CN103969452A - 索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒。本发明揭示了Gankyrin过表达可以明显抑制索拉菲尼引起的细胞死亡以及皮下肿瘤增殖，但是若联合羟氯喹则明显抑制Gankyrin过表达引起的抗药反应。本发明为索拉菲尼的临床应用提供了新的参考依据。

Description

索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药领域；更具体地，本发明涉及索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒。
背景技术
原发性肝癌(简称肝癌)是世界范围内第六位的最常见恶性肿瘤，每年新增病例约70余万，其中肝细胞癌约占80％。肝癌是中国最常见的恶性肿瘤，我国每年新发肝癌病例约占全球发病总数的55％，肝癌亦是我国第二大肿瘤致死原因。至今，手术切除仍是治疗肝癌的最佳治疗方法，也是早期肝癌的首选治疗措施。但由于原发性肝癌发病隐匿，发展快速，确诊时能手术切除者仅为10％左右，即使施行手术，仍有许多病例无法完全切除或肿瘤难以避免术后复发。此外，由于手术对人体的创伤较大，会使患者的免疫力降低，并且导致一系列并发症。对于晚期肝癌，多因肝功能不全而无法手术。这一部分病人，需通过各种非手术切除的方法进行治疗，或者先行非手术治疗，让肿块缩小局限，再行手术切除治疗，即二期切除，可使病人获得较好的益处。因此，寻找有效的肝癌非手术治疗方式对于提高肝癌患者，尤其是中晚期肝癌患者的生存率是至关重要的。
索拉菲尼作为一种新型的肿瘤药物越来越受到人们的重视。但是其依然存在并不是所用肝癌患者都有效的问题(Shen YC et al，Liver Cancer.20132(3-4)：345-364.)。因而，索拉菲尼联合用药也得到关注。近年来，自噬在肿瘤中的作用及功能成为了热点问题(Choi，A.M.et al，N Engl J Med.368(19)1845-6)。特别是自噬抑制剂作为治疗肿瘤的辅助用药，可以达到同等条件下低副作用的效果。自噬抑制剂羟氯喹联用索拉菲尼可以更有效的治疗肝癌(ShiYH et al，Autophagy.2011Oct；7(10)：1159-72)。虽然这种治疗方案可以有效提高索拉菲尼对肝癌的治疗效果，但是，这种联合用药疗法的特异性问题亟待解决。
Gankyrin是人26S蛋白酶体的一个非ATP酶调节亚基，包含七个ankyrin序列。2000年发现其在人肝癌组织中的高表达。Gankyrin可以通过影响MDM2/P53，CDK4/Rb，NF-kb/RelA，RhoA/ROCK/Ras，PI3K/AKT/HIF-1alpha，Wwp2/Oct4信号通络影响肝癌的发生发展。Gankyrin已经证实可以作为肝癌治疗的重要靶点(Li H et al，Gastroenterology.2005，128(7)：2029-41)。在临床应用这些研究结果都提示我们Gankyrin在肿瘤的发生发展过程中起着无可替代的重要作用。并且有验证证实Gankyrin对p53以及Oct4的调控有助于肝癌细胞抵御化疗药物引起的肿瘤细胞的死亡。
目前，有关Gankyrin在肝癌的发展发生中的报道很多，但至今未见Gankyrin作为索拉菲尼联用羟氯喹分子诊断试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒。
在本发明的第一方面，提供Gankyrin蛋白的用途，用于制备进行肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的预后包括：肝癌切除术后的预后。
在另一优选例中，所述的索拉菲尼治疗还包括：索拉菲尼联合氯喹或3-甲基腺嘌呤治疗。
在本发明的另一方面，提供特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂的用途，用于制备进行肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的诊断试剂盒。
在一个优选例中，所述的特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂是抗人Gankyrin的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的试剂盒，所述试剂盒中包括：特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体。
在另一优选例中，所述的可检测信号分子选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：免疫组化试剂；较佳地，所述的免疫组化试剂包括：显色试剂，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂。
在另一优选例中，所述的可检测信号分子是辣根过氧化物酶，还包括免疫组化试剂：
内源性过氧化物酶阻断剂；
DAB缓冲液；
DAB底物；
苏木素体细胞染色液；
空白对照试剂；
柠檬酸组织抗原修复液；
Gankyrin阳性对照片；
PBS磷酸盐缓冲液；或
DAB显色液配制管。
在本发明的另一方面，提供一种肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的方法，所述方法包括：
(1)应用所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中Gankyrin蛋白表达水平；
(2)分析蛋白表达水平，
若Gankyrin低表达，则该受试者预后治疗方案为：应用索拉菲尼治疗；
若Gankyrin高表达，则该受试者预后治疗方案为：应用索拉菲尼联合氯喹或3-甲基腺嘌呤治疗。
在本发明的另一方面，提供特异性抑制Gankyrin表达的干扰试剂的用途，用于制备与索拉菲尼联用治疗肝癌的药物。
在一个优选例中，所述的特异性抑制Gankyrin表达的干扰试剂具有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列(较佳地为GTTTTGGCCACTGACTGAC)，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述的干扰分子可形成以下结构：
其中，
Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。
在本发明的另一方面，提供一种用于与索拉菲尼联用治疗肝癌的干扰试剂，其具有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、不同剂量以及不同时间对索拉菲尼刺激条件下，Gankyrin对索拉菲尼引起的细胞死亡的影响。
图2、索拉菲尼刺激条件下，Gankyrin对索拉菲尼引起的细胞凋亡的影响。
A、过表达Gankyrin对于索拉菲尼用药效果的影响。
B、干扰Gankyrin对于索拉菲尼用药效果的影响。
C、过表达Gankyrin对于索拉菲尼用药效果的影响。
图3、索拉菲尼联用氯喹刺激条件下，Gankyrin对肝癌治疗的效果。
A、通过索拉菲尼联用氯喹或者3-MA抑制自噬，对于Gankyrin过表达细胞的影响。
B、通过索拉菲尼联用氯喹或者3-MA抑制自噬，免疫印迹检测PARP剪切体的表达。
C、通过索拉菲尼联用氯喹或者3-MA抑制自噬，Annexin V检测凋亡细胞比例。
图4A-B、小鼠皮下模型中，索拉菲尼联用氯喹刺激条件下，Gankyrin对肝癌治疗的效果。
图5、Gankyin作为预测69例肝癌患者术后服用索拉菲尼的分子指标。
图6、PDX实验的结果。
具体实施方式
本发明人利用肝癌细胞系，通过基因方法过表达或者沉默其中Gankyrin的表达，观察其在索拉菲尼或者索拉菲尼联用羟氯喹条件下的增殖以及凋亡情况。通过建立小鼠肝癌荷瘤模型，观察皮下肿瘤给予索拉菲尼或者索拉菲尼联用羟氯喹条件下的肿瘤体积大小，发现Gankyrin过表达可以明显抑制索拉菲尼引起的细胞死亡以及皮下肿瘤增殖，但是若联合羟氯喹则明显抑制Gankyrin过表达引起的抗药反应。本发明为索拉菲尼的临床应用提供了新的参考依据。
在此基础上，本发明人建立了一种用于指导临床索拉菲尼联合羟氯喹治疗方案的分子分型的检测系统，从而有利于方便、快捷地用于临床检测。作为本发明的优选方式，所述的检测系统是一种检测试剂盒，所述的试剂盒中含有特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂。
作为本发明的优选方式，所述的特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂是抗Gankyrin蛋白的抗体。
制备抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体可以是对Gankyrin蛋白具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。所述单克隆抗体可以利用Gankyrin蛋白或蛋白片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
本发明的抗体也可以是对Gankyrin蛋白具有特异性的多克隆抗体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的Gankyrin蛋白导入动物中来获得，例如，将Gankyrin与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。作为本发明的优选方式，采用兔来生产所述的多克隆抗体：兔免疫2-3个月后，从其静脉血中收获抗血清并纯化，获得特异性多克隆抗体。
在获得了特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂后，可以方便地制备出用于特异性检测Gankyrin蛋白的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有所述抗体以外，还可以包含：携带有可检测信号分子的检测抗体(用于与抗Gankyrin抗体结合)，以及疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于：显色试剂，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。
如本文所用，所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中Gankyrin蛋白的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类和特性，选择适宜的底物。
作为本发明的具体实施例，所述的试剂盒中可以包括如下试剂：抗人Gankyrin的抗体；携带可检测信号分子的检测抗体，所述可检测信号分子是辣根过氧化物酶；内源性过氧化物酶阻断剂；DAB缓冲液；DAB底物；苏木素体细胞染色液；空白对照试剂；柠檬酸组织抗原修复液；Gankyrin阳性对照片；PBS磷酸盐缓冲液；和/或DAB显色液配制管。
在获得了本发明提供的试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中Gankyrin蛋白的表达量，这些方法均被包含在本发明中。
作为一种优选方式，本发明提供了使用上述试剂盒用于一种肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的方法，所述方法包括：(1)应用所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中Gankyrin蛋白表达水平；(2)分析蛋白表达水平，若Gankyrin低表达，则该受试者治疗方案为：应用索拉菲尼治疗；若Gankyrin高表达，则该受试者治疗方案为：应用索拉菲尼联合氯喹或3-甲基腺嘌呤治疗。
通过免疫组化检测试剂盒检测切除的肝细胞癌患者术后石蜡包埋的肝癌及癌旁正常肝组织中Gankyrin的表达水平并对染色结果评分，根据其免疫组化评分结果，可以判断该患者预后及肝切除术后辅助性服用索拉菲尼及羟氯喹的疗效，指导肝癌患者术后的个体化治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料与方法
1.细胞，病毒及相关实验材料
肝癌肿瘤细胞系SMMC-7721，MHCC-LM3由中科院细胞库提供。
1.1Gankyrin干扰慢病毒载体的构建、测序、包装、测滴度、PCR鉴定及转染方法
1.1.1克隆含有目标siRNA的引物
GFP-F(SEQ ID NO:8)：
5’ATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCATGGGCCTCACGCTTAA3’
GFP-R(SEQ ID NO:9)：
5’CGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATGGGCCTCACGCTTAA3’
siGankyrin-F：
5’TCGACTTCAAGAGAGGAGTGTTACCCTCAGTGTCTT3’(SEQ ID NO:1)；
siGankyrin-R：
5’GATCAAGACACTGAGGGTAACACTCCTCTCTTGAAGGAGTGTTACCCTCAGTGTCTT3’(SEQ ID NO:2)。
也即所设计的靶向序列为：AAGACACTGAGGGTAACACTC(SEQ ID NO:3)。
1.1.2设计寡核苷酸插入片段：
所设计的shRNA因能产生发夹siRNA，siRNA二聚体中的两条链都在单个的DNA模板中。每个结构域长19-21个核苷酸且与目标基因的编码区相对应。这两个结构域能形成反向重复序列被9个核苷酸所分开形成发夹茎环。插入片段可通过合成两条互补的寡核苷酸片段，退火形成，5’、3’两端分别含有Xho1和Xba1酶切位点。
1.1.3siRNA插入片段的引物退火
(1)反应体系：
正向引物： 1ul(100pmol/ul或1ug/ul)
反向引物： 1ul(100pmol/ul或1ug/ul)
退火缓冲液： 10ul
去离子水： 88ul
总体积： 100ul
(2)95℃孵育10min。
(3)逐渐冷却至室温，约30-40min。
1.1.4插入片段克隆入腺病毒载体(详见GeneSuppressorTMSystem kit)：
(1)反应体系：(建阴性对照，即插入干扰GFP片段的连接)
(2)22℃，16hr。
(3)取5ul连接的质粒DNA转入100ul的宿主DH5α，铺在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上(转化)：
取100ul菌液冰上预冷。
加入5ul连接反应液轻轻混匀。
冰上放置30min。
42℃水浴40s。
冰上放置，加入1ml SOC培养基，37℃摇床40min。
1500g离心5min，祛除大部分培养基，留下约100ul，重悬菌液。
取60-70ul菌液铺在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。
用Qiagen mini plasmid DNA kit制备重组质粒DNA，进行测序鉴定。
1.2Gankyrin过表达慢病毒载体的构建
1.2.1.转基因过表达载体中目的基因的构建序列
(1)将Gankyrin的编码框序列(如下，去掉终止密码子)通过设计含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的上下游引物经常规PCR、酶切、连接(众所周知)后，插入到pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体(Invitrogen公司)。
Gankyrin的编码框序列(SEQ ID NO:4)：
(2)再以含有Gankyrin编码框的pcDNA3.1/Myc-His(-)A融合载体为模版，将同时含有Gankyrin编码框及载体上的myc-tag序列这一区域的DNA序列(如下)(SEQ ID NO:5)：
通过引物设计，将上述片段插入pLenti6/V5-D-TOPO质粒(慢病毒质粒，购自Invitrogen公司)中。按照该载体的说明书要求，在该基因的起始密码子Atg之前即5’端加入了CACC四个碱基，即设计引物上游引物：5’-CACCATGGAGGGGTGTGTGTCTAAC-3’(SEQ ID NO:6)，下游引物5’-TCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTT-3’(SEQ ID NO:7)，经常规PCR、连接(公所周知)后，插入到pLenti6/V5-D-TOPO(具体操作见其说明书)。
1.2.2.重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。
1.2.3.重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。
1.2.4.用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。
1.2.5.胶回收线性化质粒，以备共转化使用。
1.3慢病毒的包装(在293细胞中)、鉴定、扩增、纯化、滴度测定及转染按照常规技术。
1.3Gankyrin稳定细胞系的构建
1.3.1.在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3～5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养基体积为100μl；进行慢病毒感染时细胞的融合度约为70％左右。
1.3.2.取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可)；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
1.3.3.病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验，a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基b吸去培养基的培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液)c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液d混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)孵育过夜。感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。
1.3.4.一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养(建议在8-12小时更换为宜)。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。
1.3.4.通过Real-time RT-PCR或者Western blot检测目的基因的表达。
anti-PARP，anti-Myc抗体购自CST公司，anti-Gankyrin抗体(鼠抗人Gankyrin免疫组化单克隆抗体)购自santa CRUZ公司，anti-β-actin抗体购自康成生物科技有限公司。Western用荧光二抗购自LI-COR Biosciences公司。CCK-8试剂，annexin V/propidium iodide staining购自Invitrogen公司。裸鼠购自于南京大学模式动物中心。Sorafenib购自LC laboratories，氯喹购自Sigma公司。
2.细胞培养
SMMC-7721，HCC-LM3，细胞用高糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’smedium)培养，按10％(v/v)加入胎牛血清(FBS：Bovine serum albumin)。置于37℃、5％CO2的孵箱，保持饱和湿度。
消化：用吸引器吸取培养皿中培养基弃去，生理盐水轻洗两遍，加少许0.25％胰蛋白酶(trypsin)，室温放置数分钟，加少量新鲜培养基终止消化，轻轻吹打，将细胞收集到10ml离心管中，900rpm离心3分钟，弃上清，加入适量新鲜培养基加入新培养皿，摇晃使细胞平均分布后置于孵箱中。
冻存：10cm培养皿细胞生长至70％密度时，胰酶消化离心后弃去上清；将细胞沉淀悬浮于1ml冻存液(DMEM+40％胎牛血清+10％DMSO)中，转移到冻存管中，而后置于细胞冻存盒中，置于-80℃，第二天将细胞放进液氮中。
复苏：将从液氮罐中取出的细胞直接置于37℃水中融化不断搅动，待完全溶化后，转移细胞于10ml离心管中，900转离心3分钟，弃上清，加有新鲜完全培养液的培养瓶中培养，次日更换培养液。
3.免疫印迹(Western Blot)
(1).组织切下黄豆大小加入2ml EP管，加入适量IP裂解液及钢珠，震荡机充分震荡后超声处理，细胞用生理盐水洗涤两遍，加入适量IP裂解液冰上充分裂解30分钟。
(2).4℃，12,000转，离心15分钟，转移上清到新EP管中，注意不要吸到沉淀。
(3).BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量(组织样品稀释100倍，细胞样品稀释10倍)，使用多功能酶标仪得到样本的蛋白浓度。
(4).按样品体积的三分之一加入4×SDS上样缓冲液，100℃变性5分钟。
(5).1×Tris-甘氨酸进行SDS-PAGE蛋白电泳(积层胶80V30分钟，分离胶120V3-4h)。
(6).通过半干转式转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)共2-2.5h(上下个三层3M滤纸8.2cm×7.2cm，NC膜面积最大8.5cm×7.5cm)。
(7).转膜结束后将NC膜转移到杂交盒内(杂交盒预先应冲洗干净，防治膜上孵育上杂质)，5％脱脂奶粉封闭液室温封闭NC膜1h(也可4度过夜封闭)。
(8).取出NC膜，弃去上层封闭液，倒入适量1×TBST洗3次，每次5分钟。
(9).弃去1×TBST，杂交盒内倒入5％BSA稀释一抗，室温下在杂交摇床上缓慢摇荡孵育NC膜1.5h-2h(或放在4℃摇床孵育过夜)。
(10).一抗孵育结束后应回收回原管，4℃保存，倒入适量1×TBST洗3次，每次5分钟。5％BSA稀释荧光二抗液室温下孵育1-1.5h。
(11).二抗孵育结束后回收回原管，4℃保存，倒入适量1×TBST避光洗3次，每次5分钟。
(12).Odyssey荧光扫描仪扫膜，完成后可根据分子量加入其他一抗孵育。
4.临床样本收集
收集70例术后服用Sorafenib的肝癌病人组化样本。
5.皮下荷瘤实验
接种10cm培养皿70-80％密度的细胞到裸鼠皮下，一周以后通过腹腔给予Sorafenib(30毫克/千克体重/天)以及Chloroquine(60毫克/千克体重/天)，四周后处死老鼠测量肿瘤体积(V＝a x b2xπ/6)。
6.PDX动物模型
(1)病人肿瘤标本的收集：尽可能在肿瘤离体后收集，标本可来源于组织活检和肿瘤根治手术标本。新鲜肿瘤组织最好取肿瘤靠近边缘、坏死较少的肿瘤组织，完全浸泡于0℃带或不带血清、0.05％青霉素及链霉素双抗PRMI1640培养基中。
(2)清洗后转移到带上述培养基的消毒培养皿中(0℃)，完全浸泡并带回动物房操作。
(3)用消毒组织剪将肿瘤组织修剪成2×2×3mm，并用以上培养基中清洗3遍。
(4)麻醉下的4-6周龄的SCID小鼠或者裸鼠皮下后两侧皮肤各开一个约3mm小口，并分离出一个小口袋状空间，将修剪的肿瘤小块组织种植于皮下，缝合皮肤剪口。
(5)在切口滴一滴100×双抗溶液防止伤口感染。
(6)剩余组织储存于-80℃冰箱或制作石蜡切片待以后做进一步的分析。
(7)每种肿瘤都种植于2个小鼠，至少每周观察一次种植肿瘤情况。观察内容包括有无肿瘤生长及测量肿瘤的长、宽并计算肿瘤的体积。在接种肿瘤的第一周，在移植部位可以看到一个隆起的小结，然后会消失，约在12-16周后移植肿瘤才开始生长成1-2cm3大小。
实施例1、过表达Gankyrin促进肝癌细胞在索拉菲尼刺激下的存活
SMMC-7721-luc或者SMMC-7721-Gank细胞系在20uM索拉菲尼刺激24，48，72小时后或者不同浓度的索拉菲尼(5uM，10uM，20uM)刺激24小时后，进行活细胞数检测。
结果如图1所示，发现过表达Gankyrin可以促进肝癌细胞在索拉菲尼刺激下的存活。
实施例2、过表达Gankyrin或干扰Gankyrin对于索拉菲尼引起的凋亡的影响
对照细胞系SMMC-7721-luc或者Gankyrin过表达细胞系SMMC-7721-Gank在20uM Sorafenib(索拉菲尼)刺激相应时间后，检测PARP剪切体的蛋白表达水平。结果如图2A所示，发现过表达Gankyrin可以抑制索拉菲尼引起的凋亡剪切体升高。
HCC-LM3细胞系通过对照腺病毒(Ad-GFP)或者Gankyrin干扰腺病毒(Ad-siGank)处理，20uM Sorafenib(索拉菲尼)刺激相应时间后，检测相应分子的蛋白表达水平。结果如图2B所示，发现干扰Gankyrin可以促进索拉菲尼引起的细胞凋亡。
SMMC-7721-luc或者SMMC-7721-Gank细胞系在20uM Sorafenib(索拉菲尼)刺激相应时间后，Annexin V染色检测凋亡细胞比例。结果如图2C，表明过表达Gankyrin可以抑制索拉菲尼引起的凋亡。
实施例3、通过氯喹或者3-MA抑制自噬以后，Gankyrin不能再抑制Sorafenib引起的细胞凋亡
SMMC-7721-luc/SMMC-7721-Gank细胞系在20uM Sorafenib(索拉菲尼)联用CQ(氯喹，Chloroquine)/3-MA(3-甲基腺嘌呤，3-Methyladenine)刺激相应时间后，检测活细胞数量。结果如图3A所示。
SMMC-7721-luc/SMMC-7721-Gank细胞系在20uM Sorafenib(索拉菲尼)联用CQ(氯喹，Chloroquine)/3-MA(3-甲基腺嘌呤，3-Methyladenine)刺激24小时后，免疫印迹检测PARP剪切体的表达。结果如图3B所示。
SMMC-7721-luc/SMMC-7721-Gank细胞系在20uM Sorafenib(索拉菲尼)联用CQ(氯喹，Chloroquine)/3-MA(3-甲基腺嘌呤，3-Methyladenine)刺激相应时间后，Annexin V检测其凋亡细胞比例。结果如图3C所示。
上述结果表明，通过氯喹或者3-MA抑制自噬以后，Gankyrin不能再抑制Sorafenib(索拉菲尼)引起的细胞凋亡。
实施例4、抑制自噬可阻断Gankyrin介导的对Sorafenib的药物抵抗
SMMC-7721-luc/SMMC-7721-Gank细胞系接种到裸鼠皮下2周后给予如图所示处理，每3天测量一次肿瘤体积大小，30天后处死小鼠取出瘤体，如如图4A。
图4A中SMMC-7721-luc/SMMC-7721-Gank组sorafenib单独处理或者sorafenib-CQ联用的瘤体生长曲线如图4B。每个点数值均为三次测量所得。
通过体内实验发现，通过氯喹抑制自噬可阻断Gankyrin介导的对Sorafenib(索拉菲尼)的药物抵抗。
实施例5、Gankyrin高表达影响生存时间
本发明人收集了东方肝胆外科医院70例手术后服用索拉菲尼病人的肝癌样本以及临床病理资料(如表1)。对肝癌样本中代表性的Gankyrin进行免疫组化染色。
表1、70例肝癌术后服用索拉菲尼病人的临床病理学分布
免疫组化染色结果如图5上图。图5的下图为Gankyrin高表达组以及Gankyrin低表达组病人的总生存期分析。
结果表明，Gankyrin高表达组总生存期显著差于Gankyrin低表达组。
实施例6、试剂盒
根据上述细胞学实验结果，提供了一种Gankyrin诊断试剂盒，具体细节如下：
1、诊断试剂盒成分
诊断试剂盒成分如表2。
表2
2、试剂盒质控要求
(1)外观
试剂盒外观完整，内装细分齐全：试管为无色、透明、干燥：质控片完整无破裂。
内源性过氧化物酶阻断剂，柠檬酸组织抗原修复液(空白对照试剂，DAB缓冲液，DAB底物(20×)为：无色透明液体，无沉淀或其他异物。
鼠抗人Gankyrin免疫组化单克隆抗体为：绿色透明液体，无沉淀或其他异物。
酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物为：浅红色透明液体，无沉淀或其他异物。
DAB色原(20×)为：棕色液体，无沉淀或其他异物。
苏木素体细胞染色液为：蓝紫色液体，无沉淀或其他异物。
(2)敏感度
用Gankyrin弱阳性对照片(原发性肝细胞癌)进行检测，三份Gankyrin弱阳性对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质上观察到浅黄色着色，且颜色无明显差异。
(3)特异性
用Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)进行检测，三份Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质上观察到黄色或棕黄色着色：而正常肝细胞、胆管细胞、各种淋巴细胞、平滑肌细胞和纤维细胞上未观察到任何黄色或棕黄色着色。
用空白对照试剂取代鼠抗人Gankyrin免疫组化单克隆抗体配合Gankyrin对照片(原发性肝细胞癌)进行检测，三份Gankyrin对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质在应显示阴性结果。
(4)批内差
取同一批次的产品，检测同一来源的Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)，同一来源的三份Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质上观察到黄色或棕黄色着色，且颜色无明显差异。
(5)批间差
取三个批次的产品各一盒，检测同一来源的Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)，同一来源的三份Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质上观察到黄色或棕黄色着色，且颜色无明显差异。
(6)稳定性
热稳定性试验：在效期内的产品在37℃放置6天，检测外观、敏感度、特异性、批内差，应符合前述的要求。
(7)背景
阳性细胞外组织呈均一蓝色或蓝紫色，无沉淀及颗粒。
(8)质控片(阳性对照片)开封稳定性
取三份Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)拆开包装后，保存在4℃三周后进行检测，三份Gankyrin阳性对照片(原发性肝细胞癌)中肿瘤细胞细胞质上观察到黄色或棕黄色着色，且颜色无明显差异。
3、通过免疫组织化学方法检测原发性肝细胞癌患者手术切除术后石蜡包埋的肝细胞癌及癌旁正常肝组织中Gankyrin的表达水平
(1)60℃烤箱烘烤1h后，二甲苯10分钟×3，100％乙醇(ethyl alcohol)5分钟，95％乙醇(ethyl alcohol)5分钟，85％乙醇(ethyl alcohol)5分钟，75％乙醇(ethylalcohol)5分钟，ddH2O5分钟。3％H2O2甲醇液室温20min去除内源性过氧化物酶的影响。
(2)ddH2O洗5分钟×3次，0.01M枸橼酸高压抗原修复2分钟，开盖自然冷却。
(3)ddH2O洗5分钟×2次，PH7.4PBS洗5分钟×1次，50ul1％BSA置于湿盒中封闭37℃30分钟。
(4)吸去封闭液，滴加一抗50ul，4℃过夜。
(5)4℃取出，室温复温15分钟，PBS洗5分钟×4次，滴加50ul相应二抗，37℃孵育30分钟。
(6)PBS洗5分钟×4次，DAB(1:50)显色3-10min，出现明显砖红色即可将其放入ddH2O中终止反应。
(7)ddH2O洗5分钟×2次，苏木素复染10分钟。
(8)取出片子后流水洗去多余苏木素，盐酸乙醇分化1-2次，流水20-30分钟冲洗反蓝，而后取出片子，沥干水。
(9)ddH2O5分钟，75％乙醇(ethyl alcohol)5分钟，85％乙醇(ethyl alcohol)5分钟，95％乙醇(ethyl alcohol)10分钟，100％乙醇(ethyl alcohol)10分钟×2次，石炭酸处理5min，二甲苯15分钟。
(10)滴加中性树脂50ul，盖上盐酸处理并洗净的盖玻片，放入37℃孵箱过夜，第二天取出永久保存。
4、根据免疫组化的方法检测肝细胞癌手术切除肿瘤和癌旁正常肝组织标本中Gankyrin的表达水平，进行IRS评分系统评分
方法如下：在所有标本的每张切片随机选择五个视野，每个视野计数100个细胞；根据计数细胞的百分比，Gankyrin的表达被划分4个等级：1分为1-25％，2分为26-50％，3分为51-75％，4分为76％以上；再根据细胞着色的前度Gankyrin的表达划分为4个等级：0分为无着色，1分为浅黄色颗粒，2分为黄褐色颗粒，3分为深褐色颗粒。每张切片对应一个百分比分数和着色分数，两者相加即为该切片的最后得分。
实施例7、肝癌原代动物移植瘤模型(Patient-Derived Xenograft，PDX)验证Gankyrin试剂盒临床应用
获得20位临床患者的肝癌组织，制备免疫组化样本的同时构建PDX模型(构建方法公所周知)，将其按Gankyrin试剂盒检测结果划分为Gankyrin高低表达两组。人源肿瘤细胞接种到NOD SCID小鼠皮下后十周后给予Sorafenib或者Sorafenib联用自噬抑制剂CQ，每3天测量一次肿瘤体积大小，30天后处死小鼠取出瘤体。通过PDX实验发现，低表达组Sorafenib处理或者Sorafenib联用自噬抑制剂处理两者差异并不明显，而高表达组中Sorafenib处理或者Sorafenib联用自噬抑制剂处理两者有明显差异(图6)。提示Gankyrin检测试剂盒可以作为临床肝癌病人是否使用Sorafenib联用自噬抑制剂疗法的分子分型的靶标。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.Gankyrin蛋白的用途，用于制备进行肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的诊断试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的索拉菲尼治疗还包括：索拉菲尼联合氯喹或3-甲基腺嘌呤治疗。
3.特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂的用途，用于制备进行肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的诊断试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂是抗人Gankyrin的抗体。
5.一种用于肝癌的索拉菲尼治疗的预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：特异性检测Gankyrin蛋白表达水平的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测信号分子是辣根过氧化物酶，还包括免疫组化试剂：
内源性过氧化物酶阻断剂；
DAB缓冲液；
DAB底物；
苏木素体细胞染色液；
空白对照试剂；
柠檬酸组织抗原修复液；
Gankyrin阳性对照片；
PBS磷酸盐缓冲液；或
DAB显色液配制管。
8.特异性抑制Gankyrin表达的干扰试剂的用途，其特征在于，用于制备与索拉菲尼联用治疗肝癌的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特异性抑制Gankyrin表达的干扰试剂具有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
10.一种用于与索拉菲尼联用治疗肝癌的干扰试剂，其特征在于，其具有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
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