CN112501239B - Tak1抑制剂抑制pdl1的检测方法及其在制备抗pdl1药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,包括如下步骤:(1)探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制:利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞,分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达;(2)检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平;(3)验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用:用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后,用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。本发明采用的TAK1抑制剂是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物,在基因水平明显下调PDL1的表达,有望为临床上治疗乳腺癌提供可行性和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用。
背景技术
程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1, PD1)是一种广泛表达在T细胞表面的重要免疫抑制性分子,为免疫球蛋白超家族,是一个含有268个氨基酸残基的跨膜蛋白。PD-1主要抑制慢性炎症、感染或癌症中激活的T细胞活性,其有两个相关配体,即程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)和程序性死亡-配体2(Programmed cell death 1 ligand 2,PD-L2)。一般地,在肿瘤微环境中,肿瘤细胞能够高表达PD-L1或PD-L2,显著抑制T细胞的抗肿瘤活性,从而达到免疫逃逸的目的。其中,PD-1又称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274,CD274)或B7同源体(B7homolog 1,B7-H1),是由9号染色体上的CD274基因在干扰素调节因子1(IRF1)和信号转导激活转录1(STAT1)反应元件的控制下编码。研究发现,PD-L1是一种40kDa的跨膜蛋白,在多种恶性肿瘤中上调,并且通常在肿瘤细胞表面上表达。例如,在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等组织中都有PD-L1蛋白的高表达。乳腺癌(breast cancer,BC)一直是肿瘤研究领域的热点之一,其死亡率在女性恶性肿瘤中位居首位。近几十年来,尽管乳腺癌的发病率一直在增加,但由于诊断和治疗技术的快速发展,其死亡率持续下降。临床上一般采用手术、化疗、靶向治疗等方法进行治疗,但由于肿瘤耐药问题的广泛存在,其临床治疗效果一直不理想。例如,在恶性程度较高的三阴性乳腺癌中,治疗手段相对缺乏,PD1单抗Pembrolizumab(MK-3475)是一种高选择性的人源化IgG4/k型抗PD1单克隆抗体,在针对复发/转移性三阴性乳腺癌的 KEYNOTE-12Ib期临床试验中,客观缓解率(ORR)为18.5%,但还是会出现不良反应,包括关节痛、乏力、恶心、肌痛等。
转化生长因子激酶1(TGF beta-Activated Kinase 1,TAK1)是丝裂源激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族成员之一。1995年,Yamaguchi等首次在酵母体内进行MAPK信号通路的遗传选择实验中被证实,是细胞内重要的信号分子。TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol(5Z7),是一种不可逆的ATP竞争性抑制剂,主要由真菌分泌提纯而成。有研究发现,小分子5Z-7抑制TAK1或基因沉默可大量诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞死亡。机制上,抑制TAK1可显著降低核因子κB(NF-κB)活性,并且发现TAK1的抑制通过抑制慢性NF-κB信号来促进DLBCL细胞的死亡。
乳腺癌是一种异质性疾病,目前确定的危险因素还无法完全阐述其发病机理。随着信号通路、细胞凋亡等分子生物学方法在肿瘤研究中的应用,乳腺癌分子靶点和靶向治疗逐渐成为抗乳腺癌研究的趋势和热点。鉴于传统治疗方法的局限性,免疫疗法以其高特异性和记忆性,对改善肿瘤患者的生存率和预后情况具有潜在作用。免疫检查点是阻碍机体免疫细胞抗肿瘤的主要原因,也是发生免疫逃逸的罪魁祸首。目前针对免疫检查点,主要是采用单克隆抗体抑制剂的方法来提高抗肿瘤的效果。PDL1和PDL2是目前肿瘤免疫治疗,特别是免疫检查点阻断疗法的核心靶点。抑制PD-L1和PD-L2功能,可以激活T细胞的抗肿瘤免疫,杀伤肿瘤细胞。TAK1抑制剂的抗肿瘤作用已在多种肿瘤治疗中得到广泛开展,本发明旨在研究TAK1抑制剂在制备抗PD-L1药物中的应用,为TAK1抑制剂的临床实践提供更多的理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用,为TAK1抑制剂的临床实践提供更多的理论依据。
为解决上述技术问题,本发明的实施例提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,包括如下步骤:
(1)探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制:利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞,分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达;
(2)检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平;
(3)验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用:用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后,用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。
其中,步骤(1)中,小分子抑制剂为TAK1抑制剂5Z7,处理浓度为0、1和3 μM。
其中,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231。
其中,步骤(1)中采用Western Blot方法和实时定量PCR方法检测PDL1蛋白水平和基因水平的表达。
其中,步骤(1)的具体步骤包括:
(1-1)复苏细胞:从-80℃中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,摇动令其尽快融化(慢冻速溶);从37℃水浴中取出冻存管,加入1mL的完全培养基,混匀;1000rpm离心3min,弃去上清液;加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞,均匀接种于60mm的培养皿中,5%CO2,37℃培养箱静置培养;次日更换一次培养液,继续培养;待细胞密度达到90%时,胰酶消化细胞,根据后续实验确定铺孔的数目(6孔板),继续培养;
(1-2)TAK1抑制剂5Z7的处理:选择处理的浓度依次为0、1和3μM,加药处理时间为24h;
(1-3)蛋白质免疫印迹
(1-3-1)蛋白样品的制备:配制裂解缓冲液(含10μL PMSF与990 μL Lysisbuffer)置于冰浴中备用;细胞经预冷PBS清洗后转移至灭菌离心管,离心后弃去上清;用含有PMSF的裂解液重悬细胞,冰浴上裂解30min(摇床);4℃,高速离心15min后完全吸取上清(蛋白);蛋白与5×Loading buffer混匀后,按4:1的比例吸取,95℃金属浴煮沸5min,置于-20℃储存;
(1-3-2)电泳跑胶及转膜显色:将蛋白样品105℃再次煮沸5 min;按照蛋白胶的配方配制10%的分离胶,上层配制5%的浓缩胶,各孔加入10μL蛋白样品;调节电泳仪电压至80V,当溴酚蓝指示剂到达下层分离胶时再次调节电泳仪电压至120V;依据标准蛋白marker将待考察的样品区域胶割下;PVDF膜剪成与割离的蛋白胶相同大小,置于转膜buffer中平衡3 min;
按照如下叠放顺序:电源正极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-电源负极,300mA湿转1h;PVDF膜置于5%脱脂奶粉中,封闭2h;TBST漂洗PVDF膜3min,加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗(1:1000),4℃孵育过夜;次日TBST漂洗5 min*3,加入适量的二抗(1:2000),室温孵育2h;最后TBST漂洗10min*3,使用ECL试剂显色;
(1-4)实时定量PCR
(1-4-1)细胞总RNA提取:利用Trizol法从上述处理的细胞中提取总RNA,具体如下:细胞弃去培养液,利用PBS清洗一次,加入胰酶消化细胞并收集在无RNA酶的EP管中;加入1mL RNA isolater(诺唯赞R401-01),室温放置5min;加入200μL氯仿,剧烈震荡15s,室温静置3min;12000r,4℃离心15min,分为三层,小心吸取上层至一个新的无RNA酶的EP管中,加入0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃静置2h(增加沉淀);12000r,4℃离心10min,管底有白色沉淀;弃上清,加入1mL预冷的75%乙醇(DEPC水配制),7500r,4℃离心5min,尽可能的弃去上清;在通风橱中干燥沉淀10-30min,加入30μL的DEPC水溶解RNA,65℃水浴加热5min,测浓度后放置于-80℃保存;
(1-4-2)cDNA的合成及qPCR检测:把上面测量后RNA按照HiScript® II Q RTSuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(诺唯赞R223-01)的说明书逆转合成cDNA,具体如下:
①基因组去除:在RNase-free的离心管中配制如下混合液,模板RNA 1µg;4×gDNAwiper Mix,4µL;RNase-free ddH2O补足至16μL,用移液器轻轻吹打混匀,42℃ 2min;
②配制逆转录反应体系:在第①步的反应管中直接加入4µL的5 × HiScript IIqRT SuperMix II;
③进行逆转录反应:50℃ 15min,85℃ 5s,产物加水稀释8倍,置于-20℃保存,随后利用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix(诺唯赞Q111-02)试剂盒检测PDL1和PDL2的基因表达水平。
进一步,步骤(1-4)通过基因转录水平进行检测,分别设计了PDL1和PDL2的RT-PCR引物,分别在SUM159和MDA-MB-231细胞中验证;引物分别为:
PDL1-RT-F:GTAGCACTGACATTCATCTTC;
PDL1-RT-R:TTCCTTCCTCTTGTCACGCTC;
PDL2-RT-F:CATAGCCACAGTGATAGCCCT;
PDL2-RT-R: GGCTCCCAAGACCACAGGTTC。其中,步骤(3)中免疫荧光实验的具体方法如下:
让肿瘤细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上,接种密度达到60%,加药处理细胞24h;每孔用500μL的PBS洗细胞3次,每次5min;之后每孔加200ul 4% 多聚甲醛,室温固定15min;去除多聚甲醛,每孔用500μL PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入500μL的1%BSA,室温封闭2h;去除封闭液,每孔加200μL一抗(BSA稀释),4℃过夜;去除抗体,每孔用500 μLPBS洗细胞3次,每次5min;每孔加200μL荧光二抗,室温孵育2h;去除二抗,每孔用500PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入Hochest(1:200PBS稀释),室温10min,500μL PBS洗细胞3次,每次5min;载玻片上滴一小滴抗褪色剂,将盖玻片从孔中取出,面朝下盖到抗褪色剂上,使其轻轻接触到载玻片上(小心气泡);将玻片置于暗处5min使其晾干,此时即可在荧光显微镜下进行观察。
本发明还提供一种TAK1抑制剂在制备抗PDL1药物中的应用。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:本发明的研究发现,在乳腺癌细胞SUM159和MDA-MB-231中,TAK1抑制剂5Z7能够显著下调PD-L1的蛋白水平,并且在转移能力较强的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,其抑制能力高于SUM159细胞。TAK1还可以通过磷酸化的方式激活MAPKKs,从而导致MAPKs的激活(ERK)。磷酸化修饰被认为是TAK1依赖的信号转导过程中重要调节机制,5Z7在蛋白水平降低了磷酸化ERK。本发明采用的TAK1抑制剂是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物,在基因水平明显下调PDL1的表达,有望为临床上治疗乳腺癌提供可行性和理论依据。
附图说明
图1为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后WB检测PDL1的表达图;
图2为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后RT-PCR检测PDL1的表达图;
图3为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后WB检测p-ERK的表达图;
图4为本发明中不同浓度的TAK1抑制剂处理SUM159细胞后免疫荧光检测PD-L1的表达图;
图5为本发明中不同浓度的TAK1抑制剂处理MDA-MB-231细胞后免疫荧光检测PD-L1的表达图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,包括如下步骤:
(1)探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制:利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞,分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达;
(2)检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平;
(3)验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用:用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后,用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。
本发明还提供一种TAK1抑制剂在制备抗PDL1药物中的应用。
下面结合具体实施例详细阐述本发明的技术方案。
为了获得抑制PD-L1的新方法,检测了不同小分子抑制剂抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达情况,TAK1抑制剂5Z7处理乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231,PD-L1和PD-L2的表达显著下降。TAK1抑制剂5Z7处理乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231。实验中,选择5Z7处理浓度分别为0、1和3μM,通过Western Blot方法和实时定量PCR(RTPCR)方法检测PDL1蛋白水平和基因水平的表达。具体实验步骤包括:
(1-1)复苏细胞:从-80℃中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,摇动令其尽快融化(慢冻速溶);从37℃水浴中取出冻存管,加入1mL的完全培养基,混匀;1000rpm离心3min,弃去上清液;加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞,均匀接种于60mm的培养皿中,5%CO2,37℃培养箱静置培养;次日更换一次培养液,继续培养;待细胞密度达到90%时,胰酶消化细胞,根据后续实验确定铺孔的数目(6孔板),继续培养。
(1-2)TAK1抑制剂5Z7的处理:选择处理的浓度依次为0、1和3μM,加药处理时间为24 h。
(1-3)蛋白质免疫印迹
(1-3-1)蛋白样品的制备:配制裂解缓冲液(含10μL PMSF与990μL Lysis buffer)置于冰浴中备用;细胞经预冷PBS清洗后转移至灭菌离心管,离心后弃去上清;用含有PMSF的裂解液重悬细胞,冰浴上裂解30min(摇床);4℃,高速离心15min后完全吸取上清(蛋白);蛋白与5×Loading buffer混匀后,按4:1的比例吸取,95℃金属浴煮沸5min,置于-20℃储存。
(1-3-2)电泳跑胶及转膜显色:将蛋白样品105℃再次煮沸5min;按照蛋白胶的配方配制10%的分离胶,上层配制5%的浓缩胶,各孔加入10μL蛋白样品;调节电泳仪电压至80V,当溴酚蓝指示剂到达下层分离胶时再次调节电泳仪电压至120V;依据标准蛋白marker将待考察的样品区域胶割下;PVDF膜剪成与割离的蛋白胶相同大小,置于转膜buffer中平衡3min。
按照如下叠放顺序:电源正极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-电源负极,300mA湿转1h;PVDF膜置于5%脱脂奶粉中,封闭2h;TBST漂洗PVDF膜3min,加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗(1:1000),4℃孵育过夜;次日TBST漂洗5 min*3,加入适量的二抗(1:2000),室温孵育2h;最后TBST漂洗10min*3,使用ECL试剂显色。
(1-4)实时定量PCR:通过基因转录水平进行检测,分别设计了PDL1和PDL2的RT-PCR引物,分别在SUM159和MDA-MB-231细胞中验证;引物分别为:
PDL1-RT-F:GTAGCACTGACATTCATCTTC;
PDL1-RT-R:TTCCTTCCTCTTGTCACGCTC;
PDL2-RT-F:CATAGCCACAGTGATAGCCCT;
PDL2-RT-R: GGCTCCCAAGACCACAGGTTC。(1-4-1)细胞总RNA提取:利用Trizol法从上述处理的细胞中提取总RNA,具体如下:细胞弃去培养液,利用PBS清洗一次,加入胰酶消化细胞并收集在无RNA酶的EP管中;加入1mL RNA isolater(诺唯赞R401-01),室温放置5min;加入200μL氯仿,剧烈震荡15s,室温静置3min;12000r,4℃离心15min,分为三层,小心吸取上层至一个新的无RNA酶的EP管中,加入0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃静置2h(增加沉淀);12000r,4℃离心10min,管底有白色沉淀;弃上清,加入1mL预冷的75%乙醇(DEPC水配制),7500r,4℃离心5min,尽可能的弃去上清;在通风橱中干燥沉淀10-30min,加入30μL的DEPC水溶解RNA,65℃水浴加热5min,测浓度后放置于-80℃保存。
(1-4-2)cDNA的合成及qPCR检测:把上面测量后RNA按照HiScript® II Q RTSuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(诺唯赞R223-01)的说明书逆转合成cDNA,具体如下:
①基因组去除:在RNase-free的离心管中配制如下混合液,模板RNA 1µg;4×gDNAwiper Mix,4µL;RNase-free ddH2O补足至16μL,用移液器轻轻吹打混匀,42℃ 2min;
②配制逆转录反应体系:在第①步的反应管中直接加入4µL的5 × HiScript IIqRT SuperMix II;
③进行逆转录反应:50℃ 15min,85℃ 5s,产物加水稀释8倍,置于-20℃保存,随后利用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix(诺唯赞Q111-02)试剂盒检测PDL1和PDL2的基因表达水平。
蛋白水平检测结果如图1所示,结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中,TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制PDL1蛋白的表达。同理,mRNA水平检测结果如图2所示,结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中,TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制pdl1基因的转录。
前期结果表明,SUM159和MDA-MB-231细胞中PD-L1和PD-L2的表达,依赖肿瘤细胞中ERK的激活。此外,在两种细胞中,TAK1抑制剂5Z7处理前后检测了ERK的磷酸化水平,结果如图3所示,结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中,TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制ERK的磷酸化水平。
为了进一步验证TAK2抑制剂5Z7对肿瘤细胞PD-L1的抑制作用,又用免疫荧光技术检测细胞中PD-L1的蛋白表达水平。接着,利用免疫荧光技术在SUM159和MDA-MB-231细胞中检测PDL1的表达水平,实验中,,选择5Z7处理浓度分别为0、3和5μM。SUM159细胞的检测结果如图4所示,结果分析TAK1抑制剂5Z7处理SUM159细胞以后,免疫荧光强度明显减弱,这表明PDL1蛋白水平显著下调。类似的实验结果在MDA-MB-231细胞中也得到证实,试验结果如图5所示。
上述的免疫荧光实验的具体方法如下:
让肿瘤细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上,接种密度达到60%,加药处理细胞24h。每孔用500μL的PBS洗细胞3次,每次5min;之后每孔加200ul 4% 多聚甲醛,室温固定15min;去除多聚甲醛,每孔用500μL PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入500μL的1%BSA,室温封闭2h;去除封闭液,每孔加200μL一抗(BSA稀释),4℃过夜;去除抗体,每孔用500 μLPBS洗细胞3次,每次5min;每孔加200μL荧光二抗,室温孵育2h;去除二抗,每孔用500PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入Hochest(1:200PBS稀释),室温10min,500μL PBS洗细胞3次,每次5min;载玻片上滴一小滴抗褪色剂,将盖玻片从孔中取出,面朝下盖到抗褪色剂上,使其轻轻接触到载玻片上(小心气泡);将玻片置于暗处5min使其晾干,此时即可在荧光显微镜下进行观察。
综上,TAK1抑制剂5Z7在乳腺癌细胞中(主要是SUM159和MDA-MB-231)能够显著抑制PDL1基因和蛋白两个水平的表达,并且可能是通过减弱ERK的磷酸化水平的方式来降低PDL1基因的转录,从而抑制了PDL1在肿瘤细胞中的表达。因此,TAK1抑制剂5Z7可以增强T细胞在乳腺癌中的免疫治疗效果,可以作为未来的一个治疗靶点,本发明的结论可以为乳腺癌的治疗提供必要的指导意义。
抑制肿瘤细胞中PD-L1的功能,可以激活T细胞的抗肿瘤免疫。在临床上,部分病人对抗PD-L1治疗具有较好的反应。目前抗PD-L1主要通过抗体来实现。本发明发现了小分子抑制剂可以抑制肿瘤细胞中的PD-L1表达,从而可以获得抗PD-L1相似的作用。TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物,在多种肿瘤治疗中备受关注。本发明发明,在乳腺癌细胞SUM159和MDA-MB-231中,5Z7明显抑制了PDL1的表达。因此,TAK1抑制剂可以抑制肿瘤细胞的PD-L1表达,激活T细胞的抗肿瘤免疫。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用
<141> 2020-12-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys
20
Claims (5)
1.一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制:利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞,分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达;
(2)检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平;
(3)验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用:用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后,用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平;TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol通过减弱ERK的磷酸化水平的方式来降低PDL1基因的转录,从而抑制了PDL1在肿瘤细胞中的表达;
所述检测方法为非疾病诊断和治疗目的;
步骤(1)中,小分子抑制剂为TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol ,处理浓度为0、1和3 μM;
所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231。
2.根据权利要求1所示的TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,其特征在于,步骤(1)中采用Western Blot方法和实时定量PCR方法检测PDL1蛋白水平和基因水平的表达。
3.根据权利要求1或2所示的TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,其特征在于,步骤(1)的步骤包括:
(1-1)复苏细胞:从-80℃中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,摇动令其尽快融化;从37℃水浴中取出冻存管,加入1mL的完全培养基,混匀;1000 rpm离心3min,弃去上清液;加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞,均匀接种于60mm的培养皿中,5%CO2,37℃培养箱静置培养;次日更换一次培养液,继续培养;待细胞密度达到90%时,胰酶消化细胞,根据后续实验确定铺孔的数目,继续培养;
(1-2)TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol的处理:选择处理的浓度依次为0、1和3μM,加药处理时间为24h;
(1-3)蛋白质免疫印迹
(1-3-1)蛋白样品的制备:配制裂解缓冲液置于冰浴中备用;细胞经预冷PBS清洗后转移至灭菌离心管,离心后弃去上清;用含有PMSF的裂解液重悬细胞,冰浴上裂解30min;4℃,高速离心15min后完全吸取上清;蛋白与5×Loading buffer混匀后,按4:1的比例吸取,95℃金属浴煮沸5min,置于-20℃储存;
(1-3-2)电泳跑胶及转膜显色:将蛋白样品105℃再次煮沸5 min;按照蛋白胶的配方配制10%的分离胶,上层配制5%的浓缩胶,各孔加入10μL蛋白样品;调节电泳仪电压至80V,当溴酚蓝指示剂到达下层分离胶时再次调节电泳仪电压至120V;依据标准蛋白marker将待考察的样品区域胶割下;PVDF膜剪成与割离的蛋白胶相同大小,置于转膜buffer中平衡3min;
按照如下叠放顺序:电源正极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-电源负极,300mA湿转1h;PVDF膜置于5%脱脂奶粉中,封闭2h;TBST漂洗PVDF膜3min,加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗,4℃孵育过夜;次日TBST漂洗5 min*3,加入适量的二抗,室温孵育2h;最后TBST漂洗10min*3,使用ECL试剂显色;
(1-4)实时定量PCR
(1-4-1)细胞总RNA提取:利用Trizol法从上述处理的细胞中提取总RNA,如下:细胞弃去培养液,利用PBS清洗一次,加入胰酶消化细胞并收集在无RNA酶的EP管中;加入1mL RNAisolater,室温放置5 min;加入200μL氯仿,剧烈震荡15s,室温静置3min;12000r, 4℃离心15min,分为三层,小心吸取上层至一个新的无RNA酶的EP管中,加入0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃静置2h;12000r,4℃离心10min,管底有白色沉淀;弃上清,加入1mL预冷的75%乙醇,7500r,4℃离心5min,尽可能的弃去上清;在通风橱中干燥沉淀10-30min,加入30μL的DEPC水溶解RNA,65℃水浴加热5min,测浓度后放置于-80℃保存;
(1-4-2)cDNA的合成及qPCR检测:把上面测量后RNA逆转合成cDNA,如下:
①基因组去除:在RNase-free的离心管中配制如下混合液,模板RNA 1µg;4×gDNAwiper Mix,4µL;RNase-free ddH2O补足至16μL,用移液器轻轻吹打混匀,42℃ 2min;
②配制逆转录反应体系:在第①步的反应管中直接加入4µL的5×HiScript II qRTSuperMix II;
③进行逆转录反应:50℃ 15min,85℃ 5s,产物加水稀释8倍,置于-20℃保存,随后检测PDL1和PDL2的基因表达水平。
4.根据权利要求3所示的TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,其特征在于,步骤(1-4)通过基因转录水平进行检测,分别设计了PDL1和PDL2的RT-PCR引物,分别在SUM159和MDA-MB-231细胞中验证;引物分别为:
PDL1-RT-F:GTAGCACTGACATTCATCTTC;
PDL1-RT-R:TTCCTTCCTCTTGTCACGCTC;
PDL2-RT-F:CATAGCCACAGTGATAGCCCT;
PDL2-RT-R: GGCTCCCAAGACCACAGGTTC。
5.根据权利要求1或2所示的TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,其特征在于,步骤(3)中免疫荧光实验的方法如下:
让肿瘤细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上,接种密度达到60%,加药处理细胞24h;每孔用500μL的PBS洗细胞3次,每次5min;之后每孔加200ul 4%多聚甲醛,室温固定15min;去除多聚甲醛,每孔用500μL PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入500μL的1%BSA,室温封闭2h;去除封闭液,每孔加200μL一抗,4℃过夜;去除抗体,每孔用500μL PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加200μL荧光二抗,室温孵育2h;去除二抗,每孔用500 PBS洗细胞3次,每次5min;每孔加入Hochest,室温10min,500μL PBS洗细胞3次,每次5min;载玻片上滴一小滴抗褪色剂,将盖玻片从孔中取出,面朝下盖到抗褪色剂上,使其轻轻接触到载玻片上;将玻片置于暗处5min使其晾干,此时即可在荧光显微镜下进行观察。
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