CN114200128A - 二维蛋白纳米阵列作为免疫传感元件载体的制备和应用 - Google Patents
二维蛋白纳米阵列作为免疫传感元件载体的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种免疫传感元件载体，其包含重组的S层蛋白rSbpA‑SpyCatcher。本发明还提供了所述免疫传感元件载体的制备方法及其在蛋白质检测中的应用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白阵列免疫传感器领域。
背景技术
具有光学、电化学、磁性和其他转导原理的免疫传感器已被广泛用于检测病原体和分析与病原体相关的特定抗体，以应对各种新出现的传染病，如SARS-CoV-2、登革热、禽流感、丙型肝炎、埃博拉病毒、寨卡病毒和其他病原体等。无论是哪种免疫传感器，都必须将特定的生物敏感元件固定在传感器的表面(如电极或传感器芯片)，从而可以捕获目标产生检测信号。最广泛使用的固定化策略是基于生物分子的官能团(如氨基、羧基和硫醇)与交联剂之间的化学共价结合。虽然化学共价交联可以实现识别元素在传感器表面的牢固固定，但在固定蛋白质一类的生物分子时可能存在几个问题。首先，固定后的蛋白质通常是无序的，这可能会对传感器的灵敏度产生影响。其次，由于蛋白质中功能基团有多个重复，而化学交联反应缺乏位点特异性，这可能导致化学交联过程中蛋白质结构构象的破坏和活性的丧失。第三，大多数化学交联反应不是在温和的生理条件下进行的，一些蛋白质在特定的反应体系中可能会由于稳定性差而降解，从而无法固定在传感器表面。
为了实现生物分子在传感器表面的均匀固定以实现高性能的传感，许多固定策略被应用于蛋白质的固定。例如，在化学偶联之前，通常使用高度均匀的自组装单层膜(SAMs)和官能团有序排列的各种规则纳米结构来修饰传感表面。为了实现位点特异性固定化，生物正交反应，如叠氮化物-炔烃、酶和酶自标记标签介导的反应是常用的固定方法。此外，还有其他专门用于位点特异性固定化的技术，包括生物素-链霉亲和素相互作用、与抗体结合的蛋白A或蛋白G、基因编码的蛋白或肽标签等。然而在保持原有蛋白活性的情况下，蛋白在传感器表面均匀、稳定和高密度固定仍然是一个挑战。
发明内容
1.要解决的技术问题：
免疫传感器中生物敏感元件的固定常用化学交联的方法，这会导致生物分子(抗原)活性的降低，本发明提出一种利用二维蛋白纳米阵列作为传感元件载体，从而在传感器表面温和固定的方法，其能最大限度的保留抗原的活性和抗原表位，提高血清中抗体的检测灵敏度。其中，所述二维蛋白纳米阵列是由重组的S层蛋白形成，其中，S层是广泛存在于古生菌和细菌的表面纳米级的单分子蛋白阵列。S层蛋白能够在不同界面或表面自组装成类似天然S层晶体的结构，因此S层蛋白可以作为多功能纳米材料，用于高灵敏传感器的传感表面功能化。本发明将组装的S层蛋白与SpyCatcher-SpyTag之间的共价结合组合在一起，提出一种温和的生物学固定方法，解决在免疫传感器中抗原固定后排列无序和活性降低导致的检测灵敏度低的问题。
2.技术方案
来源于球形芽孢杆菌CCM2177(Ilk，N.；
，C.；Egelseer，E.M.；Breitwieser，A.；Sleytr，U.B.；Sára，M.Molecular Characterization of theS-LayerGene，SbpA，of Bacillus Sphaericus CCM 2177and Production of a Functional S-Layer Fusion Protein with the Ability to Recrystallize in a DefinedOrientation While Presenting the Fused Allergen.Appl.Environ.Microbiol.2002，68(7)，3251-3260)的S层蛋白SbpA为本领域已公开的蛋白，其全长1268个氨基酸，取其31位至1068位氨基酸，截短后的突变体命名为rSbpA，将rSbpA与SpyCatcher融合表达，形成的重组S层蛋白rSbpA-SpyCatcher在裸金表面自组装形成纳米晶格结构，将待研究的抗原与SpyTag融合表达，抗原通过SpyCatcher-SpyTag之间的共价结合作用力固定到晶格表面，实现抗原的温和有序固定。抗原固定完成后进行血清中抗体的检测。具体方案示例如图1所示。理论上所使用的S层蛋白的序列并不只限定于rSbpA，也可以是SbpA全长或31位至1268位氨基酸截短突变体或其他可自组装的突变体。只要所使用的S层蛋白在与SpyCatcher融合后仍具有自组装的能力即可。
在本发明中，SpyCatcher和SpyTag是一对来源于化脓性链球菌纤维连接素结合蛋白FbaB的短肽，它们可以自发形成异肽键，即可以共价结合在一起。其可以包括SpyCatcher和SpyTag的各种变体，如SpyCatcher002-SpyTag002或SpyCatcher003-SpyTag003。其中，SpyCatcher002的氨基酸序列为：VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGEATKGDAHT(SEQ ID NO：3)，SpyTag002的氨基酸序列为VPTIVMVDAYKRYK(SEQ ID NO：6)。SpyCatcher003的氨基酸序列为VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT(SEQ ID NO：4)，SpyTag003的氨基酸序列为RGVPHIVMVDAYKRYK(SEQ ID NO：7)。
在本发明中，在rSbpA与SpyCatcher之间使用(GS)4作为接头，并且在抗原与SpyTag之间使用GSGSGSGS作为接头，接头序列并不只限于这两种，只要是长度合适的柔性氨基酸组成的接头均可。
具体地，本发明涉及以下技术方案：
1、一种免疫传感元件载体，其包含重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher。
2、根据项目1所述的免疫传感元件载体，其中所述重组的S层蛋白在rSbpA和SpyCatcher之间连接有柔性接头。
3、根据项目1所述的免疫传感元件载体，其中，所述rSbpA为S层蛋白SbpA的全长序列或具有31位至1068位氨基酸的截短突变体，所述rSbpA优选具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4、根据项目1所述的免疫传感元件载体，其中，所述SpyCatcher具有如SEQ ID NO：2-4任一所示的氨基酸序列。
5、根据项目2所述的免疫传感元件载体，其中，所述柔性接头为(GS)4。
6、重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher在制备免疫传感元件载体中的应用。
7、免疫传感元件载体的制备方法，包括将重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher在裸金表面进行自组装。
8、根据项目7所述的免疫传感元件载体的制备方法，其包括将重组的S层蛋白稀释至终浓度为1mg/mL，然后以恒定的流速上样，直至RU值稳定，即可获得在裸金表面自组装有重组S层蛋白的免疫传感元件载体。
9、用于检测抗体的方法，其使用项目1-5任一所述的免疫传感元件载体。
10、根据项目9所述的方法，其包括：将待测抗体的特异性抗原与SpyTag连接，获得SpyTag-抗原，并将SpyTag-抗原固定在项目1-5任一所述的免疫传感元件载体上，然后将待测抗体流经固定有抗原的传感元件载体表面并进行检测；
任选地，其中所述SpyTag具有如SEQ ID NO：5-7任一所示的序列；
优选地，所述抗原与所述SpyTag之间连接有柔性接头，所述柔性接头优选为(GS)4。
技术效果：
1.本发明相对传统的化学交联固定抗原的方法相比，摈弃了化学交联试剂的使用，使得抗原能在温和条件下被固定，对于某些不稳定的蛋白抗原非常友好，扩大了可被固定抗原的范围。如本发明中使用的非洲猪瘟病毒抗原K78R则不能通过化学交联的方式固定在金芯片表面，因为化学交联的固定过程要求蛋白在较低的pH溶液中，但K78R无法耐受低pH从而无法通过化学交联被固定。
2.本发明提出的免疫传感元件载体不破坏免疫传感元件(抗原)的结构，能最大限度的保留抗原的活性和免疫原性，且固定后的抗原呈高密度有序排列的二维阵列，提高了抗原在单位面积内的有效浓度，从而提高免疫传感器的检测灵敏度。如本发明中在进行MBP抗体检测时，得到的KD值为5.58×10-11M，表现出极高的检测灵敏度。
3.本发明提出的免疫传感元件载体具有较高的灵敏度和准确性，例如用于固定非洲猪瘟病毒抗原，在进行非洲猪瘟病毒感染的猪血清样本时表现出较高的灵敏度。对来源于不同感染猪的血清能进行较好的区分，且来源于同一感染猪血清中对应不同抗原的抗体也能进行区分。将化学交联固定抗原的方法与本发明提出的免疫传感元件载体固定抗原方法进行比较，发现本发明提出的方法具有很大优势。具体表现在由于血清成分复杂，与芯片具有较高的非特异吸附作用，但本发明提出的方法中使用的重组S层蛋白具有较高的防污特性，能大大降低血清中非特异吸附对检测结果的影响，显著提高了血清检测的准确性。
4.本发明提出的免疫传感载体是通过与抗原融合表达一个SpyTag，再通过SpyTag和SpyCatcher之间的共价结合作用实现抗原的固定，而SpyTag大小只有13个氨基酸，与抗原融合基本不会影响其表达及功能，且共价结合非常牢固，所以本发明提出的方法能适用于绝大多数抗原的稳定固定。
附图说明
图1显示了本发明技术方案的示意图。
图2显示了pET28a-rSbpA-SpyCatcher载体图谱。
图3显示了在大肠杆菌中表达纯化重组S层蛋白rSbpA-SpyCatcher的示意图，其中1通道对应BL21-pET28a-rSbpA-SpyCatcher的全菌，2通道对应BL21-pET28a-rSbpA-SpyCatcher诱导后的全菌，3通道是纯化后的rSbpA-SpyCatcher。
图4显示了rSbpA-SpyCatcher和SpyTag-MBP在金芯片表面组装和结合的过程。
图5显示了利用重组S层蛋白形成的晶格结构对不同浓度的MBP抗体进行SPR分析的结果图；其中，图a中各曲线代表MBP抗体的不同浓度，从上至下分别为：64nM，32nM，16nM，8nM，4nM，2nM，lnM，0.5nM，0.25nM，0nM，CD87(64nM)。
图6显示了利用重组S层蛋白形成的晶格结构对不同感染了非洲猪瘟病毒的血清样本进行SPR分析的结果图；其中，a，b图中各曲线都代表不同的血清样本。a图中从上至下依次为2#，1#，3#，4#，6#，7#，阴性抗体CD87，健康猪血清，空白对照，5#。b图中从上至下依次为2#，1#，5#，4#，7#，3#，6#，阴性抗体，健康猪血清，空白对照。数字代表不同的血清编号。
图7显示了利用本发明技术方案和传统化学交联方法对非洲猪瘟病毒感染的血清进行抗体检测时的区别；其中，CM5芯片是传统化学交联方法使用的芯片，裸金芯片是本发明提出的方法中使用的芯片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例1、重组S层蛋白载体的构建
首先在大肠杆菌中构建表达重组S层蛋白的载体pET28a-rSbpA-SpyCatcher(其图谱参见图2)，其中rSbpA与SpyCatcher之间用(GS)4作为linker，rSbpA-SpyCatcher的氨基酸序列如下：粗体部分为rSbpA序列，加下划线的为linker序列，斜体的为SpyCatcher序列。本发明中使用的核酸均由生物工程(上海)有限公司合成。并且，重组载体的构建方法均采用本领域中用于构建重组载体的常规操作方法。
实施例2、抗原与SpyTag在大肠杆菌中的融合表达
其次，在大肠杆菌中构建抗原与SpyTag融合表达的载体pET28a-SpyTag-抗原，抗原与SpyTag之间的linker氨基酸序列为GSGSGSGS，SpyTag氨基酸序列：AHIVMVDAYKPTK(SEQID NO：5)。抗原可以是任意一个感兴趣的蛋白，在本发明中以麦芽糖结合蛋白(MBP)作为抗原为例进行描述。或者，也可以选择非洲猪瘟病毒抗原K78R和I215L。上述抗原均为本领域公知的抗原，其核苷酸序列和氨基酸序列也是本领域技术人员已知的。并且，重组载体的构建方法均采用本领域中用于构建重组载体的常规操作方法。
实施例3、重组S层蛋白和抗原在大肠杆菌中的表达
将实施例1和实施例2中构建成功的重组质粒分别转至BL21(DE3)感受态细胞(购买于北京全式金生物技术有限公司)中，挑取转化成功的重组子于10mL相应抗性的LB液体培养基中，在37℃摇床过夜培养。再将过夜培养的菌液以1％的比例转接至800mL的LB液体培养基中，并加入相应种类的抗生素进行筛选。在37℃继续培养2-3小时，待培养液OD600到达0.6-0.8之间时，加入0.5mM的IPTG，16℃诱导18小时后收集菌体。
实施例4、重组S层蛋白rSbpA-SpyCatcher的纯化
1.将实施例3中诱导后的菌株在4℃，6000rpm，10分钟条件下收集菌体。
2.称量菌体湿重，以1g菌体湿重为例，进行以下纯化步骤。
3.将菌体重悬在100mL的0.1M CaCl2中，并在冰上静置30分钟。
4.在4℃，6000rpm，10分钟条件下收集菌体，弃上清。
5.将菌体重悬在100mL的50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl，10mM EDTA，1％甘油中，并加入10mg的溶菌酶。将重悬好的菌液放入水浴锅中，逐渐升温至42℃并反应一段时间。
6.将菌液放至30℃水浴锅中反应15分钟。
7.加入10mL的50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl，1％TritonX-100中，然后在20℃静置10分钟。
8.利用高压匀浆机对菌液进行破碎，破碎后的菌液在20000g，30分钟，4℃条件下离心，弃上清。
9用适量50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl，1％TritonX-100对破菌沉淀进行洗涤，再在20000g，30分钟，4℃条件下离心，弃上清。再用适量50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mMNaCl洗涤两次，离心后弃上清。
10.称量洗涤后的沉淀湿重，加入五倍体积的50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mMNaCl，5M盐酸胍溶解沉淀，并在冰上振荡20分钟使其充分溶解。然后在36000g，30分钟，4℃条件下离心，取上清，加入适量体积的50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl调节盐酸胍的浓度至2M。
11.取4mL上清过分子筛surperdex 200，用50mM Tris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl，2M盐酸胍收集，对收集的蛋白样品进行SDS-PAGE检测。具体结果如图3所示，其中1通道对应BL21-pET28a-rSbpA-SpyCatcher的全菌，2通道对应BL21-pET28a-rSbpA-SpyCatcher诱导后的全菌，3通道是纯化后的rSbpA-SpyCatcher，其大小为122kD左右，表明得到了纯化后的重组S层蛋白，即rSbpA-SpyCatcher。
实施例5、重组抗原SpyTag-MBP的纯化
在本实施例中是以MBP作为抗原，进行重组抗原SpyTag-MBP的纯化，具体操作步骤如下：
1.将实施例3中诱导完成后的菌株在4℃，6000rpm，10分钟条件下收集菌体。
2.用适量PBST重悬菌体。
3.用高压匀浆机对菌体进行破碎，随后在20000g，30分钟，4℃条件下离心，弃沉淀。
4.将上清用0.22μm的滤膜进行过滤，保存在4℃待用。
5.将MBP填料用超纯水清洗10个柱体积，再用PBST溶液平衡10个柱体积。
6.取破菌上清与平衡好的MBP填料混合，在4℃冰箱孵育1小时。
7.用10个柱体积的PBST洗脱杂蛋白。
8.向PBST中加入适量体积1M的麦芽糖，使其终浓度为10mM，洗脱目的蛋白SpyTag-MBP。
9.用10个柱体积的超纯水洗脱MBP填料，再用20％乙醇保存。
通过以上步骤，获得纯化后的重组抗原SpyTag-MBP。
实施例6、重组非洲猪瘟病毒抗原的纯化
在本实施例中是以非洲猪瘟病毒抗原K78R和1215L为抗原，进行重组抗原的纯化，具体操作步骤如下：
1.将实施例3中诱导完成后的菌株在4℃，6000rpm，10分钟条件下收集菌体。
2.用适量Binding buffer重悬菌体。
3.用高压匀浆机对菌体进行破碎，随后在20000g，30分钟，4℃条件下离心，弃沉淀。
4.将上清用0.22μm的滤膜进行过滤，保存在4℃待用。
5.用超纯水清洗AKTA纯化仪的所有管道和上样泵。然后将填充的镍柱连接到AKTA纯化仪上，连接的时候注意不要产生气泡。
6.用10个柱体积的Bingding buffer平衡镍柱。
7.用上样泵对步骤4中的破菌上清进行上样，必要时可以重复上样多次，使上清中的目的蛋白与镍填料充分结合。
8用10个柱体积的Bingding buffer洗掉没有结合的杂蛋白，直到紫外吸收峰的曲线保持水平。
9.用10个柱体积的Wash buffer洗掉非特异结合的杂蛋白。
10.用10个柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，并对有紫外峰的蛋白分管收集。
通过以上步骤，获得纯化后的重组抗原，即SpyTag-K78R或SpyTag-I215L。
实施例7、重组S层蛋白在裸金表面自组装
重组S层蛋白在裸金表面的自组装以及后续的所有过程都是在表面等离子共振仪(SPR)中完成的。所有缓冲液在使用前要用0.22μm的滤膜抽滤，超声30分钟除气，冷却至常温后使用。所用蛋白要在13000rpm条件下离心5分钟去沉淀，取上清后再次以同样条件离心2分钟去除气泡。具体操作如下：
将实施例4纯化后的重组S层蛋白，用50kDa的超滤管进行浓缩，再将浓缩后的蛋白在4℃冰箱用超纯水透析一小时。透析完成后将蛋白在4℃，13000rpm，条件下离心15分钟去掉透析过程中形成的自组装产物，取上清用碧云天蛋白浓度试剂盒(购买于碧云天生物技术公司)检测蛋白浓度。取裸金芯片放置在表面等离子共振仪中，首先用组装buffer 50mMTris-HCl(pH9.0)，150mM NaCl，10mM CaCl2清洗探针和管道以及裸金芯片的表面，再使用同样的buffer稀释重组S层蛋白至终浓度为1mg/mL。用10μL/min的流速上样，一直上样到RU值稳定不变，用buffer洗掉芯片表面的非特异结合蛋白。
实施例8、在重组S层晶格表面固定抗原
在上述裸金芯片表面固定带有SpyTag的蛋白(抗原)，以SpyTag-MBP为例，加入适量体积的实施例5所获得的纯化后的SpyTag-MBP，上样速度为10μL/min，一直上样到RU值不变，即所有的S层蛋白都通过SpyCatcher结合了带有SpyTag的抗原，再通过PBST洗掉非特异结合的抗原。重组S层蛋白在裸金表面的自组装和SpyTag-MBP的固定过程中的RU值变化如图4所示。
实施例9、MBP抗体的检测
取MBP抗体(购买于ABclonal公司)13000rpm条件下离心5分钟后去沉淀，取上清再次13000rpm，离心2分钟，然后将抗体用PBST进行一系列的梯度稀释。首先将稀释度高的抗体流过构建好的传感器表面，抗体会与固定在传感器表面的抗原结合，同时会显示RU值的上升。接着使用不同pH值的酸碱溶液或盐溶液(如Gly-HCl溶液或NaOH溶液)对结合的抗体进行解离，使RU值下降到基线，再将相同稀释度的抗体重复流过传感器表面，对溶液的种类和体积进行优化，如果RU值可以恢复到抗体解离前的数值则确定该溶液为抗体的最佳解离条件。最后对各个稀释度的抗体或血清进行检测，检测时流速为30μL/min，结合时间为60s，解离时间为300s。使用的阴性抗体是CD87。根据抗体的结合解离曲线可计算抗原与抗体之间的亲和力，数据采用BIAcore 3000分析软件(BIAevaluation Version 4.1)进行局部拟合，采用1：1Langmuir结合模式。具体检测结果如图5所示，其中，5a是不同浓度的MBP抗体在裸金芯片上响应曲线，5b是根据3-4次重复实验得出的校准曲线，5c是MBP抗体检测的线性范围。从图中可以看出不同浓度的MBP抗体都能被检测到，根据不同浓度抗体的响应曲线，可以计算出抗体的KD值为5.58×10-11M。抗体检测的线性范围为0.5nM-8nM。大多数抗体的KD值都在低微摩尔(10-6)至纳摩尔(10-7至10-9)范围内。通常认为，高亲和力抗体处于低纳摩尔范围内(10-9)，而亲和力非常高的抗体处于皮摩尔范围内(10-12)。利用本专利中的免疫传感元件载体固定的抗原，对于抗体进行亲和力检测时KD值达到10-11数量级，代表着用此方法固定的抗原表位没有被破坏，最大限度的保留了抗原的活性，不影响抗原与抗体的结合。同时固定后的抗原在S层蛋白的晶格上呈二维阵列，实现了抗原的高密度规则排列，对抗体的检测灵敏度也大大提高。
实施例10、非洲猪瘟病毒感染的血清样本中抗体的检测
将实施例6中获得的纯化的重组抗原固定到重组S层蛋白在裸金芯片表面形成的晶格表面(具体操作可参见实施例8)。将感染了非洲猪瘟病毒的猪血清随机选取7份并分别编号，在60℃灭活30分钟，随后进行血清中抗体的检测。具体检测步骤与实施例9中抗体检测的步骤一样，CD87抗体作为阴性抗体。检测结果如图6所示。检测结果的响应值由固定了抗原通道的响应值减去空白通道(没有固定抗原，只有重组S层蛋白)的响应值得到。其中，6a为固定K78R时血清中抗体检测的结果，6b为固定I215L时血清中抗体检测的结果。由图6的结果可知，对于K78R而言，在样品1#-4#中检测到了较多的K78R抗体，且不同血清样本中的抗体浓度不一样，5#-7#样本中的抗体较少。对于I215L而言，在样品1#-7#中都检测到了较多的1215L抗体。正常猪血清和阴性抗体都没有检测到信号。此结果说明利用本专利中的免疫传感元件载体固定的非洲猪瘟抗原都能用于抗体的检测，且具有较高的特异性。
实施例11、在CM5芯片表面固定抗原和血清检测
CM5芯片是传统化学交联方法使用的芯片，本实施例将本发明制备的固定有重组S层蛋白的芯片与传统的CM5芯片进行了比较，具体如下：
CM5(BR-1003-99，GE，USA)芯片上带有羧基基团，被活化后可与蛋白中的氨基基团发生反应，从而将蛋白固定在芯片表面。下面以SpyTag-I215L为例进行说明。被固定的蛋白需要在酸性环境中，常用的缓冲液为10mM醋酸缓冲液，pH范围为4.0，4.5，5.0，5.5四种，蛋白浓度在20-50μg/mL。首先对SpyTag-I215L的固定条件进行pH和浓度的优化，最终选定的条件为pH 4.0，浓度为15μg/mL。以10μL/min的流速在CM5表面注射N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基羧二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物来激活芯片表面的羧基；注射15μg/mL的SpyTag-I215L到活化后的芯片上进行固定。最后，用75μL乙醇胺(pH 8.5)阻断芯片上剩余的活性偶联位点，用50mM NaOH作为再生液。以同样方法将牛血清白蛋白(BSA)固定在空白通道上。血清检测步骤与实施例10相同，且检测的响应值由固定了抗原的通道的响应值减去空白通道(固定BSA)的响应值得到，结果如图7所示。从结果可以看出，由于血清成分复杂，在CM5芯片上进行检测时，在空白通道产生了非常强的非特异结合，用抗原通道的响应值减去空白通道的响应值后都是负值，而在裸金芯片上由于S层蛋白的防污特性，在空白通道非特异结合较少，能较好的进行血清中抗体的检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO：1，rSbpA序列
SEQ ID NO：2，SpyCatcher序列
SEQ ID NO：3，SpyCatcher002序列
SEQ ID NO：4，SpyCatcher003序列
SEQ ID NO：5，SpyTag氨基酸序列
SEQ ID NO：6，SpyTag002的氨基酸序列
SEQ ID NO：7，SpyTag003的氨基酸序列
Claims (10)
1.一种免疫传感元件载体，其包含重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher。
2.根据权利要求1所述的免疫传感元件载体，其中所述重组的S层蛋白在rSbpA和SpyCatcher之间连接有柔性接头。
3.根据权利要求1所述的免疫传感元件载体，其中，所述rSbpA为S层蛋白SbpA的全长序列或具有31位至1068位氨基酸的截短突变体，所述rSbpA优选具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的免疫传感元件载体，其中，所述SpyCatcher具有如SEQ ID NO：2-4任一所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的免疫传感元件载体，其中，所述柔性接头为(GS)4。
6.重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher在制备免疫传感元件载体中的应用。
7.免疫传感元件载体的制备方法，包括将重组的S层蛋白rSbpA-SpyCatcher在裸金表面进行自组装。
8.根据权利要求7所述的免疫传感元件载体的制备方法，其包括将重组的S层蛋白稀释至终浓度为1mg/mL，然后以恒定的流速上样，直至RU值稳定，即可获得在裸金表面自组装有重组S层蛋白的免疫传感元件载体。
9.用于检测抗体的方法，其使用权利要求1-5任一所述的免疫传感元件载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其包括：将待测抗体的特异性抗原与SpyTag连接，获得SpyTag-抗原，并将SpyTag-抗原固定在权利要求1-5任一所述的免疫传感元件载体上，然后将待测抗体流经固定有抗原的传感元件载体表面并进行检测；
任选地，其中所述SpyTag具有如SEQ ID NO：5-7任一所示的序列；
优选地，所述抗原与所述SpyTag之间连接有柔性接头，所述柔性接头优选为(GS)4。
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| CN202111409999.1A Pending CN114200128A (zh) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 二维蛋白纳米阵列作为免疫传感元件载体的制备和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114200128A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115951051A (zh) * | 2022-10-18 | 2023-04-11 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104730234A (zh) * | 2015-02-07 | 2015-06-24 | 中国计量学院 | 一种基于免疫金的电化学传感元件的制备方法及其应用 |
| CN107533049A (zh) * | 2014-09-19 | 2018-01-02 | 皇家学习促进会/麦吉尔大学 | 用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器 |
| CN111954683A (zh) * | 2018-04-05 | 2020-11-17 | 生物辐射Abd瑟罗泰克有限公司 | 感兴趣的蛋白质的展示系统 |
-
2021
- 2021-11-24 CN CN202111409999.1A patent/CN114200128A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107533049A (zh) * | 2014-09-19 | 2018-01-02 | 皇家学习促进会/麦吉尔大学 | 用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器 |
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| Title |
|---|
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| E. BARANOVA: "SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca 2+ triggered S-layer assembly", 《NATURE》, no. 487, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 119 - 122 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115951051A (zh) * | 2022-10-18 | 2023-04-11 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法 |
| CN115951051B (zh) * | 2022-10-18 | 2024-01-12 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法 |
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