CN111440776A - 一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用 - Google Patents

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方佳琪
方洁
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Abstract

本发明公开了一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用。本发明发现TcpC对中性粒细胞胞外捕捉网的形成(NETosis)具有抑制作用，不仅能在体外抑制NETosis，而且能在体内抑制NETosis。本发明研究表明，尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)CFT073菌株分泌的一种含有Toll/白细胞介素1受体结构域蛋白TcpC能增强中性粒细胞NETosis关键蛋白——肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD4)的泛素化降解，抑制NETosis形成，逃逸中性粒细胞对UPEC的杀伤，利于细菌在机体内的存活和致病。由于NETosis参与恶性肿瘤、自身免疫病和心血管病等多种疾病的发生发展。本发明发现TcpC作为NETosis的一种抑制剂，可用于恶性肿瘤、糖尿病、自身免疫病和心血管病等疾病治疗药物的开发。

Description

一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用
技术领域
本发明属于分子生物技术和医学领域，具体涉及一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用。
背景技术
尿路感染(Urinary tract infection，UTI)是一种最常见的感染性疾病，是由入侵泌尿系统的各种病原体所引起的尿路炎症。全球每年约有1.5亿人由大肠杆菌感染引起UTI，医疗费用的支出超过了60亿美元。大约80％的UTI由大肠杆菌引起，而尿路致病大肠埃希菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)可以特异性地黏附并植入尿路黏膜上皮细胞，引起尿路感染。UPEC能分泌一种含TIR结构域的蛋白(TIR-containing protein encoded byE.coli)，即TcpC。我们前期研究发现，TcpC是一种MyD88靶向的E3泛素连接酶，通过增强MyD88泛素化降解，抑制TLR信号途径介导的巨噬细胞活化与杀菌功能，从而逃逸机体的固有免疫应答，利于UPEC在体内的生存与繁殖，在肾盂肾炎等尿路感染中发挥重要作用。
肾盂肾炎等尿路感染典型的病理变化为大量中性粒细胞浸润，中性粒细胞具有一种新型的抗感染方式，即产生中性粒细胞胞外捕捉网(NETs)，其产生过程称为NETosis。迄今发现，细菌、真菌、寄生虫等病原体或者佛波-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)、IL-8、免疫复合物、活化的血小板等非病原体均可刺激中性粒细胞生成NETs。上述刺激物可增强NETosis关键蛋白肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptide arginine deaminase 4，PAD4)的转录和翻译，PAD4入核，催化染色质上的组蛋白发生瓜氨酸化，从而导致高度螺旋的染色质解螺旋，形成松散的染色质，此过程发生熵变，产生巨大能量，使核膜与细胞膜破裂，胞质溶胶中大量抗菌颗粒蛋白附着于解聚的染色质上，一起被释放出胞外，形成NETs，释放的NETs可捕捉病原物，然后利用附着在网状骨架上的抗菌蛋白将微生物杀灭。NETosis主要分为三个阶段：组蛋白修饰，染色质解聚，NETs释放。根据形成机制，NETosis可分为NADPH氧化酶(NADPHoxidase，NOX)依赖型与NOX非依赖型两种，细菌感染激活中性粒细胞产生的主要是NOX依赖型NETosis。NETs在中性粒细胞抗感染过程中发挥着关键作用。
泛素化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一，在蛋白质降解、应激反应、细胞周期调节、蛋白质运输、信号转导和转录调节等过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明泛素化与细胞免疫和炎症反应、细胞的转化和肿瘤的发生等密切相关，泛素化过程由泛素分子在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的共同作用下将蛋白质运送到蛋白酶体降解，在蛋白质泛素化过程中，E3可特异地结合底物蛋白，具有十分关键的作用。
迄今，NETosis的病理生理作用尚未完全阐明，近年来的研究发现，除了发挥抗感染作用之外，NETs形成后不降解或NETosis过程失控参与癌症、自身免疫病、糖尿病、心血管病等多种疾病的发生发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种新的NETosis抑制剂TcpC，所述NETosis抑制剂TcpC为如下a)或b)所述的蛋白：
a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同NETosis抑制活性的由a)衍生的蛋白。
另一方面，一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
c)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同NETosis抑制剂活性的蛋白的核苷酸序列。
另一方面，提供根据第一方面中a)或b)所述的蛋白作为NETosis抑制剂TcpC的应用。
另一方面，提供一种新的NETosis抑制剂TcpC活性鉴定方法，所述NETosis抑制剂TcpC的氨基酸序列为SEQ ID No.2，该氨基酸序列中含有NETosis抑制剂功能的关键位点，通过检测该关键位点来判断NETosis抑制剂TcpC的活性。
进一步地，所述TcpC的核苷酸序列中含有NETosis抑制剂功能的关键位点Cys12与关键功能结构域WW结构域。
另一方面，提供一种制剂或试剂盒，该制剂或试剂盒含有第一方面所述的NETosis抑制剂。
另一方面，提供根据第一方面所述的NETosis抑制剂TcpC在恶性肿瘤、糖尿病、自身免疫病和心血管病治疗药物及药物组合物中的应用。
本发明取得的有益效果：
本发明发现，分泌TcpC的UPEC能显著抑制肾盂肾炎模型小鼠肾组织中浸润的中性粒细胞的NETosis，这是分泌TcpC的UPEC实现免疫逃逸的重要机制。我们通过基因重组技术，制备了基因重组TcpC(rTcpC)，发现rTcpC能显著抑制中性粒细胞产生NETosis。我们进一步探究TcpC抑制NETosis的分子机制，发现TcpC可剂量依赖性地抑制中性粒细胞NETosis关键蛋白PAD4的蛋白水平，而不影响其mRNA水平。我们前期已经发现，TcpC是一种具有WW结构域的HECT型E3泛素连接酶，生物信息学分析显示，人和小鼠PAD4氨基酸序列中含有能与WW结构域结合的PY基序，提示PAD4可能是TcpC的E3酶底物。免疫共沉淀实验证实，rTcpC能与PAD4结合，并能增强PAD4的泛素化促进其降解。体外泛素化实验证明PAD4是TcpC的E3连接酶底物。激光共聚焦实验证明rTcpC作为E3连接酶将PAD4转运到蛋白酶体上。这些结果均显示TcpC作为PAD4靶向的E3泛素连接酶，通过增强中性粒细胞PAD4的泛素化，促进PAD4在蛋白酶体的降解，从而抑制中性粒细胞活化与产生NETosis。这些发现不仅阐明了一种UPEC介导免疫逃逸的新机制，而且提示，TcpC作为一种NETosis抑制剂，可用于恶性肿瘤、糖尿病、自身免疫病和心血管病等疾病NETosis靶向药物的研发。
附图说明
图1：分泌TcpC的CFT073野生株(CFT073wt)抑制NETosis。(A)CFT073wt及tcpc基因敲除的CFT073(CFT073Δtcpc)诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾脏大体病理观察。CFT073wt所致肾盂肾炎模型小鼠肾脏有明显的脓肿，空白对照组及CFT073Δtcpc感染组肾脏未见脓肿。(B)CFT073wt和CFT073Δtcpc诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾脏组织学检查。(C)激光共聚焦观察CFT073wt和CFT073Δtcpc诱导的肾盂肾炎模型小鼠肾组织原位NETosis，CFT073wt感染组肾组织原位NETosis显著受抑。(D)ImageJ分析(C)实验中MPO和DNA共定位(即NETosis)的百分率和荧光强度。(E)激光共聚焦观察CFT073wt和CFT073Δtcpc处理中性粒细胞，对LPS诱导的NETosis的影响。(F)ImageJ分析(E)实验中MPO和DNA共定位的百分率和荧光强度。
图2：rTcpC对NETosis的抑制作用。(A)激光共聚焦观察rTcpC对人中心粒细胞LPS诱导的NETosis的影响。(B)ImageJ分析(A)实验中MPO和DNA共定位的百分率和荧光强度，**:p<0.01。(C)Sytox Green染色动态观察rTcpC对LPS诱导的核染色质解聚的影响。(D)ImageJ分析(C)实验中NETosis的百分率，*:与LPS组相比p<0.05。
图3：rTcpC抑制PAD4的蛋白水平但不影响PAD4 mRNA转录水平。(A)qRT-PCR检测不同浓度rTcpC对中性粒细胞LPS诱导的PAD4 mRNA水平的影响。(B)qRT-PCR动态检测rTcpC对中性粒细胞LPS诱导的PAD4 mRNA水平的影响。(C)Western Blot检测不同浓度rTcpC对LPS诱导的中性粒细胞PAD4蛋白水平的影响。(D)ImageJ软件分析(C)实验中PAD4/GAPDH灰度比值变化。(E)Western Blot动态检测rTcpC对LPS诱导的中性粒细胞PAD4蛋白水平的影响。(F)ImageJ分析(E)实验中PAD4/GAPDH灰度比值变化。*p<0.05(LPS+rTcpC vs LPS)；#p<0.05(rTcpC vs Control)。
图4：PAD4是TcpC的E3泛素连接酶底物。(A-B)人和小鼠PAD4氨基酸序列生物信息学分析。PAD4含有可与E3连接酶结合的PY基序。(C)免疫共沉淀与免疫印迹检测rTcpC对PAD4泛素化的影响。rTcpC显著增强LPS处理的中性粒细胞PAD4泛素化。(D)体外泛素化实验检测rTcpC对PAD4的泛素化作用。
图5：rTcpC能促进PAD4在蛋白酶体的积聚。(A)激光共聚焦观察rTcpC对PAD4与蛋白酶体标志LAMP1共定位的影响。(B)ImageJ软件统计分析(A)实验中PAD4与蛋白酶体LAMP1共定位百分比与荧光强度，*p<0.05。(C)在有蛋白酶体抑制剂MG-132存在的条件下，观察rTcpC对PAD4与蛋白酶体标志LAMP1共定位的影响。(D)ImageJ软件统计分析(C)实验中PAD4与蛋白酶体LAMP1共定位百分比与荧光强度，**p<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：GenBank(GQ903014.1)TcpC的核苷酸(SEQ ID No.1)和氨基酸序列(SEQID No.2)。
实施例2：小鼠肾盂肾炎模型构建
(1)取6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠24只分成3组，分别为空白对照组，CFT073wt组与CFT073Δtcpc组，每组小鼠8只。
(2)将菌株用LB培养基振荡培养到吸光度为0.6-0.8，5500rpm/min，4℃离心30min，弃上清留沉淀，用生理盐水清洗菌3次后用生理盐水重悬菌至1010CFU/ml。
(3)用0.61mm规格的软聚乙烯导管经小鼠尿道插入膀胱，滴注0.1ml的菌液(109CFU)；空白对照组每鼠滴注0.1ml生理盐水。
(4)3日后将小鼠脱颈处死，取肾做病理学检查。
发现CFT073wt菌株感染的小鼠肾脏有明显的脓肿，而空白对照组与CFT073Δtcpc感染的小鼠肾脏无脓肿(图1A)。组织学检查发现，与CFT073Δtcpc感染组相比，CFT073wt感染组肾组织中性粒细胞浸润显著增多(图1B)。
实施例3：激光共聚焦显微镜检测模型小鼠肾脏原位NETosis
(1)根据上述方法建立小鼠肾盂肾炎模型，72小时后，在麻醉状态下，对模型小鼠进行4％多聚甲醛灌注，肾组织石蜡包埋，常规切片。
(2)脱蜡至水：将肾组织切片室温放置10min后，依次将切片放入二甲苯30min—无水乙醇5min—更换95％乙醇5min—85％酒精5min—75％酒精5min—50％酒精5min—ddH2O洗5min。
(3)抗原修复：脱蜡切片置于柠檬酸抗原修复液(稀释至1X使用)中，于微波炉内进行抗原修复，中火8min—停火8min—中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将切片置于PBS(pH＝7.4)中，脱色摇床轻轻晃动洗涤3次，每次5min。
(4)切片稍晾干后，用组化笔在组织周围画圈。
(5)0.1％Triton X-100室温通透1h。
(6)BSA封闭：在圈内滴加1％的BSA孵育封闭1h。
(7)一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加100μl 1:200稀释的兔抗MPO(IgG)，将切片平放于湿盒内，4℃孵育过夜。
(8)二抗孵育：玻片置于TBS-T(0.1％Tween 20in TBS)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在阻水圈内滴加羊抗兔IgG荧光二抗(Alex Flour 647)覆盖组织，避光，常温孵育2h。
(9)DAPI染核：TBS-T脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，常温避光孵育30min。
(10)封片：TBS-T脱色摇床晃动洗涤3次，每次5min。滴加适量防荧光淬灭剂(Invitrogen,USA)，封片。
(11)激光共聚焦显微镜观察：DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；Alex Flour 647激发波长594nm或633nm，发射波长647nm，发红光，用Image J软件做最终处理。
结果发现，CFT073wt菌株感染的小鼠肾组织中原位NETosis显著减少(图1C-D)。
实施例4：激光共聚焦观察CFT073wt和CFT073Δtcpc与中性粒细胞隔开共培养对NETosis的影响
(1)抽取健康志愿者静脉血，分选中性粒细胞，流式细胞术检测中性粒细胞纯度。
(2)将106细胞(1ml)培养至Transwell系统的下室中，将CFT073wt或CFT073Δtcpc(108CFU)培养于系统的上室中。
(3)共设4组，分别为空白对照组(Control)，LPS诱导NETosis组(LPS)，LPS+CFT073wt组与LPS+CFT073Δtcpc组。
(4)培养12h后，收集细胞用4％多聚甲醛固定30min。用D-Hanks洗3遍。用0.1％TritonX-100破膜30min，破膜后用D-Hanks洗3遍。
(5)破膜后的细胞用10％BSA常温摇床封闭2h，封闭后用D-Hanks洗3遍。
(6)将封闭后的中性粒细胞与1：200稀释比的兔抗人MPO IgG 4℃共孵育过夜。
(7)将与一抗共孵育过夜后的中性粒细胞用D-Hanks洗3遍后与1:500稀释比的羊抗兔IgG(Alexa flour 647nm)常温共孵育2h。
(8)D-Hanks洗3遍，DAPI染核30min。
(9)D-Hanks洗3遍，离心收集细胞，用D-Hanks将细胞重悬至106/ml。将10μl细胞滴至提前用多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片上，暗盒中爬片1h。
(10)将圆形盖玻片盖到提前滴有封片剂的载玻片上用激光共聚焦观察。
我们发现LPS+CFT073wt组与LPS+CFT073Δtcpc组相比，NETosis显著受抑(图1E-F)。
实施例5:激光共聚焦检测rTcpC对NETosis的影响
(1)将人外周血中性粒细胞分为4组，每组106细胞，即不做处理的空白对照组(Control)，1μg/ml LPS处理的NETosis阳性对照组(LPS)，4μg/ml的rTcpC单处理组(rTcpC)和rTcpC+LPS联合处理组(LPS+TcpC)。
(2)将细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养210min。
(3)收集细胞用于制片，免疫荧光染色过程与实施例3相同。
结果发现，rTcpC可显著抑制LPS诱导的中性粒细胞NETosis(图2A-B)。
实施例6：Sytox Green染色观察rTcpC对LPS诱导的核染色质解聚的影响
(1)中性粒细胞分成如实施例4中的4组，并进行相同的处理，但培养时间为240min。
(2)在开始培养时，每孔加入500nM Sytox Green，每隔30min用激光共聚焦显微镜(发射波长488nm)动态观察DNA解聚情况。
(3)ImageJ软件分析DNA解聚面积，未经处理的中性粒细胞核面积为62±6.1μm2，当核面积大于70μm2时被认为发生了核解聚，以此分析中性粒细胞发生NETosis的百分比。
结果显示，rTcpC显著抑制LPS诱导的中性粒细胞核染色质解聚(图2C)和NETs形成百分率(图2D)。
实施例7：不同浓度梯度rTcpC对LPS诱导的中性粒细胞PAD4表达的影响
(1)分别用浓度为2、4、8、12μg/ml的TcpC，在有或没有1μg/ml LPS存在的条件下，处理中性粒细胞210min(37℃，5％CO2)。
(2)离心收集细胞，D-Hanks洗3遍，一部分细胞用RIPA裂解液裂解，制备细胞总蛋白，用于Western blot检测PAD4蛋白水平，另一部分细胞则用Trizol提取细胞总RNA，用于qRT-PCR检测PAD4 mRNA水平。
(3)按常规方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白条带，电转移到PVDF膜上。
(4)将膜取下，用TBST短暂浸洗后，于10％脱脂牛奶中常温封闭2h。封闭后用TBST洗6次，每次5min。
(5)将PVDF膜浸入1：10000稀释的兔抗人PAD4的一抗(IgG)中，4℃孵育过夜，用TBST洗6次，每次5min。
(6)将孵过一抗的PVDF膜浸入1：5000的羊抗兔IgG荧光二抗中，常温摇床孵育2h，用TBST洗6次，每次5min。
(7)用扫膜仪的700通道进行扫膜观察PAD4的蛋白表达水平。
(8)用Image J软件统计分析WB结果中PAD4的条带，GAPDH作为内参照。
(9)qRT-PCR检测rTcpC对PAD4 mRNA水平的影响。β-actin为内参，采用2-△△CT法计算CQ值。每组实验设置三个重复。引物序列如下：
PAD4上游引物：5’-CTCTCCAGGAGTCATCGTAG-3’
PAD4下游引物：5’-CCAACACCAGCTGATACTTT-3’
β-actin上游引物：5’-ATGGATGACGATATCGCTG-3’
β-actin下游引物：5’-AACACCCATTCCCTTCACAG-3’
结果发现，不同浓度的rTcpC对LPS诱导的中性粒细胞PAD4 mRNA水平无显著影响(图3A-B)，但是rTcpC呈浓度和时间依赖的方式抑制PAD4蛋白水平(图3C-F)。
实施例8：生物信息学分析PAD4的PY基序
采用NCBI Batch CD-Search Server在线软件对PAD4氨基酸序列进行功能结构域分析。结果显示，人和小鼠PAD4含有可与E3泛素连接酶结合的PY基序(图4A-B)，我们前期已经证实TcpC含有HECT家族E3泛素连接酶N端关键的Cys(C12)以及WW结构域。提示PAD4是TcpC的E3酶底物。
实施例9：免疫共沉淀检测rTcpC对中性粒细胞PAD4泛素化水平的影响
(1)将人中性粒细胞按图4C所示分组处理210min，有蛋白酶体抑制剂(MG-132)的处理组，在加入其他处理因素前30min加入终浓度为1μM的MG-132。
(2)收集细胞，4℃，1000r/min，离心10min，取沉淀，用D-Hanks，离心洗3次。
(3)用RIPA裂解液裂解细胞，制备细胞裂解物总蛋白。
(4)将预包被Protein A的磁珠用1ml，1×PBS洗3次。
(5)经洗涤的磁珠与1:500稀释的兔抗人PAD4一抗混匀，4℃过夜，摇床孵育。
(6)收集免疫磁珠，用1ml，1×PBS洗3次。
(7)PBS洗过后的磁珠与上述制备的细胞裂解物蛋白上清液4℃过夜，摇床孵育。
(8)用磁力架收集磁珠，1ml，1×PBS洗3次。
(9)每管中加入50μl，2×loading缓冲液后沸水浴10min。
(10)煮沸10min后用磁力架收集蛋白样品，弃磁珠。
(11)收集后的蛋白样品用于Western blot检测相应的蛋白。
(12)检测PAD4泛素化：电转后的PVDF膜封闭后孵1:10000稀释的兔抗人Ub一抗(IgG)，4℃过夜，摇床孵育。
(13)TBST洗6次，每次5min。
(14)将孵过一抗的PVDF膜浸入1:5000稀释的羊抗兔IgG荧光二抗，常温摇床孵育2h，用TBST洗6次。扫膜仪700通道扫膜观察PAD4泛素化水平。
结果显示，rTcpC能显著增强PAD4泛素化水平(图4C)。
实施例10:体外泛素化试剂盒检测rTcpC的PAD4靶向性E3泛素连接酶活性
(1)将4μg/ml的rTcpC替代试剂盒中的E3泛素连接酶，人重组PAD4或中性粒细胞裂解物蛋白替代试剂盒中的底物S5a。
(2)按照体外泛素化试剂盒说明操作。
(3)反应结束后加5×loading混匀，沸水浴10min。
(4)将蛋白样品用于Western blot检测PAD4泛素化水平，方法同上述实施例9。
结果显示，rTcpC可增强PAD4的泛素化水平，并且此等作用可被E3泛素连接酶抑制剂Nutlin-3抑制，表明TcpC是一种PAD4靶向性的E3连接酶(图4D)。
实施例11：激光共聚焦检测rTcpC对PAD4在蛋白酶体积聚的影响
(1)将人中性粒细胞在有或没有1μg/ml的LPS存在的条件下，以4μg/ml的rTcpC处理120min。在蛋白酶体抑制剂(MG-132)存在的条件下，观察rTcpC对PAD在蛋白酶体积聚影响时，在加入其他处理因素前30min加入终浓度为1μM的MG-132。
(2)4℃，1000r/min，10min离心收集细胞。收集的细胞用D-Hanks，离心洗3遍。
(3)加入4％多聚甲醛固定细胞30min，D-Hanks离心洗3次。
(4)用0.1％TritonX-100破膜30min，用D-Hanks洗3次。
(5)用10％BSA常温摇床封闭2h，D-Hanks洗3次。
(6)将细胞与1：200稀释的兔抗人PAD4(IgG)及鼠抗人LAMP1(IgG)4℃共孵育过夜。
(7)D-Hanks洗3次，与1:500稀释的羊抗兔IgG(Alexa flour 647nm)和与羊抗鼠IgG(Dylight 488nm)常温孵育2h。
(8)D-Hanks洗3次，用DAPI染核30min。
(9)D-Hanks洗3次后离心收集细胞，用D-Hanks将细胞重悬至106/ml。将10μl细胞滴至提前用多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片上，暗盒中爬片1h。
(10)将圆形盖玻片盖到提前滴有封片剂的载玻片上用激光共聚焦观察。
(11)用ImageJ软件统计分析激光共聚焦中PAD4与LAMP1共定位的百分比及荧光强度。
结果显示，rTcpC能显著增强PAD4与LAMP1的共定位(图5A-B)，当蛋白酶体活性被抑制时，PAD4在蛋白酶体的积聚进一步增加(图5C-D)，说明rTcpC促进PAD在蛋白酶体的积聚，促进PAD4降解。
序列表
<110> 浙江大学城市学院
<120> 一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
gtgatagcat atgaaaacat agaatttttt atatgcttgg tgaatgtttt gggcaacaat 60
atgtataata tccttttctt catctttctt tcaatagcaa ttccattcct tttattcctc 120
gcatggaaac agcacctaaa aaccaaagag attcgttcat atctattgaa agagggatat 180
aatattattt tcaacggaga aggtaactca tatctcgcgt ttaatattag taatgcgaca 240
tttcgcgcag gtaatttaac ttccaatgat tattttcaag catcaatttc ttatatccac 300
gattatagat gggagtggaa ggaggttgag gcaaagaaaa taaataatat atttattatt 360
tacatttcga atattgattt cccttcccaa aaactatttt atcgcaataa taaatcttta 420
gcagaaatag actgggcaaa attacaagca atttttcatc aaccatatga aatacagaat 480
gacgtcatgc aagataacaa taatacgcac tatgattttt tcatatccca tgcaaaagag 540
gataaagata cttttgtcag accactggta gacgagttaa atagacttgg tgtaattatt 600
tggtatgatg aacagacact tgaagtcggc gatagcttaa ggagaaatat tgatttaggc 660
ctaagaaaag caaattatgg catagtcata ctttctcata actttctaaa caagaaatgg 720
acacaatacg aattagatag tttaattaat cgtgcagtgt atgatgataa taagattata 780
ttgccaatct ggcataatat caatgctcaa gaggtatcta aatacagcca ttatttggcg 840
gataaaatgg cactgcaaac ttctttatat agcgttaagg aaatagcaag agagttggct 900
gaaatagcat acaggagaag ataa 924
<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Met Ile Ala Tyr Glu Asn Ile Glu Phe Phe Ile Cys Leu Val Asn Val
1 5 10 15
Leu Gly Asn Asn Met Tyr Asn Ile Leu Phe Phe Ile Phe Leu Ser Ile
20 25 30
Ala Ile Pro Phe Leu Leu Phe Leu Ala Trp Lys Gln His Leu Lys Thr
35 40 45
Lys Glu Ile Arg Ser Tyr Leu Leu Lys Glu Gly Tyr Asn Ile Ile Phe
50 55 60
Asn Gly Glu Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Phe Asn Ile Ser Asn Ala Thr
65 70 75 80
Phe Arg Ala Gly Asn Leu Thr Ser Asn Asp Tyr Phe Gln Ala Ser Ile
85 90 95
Ser Tyr Ile His Asp Tyr Arg Trp Glu Trp Lys Glu Val Glu Ala Lys
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Ile Phe Ile Ile Tyr Ile Ser Asn Ile Asp Phe Pro
115 120 125
Ser Gln Lys Leu Phe Tyr Arg Asn Asn Lys Ser Leu Ala Glu Ile Asp
130 135 140
Trp Ala Lys Leu Gln Ala Ile Phe His Gln Pro Tyr Glu Ile Gln Asn
145 150 155 160
Asp Val Met Gln Asp Asn Asn Asn Thr His Tyr Asp Phe Phe Ile Ser
165 170 175
His Ala Lys Glu Asp Lys Asp Thr Phe Val Arg Pro Leu Val Asp Glu
180 185 190
Leu Asn Arg Leu Gly Val Ile Ile Trp Tyr Asp Glu Gln Thr Leu Glu
195 200 205
Val Gly Asp Ser Leu Arg Arg Asn Ile Asp Leu Gly Leu Arg Lys Ala
210 215 220
Asn Tyr Gly Ile Val Ile Leu Ser His Asn Phe Leu Asn Lys Lys Trp
225 230 235 240
Thr Gln Tyr Glu Leu Asp Ser Leu Ile Asn Arg Ala Val Tyr Asp Asp
245 250 255
Asn Lys Ile Ile Leu Pro Ile Trp His Asn Ile Asn Ala Gln Glu Val
260 265 270
Ser Lys Tyr Ser His Tyr Leu Ala Asp Lys Met Ala Leu Gln Thr Ser
275 280 285
Leu Tyr Ser Val Lys Glu Ile Ala Arg Glu Leu Ala Glu Ile Ala Tyr
290 295 300
Arg Arg Arg
305

Claims (7)

1.一种新的NETosis抑制剂TcpC，其特征在于，所述TcpC为如下a)或b)所述的蛋白：
a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同NETosis抑制活性的由a)衍生的蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
c)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同NETosis抑制活性的蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求1中a)或b)所述的蛋白作为NETosis抑制剂TcpC的应用。
4.一种新的NETosis抑制剂TcpC活性鉴定方法，其特征在于，所述NETosis抑制剂TcpC的氨基酸序列为SEQ ID No.2，该氨基酸序列中含有NETosis抑制剂功能的关键位点，通过检测该关键位点来判断NETosis抑制剂TcpC的活性。
5.根据权利要求4所述的一种新的NETosis抑制剂TcpC活性鉴定方法，其特征在于，所述TcpC的核苷酸序列中含有NETosis抑制剂功能的关键位点Cys12与关键功能结构域WW结构域。
6.一种制剂或试剂盒，其特征在于，该制剂或试剂盒含有权利要求1所述的NETosis抑制剂TcpC。
7.根据权利要求1所述的NETosis抑制剂TcpC在恶性肿瘤、糖尿病、自身免疫病和心血管病治疗药物及药物组合物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113238050A (zh) * 2021-02-20 2021-08-10 吴炜 一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法
CN115951051A (zh) * 2022-10-18 2023-04-11 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111411088A (zh) * 2020-03-02 2020-07-14 浙江大学城市学院 一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111411088A (zh) * 2020-03-02 2020-07-14 浙江大学城市学院 一种新的E3泛素连接酶TcpC及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHUBERT,S. 等: "Escherichia coli strain ECOR63 TcpC (tcpC) gene, complete cds", 《GENBANK》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113238050A (zh) * 2021-02-20 2021-08-10 吴炜 一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法
CN115951051A (zh) * 2022-10-18 2023-04-11 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法
CN115951051B (zh) * 2022-10-18 2024-01-12 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法

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