CN115951051B - 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒，属于病毒检测领域，通过新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体与SpyTag组成融合蛋白，再与胶体金标记的SpyCatcher结合，形成胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体，并附着于胶体金垫用于检测，提高了检测的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒检测方法主要有核酸检测，抗原检测和抗体检测，其中核酸检测需要专业的实验操作人员，标准的PCR实验室，昂贵的检测设备等，且检测耗时长，而在新型冠状病毒感染后机体内抗体出现时间晚于抗原，且抗体检测需要专业医护人员进行样本采集，无法实现居家自检，因此抗原检测以窗口期早，检测速度快，操作简便，不受检测场所限制等优点，成为世界范围内新型冠状病毒检测的重要手段。
新型冠状病毒抗原检测主要采用免疫学双抗体夹心法，利用免疫层析平台进行检测，其原理是由特异性识别新型冠状病毒抗原的胶体金标记抗体结合样本中的新型冠状病毒抗原，再被固相标记的特异性新型冠状病毒单克隆抗体捕获，实现检测。通过控制新型冠状病毒单克隆抗体的质量，实现检测结果的准确性。
发明专利CN202110332403.6中公开了一种新冠病毒胶体金检测试纸及其制备方法和应用，金标记结合物垫分别采用新冠病毒的S蛋白和N蛋白进行标记，可同时识别样本中针对新冠病毒S蛋白的IgM抗体和IgG抗体，以及新冠病毒N蛋白的IgM抗体和IgG抗体，对S蛋白金标记PH值为7.5±0.5，且金标记S蛋白是均匀的铺在结合物垫上；对N蛋白金标记PH值为9.5±0.5，且金标记N蛋白采用喷金划膜仪喷在结合物垫上；以及通过对S蛋白和N蛋白进行差异化的金标记和处理方式和采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器进行胶体金颗粒的烧制、并在缓冲溶液1、缓冲溶液2中加入表面活性剂月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠能够大幅提高检测灵敏度，使得整体的检测效率提高。
实用新型专利CN202020677907.2中公开了长余辉-胶体金联用检测新冠病毒的免疫层析试纸条。试纸条包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸；结合垫上含有S蛋白和/或N蛋白偶联的胶体金、N蛋白偶联的长余辉微球与S蛋白偶联的长余辉微球；NC膜上设有含抗人IgM的胶体金IgM线、含抗人N-IgG的长余辉N-IgG线、含抗人S-IgG的长余辉S-IgG线与质控线；质控线上分别设有用于指示S蛋白和/或N蛋白偶联胶体金、N蛋白偶联长余辉微球与S蛋白偶联长余辉微球的有效性的活性验证物。该免疫层析试纸条可快速判断出病人是否感染过新冠病毒，有效区分早、中、后期感染，为新冠病毒的检测、防治提供重要依据。
但针对新型冠状病毒抗原检测还存在如下问题，1)胶体金标记抗体时，由于是物理结合，可结合抗体的任何位点，若胶体金标记时占用了抗体的Fv段，则导致抗体在结合样本中新型冠状病毒抗原时效率降低，导致检测的灵敏度下降，在实际检测时出现漏检；2)由于胶体金标记抗体的作用力为物理吸附，标记稳定性差，导致产品批间差异大。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法。
本发明中，“胶体金垫”即胶体金结合垫。
本发明中，“新型冠状病毒”指新型冠状病毒，世卫组织2020年1月命名为2019-nCoV；国际病毒分类委员会2020年2月11日命名为SARS-CoV-2。
一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒。
所述的试剂盒中包括SpyTag和SpyCatcher；所述的SpyTag的序列包括SEQ IDNO.1；所述的SpyCatcher的序列包括SEQ ID NO.2。
优选地，所述的SpyTag的序列为SEQ ID NO.1；所述的SpyCatcher的序列为SEQ IDNO.2。
所述的试剂盒中包括胶体金垫。
所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。
所述的胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体中包括SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的融合蛋白。
所述的SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Fc端连接。
所述的融合蛋白中的序列直接相连或通过接头连接。
所述的胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体中还包括胶体金标记的SpyCatcher。
所述的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体与SpyTag组成融合蛋白，再与胶体金标记的SpyCatcher结合，形成胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体；即所述的胶体金先标记SpyCatcher，再与融合蛋白结合，形成胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。
优选地，所述的融合蛋白中引入WW结构和接头序列，所述的WW结构的序列为SEQID NO.3，所述的接头序列为SEQ ID NO.4。
进一步优选地，所述的融合蛋白结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag。
优选地，所述的SpyCatcher中引入PY肽；所述的PY肽的序列为SEQ IDNO.5。
优选地，所述的SpyCatcher与His tag、PY肽、接头连接。
所述的SpyCatcher与PY肽通过接头连接，所述的接头的序列为SEQ IDNO.4。
所述的PY肽上连接有Histag；Histag序列为SEQ ID NO.6。
进一步优选地，所述的胶体金标记的结构为His tag-PY肽-接头-SpyCatcher。
优选地，所述的胶体金垫上还包括质控抗体兔IgG。
所述的质控抗体兔IgG为胶体金标记的质控抗体兔IgG。
优选地，所述的胶体金垫位于试纸条上，所述试纸条包括：PVC底板，以及位于底板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。
在所述的试纸条上，沿样品层析的方向，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次相连。
所述硝酸纤维素膜上设有T线和C线，所述T线包被有市售的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体2，所述C线上包被有与所述胶体金标记的兔IgG特异结合的羊抗兔IgG。
所述的试剂盒中还可以包括其他胶体金检测试剂盒中常见的配置，如检测卡壳。
又一方面，本发明提供了前述SpyTag和SpyCatcher在制备胶体金检测试剂盒中的应用。
所述的SpyTag和SpyCatcher利用其共价结合更稳定的特性，实现胶体金对抗体的稳定可控的标记。
优选地，所述的试剂盒为新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒。
又一方面，本发明提供了一种前述的新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒的制备方法。
所述的制备方法中包括胶体金垫的制备。
所述的胶体金垫的制备方法为：将胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG进行混合后，进行喷金制备胶体金垫，烘干备用。
所述胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备步骤包括：
对SpyCatcher进行胶体金标记；
将胶体金标记的SpyCatcher与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-SpyTag融合蛋白混合。
所述的SpyCatcher与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Fc端的SpyTag共价结合，同时新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的Fv端定向标记使Fv端充分暴露来结合样本中的新型冠状病毒抗原。
进一步地，所述胶体金标记的具体步骤包括：
对His tag-PY肽-接头-SpyCatcher进行胶体金标记；
将胶体金标记的SpyCatcher与融合蛋白混合，融合蛋白结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag。
本发明通过SpyCatcher与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Fc端的SpyTag的共价结合，WW结构特异性高且定向SpyTag，增加连接反应速度，PY序列高度可溶且稳定性强，有助于降低Catcher蛋白活性衰减速度，增加连接效率，PY肽与WW结构特异性结合，使胶体金标记新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体结合更稳定，同时新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的Fc端定向标记使Fv端充分暴露来结合样本中的新型冠状病毒抗原。
本发明的有益效果：
1.通过引入SpyCatcher/SpyTag，且利用其共价结合更稳定的特性，实现胶体金对抗体的稳定可控的标记。
2.由于SpyTag标记的抗体Fc端，可以使特异性结合样本中靶标抗原的Fv端充分暴露，使抗体捕获抗原的效率更高，从而提高试剂检测的灵敏度和特异性。
3.WW结构和PY肽结构的引入，WW结构特异性高可定向SpyTag，增加结合速度，PY序列高度可溶且稳定性强，有助于降低Catcher蛋白活性衰减速度，增加连接效率。
附图说明
图1为实施例1试纸条的组装方式。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒
包括检测卡壳、检测卡壳内的检测试剂条。
所述检测试剂条为PVC底板上延长度方向依次粘贴样本垫、金标垫、NC膜、吸水纸。
所述NC膜上靠近金标垫侧设有检测线T线并含有新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体2(北京乐彦生物技术有限公司，货号：K-1018)，靠近吸水纸侧设有质控线C线并含有羊抗兔IgG，金标垫含有胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1(北京乐彦生物技术有限公司，货号：K-1017)和胶体金标记的兔IgG。
所述胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1为通过胶体金标记Spycatcher与Fc端融合SpyTag的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1共价结合进行的间接标记。
标记新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1具体步骤为：
1、烧金：量取1L的纯化水倒入已清洁的圆底烧瓶中，加入搅拌子，置电加热套上加热煮沸5分钟后，取4mL 10％氯金酸溶液全部加入至沸水中，待1分钟后，取6.2mL 10％柠檬酸三钠溶液一次性全部加入至烧瓶中，持续煮沸10分钟，即得烧制完成的胶体金液；
2、取1mL胶体金液，加入8-12μL 0.2M碳酸缓冲液调节胶体金溶液pH值至8.0-10.0；
3、制备SpyCatcher胶体金标记物：将10-20μg SpyCatcher(SEQ ID NO.2)加入到1mL胶体金溶液中进行标记，持续混匀20min；加入20μL 10％-20％ BSA，持续混匀20min进行封闭后离心，收集沉淀，再使用0.3-1.0mL胶体金复溶液进行重悬，然后加入1mg新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1-SpyTag(SEQ IDNO.1)融合蛋白持续混匀20min，即得胶体金定向标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1。
标记质控抗体兔IgG具体步骤为：
1.取1mL胶体金液，加入8-12μL 0.2M碳酸缓冲液调节胶体金溶液pH值至8.0-10.0。
2.制备兔IgG胶体金标记物：将10-20μg兔IgG(Solarbio，货号：SP034)加入到1mL胶体金溶液中进行标记，持续混匀20min；加入20μL 10％-20％ BSA，持续混匀20min进行封闭后离心，收集沉淀，再使用0.3-1.0mL胶体金复溶液进行重悬，即得胶体金标记的兔IgG。
胶体金结合垫的制备：
将胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体1与胶体金标记的兔IgG进行等比例混匀，然后铺到玻璃纤维素膜上，重发干燥获得胶体金结合垫。
制备硝酸纤维素膜：
将新型冠状病毒单克隆抗体2包被在硝酸纤维素膜上形成检测线(T)，将羊抗兔IgG(Solarbio，货号：SPA134)包被在硝酸纤维素膜上形成质控线(C)。
组装试纸条：
将吸水纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样本垫如图1所示贴合于塑料的底板上，并纵向裁切成3.0mm宽的小条，装入盒体，即得新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒。
层压参数：金结合垫搭上NC膜1-2mm；样品垫搭上金结合垫1-2mm；吸水垫搭上NC膜1-2mm。
实施例2一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒
与实施例1的区别在于：
SpyCatcher与His tag、PY肽、接头连接，胶体金标记的结构为His tag-PY肽-接头-SpyCatcher；PY肽的序列为SEQ ID NO.5，接头的序列为SEQ ID NO.4，Histag序列为SEQID NO.6。
新型冠状病毒单克隆抗体1-SpyTag融合蛋白中引入WW结构，并通过接头连接，具体结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag，其中WW结构的序列为SEQ ID NO.3，接头序列为SEQ ID NO.4。
实验例试剂盒检测效果验证
采用实施例1和实施例2的试剂盒对新型冠状病毒抗原检测试剂国家参考品(370095-202202)进行检测，并设置胶体金直接标记新型冠状病毒单克隆抗体1为对比例。
检测参考品结果如下：
备注：“+++”表示强阳，“++”表示中阳，“+”表示弱阳，“-”表示阴性。
结果表明，实施例1和实施例2的检测方法相对于技术改进前的对比例，检测特异性和灵敏度更高，特别是实施例2的试剂盒，对于所有阳性参考品均表现出了强阳性结果，最低检测限参考品的检测效果也更好。
Claims (6)
1.一种新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒，其特征在于，包括SpyTag和SpyCatcher；所述的SpyTag的序列为SEQ ID NO.1；所述的SpyCatcher的序列为SEQ ID NO.2；
所述的SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体形成融合蛋白；所述的SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Fc端连接；所述的融合蛋白中引入WW结构和接头序列，所述的WW结构的序列为SEQ ID NO.3，所述的接头序列为SEQ ID NO.4；所述融合蛋白结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag；
所述的SpyCatcher为胶体金标记的SpyCatcher；
所述的胶体金标记的SpyCatcher结构为His tag-PY肽-接头-SpyCatcher；
所述的接头的序列为SEQ ID NO.4，所述的PY肽的序列为SEQ ID NO.5，Histag序列为SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶体金先标记SpyCatcher，再与融合蛋白上的SpyTag结合，形成胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括质控抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体和质控抗体位于胶体金垫上，所述的胶体金垫位于试纸条，所述试纸条包括：PVC底板，以及位于底板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。
5.SpyTag和SpyCatcher在制备胶体金检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的SpyTag的序列为SEQ ID NO.1，所述的SpyCatcher的序列为SEQ ID NO.2；
所述的SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体形成融合蛋白；所述的SpyTag与新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Fc端连接；所述的融合蛋白中引入WW结构和接头序列，所述的WW结构的序列为SEQ ID NO.3，所述的接头序列为SEQ ID NO.4；所述融合蛋白结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag；
所述的SpyCatcher为胶体金标记的SpyCatcher；
所述的胶体金标记的SpyCatcher结构为His tag-PY肽-接头-SpyCatcher；
所述的接头的序列为SEQ ID NO.4，所述的PY肽的序列为SEQ ID NO.5，Histag序列为SEQ ID NO.6。
6.权利要求1所述的新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
对His tag-PY肽-接头-SpyCatcher进行胶体金标记；
将胶体金标记的SpyCatcher与融合蛋白混合，融合蛋白结构为新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体-WW结构-接头序列-SpyTag。
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