CN104975071A

CN104975071A - 用于肿瘤诊断和治疗的分子标记

Info

Publication number: CN104975071A
Application number: CN201410131519.3A
Authority: CN
Inventors: 曾木圣; 林志锐; 钟茜
Original assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN104975071B

Abstract

本发明公开了用于肿瘤诊断和治疗的分子标记，该分子标志为融合基因PLEKHA1-TACC2，融合基因同时包含基因PLEKHA1和基因TACC2的部分序列。本发明的分子标志，有助于肿瘤的早期诊断以及治疗，提高筛查效率，降低筛查成本，为个体化治疗提供方向，改善病人的存活率和生存质量。

Description

用于肿瘤诊断和治疗的分子标记

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、研究以及治疗领域，特别涉及肿瘤特异性的融合基因作为肿瘤诊断分子标志及临床治疗的分子靶标。

背景技术

随着社会的发展，人们生活环境及饮食习惯等的变迁，恶性肿瘤已经成为人类健康的头号杀手之一，近年来在全球范围内患病人数不断增加，为全球经济和人类社会的发展带来了沉重的负担。

恶性肿瘤的发生发展是多步骤并伴随多基因遗传或表观遗传发生变化的过程。鉴定致瘤性的遗传异常是肿瘤研究的一个重要目标，能够为肿瘤治疗提供潜在的靶点。其中值得注意的是，染色体重排导致两基因的融合，作为一种新的突变形式在肿瘤发病过程中起着关键作用，它的发现扩展了肿瘤基因的范畴。

融合基因作为肿瘤基因新类型，其促进肿瘤发生和恶性转化主要通过两种方式：第一，一个基因的启动子或/和增强子元件等由于染色体重排异常地跟一个原癌基因紧靠在一起，驱使癌基因的异常表达，例如B细胞肿瘤IG-MYC、T细胞肿瘤TCR-MYC导致癌基因MYC活化；第二，两基因融合产生有新功能的融合蛋白，例如BCR-ABL1。然而，超过80%的已知融合基因存在于仅占人类肿瘤的10%的白血病、淋巴瘤、骨及软组织肉瘤中，而在较为常见上皮性实体瘤却只发现10%融合基因。

近年来随着分析及检测方法的进步，肿瘤学家分别在50%前列腺癌和1-5%肺癌（5-10%非小细胞肺癌）发现新的融合基因TMPRSS2-ERG， EML4-ALK，并进一步阐明它们的致癌机制，为前列腺癌和肺癌的分型诊断和靶向治疗奠定基础。可见染色体重排导致两基因融合同样可以是上皮性实体瘤的癌变机制之一。融合基因因其在肿瘤细胞特异性表达，可作为理想的治疗靶点，例如针对CML的融合基因BCR-ABL设计的分子靶向药物imatinib/Gleevec已经在临床得到应用，同样地临床前及临床1期，2期数据表明ALK激酶抑制剂对治疗EML4-ALK阳性病人有效。

用于癌症的融合基因的研究已经日益成为热点。

PLEKHA1基因位于10号染色体长臂第二区第6带的第13个亚带（10q26.13），存在3个转录本，以转录本1为例（NM_021622.4）其转录的mRNA包含12个外显子，编码404个氨基酸，分子量约45.5 kDa。该基因编码包含pleckstrin 同源性结构域的衔接蛋白，能通过特异性结合3，4-二磷酸磷脂酰肌醇而定位在细胞膜，因此其可能参与到细胞膜信号通路传导的过程中。另外，PLEKHA1基因的多态性与一些疾病相关，包括kuhnt-junius degeneration以及macular degeneration，至今其与肿瘤的关系并没有研究。

TACC2基因位于10号染色体长臂第二区第6带（10q26），转录产生4个转录本，以转录本1为例（NM_206862.2）其转录mRNA包含23个外显子，编码2948个氨基酸，分子量约309.4 kDa。该基因编码的蛋白包含SPAZ结构域以及C端transforming, acidic coiled-coil结构域，主要表达在胞浆以及在细胞周期进展过程中在中心体附近富集。TACC2蛋白通过C端的TACC结构域与多种分子相互作用，包括与微管相互作用参与细胞的分裂，与YEATS4、 GCN5L2、PCAF等相互作用参与基因的表达调控。之前的研究发现TACC2与肿瘤的发生发展关系密切，最初TACC2在乳腺癌中被首次发现，并证实其对乳腺癌的进展起着抑制的作用。最近在前列腺癌的报道中，TACC2起着促癌作用。TACC2与肿瘤关系仍有待进一步阐明。

上述两个基因位于的染色体区域在肿瘤中经常发生异常，揭示该区域与肿瘤的发生发展密切相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肿瘤的分子标志及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

用于肿瘤的分子标志，所述分子标志为融合基因PLEKHA1-TACC2，融合基因同时包含基因PLEKHA1和基因TACC2的部分序列。

优选的，上述融合基因PLEKHA1-TACC2的融合形式选自：PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 6：TACC2 exon 13，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 20，PLEKHA1 exon 8：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 4：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 3：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 9：TACC2 exon 23。

特别的，融合基因PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列：

PLEKHA1部分：

TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAGAAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATGGATAATCCACAG（SEQ ID NO：1）；

TACC2部分：

AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGAACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGGTTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAGGAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGTATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAGGGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGATCTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTTTTCTTTGGATCTTGGCAA（SEQ ID NO：2）。

一种用于肿瘤临床病理特征和/或预后判断的诊断制剂，制剂中含有可检测上述任意一项的分子标志或其表达产物的试剂。

肿瘤选自头颈部肿瘤，特别是食管鳞癌、鼻咽癌、喉癌或口腔部鳞癌。

一种治疗肿瘤的生物制剂，该生物制剂可以使融合基因PLEKHA1-TACC2在肿瘤细胞中的表达量下降或者使其表达融合蛋白丧失功能。

特别的，上述治疗肿瘤的生物制剂含有siRNA、融合基因PLEKHA1-TACC2启动子抑制剂、融合基因PLEKHA1-TACC2增强子抑制剂、融合基因PLEKHA1-TACC2表达蛋白抗体中的至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明的分子标志，有助于肿瘤的早期诊断以及治疗，提高筛查效率，降低筛查成本，为个体化治疗提供方向，改善病人的存活率和生存质量。

本发明的诊断制剂，通过检测融合基因的表达情况，可以对肿瘤进行早期筛查，有助于肿瘤的早期介入和预防。

本发明的治疗肿瘤的生物制剂，通过使融合基因PLEKHA1-TACC2的表达量下降，对肿瘤的进展有一定的治疗作用，具有广阔的开发前景。

附图说明

图1：利用RNA-seq发现食管鳞癌存在新的recurrent gene fusion；

图2：野生型PLEKHA1和TACC2在不同标本中的表达量；

图3：过表达融合蛋白对食管癌肿瘤细胞增殖的影响；

图4：敲降PLEKHA1、TACC2对食管癌肿瘤细胞增殖的影响

图5：敲降TACC2对细胞周期分布的影响；

图6：敲降TACC2对肿瘤细胞耐药性的影响；

图7：融合基因的分析检测流程；

图8：融合基因PLEKHA1-TACC2在不同头颈部肿瘤中的测序情况。

具体实施方式

特别的，融合基因PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列：

PLEKHA1部分：

TACC2部分：

一种用于肿瘤临床病理特征和/或预后判断的诊断制剂，制剂中含有可检测上述任意一项的分子标志或其表达产物的试剂。所述的试剂可以融合蛋白的抗体、针对融合基因的特异性探针或特异性PCR引物。其实现方法可以采用本领域公知的技术。

融合基因 PLEKHA1-TACC2 的发现

本发明的发明者采用paired-end RNA-seq 方法对6对食管鳞癌组织RNA进行全转录组分析。经过强大计算机集群对测序的海量数据进行预处理后，利用融合基因检测流程，在测序样品4T中发现新融合基因PLEKHA1-TACC2，而在与其配对的癌旁组织中没有检测到，证实此新发现的融合基因是肿瘤特异性的。具体实验步骤如下：

1) 收集新鲜6例食管鳞癌及与其配对癌旁组织，置于RNA later溶液中，4℃浸泡过夜后，在-80℃长期储存；

2) 利用OMEGA生物制剂公司的E.Z.N.A. total DNA/RNA 分离试剂盒（R6731-02，200次）提取及纯化组织的总RNA和DNA，具体步骤如下：

(1) 研磨组织：

a) 洗净所用的研钵和研杵，然后浸泡在医用消毒液中过夜（约12个小时左右），次日用清水冲洗干净后擦干，用锡箔纸包裹好研钵和研杵，放入烤箱中用180℃烘烤3个小时备用。（用锡箔纸包裹是防止研钵和研杵在烘烤过后使用前，有异物或RNA酶污染。）从-80℃冰箱取出所需的组织，放入研钵中，加入液氮冷冻组织后将组织研磨成粉末，标记好组织编号。此步骤需注意：先研磨非癌组织，再研磨肿瘤组织，尽量避免交叉污染；

b) 每20-30mg的组织加入700μl 的GTC Lysis Buffer，收集入1.5ml EP管中，用10ml的一次性注射器反复抽打，使组织更好的裂解；

c) 13000×g室温离心5min，将上清移至已经插入2ml收集管的HiBind^TMDNA Column中，离心一分钟，13000×g/min；

d) 将收集管里的液体分别移到1.5ml的EP管中，此步骤之后DNA和RNA就分开提取。

(2) RNA提取：

a) 加入与1.5ml EP管中等体积的70%的乙醇（约350μl ），此时可看到白色沉淀，上下颠倒几次后用震荡器剧烈震荡15sec以上；

b) 将液体转移至HiBind^TMRNA分离柱中，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；

c) 向HiBind^TMRNA分离柱中加入500μl RNA Wash BufferⅠ，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；

d) 向HiBind^TMRNA分离柱中加入500μl RNA Wash BufferⅡ，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；

e) 重复第d）的步骤；

f) 将空的HiBind^TMRNA分离柱，离心，≥10000×g，2min；

g) 丢掉上一步所用的收集管，将HiBind^TMRNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向HiBind^TMRNA分离柱中心滴加40μl 的DEPC水，室温孵育3min后离心，≥10000×g，2min。离心下来的为RNA，分装后放入-80℃中保存。

(3) DNA提取：

a) 将HiBindTM DNA分离柱插入新的2ml的收集管中；

b) 向HiBindTM DNA分离柱中加入500μl 的HB Buffer，离心，≥10000×g，1min；弃去收集管里的液体；

c) 向HiBindTM DNA分离柱中加入700μl DNA Wash Buffer，离心，≥10000×g，1min；弃去收集管里的液体；

d) 将空的HiBindTM DNA分离柱中离心，≥10000×g，2min；

e) 将HiBindTM DNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向每个HiBindTM DNA分离柱中心滴加60μl Elution Buffer。室温孵育3min后离心，≥10000×g，2min。提取的DNA分装后放在-80℃保存。

3) 将纯化好的总RNA干冰运送到深圳华大基因公司，利用agilent 2100检测，质检合格后进行测序文库的构建与测序：

(1) 总RNA用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；

(2) 加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段；

(3) 以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链；

(4) 经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头；

(5) 琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，约200bp，进行PCR扩增；

(6) 在Illumina HiSeq™ 2000平台进行paird-end 测序；

4) 利用生物信息分析方法，对测序数据进行处理，利用一套成熟的流程检测样品中的融合基因，分析流程如图7所示。

在样品4T检测到新融合基因PLEKHA1-TACC2，通过基因定位分析显示这两个基因都位于10号染色体，相隔137.3 kb，支持该融合基因的paire-end reads比对结果，见图1 A。

食管鳞癌新融合基因 PLEKHA1-TACC2 的鉴定

根据RNA-seq reads比对结果，本发明的发明人在RNA融合位点两端设计引物，联用PCR扩增以及sanger 测序在测序样品4T中验证PLEKHA1-TACC2的存在，引物序列：

PLEKHA1-TACC2-RT-sense：5’- TCGTCAGAATCGCATTTGTGG-3’（SEQ ID NO：3）

PLEKHA1-TACC2-RT-antisense：5’- GCTGCTCACCCTGGGAACTT-3’ （SEQ ID NO：4）

实验步骤如下：

1) RNA逆转录cDNA

使用Invitrigen公司的M-MLV逆转录试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA.C28025-032)，按说明书用Oligo(dT)为逆转录引物，取1μg总 RNA进行逆转录，逆转录体系共20μl 冰上操作，配置体系如下：

0.5μg RNA	0.5μg RNA对应的μl 数
		Oligo(dT)20 (50 µM)	1μl
10 mM dNTP mix	1μl
		DEPC H₂O	to 10μl

共10μl 体系，在PCR仪中完成变性过程， 65℃ 5min，4℃ 至少1 min；取出反应体系立即置于冰上，立即配置如下反应体系：

5×First-Strand Buffer (includes 15 mM MgCl₂)	4μl
		0.1 M DTT	2μl
M-MLV RT	1μl
		DEPC H₂O	3μl

加入标记好的EP管中各10μl ，在PCR仪中完成如下步骤：

37℃50min；70℃终止反应15min；4℃ forever将上述逆转录好的cDNA分装保存-20℃备用。

2) PCR扩增

使用TaKaRa公司Taq™ Hot Start Version，按说明书使用PLEKHA1-TACC2检测引物，配置50μl PCR体系如下：

10×PCR buffer	5μl
		dNTP mix（各2.5mM）	4μl
上游引物（10uM）	1μl
		下游引物（10uM）	1μl
cDNA	1μl
		Hot start Taq	0.3μl
ddH₂O	37.7μl

在PCR热循环仪上完成PCR过程：预变性95℃ 5min 变性 95℃ 30sec 退火 60℃ 30sec延伸 72℃ 1min 72℃ 10min 4℃ forever 循环数：45cycles；

3) 取5μl PCR产物跑琼脂糖电泳鉴定特异性扩增；

4) 剩下PCR产物送去Invitrogen公司，在3500遗传分析仪平台进行sanger 测序；

5) 对测序结果进行比对分析，证实新融合基因PLEKHA1-TACC2存在。

从图1 B中的上图可知，琼脂糖电泳结果表明在测序样品4T能特异地扩增出跟预测大小相符的条带，后续的sanger测序结果证实在RNA水平PLEKHA1 （NM_021622）exon 2 与TACC2 （NM_206862）exon 23发生融合。

基因组融合位点的鉴定

为了进一步证明PLEKHA1与TACC2间的融合是由于染色体重排产生的，利用TaKaRa公司的 TaKaRa LA Taq® Hot Start Version ，以基因组DNA为模板，使用同一对引物进行long Range PCR扩增，对扩增产物进行sanger 测序，鉴定基因组融合位点，实验步骤如下：

1) 配置50μl PCR反应体系：

10×LA PCR buffer	5μl
		dNTP mix（各2.5mM）	8μl
上游引物（10uM）	1μl
		下游引物（10uM）	1μl
DNA	1.5μl
		LA Taq Hot start	0.5μl
ddH₂O	33μl

2) PCR扩增：

95℃ 5min 95℃ 30sec 58℃ 30sec 72℃ 5min 10 cycles 5min + 10sec/cycle 35 cycles 72℃ 10min 4℃ forever；

3) 取5μl PCR产物跑琼脂糖电泳，明确扩增出特异条带；

4) 剩下PCR产物送到Invitrogen公司，在3500遗传分析仪平台进行sanger 测序分析；

5) 测序结果进行比对分析，明确基因组融合位点。

从图1B的下图可知，琼脂糖电泳结果显示以测序样品4T的DNA为模板，利用long range PCR特异地扩增出约 8kb的片段，测序结果证实PLEKHA1与TACC2间的融合发生在DNA水平，融合位点为Chr10:124011190-124155852（hg19）。

PLEKHA1-TACC2 在食管鳞癌临床标本上表达

为进一步验证新融合基因是食管鳞癌高频事件，而不是只在某个样品发生的个体独特事件，并且检测两个基因是否存在不同的融合方式，本发明发明人联用PCR扩增和sanger 测序在另外160例食管鳞癌临床标本中验证，实验步骤如下：

1) 收集160例食管鳞癌组织标本；

2) 组织总RNA和DNA的提取纯化；

使用OMEGA生物制剂公司的E.Z.N.A. total DNA/RNA 分离试剂盒（R6731-02，200次），具体实验步骤同上；

3) 逆转录反应；

4) PCR扩增：

为了检测不同融合位点的嵌合转录本，PCR热循环过程中的延伸时间改为4min；

5) 取5μl 跑琼脂糖电泳，鉴定有特异性扩增；

6) 将特异性扩增的PCR产物送测序；

7) 测序结果比对分析，明确存在融合基因的临床标本以及其融合位点。

从图1 C和D可知，新融合基因PLEKHA1-TACC2在食管鳞癌中是recurrent的，在6.6%（11/166）食管鳞癌中有表达,并且存在9种RNA融合方式，分别为：PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 6：TACC2 exon 13，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 20，PLEKHA1 exon 8：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 4：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 3：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 9：TACC2 exon 23。

野生型 PLEKHA1 和 TACC2 在食管癌组织标本的 mRNA 表达水平检测

发明人利用实时定量PCR（QPCR）在食管癌临床标本及其配对癌旁组织中分别检测野生型PLEKHA1和TACC2基因的mRNA表达水平。发明人利用Bio-rad公司Sybr-green buffer（#170-8880）以及CFX96平台进行实时定量PCR检测，具体步骤如下：

1) 引物设计与合成（invitrogen公司）

PLEKHA1-real time-sense：5’-TGTGTAAAACAAGGAGCAGTGATG-3’ （SEQ ID NO：5）

PLEKHA1-real time-antisense：5’-CATTCCTGGACTTTATGAACCTCT-3’ （SEQ ID NO：6）

TACC2-real time-sense：5’- GCTATGGAAGCCAATGGAGTG-3’ （SEQ ID NO：7）

TACC2-real time-antisense：5’- ACTGGTGGTGTTTCTGGTGTAGC-3’ （SEQ ID NO：8）

GAPDH-real time-sense：5’- CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’ （SEQ ID NO：9）

GAPDH-real time-antisense：5’-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’ （SEQ ID NO：10）

2) QPCR反应体系（10μl ）

首先将逆转录得到的1μg cDNA原液稀释，1μl cDNA原液加19μl 的DEPC水稀释，得到的稀释液浓度为50ng/4μl 。反应试剂及体系如下：

试剂	剂量（μl ）
		2× iQ™ universal SYBR^® Green qPCR SuperMix	5
2.5μM上、下游引物的混合物	1
		稀释后的cDNA	4

反应程序：95℃预变性2min，反应一次； 95℃ 变性15sec，60℃退火与延伸30sec，反应重复40个循环。溶解曲线反应程序为： 95℃ 15sec； 60℃ 15 sec；95℃ 30 sec。溶解曲线的作用是用于判断引物是否特异，有无二聚体干扰或者其他的污染以及扩增曲线可得出产物扩增的情况。

结果分析：目的基因的相对表达量用2^‾ ^△ ^Ct表示，△Ct＝目的基因CT－参照基因CT。

从图2可知，两个野生型基因PLEKHA1和TACC2在食管癌标本中低表达，并且在融合基因阳性的标本中mRNA表达水平较融合基因阴性的食管癌标本中更低。A和B：PLEKHA1，TACC2在食管癌及其配对的癌旁组织的mRNA表达差异分析；C和D：PLEKHA1和TACC2在融合基因阳性和阴性的食管癌标本中mRNA表达差异分析。

融合基因及野生型基因功能研究

PLEKHA1-TACC2的融合方式多变，通过生物信息学分析和预测，不同融合方式编码不同的蛋白以及以上的QPCR结果，发明人认为PLEKHA1-TACC2融合基因可通过两种方式促进肿瘤的发生发展：1.产生致瘤性融合蛋白；2.破坏两个候选抑癌基因，抑制两个抑癌基因的表达。

为了证明以上假设，发明人采用Tet-off诱导表达系统过表达融合蛋白（融合方式：P-exon 6:T-exon 13经生物信息预测ORF）、瞬时特异性siRNA和稳定shRNA敲降野生型基因、MTT assay、细胞周期检测、耐药性检测等实验进行功能研究，具体实验步骤如下：

1) 生物信息学分析融合方式P-exon 6:T-exon 13编码的ORF

根据之前鉴定的RNA 融合位点，发明人推测出融合基因转录本全长，利用DNA start软件（可选用其他软件）的edit seq 模块，预测得到编码蛋白的ORF。

2) PCR扩增全长ORF，并克隆到pRetroX-Tight-Pur表达载体

发明人针对以上预测ORF，设计克隆引物，PCR扩增，因没有特异性识别此融合蛋白的抗体，因此在融合蛋白N端带上flag标签

(1) 引物设计与合成（Invitrogen公司）

PLEKHA1-TACC2-full length-sense：5’-CGGGATCCATGGATTACAAGGATGAC（SEQ ID NO：11）

5’-GACGATAAGATGCCTTATGTGGATCGTCAGAA-3’ （SEQ ID NO：12）

PLEKHA1-TACC2-full length-antisense：5’-GGAATTCTTAGCTTTTCCCCATTT（SEQ ID NO：13）

TGGC-3’

(2) PCR扩增

采用Takara 公司的primer start 高保真DNA聚合酶，模板是包含该融合方式的食管癌标本cDNA，反应体系如下：

试剂	剂量（μl ）
		5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus）	10
dNTP Mixture（各2.5 mM）	4
		Primer 1（10 μM）	1
Primer 1（10 μM）	1
		cDNA	8.5
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase（2.5 U/μl ）	0.5
		灭菌蒸馏水	25μl

(3) 琼脂糖电泳以及胶回收

配置1%琼脂糖胶

1g 琼脂糖粉

100ml 1XTAE电泳缓冲液

胶回收用的是天根公司的胶回收试剂盒（DP209），并按照说明书操作。

(4) 胶回收的PCR以及pCDNA3.1（+）空载体酶切

50μl 酶切体系配置：

试剂	剂量（μl ）
		10XNEB buffer 4	5
BamHI-HF	1
		EcoRI-HF	1
胶回收产物（ pCDNA3.1（+）1μg/μl ）	23(2)
		ddH₂O	20(41)

37℃孵育30min以上；

(5) 琼脂糖电泳及胶回收，步骤同上，其中回收产物用20μl ddH₂O洗脱，空载用50 μl ddH₂O洗脱。

(6) 连接

15μl 连接体系

试剂	剂量（μl ）
		Ligation High	5
插入片段	8.5
		空载	1.5

16℃连接30min以上。

(7) 连接产物转化

根据天根公司的DH5α感受态细胞（CB101）转化步骤进行。

(8) 挑单克隆

10μl 枪头挑至少2个菌落至含100ng/ml氨苄抗生素的LB培养基，37℃摇床培养12-20h。

(9) 小提质粒

按照天根公司小提质粒的试剂盒说明书的步骤进行。

(10) 酶切鉴定

酶切体系同上。

(11) 琼脂糖电泳，目的片段大小判断；

(12) 鉴定正确的质粒送测序，鉴定没有突变；

(13) 质粒大量提纯：

测序鉴定没有突变的质粒，需要经行质粒的大量提取，本发明人所在实验室采用氯化铯密度梯度离心法。

(14) 磷酸钙转染和磷酸钙包装逆转录病毒

a) 提前一天铺293FT细胞,因为细胞贴壁不牢，培养皿需要用明胶预先处理：在10cm 培养板中加2-3ml 0.1% 的明胶覆盖培养皿底部在37度放置至少15min；

b) 消化293FT细胞，吸走培养皿中的明胶，10cm培养皿铺1-1.2x10⁶细胞数，放培养箱内培养

c) 24h后，待细胞密度达40%左右时，进行磷酸钙转染：

加反应体系：

I. 目的质粒稀释至1ug/ul，病毒包装质粒PIK也稀释至1ug/ul；

II. 取1.5ml 离心管，每管加20-25ul目的质粒，然后加等量PIK；

III. 加100ul 超纯水；

IV. 加50 ul 1M 的CaCl₂；

V. 加200ul HBS（PH=6.75），缓慢逐滴加入，混匀。

d) EP管在室温下静置15-30 min；

e) 将待转染的293FT细胞取出，吸走部分培养基，是剩下的培养基4-5ml；

f) 将待转染的质粒（DNA-磷酸钙沉淀）均匀滴入转染细胞培养皿，轻轻摇动使混匀；

g) 每培养皿中加40 ul氯喹(终浓度25uM)，轻轻混匀；

h) 37度，5% CO₂培养箱中培养6小时；

i) 6小时候后，从培养箱中取出细胞，小心吸去培养基；

j) 用1x的solution A洗细胞两次，轻轻摇晃，至沉淀全部溶解；

k) 培养皿加入含10% FBS的新鲜培养基6.5ml在37度，5% CO₂培养箱中培养。

(15) 病毒收集和细胞感染

a) 18小时后，开始收集病毒，每4小时收集一次，用注射器吸取培养皿上清，0.45um过滤器进行过滤。病毒液可以直接用于感染细胞；

b) 病毒液也可以保存于病毒冻存管中，-80度保存。

2×HBS（PH=6.75）：

50mmol/L HEPES,

130mmol/L NaCl，

1.5mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄

调PH=6.75

过滤后分装4度保存

1mol/L CaCl₂：111g CaCl₂溶于900ml水中，搅拌溶解，定容至1000ml，过滤。

(16) 建立稳定细胞株

病毒2天内感染3次后，加入含抗生素puromycin（2ug/ml）、G418（400ug/ul）以及Dox（200ng/ml）培养基培养2周,注意每隔两天换液，待细胞生长正常后收取蛋白和RNA用于鉴定。

(17) MTT assay

a) 消化细胞并计数；

b) 取200μl 细胞悬液含2000 cell加入96孔板内，每组设6个平行的复孔，连续测6天；

c) 5％CO₂、37℃培养；

d) 实验中止前4h加入5mg/ml MTT液20μl ，继续培养4h；

e) 弃去培养液，每孔加入200μl DMSO，37℃10分钟，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测490nm波长下每孔的OD值；

f) 待6天检测完后，利用每天的OD值做生长曲线。

(18) Western Blot，检测融合蛋白表达情况

a) 细胞蛋白样品的提取

收集状态较好的细胞，弃去培养液，用PBS洗涤两次，洗净残余的培养基。弃去PBS，根据细胞的数量加入适当的1×sample buffer，在冰上裂解10min后用细胞刮将粘稠的细胞裂解产物刮下，收集到1.5ml的EP管中，用1ml的无菌一次性注射器对裂解产物反复抽吸，抽吸到裂解产物变成清澈的水滴状物质。12000rpm离心5min，若有沉淀则吸取上清到新的EP管中，弃去沉淀。放在冰上待测浓度，分装后-20℃短暂保存，-80℃可长期保存，避免反复冻融。

b) 蛋白定量

根据BCA蛋白定量试剂盒说明书，计算出所需的BCA工作液的总量，96孔板每孔加入200μl 工作液，配制BCA工作液的比例为A液：B液=50：1。首先在每200μl BCA工作液中加入5μl PBS，然后按浓度从小到大的顺序加入5μl 标准液，再在后面的孔中加入样品蛋白，记好顺序和编号，放入37℃恒温箱中孵育30min。用酶标仪在波长562nm测定吸光光度，并换算成蛋白浓度。

c) 配胶

根据上样量选择1.5mm的配胶玻璃板和孔梳，洗干净后，组装好玻璃板后，加入去离子水以检测有无漏水，若是5min后水面无明显下降即可定为无渗漏现象。用吸水纸吸出玻璃板中的水，配置10.5%的SDS聚丙烯酰胺下层胶（分离胶），迅速加入玻璃板至距薄玻璃板上缘约1.5-2cm的位置（尽量避免产生气泡），立刻加入无水乙醇封胶。待下层胶凝固后，用吸水纸吸去无水乙醇，配置上层胶(浓缩胶)，配好后迅速加入玻璃板中，插入孔梳（避免有气泡）。配好的胶可以放入4℃过夜次日使用，但是最好是现配现用。

d) 蛋白变性与配平

100μl 样品加入5μl 的已混入少量溴酚蓝ß-巯基乙醇，混匀，短暂离心后放入加热仪中98℃变性10min，变性好的蛋白放在冰上避免降解。根据蛋白浓度计算出上样量30μg所需蛋白体积，用上样缓冲液配至相同体积。

e) 上样与电泳

组装好电泳装置后，向槽内的玻璃板中缓慢倒入1×running buffer直至液面与玻璃板齐平，确定无液体漏出后，向外槽也加入适量的1×running buffer。用10μl 移液器分别缓慢加入样品液，和蛋白Marker，注意避免样品从孔中溢出。正确连接导线，接通电源，先用60V恒压电泳，待样品泳入下层胶（分离胶）后，根据目的条带的大小（PTK6条带大小约55左右），将电压调制100V，直到看见蓝色的溴酚蓝条带移到玻璃板底端，可关闭电源停止电泳。

f) 转膜

先将剪好的PVDF膜用甲醇浸泡，将双层滤纸、转膜夹及衬垫浸泡在1×transfer buffer中。取出电泳槽中的玻璃板，撬开后，移开薄玻璃板使胶体在厚的玻璃板上，除去上层胶，将双层滤纸紧密贴于胶面上，避免有气泡，翻转后移开厚玻璃板使胶体放置在滤纸上，再在胶的一面紧密的覆盖上用甲醇浸泡了3min的PVDF膜，PVDF膜上再覆盖一张滤纸，正确组装好转膜夹子，插入转膜槽中，在转膜槽的另一半放入一个配套的冰盒，正确连接导线。最后将转膜槽放入一个冰盒中，周围装满碎冰（一定要保持转膜槽放置平稳），以达到降温效果。接通电源，200mA恒流下转膜3小时。

g) 封闭

用TBST配置含5%脱脂奶的封闭液，将PVDF膜放入封闭液中，室温下放置摇床上封闭1.5个小时。

h) 抗体反应

一抗反应：将封闭完的PVDF膜充分浸泡在用一抗稀释液配制好浓度为1:1000的anti-flag， 4℃过夜。次日回收一抗，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，洗膜过程在摇床上进行。

二抗反应：二抗为TBST配制的5%脱脂奶稀释的鼠二抗（稀释浓度1:3000），室温下孵育1小时之后，弃去二抗，用TBST洗膜三次，方法同洗一抗。

i) 显影

准备好显影所用的物品，包括：滤纸、移液器和枪头、保鲜膜、显影液、X光胶片，压片盒及小镊子。显影的操作在专门的暗房中进行。取适量的显影液放在保鲜膜上，用PVDF浸泡在显影液中，用滤纸吸去多余的显影液，将膜放入压片盒中，根据所看见的荧光强度确定压片显色的时间，放入X光胶片后，压紧压片盒。最后将胶片放入洗片机中显影，在胶片上标记好蛋白Marker的条带和对应的样品编号。

(19) 瞬时转染siRNA

按照Invitrogen公司Lipofectamine® RNAiMAX（13778-150）说明书进行。

(20) 构建PLEKHA1和TACC2 shRNA敲降稳定细胞株

a) shRNA设计（OligoEngine软件）和合成（Invitrogen公司）克隆至pSUPER.retro载体；

b) 制病毒、感染细胞、药物筛选建立稳定细胞株。

(21) QPCR验证siRNA和shRNA的敲降效果，QPCR步骤同上。

(22) MTT assay检测增殖能力，步骤同上。

(23) 细胞周期检测

a) 瞬转siRNA，具体步骤同上；

b) 细胞固定：离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。

c) 细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50μg/mL碘化丙啶（PI），100μg/mL RNase A, 0.2% Triton X-100, 4℃避光孵育30分钟。

d) 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件分析。

(24) 耐药性检测

DDP是食管癌治疗的常用的化疗药物，检测敲降TACC2是否影响肿瘤细胞株的抗药性。

a) 取对数生长的细胞种入96孔板内，3000cells/孔，共8列6行细胞；

b) 24h后，每列换上含有相应的浓度DDP的培养基（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/ml）继续在37℃ CO₂培养箱培养；

c) 48h后，MTT法检测吸光值，计算每个DDP浓度下细胞存活率。

(25) 相关凋亡蛋白表达情况检测

敲降TACC2后细胞对DDP耐药是否由于细胞的凋亡减少实现的，通过western blot检测凋亡蛋白Caspase 3 cleaved-Caspase 3 Caspase 7 cleaved-Caspase 7 cleaved—PARP表达情况，结果见，具体步骤如下：

a) 取对数生长的细胞铺到6孔板内；

b) 24h后，换成含有DDP 2μg/ml的培养基；

c) 培养40h后，显微镜下观察细胞存活情况，并拍照，见图；

d) 收集细胞（包括已漂在培养基中的死细胞），提取蛋白，进行Western blot，具体步骤同上，其中，下层胶12%

一抗
				Caspase 3	1:1000	Rabbit	35 KDa
cleaved-Caspase 3	1:1000	Rabbit	19 KDa
				Caspase 7	1:1000	Rabbit	35 KDa
cleaved-Caspase 7	1:1000	Rabbit	19 KDa
				cleaved—PARP	1:1000	Rabbit	89 KDa
α-tublin	1:3000	Mouse	55 KDa

以上的实验结果可见图3～6。功能实验显示，融合基因编码的融合蛋白起着癌基因的功能，能够促进肿瘤细胞的生长以及克隆形成能力，另外敲降TACC2后能通过改变细胞周期的进展来促进肿瘤细胞的增殖，减少细胞凋亡来增强对DDP的耐药性，其中：

图3：A.WB结果显示在食管癌细胞株ECA109成功通过Tet-off诱导表达系统过表达融合蛋白PLEKHA1-TACC2；B.MTT实验显示PLEKHA1-TACC2增强肿瘤细胞的增殖能力；C.平板克隆；D.平板克隆定量结果（p<0.05）。

图4：A和B，QPCR验证siRNA和shRNA在ECA109中具有很好的敲降TACC2以及PLEKHA1效果；C和D， MTT结果表明敲降PLEKHA1没有影响细胞的增殖，而敲降TACC2后明显增强细胞的增殖能力（C为siRNA敲降，D为shRNA）；E. QPCR证实shRNA在KYSE510具有良好的敲降PLEKHA1效果；F. QPCR证实shRNA在KYSE510具有良好的敲降TACC2的效果；G. MTT结果表明敲降PLEKHA1没有影响细胞的增殖，而敲降TACC2后明显增强细胞的增殖能力。

图5：A和C. 细胞周期分析显示敲降TACC2后改变细胞周期的进展；B和D. 敲降TACC2后改变细胞周期相关蛋白表达。

图6：敲降TACC2后，KYSE510细胞耐受DDP；A．三株肿瘤细胞株在2μg/ml DDP 处理40h后相差显微镜拍照；B，C．三株肿瘤细胞株在不同浓度处理后，MTT法检测细胞存活率；D．肿瘤细胞株在2μg/ml DDP 处理40h后，凋亡相关蛋白WB检测结果。

PLEKHA1-TACC2 在头颈部肿瘤的临床标本上表达

进一步验证PLEKHA1-TACC2是否为食管鳞癌特异性的融合基因，本发明人采用PCR扩增和sanger法测序联用的方法，在20例头颈鳞癌以及20例鼻咽癌临床标本检测PLEKHA1-TACC2的表达。结果显示：头颈鳞癌和鼻咽癌各发现1例标本表达该融合基因，证实PLEKHA1-TACC2并不是食管癌特异性的，可作为头颈部肿瘤的潜在分子标志物。具体实验步骤同上。

图8：A.上图：琼脂糖电泳图，利用PCR在1例头颈鳞癌特异性扩增出PLEKHA1-TACC2融合基因，下图：sanger法测序的结果，其中红色字体表示PLEKHA1的序列，蓝色表示TACC2的序列；B.上图：琼脂糖电泳图，利用PCR在1例鼻咽癌特异性扩增出PLEKHA1-TACC2融合基因，下图：sanger法测序的结果，其中红色字体表示PLEKHA1序列，蓝色表示TACC2序列。

<110> 中山大学附属肿瘤医院

<120> 用于肿瘤诊断和治疗的分子标记

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 161

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

tgtaatgttc aagctcagaa atgccttatg tggatcgtca gaatcgcatt tgtggttttc 60

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<210> 2

<211> 552

<212> DNA

<213> 人类

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工引物

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ggaattctta gcttttcccc attt 24

Claims

1.用于肿瘤的分子标志，所述分子标志为融合基因PLEKHA1-TACC2，融合基因同时包含基因PLEKHA1和基因TACC2的部分序列。

2.根据权利要求1所述的分子标志，其特征在于：所述融合基因PLEKHA1-TACC2的融合形式选自：PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 6：TACC2 exon 13，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 2：TACC2 exon 20，PLEKHA1 exon 8：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 10：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 4：TACC2 exon 23，PLEKHA1 exon 3：TACC2 exon 17，PLEKHA1 exon 9：TACC2 exon 23。

3.根据权利要求1所述的分子标志，其特征在于：所述融合基因PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列：

PLEKHA1部分：

TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAGAAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATGGATAATCCACAG；

TACC2部分：

AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGAACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGGTTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAGGAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGTATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAGGGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGATCTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTTTTCTTTGGATCTTGGCAA。

4.一种用于肿瘤临床病理特征和/或预后判断的诊断制剂，其特征在于：所述制剂中含有可检测权利要求1～3任意一项所述的分子标志或其表达产物的试剂。

5.根据权利要求4所述的诊断制剂，其特征在于：所述肿瘤选自头颈部肿瘤。

6.根据权利要求4所述的诊断制剂，其特征在于：所述肿瘤选自食管鳞癌、鼻咽癌、喉癌或口腔部鳞癌。

7.一种治疗肿瘤的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂可以使融合基因PLEKHA1-TACC2在肿瘤细胞中的表达量下降或者使其表达融合蛋白丧失功能。

8.根据权利要求7所述的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂含有siRNA、融合基因PLEKHA1-TACC2启动子抑制剂、融合基因PLEKHA1-TACC2增强子抑制剂、融合基因PLEKHA1-TACC2表达蛋白抗体中的至少一种。