水平统计图。
图9A为敲低JAZF1后的蜕膜化hESCs对HTR-8/SVneo细胞侵袭能力表达图和统计图。
图9B为过表达JAZF1后的蜕膜化hESCs对HTR-8/SVneo细胞侵袭能力表达图和统计图。
图10A为scRNA-seq分析BAX(左)、BCL2(右)在RSA和对照组的转录水平。
图10B为GO分析蜕膜基质细胞亚群1(DS1)、蜕膜基质细胞亚群2(DS2)、蜕膜基质细胞亚群3(DS3)富集的通路。
图11A为qRT-PCR检测蜕膜组织中凋亡相关基因BAX和BCL2的表达水平统计图。
图11B为Western blot检测蜕膜组织中凋亡相关基因BCL2、BAX、cleaved-caspase3、cyt c的表达水平图。
图11C为Western blot检测蜕膜组织中凋亡相关基因BCL2、BAX、cleaved-caspase3、cyt c的表达水平统计图。
图11D为Western blot检测原代蜕膜基质细胞中凋亡相关基因BCL2、BAX、cleaved-caspase3、cyt c的表达水平。
图11E为Western blot检测原代蜕膜基质细胞中凋亡相关基因BCL2、BAX、cle-caspase3、cyt c的表达水平。
图11F为免疫组织化学法检测蜕膜组织中凋亡相关基因BCL2、BAX、cleaved-caspase3、cyt c的表达水平。
图12为TUNEL法检测蜕膜组织的总体凋亡水平图。
图13A为蜕膜组织中BCL2与JAZF1的相关性分析。
图13B为蜕膜组织中cleaved-caspase3与JAZF1的相关性分析。
图13C为蜕膜组织中BAX与JAZF1的相关性分析。
图13D为蜕膜组织中cyt c与JAZF1的相关性分析。
图14A为实施例1中两组患者的JAZF1的分子诊断特异性分析结果图。
图14B为Western blot检测实施例1以外的4对人群中，正常组和复发性流产组的JAZF1表达。
图14C为实施例1以外的4对人群中，正常组和复发性流产组的JAZF1表达统计图。
图14D为实施例1以外的4对蜕膜组织样本中JAZF1的分子诊断特异性分析结果图。
上述图中，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
本发明中，siRNA为干扰JAZF1基因表达的小干扰RNA。
实施例1JAZF1在复发性流产蜕膜组织中的表达及定位
(一)、使用10×单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)数据集，包括6个RSA和5个孕周匹配的正常人工流产的蜕膜细胞，孕周均为6-8周。发现JAZF1在RSA组的所有蜕膜基质细胞中显著下调(图1A-图1C)。
(二)、为了进一步验证我们的scRNA-seq结果，使用qRT-PCR和蛋白质印迹检测复发性流产与选择性人流患者的蜕膜组织以及提取的原代蜕膜基质细胞中的JAZF1的表达量。
实验步骤：
1、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
(1)蜕膜组织RNA提取
1)提前预冷异丙醇、75％乙醇、离心机。
2)称取30mg蜕膜组织于研磨钵中，加入液氮研磨至细粉末状，用勺子转移至无菌无酶1.5mL EP管，加入1mL Trizol试剂，震荡涡旋，室温静置5min；
3)加入0.2mL氯仿，混匀，室温静置5min，使其自然分层；
4)离心(离心机参数：转速12000g/min，温度4℃，时间15min)，离心完毕后见样品分3层，吸取上层水相至另一支无菌无酶1.5mL EP管中；
5)水相中加入等体积预冷的异丙醇，混匀，冰上静置10min；
6)离心，离心完毕后见EP管底部白色沉淀，倒除上清；
7)往EP管中加入1mL 75％乙醇，使沉淀物漂浮于75％乙醇中；
8)离心(离心机参数：转速7500rpm/min，温度4℃，时间12min)，倒除上清后重复1次步骤7、8；
9)倒掉上清，于室温放置，当底部沉淀由白色转至透明状，即干燥合适；
10)根据沉淀大小加入适当体积的DEPC水，溶解RNA；
11)置于37℃金属浴加热RNA，以促进RNA溶解；
12)用Nanodrop 2000分光光度计检测A260/A280，比值为1.8-2.0之间的RNA样品，记录其RNA浓度，并进行下一步逆转录实验。
(2)逆转录合成cDNA(以下过程均在冰上操作)
①第一步：去除基因组DNA(10μL反应体系)
表1.
混匀后，42℃2min，4℃保存或进行下一步。
②第二步：逆转录(20μL反应体系)
表2.
混匀后37℃15min，85℃5sec，加入180μL DEPC稀释10倍，-80℃保存。
(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
①使用TaKaRa TBPremix Ex TaqTM(10μL反应体系)；
表3.
②反应条件：95℃30sec；(95℃5sec，60℃30sec)，40个循环。扩增完毕后，获取相应CT值。
③β-actin作为内参基因，2-△△CT分析数据。
本研究中所涉及引物均有广州复能公司或上海捷瑞公司合成，序列见下表：
表4.
2、蛋白提取并测定浓度
(1)蜕膜组织总蛋白提取
①实验前1天将实验器材高温灭菌处理，提前预冷离心机，保持于4℃；
②提前配置细胞裂解液、蛋白酶抑制剂(PIC)、磷酸酶抑制剂(PHI)体积比为100：1：1，三者按以上比列充分混合均匀后置于冰上；
③称取35mg蜕膜组织置于研磨钵中，加入液氮后研磨至细粉末状，用勺子转移至EP管，加入350μL混合好的裂解液，震荡涡旋，使其充分混匀；
④冰上静置，每10分钟震荡涡旋一次，共3次；
⑤30min后，离心(离心机参数：转速14000rpm/min，温度4℃，时间30min)，抽取上清置于另一无酶无菌的1.5mL EP管中，期间注意避免吸到底部沉淀。
(2)BCA法进行蛋白浓度测定
根据BCA蛋白定量试剂盒(购自ThermoFisher Scientific公司，货号为23227)的操作说明测定待测样品蛋白浓度；
(3)蛋白分装与保存
①计算所需样本体积，同时加入1/3体积的4×样本缓冲液，充分混匀；
②100℃金属浴10min，充分震荡混匀，离心后置-80℃保存。
(4)SDS-PAGE凝胶配制
本实施例使用的浓缩胶浓度为6％。
(5)电泳：室温24mA/板恒定电流下进行蛋白电泳，当溴酚蓝至凝胶底部时停止电泳；
(6)转膜：电转移仪(恒压100V)，整个过程在4℃中进行。甲醇激活PVDF膜30s后双蒸水摇洗3min，然后将PVDF膜和电泳凝胶转移至1×转膜缓冲液中平衡10min，制作夹板：负极-滤纸2张-电泳凝胶-PVDF膜-滤纸3张-正极。
(7)封闭：转膜完成后，将PVDF膜放入封闭液中慢摇，室温孵育1h。
(8)一抗孵育：用PBS冲洗残留封闭液，加入已稀释好一抗，摇床慢摇，4℃孵育过夜。一抗稀释比见下表5。
表5.
(9)洗膜：PVDF膜用PBS洗涤10min×3次。
(10)二抗孵育：加入已稀释好的二抗，置于摇床上慢摇，室温孵育1h。
(11)洗膜：PVDF膜用PBS洗涤10min×3次。
(12)显影、拍照。
(13)结果处理：用ImageJ软件对Western blot蛋白质条带进行定量分析，并以内参基因β-actin的表达量做标准化处理。
3、原代子宫蜕膜基质细胞的提取
①将蜕膜组织，用无菌PBS溶液清洗3-4次，然后将蜕膜组织剪成糊状；
②将蜕膜组织移至50mL离心管，加入消化液，组织体积：消化液体积为1：1，放置37℃水浴箱作用1.5h，每间隔20min震荡混匀1次；
③加入等体积的2％完全培养基终止消化，过滤(100μm)，过滤(40μm)；
④离心(离心机参数：转速800rpm/min，时间5min)，去除上清；
⑤加入4mL红细胞裂解液，室温作用10min；
⑥离心(转速800rpm/min，时间5min)，去除上清，加入10％完全培养基重悬细胞，取部分细胞接种于4孔板，用于免疫荧光检测原代子宫蜕膜基质细胞的纯度；剩余接种于10cm培养皿，置于5％CO2、37℃细胞孵育箱孵育过夜；
⑦培养24h后收取10cm培养皿中细胞，加入Trizol，进行下一步实验。
实验结果：
qRT-PCR(图2A)、Western blot(图2B)结果均提示JAZF1的mRNA和蛋白水平在RSA蜕膜组织中均明显下调。与此相一致的是，从图2C和图2D中可以看出，从RSA蜕膜中分离出来的原代蜕膜基质细胞中JAZF1的mRNA水平和蛋白水平均低于正常组。
(三)、免疫组化、免疫荧光检测JAZF1在蜕膜组织中的定位以及相对表达量。
1、免疫组织化学技术
1)切片：蜕膜组织石蜡连续切片厚度为4μm，于42℃温水中展片；
2)烤片：蜕膜组织切片置于65℃恒温电热烤片机烘烤30min；
3)脱蜡：蜕膜组织切片置于二甲苯脱蜡10min*3次，无水乙醇10min*2次，95％乙醇5min*2次，85％乙醇5min*2次，75％乙醇5min*2次，流水洗；
4)抗原修复：先将玻片置入修复液中置于高压锅中1600W加热至气阀打开后，改至900W继续高压15min，取出修复盒冷却；
5)用PBS浸泡冲洗，去除残余的抗原修复液；
6)玻片置于3％H2O2溶液，避光室温作用10min，PBST清洗5min×3次；
7)甩干液体，加入5％BSA封闭液，室温孵育60min；
8)去掉封闭液，滴加一抗(以完全覆盖组织为宜)，4℃孵育过夜；
9)PBST洗涤5min×3次；
10)甩干液体，加入二抗，室温孵育60min，PBST清洗5min×3次；
11)甩干液体，滴上DAB显色液，再于双蒸水中终止反应；
12)复染、返蓝：苏木素作用1min，自来水及时中止显色，避免核颜色过深。
13)将玻片依次浸泡于75％乙醇3min×1次，85％乙醇3min×1次，95％乙醇3min×2次，无水乙醇3min×2次，二甲苯3min×2次；
14)滴加中性树脂封片，置于通风橱晾干；
15)免疫组化图文分析：切片的拍摄由另一人完成，随机截取5个400×视野，应用ImageJ软件的IHC Profiler插件进行定量分析，阴性、弱阳性、阳性、强阳性所对应分值分别为1、2、3、4分，求得5个视野的平均值。
2、免疫荧光检测实验步骤：
1)-10)与免疫组织化学技术步骤一致；
11)甩干液体，轻轻加入1μg/ml核染料二脒基苯基吲哚(DAPI)，室温下染色10分钟，用1×PBST洗5min；
12)用移液枪吸取50ul防止荧光淬灭的封片剂滴加在载玻片的组织上(若组织块面积较大，可适当添加封片剂，过多则容易产生气泡，影响封片效果)。封片后的片子放置于4℃避光保存，并尽快在荧光显微镜下拍摄照片。
实验结果：免疫组织化学的结果如图3A-图3B所示，免疫荧光结果如图3C所示，可以看出，JAZF1广泛表达与正常人工流产以及RSA蜕膜组织中，主要定位在细胞核，且在RSA蜕膜基质细胞胞质以及胞核表达均低于孕周匹配的正常组。上述结果表明JAZF1在RSA患者蜕膜基质细胞中表达显著下调。
(四)为了探索JAZF1在蜕膜化中的潜在功能，我们体外诱导人子宫内膜基质细胞系(human endometrial stromal cells，HESCs)蜕膜化，并检测JAZF1mRNA和蛋白水平的变化以及蜕膜化相关标志物IGFBP1，PRL，FOXO1的表达情况。
在体外诱导人子宫内膜基质细胞系蜕膜化具体包括以下步骤：光镜下细胞密度达50％，进行体外诱导蜕膜化处理：对照组：2％完全培养基；实验组：蜕膜化诱导培养基(2％完全培养基：4mM醋酸甲羟孕酮溶液：环磷酸腺苷溶液体积比1000：1：10)，2ml/孔，每天光镜下观察细胞形态变化，每2天更换一次蜕膜化诱导培养基，蜕膜化6天后收集细胞进行下一步实验。
实验结果：
蛋白印迹的结果如图4A-图4B所示，免疫荧光结果如图4C所示，实验结果表明，随着蜕膜化进展，蜕膜化相关标志物IGFBP1、PRL和FOXO1表达上升，JAZF1表达也逐渐增加。
(五)、为了验证上述体外实验的结果，我们采用IHC检测增殖期以及分泌早期的人子宫内膜中JAZF1的表达情况。增殖期以及分泌早期的人子宫内膜免疫组化结果如图5A-图5B所示，结果提示JAZF1蛋白丰度在子宫内膜的分泌早期高于增殖期，尤其是在基质细胞中。
通过查阅公共数据库中的子宫内膜组织单细胞测序数据，分析JAZF1在不同时期子宫内膜组织以及基质细胞中的表达。子宫内膜公共数据集scRNA-seq数据如图5C，结果显示与增殖期相比，JAZF1在分泌早期内膜中总体表达水平上调，同时在基质细胞中的表达上调。
免疫组化结果提示JAZF1在RSA患者的增殖期以及分泌早期子宫内膜中表达水平均下调。这些结果表明，JAZF1是蜕膜化的建立和发展的一个潜在调节因子。
实施例2JAZF1敲除后对hESCs存活以及蜕膜化的影响
(一)在HESCs中有效敲除以及过表达JAZF1
为了探究JAZF1在内膜基质细胞中意义，本发明利用siRNA技术敲降(siJAZF1)、CRISPR/Cas 9技术敲除(KO-JAZF1)以及慢病毒过表达JAZF1(OE-JAZF1)，培养48h后收集细胞检测JAZF1敲降、敲除以及过表达的效率。随后我们将敲除效率有效的KO稳转株PCR后的DNA片段进行Sanger测序，以确定sgRNA是否靶向JAZF1的编码区序列。
1、siRNA的转染：
由中国吉玛公司设计并合成了JAZF1-siRNA。采用Lipofectamine RNA iMAX进行转染，具体步骤如下：
①转染前一天，将适当密度的细胞接种于6孔板中，使其在转染时40-50％的融合率，加入完全培养基培养过夜。
②转染前60min去除旧培养基，加入1.5mL新鲜的不含抗生素的新培养基。
③对于每个转染的孔，制备siRNA和Lipofectamine RNAiMAX混合物。
1)在250μL的无血清生长培养基中加入100pmole(5μL)siRNA，混匀。
2)Lipofectamine RNA iMAX使用前要先混匀，然后在250μL生长培养基中加入5μL的Lipofectamine RNA iMAX进行稀释，室温下孵育5min。
3)混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNA iMAX，室温下孵育20min。
④加入混合物到细胞中，每孔终体积为2mL，并轻晃混匀。
⑤在37℃，5％ CO2培养箱中培养细胞6小时。
⑥更换含有10％血清的培养基并继续细胞48-72h，直到进行基因敲除实验。
本研究所用到的siRNA序列如下表：
表6.
2、建立JAZF1敲除细胞系
JAZF1 KO细胞系是通过CRISPR/Cas 9技术建立的。具体步骤如下：
(1)在NCBI上查找JAZF1的编码区序列。
(2)将序列复制进https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/中，设计sgRNA。
(3)验证sgRNA，选择特异性100％的序列进行合成。
(4)慢病毒载体酶切体系：
表7.
用BsmBI酶切并去磷酸化慢病毒CRISPR质粒5μg，在37℃下反应30min。
(5)将酶切好的质粒进行琼脂糖电泳并使用胶回收试剂盒进行酶切质粒回收，具体胶回收步骤如上。
(6)磷酸化和退火sgRNA体系配置：
表8.
(7)退火PCR体系：
表9.
(8)将步骤(7)中已完成退火的引物以1：100稀释到无菌水中。
(9)已退火的sgRNA与已酶切好的质粒载体连接体系：
表10.
16℃，过夜。
(10)转化
1)在冰上解冻一管DH5-alpha感受态大肠杆菌细胞，直到最后一个冰晶消失。轻轻地将50μL细胞移入冰上的转化管中。
2)向细胞混合物中加入5μL前一天连接好的质粒DNA，混合。
3)将混合物置于冰上30分钟。不要进行涡旋操作。
4)在42℃下加热30秒，进行感受态细胞激活。置于冰上3分钟。
5)吸取950μL室温LB液体培养基至4)感受态细胞中。
6)在37℃下摇晃60分钟，剧烈摇晃(250rpm)或旋转。
7)涂布前需将6)中的菌液离心，3500rpm，5min，去掉800μL上清，用枪头混匀剩下的菌液。
8)将100μL菌种稀释液涂抹在选择板上，并在37℃下孵育过夜。
9)挑取单个面积较大的菌至培养基中，加入1000×的氨苄青霉素。
10)取4mL菌液进行小提，将质粒进行测序，确认质粒中插入的序列是否为设计的sgRNA。
(11)将测序序列正确的3个菌液分别放进100mL的LB液体培养基中，加入100μL1000×氨苄青霉素，放置于恒温摇床，37℃，200rpm，摇床过夜。
(12)留取500μL菌液，加入500μL的甘油混合后放置-80℃保存。
(13)使用HEK 293T细胞进行慢病毒包装并转染HESCs，步骤如下(10cm培养皿)：
1)第1天，每孔在10mL培养基中种2.5×106个HEK 293T细胞(上午)或3×106个HEK293T细胞(下午)。
2)第2天(早上)，在一个干净的1.5mL EP管中准备3个质粒的混合物：
表11.
将混合物涡旋，孵育10min。将混合物滴到HEK 293T细胞的培养基中。
3)6-8h后换液，换成10％完全培养基。
4)收集病毒前一天，铺板HESCs，数量为1.5×105。
5)先用0.44μm的滤器过滤病毒上清，再将一皿10cm皿的上清加至6孔板中其中一孔的hESCs中，24h后换液，换成10％完全培养基。
(17)转染目的细胞72小时后，使用1.3mg/mL Neomycin进行72h药筛。
(18)药筛结束后，将总的JAZF1-KO细胞进行消化、稀释，种至96孔板中，密度为1个细胞/孔，收集细胞提取RNA以及DNA。
(19)提取RNA检测JAZF1敲除效率，提取DNA(具体步骤同上)并进行PCR扩增(具体步骤同上)，扩增产物进行sanger测序，确认质粒基因型。
(20)基因型确认无误后，即可扩增相对应的JAZF1-KO细胞株，并进行下一步实验。
3、DNA PCR
(1)反应体系：
表12.
当扩增长度≧为10kb的产物时，使用最终浓度为0.2μM的引物。
(2)PCR扩增程序：
表13.
(3)总共扩增30个循环，结束后跑琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带是否为目的基因，确认后送sanger测序。
本研究中所用到的PCR引物序列如下：
表14.
4、过表达细胞株建立：
(1)过表达PCR引物设计：在NCBI网站上找到目的基因的DNA编码区，并用snapgene软件打开。
(2)选择合适的酶切位点：要选择质粒载体上有，但是目的基因编码区没有的两个酶切位点，设计后交给公司合成。
(3)过表达质粒载体酶切，体系如下：
表15.
(4)使用合成的引物PCR目的基因的完整CDS区，体系如下：
表16.
当扩增长度≧为10kb的产物时，使用最终浓度为0.2μM的引物。
(5)PCR扩增程序：
表17.
(6)总共扩增30个循环，结束后跑1％琼脂糖凝胶电泳，对比DNA marker的分子量确定PCR产物的分子量，以此判断是否完整PCR目的基因DNA编码区。
(7)PCR成功后，对PCR产物进行胶回收。
(8)对全部胶回收产物进行酶切处理，37℃，60min，体系如下：
表18.
(9)对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对电泳产物进行胶回收。
(10)将酶切好的DNA片段与酶切好的质粒载体进行连接，体系如下：
表19.
16℃，过夜连接。连接体系中DNA片段的质量：分子量与质粒载体质量：分子量的体积比为1：3，从而算出DNA片段以及双蒸水需要多少的体积。
(11)转化涂板，步骤同前。
(12)挑单克隆，提取质粒，测序，中量提取质粒，包慢病毒以及药筛均同前。
(13)药筛结束后，取一部分细胞提取RNA，并通过qRT-PCR检测过表达效率。
本研究中所用到的过表达引物序列如下：
表20.
实验结果：
siRNA敲降、CRISPR/Cas 9敲除以及慢病毒过表达JAZF1的qRT-PCR结果如图6A所示，Western blot结果如图6B所示，从图6A-图6B中可以看出，与对照组相比，siRNA以及慢病毒处理组JAZF1的mRNA以及蛋白水平明显降低，而过表达处理组JAZF1的表达水平明显上调，证实了有效的敲降、敲除以及过表达效率。
将敲除效率有效的KO稳转株PCR后的DNA片段进行sanger测序，以确定sgRNA是否靶向JAZF1的编码区序列。Sanger测序结果如图6C所示，结果显示编辑后的稳转株DNA编码区缺失一个碱基，终止密码子提前，基因转录提前终止，说明该株稳转系有效。
(二)JAZF1敲降后对HESCs存活以及蜕膜化的影响
使用siRNA、KO慢病毒处理HESCs后，体外用环磷酸腺苷(cAMP)以及醋酸甲羟孕酮(MPA)诱导蜕膜化6天，每两天更换一次诱导培养基，并通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测细胞凋亡以及蜕膜化相关指标表达情况。
实验结果：
qRT-PCR结果如图7A所示，结果显示敲降或者敲除JAZF1后，促凋亡分子BAX表达上调，而抗凋亡分子BCL2下调。蛋白印迹结果如图7B-图7C，也显示敲降或者敲除JAZF1后，促凋亡分子BAX、cyt c、cleaved-caspase3蛋白水平明显上调，抗凋亡分子BCL2明显下调。
(三)用流式细胞仪检测JAZF1对已蜕膜化的HESCs的抗凋亡作用，以及CCK8检测了细胞增殖状态。
实验步骤：
1、流式细胞术联合Annexin V/PI检测细胞凋亡
(1)根据实验要求诱导细胞凋亡。未经处理的细胞样品作为阴性对照。进行流式检测时需取实验组分别进行Annexin V-FITC和PI单染，用于调节补偿。
(2)收集1×105-5×105个细胞。用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1000rpm、4℃离心5min，弃上清。
(3)洗涤细胞：用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在1000rpm、4℃离心5min，弃上清。
(4)细胞重悬：加入100μL 1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。
(5)细胞染色：加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，吹匀；避光、室温孵育10min；加入400μL 1×Binding Buffer，混匀。用流式细胞仪检测。
(6)流式细胞仪分析：流式细胞仪激发波长为488nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测，本发明中使用FL3，每个样本采集10000events。用FlowJo等软件进行数据分析，FL1为横坐标，FL3为纵坐标，根据FITC和PI荧光值确定两荧光参数阴阳界限，划定十字门。典型的实验中细胞可分为三个亚群：活细胞为双阴性(AnnexinV-FITC﹣/PI﹣)；早期凋亡细胞为Annexin V-FITC单阳性(Annexin V-FITC﹢/PI﹣)；晚期凋亡细胞为Annexin V-FITC和PI双阳性(Annexin V-FITC﹢/PI﹢)。
2、细胞增殖活性检测
(1)制备标准曲线
1)设置4个浓度梯度1000、2500、5000、10000个细胞/孔。传代后计数，用培养基稀释至上述浓度，每组设5个复孔。
2)4h细胞贴壁后，加10μL CCK-8试剂培养2h、3h、4h后测定OD值。以细胞数为横坐标，OD值为纵坐标，孵育3h。
(2)细胞增殖活性的检测
1)每孔加入1*104个/100μL的细胞悬液。边缘孔加入100μL无菌PBS。
2)培养箱孵育24h后，每孔加入10μL CCK8吹打混匀，并注意避光。
3)培养箱内孵育4h后。在吸收光酶标仪450nm波长处测量各孔吸光值。
4)数据统计：取每个组5个复孔的平均值，并进行组间对比。
实验结果：
流式细胞术结果如图7D-图7E所示，结果提示JAZF1的缺失诱发了细胞凋亡，CCK8结果(图7F)提示敲降以及敲除JAZF1后，诱导蜕膜化的基质细胞增殖能力明显下调。同时JAZF1的缺乏能上调PRL和IGFBP-1的mRNA和蛋白质表达水平，造成蜕膜化缺陷。
(四)使用过表达JAZF1的慢病毒处理HESCs后，体外用cAMP以及MPA诱导蜕膜化6天，并通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测细胞凋亡以及蜕膜化相关指标表达情况。并用流式细胞仪检测细胞的凋亡水平，以及CCK8检测了细胞增殖状态。具体实验步骤同上。
qRT-PCR结果如图8A，结果显示过表达JAZF1能下调凋亡分子BAX水平，上调抗凋亡分子BCL2水平，同时能下调蜕膜化IGFBP1以及PRL的水平。Western blot结果如图8B-图8D，结果提示过表达JAZF1只能下调IGFBP1、cyt c的水平，以及上调BCL2，但BAX、cleaved-caspase3水平没变化。流式细胞术以及CCK8结果提示过表达JAZF1后HESCs的凋亡水平下调(图7E)，细胞增殖能力上调(图7F)。
综上，上述结果证明JAZF1可以防止在蜕膜化过程中HESCs的过度凋亡和蜕膜化缺陷。
实施例3JAZF1敲降或过表达后的HESCs对HTR-8/SVneo细胞侵袭能力的影响
研究表明，蜕膜反应紊乱或蜕膜细胞IGFBP1过高与流产、胎儿生长首先或自发早产有关。本发明进一步评估了JAZF1敲除的HESCs对滋养层细胞侵袭的影响。首先是用siRNA处理HESCs 6h后诱导蜕膜化或者直接对OE-JAZF1稳转系进行诱导，处理6天后取上清于小室下，种适当数量的HTR-8/SVneo细胞于小室基质胶上方进行共培养。Transwell实验显示，敲除JAZF1后的HESCs抑制了HTR-8/SVneo细胞的侵袭(图9A)，而JAZF1的过表达则促进了它的侵袭(图9B)，证明了JAZF1的缺失对蜕膜基质细胞的功能存在不利影响。
实施例4复发性流产蜕膜基质细胞的凋亡水平
(1)10×单细胞测序分析蜕膜基质细胞的凋亡情况
鉴于在体外蜕膜过程中观察到的JAZF1下调具有促凋亡作用，本发明进一步评估了RSA和对照组的蜕膜组织以及原代DSCs中的凋亡水平。我们之前DSCs的scRNA-seq分析显示，RSA组的DS中促凋亡基因BAX明显增加，但BCL2没有明显变化(图10A)。此外，与对照组相比，RSA中上调基因的GO富集分析也表明，细胞凋亡和死亡途径在DS1、DS2和DS3中被显著激活(图10B)
(2)复发性流产蜕膜基质细胞的凋亡情况
为了验证单细胞测序的结果，使用qRT-PCR、western blot、免疫组化检测蜕膜组织以及原代蜕膜基质细胞中凋亡相关基因BAX、cyt c、cleaved-caspase 3、BCL2的表达水平。
实验结果：
qRT-PCR检测蜕膜组织中凋亡相关基因的表达水平如图11A所示，Western blot检测蜕膜组织中凋亡相关基因的表达水平如图11B-图11C所示，图11A-图11C结果显示RSA蜕膜组织中促凋亡基因BAX、cyt c、cleaved-caspase 3明显上调，而抗凋亡基因BCL2水平下调。此外，从RSA蜕膜中分离出的原代蜕膜基质细胞也观察到相同的表达模式(图11D-图11E)。通过免疫组织化学检测再次验证了上述结果(图11F)。
(3)使用TUNEL染色法检测蜕膜组织的总体凋亡水平。
实验步骤：
1、TUNEL检测：
(1)样本预处理：石蜡包埋组织切片。
(2)阳性处理
样本通透处理之后，可通过DNase I处理样本用来准备阳性对照。
1)按1:10的比例用双蒸水将10×DNase I Buffer稀释成1×DNase I Buffer备用。每个样本需要准备200μL 1×DNase I Buffer。
2)滴加100μL 1×DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5min。
3)用1×DNase I Buffer稀释DNase I(2U/μL)，使其终浓度为20U/mL。
4)轻轻吸掉多余液体，加入100μL浓度为20U/mL DNase I工作液，室温孵育10min。
5)轻轻吸掉多余液体，并将载玻片/爬片在装有1×PBS的染色缸中彻底浸泡润洗2-3次。阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸。阳性对照载玻片/爬片上残余的DNase I可能会在实验组中造成假阳性的错误信号。
(3)标记及检测
1)按1:5的比例用双蒸水将5×Equilibration Buffer稀释成1×EquilibrationBuffer。
2)滴加100μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温平衡10-30min。
3)平衡期间在避光条件下按照下表配制标记液。
表21.
对于面积小于5cm2的反应，所需体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例地增加试剂体积。
4)平衡结束后，用吸水纸吸掉1×Equilibration Buffer，然后在样本上滴加50μLTdT孵育缓冲液。
5)将封口膜剪成与组织或爬片同等大小，轻盖在样本上以保证试剂均匀分布。将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60min。湿盒用锡箔纸包裹避光。
6)用新鲜的1×PBS溶液清洗2次，每次室温孵育5min。样本在用1×PBS清洗后，可再用含0.1％ Triton X-100和5mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5min。
7)2μg/mL的DAPI溶液在黑暗中对样本进行复染，染色时室温放置5min。
8)洗涤样本，将载玻片浸入1×PBS溶液中清洗3次，每次室温放置5min。
9)向样本区域加100μL用1×PBS配制的20％甘油保持样本湿润。
10)立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在620±20nm的荧光下观察BrightRed红色荧光；在460nm观察DAPI的蓝色荧光。如有必要，可以将样本进行封片处理后，4℃避光过夜保存。DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色。只在凋亡的细胞核中才有BrightRed掺入而产生的红色荧光。
实验结果：
TUNEL染色法结果如图12所示，结果显示RSA组蜕膜组织的荧光强度高于对照组，即RSA蜕膜组织的凋亡水平较高。
(四)分析JAZF1与凋亡相关分子表达量之间的关系。
图13A为蜕膜组织中BCL2与JAZF1的相关性分析，图13B为蜕膜组织中cleaved-caspase3与JAZF1的相关性分析，图13C为蜕膜组织中BAX与JAZF1的相关性分析，图13D为蜕膜组织中cyt c与JAZF1的相关性分析。我们注意到BCL2的表达与JAZF1的表达水平呈正相关，而在cleaved-caspase 3中则观察到相反的趋势，BAX、cyt c则观察不到与JAZF1存在相关性。
实施例5
利用ROC曲线建立实施例1中两组患者的JAZF1预测复发性流产的模型，并计算该预测方法的AUC值、敏感度、特异性、阳性检出率、阴性检出率以及约登指数，结果如表22与图14A所示。
表22原有10对蜕膜组织样本中JAZF1的分子诊断特异性分析
结果显示，利用JAZF1表达量可以预测复发性流产，该标记物AUC值为0.79；具有较高级的敏感性，为0.90；具有中等级的特异性，为0.60；最佳截断值为0.3654；阳性预测值为0.90；阴性预测值为0.60；约登指数为0.50。
同时，表23和图14B-图14C表明，在实施例1以外的4对检测人群中，JAZF1表达值在正常组和复发性流产组中均有显著差异(p<0.05)，通过最佳截断值对4对患者进行疾病诊断，真阳性率0.75，假阳性率0，真阴性率1.00，假阴性率0.25，提示具有较好的诊断效应。
表23实施例1以外的4对蜕膜组织样本的检出率
蛋白 真阳性率 假阳性率 真阴性率 假阴性率
JAZF1 0.75 0 1.00 0.25
我们进一步利用ROC曲线建立实施例5中4对组织的JAZF1表达预测复发性流产的模型，并计算该预测方法的AUC值、敏感度、特异性和约登指数，结果如表24与图14D所示。
表24实施例1以外的4对蜕膜组织样本中JAZF1的分子诊断特异性分析
蛋白 AUC(95％CI) 敏感性 特异性 约登指数
JAZF1 0.94(0.76-1.00) 0.75 1.00 0.75
其结果显示，利用JAZF1表达量可以预测复发性流产，该标记物AUC值为0.94；具有良好的敏感性，为0.75；具有较高的特异性，为1.00；约登指数为0.75。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.JAZF1基因在制备流产诊断或辅助诊断的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的流产为复发性流产。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品包括：用qRT-PCR、免疫检测、Western blot检测、免疫组织化学检测、免疫荧光、流式细胞检测、单细胞测序诊断流产的产品。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品选自试剂盒、基因芯片、蛋白质芯片、制剂、试剂盒质控品、试剂盒标准品中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用步骤如下：
(1)检测待测样本中JAZF1基因的表达水平；
(2)将待测样本中JAZF1基因的表达水平与对照组进行比较；
(3)与对照组的水平相比，待测样本中JAZF1基因表达下调，表明受试者为流产患者，反之，则受试者不为流产患者。
6.检测JAZF1基因的试剂在制备流产的诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述的试剂检测JAZF1基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平。
7.一种诊断或辅助诊断流产的产品，其特征在于，所述的产品中包括检测待测样本中JAZF1基因表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述检测的样本选自蜕膜组织、内膜组织、蜕膜基质细胞中的一种或多种。
9.增强JAZF1基因含量或活性的物质在制备治疗或预防流产的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用的功能为如下中的任意一种或多种：
(1)促进子宫内膜基质细胞增殖；
(2)抑制子宫内膜基质细胞凋亡；
(3)维持子宫内膜基质细胞的正常蜕膜化。
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