CN106755409B - 一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 - Google Patents
一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755409B CN106755409B CN201611201582.5A CN201611201582A CN106755409B CN 106755409 B CN106755409 B CN 106755409B CN 201611201582 A CN201611201582 A CN 201611201582A CN 106755409 B CN106755409 B CN 106755409B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bcl6
- specc1l
- fusion
- gene
- fusion gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 72
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 101000884816 Homo sapiens Cytospin-A Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038281 Cytospin-A Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 5
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126069 ALK kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101150007337 Bcl6 gene Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150006832 SPECC1L gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 206010006007 bone sarcoma Diseases 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002740 oral squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000028280 polygenic inheritance Diseases 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记，所述分子标志为融合基因BCL6‑SPECC1L，所述融合基因同时包含基因BCL6和基因SPECC1L的部分序列。本发明的分子标志，有助于肿瘤的早期诊断以及治疗，提高筛查效率，降低筛查成本，为个体化治疗提供方向，改善病人的存活率和生存质量。另外，本发明还公开一种用于肿瘤临床病理特征和/或预后判断的诊断制剂，所述制剂中含有可检测融合基因BCL6‑SPECC1L或其表达产物的试剂。同时，本发明还公开一种治疗肿瘤的生物制剂，所述生物制剂下调融合基因BCL6‑SPECC1L在肿瘤细胞中的表达量或使融合基因BCL6‑SPECC1L融合蛋白不表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子标记，尤其涉及一种将肿瘤特异性的融合基因作为肿瘤诊断分子标志及临床治疗的分子靶标。
背景技术
随着社会的发展，人们生活环境及饮食习惯等的变迁，恶性肿瘤已经成为人类健康的头号杀手之一，近年来在全球范围内患病人数不断增加，为全球经济和人类社会的发展带来了沉重的负担。
恶性肿瘤的发生发展是多步骤并伴随多基因遗传或表观遗传发生变化的过程。鉴定致瘤性的遗传异常是肿瘤研究的一个重要目标，能够为肿瘤治疗提供潜在的靶点。其中值得注意的是，染色体重排导致两基因的融合，作为一种新的突变形式在肿瘤发病过程中起着关键作用，它的发现扩展了肿瘤基因的范畴。
融合基因作为肿瘤基因新类型，其促进肿瘤发生和恶性转化主要通过两种方式：第一，一个基因的启动子或/和增强子元件等由于染色体重排异常地跟一个原癌基因紧靠在一起，驱使癌基因的异常表达，例如B细胞肿瘤IG-MYC、T细胞肿瘤TCR-MYC导致癌基因MYC活化；第二，两基因融合产生有新功能的融合蛋白，例如BCR-ABL1。然而，超过80％的已知融合基因存在于仅占人类肿瘤的10％的白血病、淋巴瘤、骨及软组织肉瘤中，而在较为常见上皮性实体瘤却只发现10％融合基因。
近年来随着分析及检测方法的进步，肿瘤学家分别在50％前列腺癌和1-5％肺癌(5-10％非小细胞肺癌)发现新的融合基因TMPRSS2-ERG，EML4-ALK，并进一步阐明它们的致癌机制，为前列腺癌和肺癌的分型诊断和靶向治疗奠定基础。可见染色体重排导致两基因融合同样可以是上皮性实体瘤的癌变机制之一。融合基因因其在肿瘤细胞特异性表达，可作为理想的治疗靶点，例如针对CML的融合基因BCR-ABL设计的分子靶向药物imatinib/Gleevec已经在临床得到应用，同样地临床前及临床1期、2期数据表明ALK激酶抑制剂对治疗EML4-ALK阳性病人有效，因此癌症的融合基因的研究已经日益成为热点。
BCL6基因位于3号染色体长臂3q27，以转录本NM_001706为例。其转录的mRNA包含9个外显子，编码706个氨基酸。BCL6与多种淋巴肿瘤相关，并且在淋巴肿瘤中存在多种融合基因，但是不存在BCL6-SPECC1L的存在。
SPECC1L基因位于22号染色体长臂22q11，以转录本NM_001145468为例，其转录mRNA包含16个外显子，编码1117个氨基酸。该基因与细胞骨架相关，与肿瘤相关报道较少。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记，所述分子标记为肿瘤的诊断及临床治疗提供了新的分子靶标。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记，其特征在于，所述分子标志为融合基因BCL6-SPECC1L，所述融合基因同时包含基因BCL6和基因SPECC1L的部分序列。
优选的，所述融合基因BCL6-SPECC1L至少包含如下序列：
BCL6部分：
ATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGATGTTCTTCTCAACCTTAATCGTCTCCGGAGTCGAGACATCTTGACTGATGTTGTCATTGTTGTGAGCCGTGAGCAGTTTAGAGCCCATAAAACGGTCCTCATGGCCTGCAGT；
SPECC1L部分：
GTGTTCTTGGGGAAGATCCCGACTAAGCCATTTTCCAGTGGCACCTCTTCCATCATGAGTTCCTGA。
优选的，所述融合基因BCL6-SPECC1L的融合形式为BCL6exon 7/9：SPECC1L exon2/17(5’-BCL6exon7-SPECC1Lexon2-3’)。
优选的，所述制剂中含有可检测权利要求1～3任意一项所述的分子标志或其表达产物的试剂。
优选的，所述肿瘤选自头颈部肿瘤。
优选的，所述肿瘤选自鼻咽癌、喉癌或口腔部鳞癌。
优选的，所述生物制剂下调融合基因BCL6-SPECC1L在肿瘤细胞中的表达量或使融合基因BCL6-SPECC1L融合蛋白不表达。
优选的，所述生物制剂含有融合基因BCL6-SPECC1L的siRNA或融合基因BCL6-SPECC1L的抗体。
优选的，所述抗体为融合基因BCL6-SPECC1L的蛋白特异性兔多克隆抗体。
优选的，所述抗体的氨基酸序列为：VFLGKIPKPFSSGTSSIMSS。
本发明的有益效果在于，本发明所述分子标记有助于肿瘤的早期诊断以及治疗，提高筛查效率，降低筛查成本，为个体化治疗提供方向，改善病人的存活率和生存质量；本发明所述诊断制剂，通过检测融合基因的表达情况，可以对肿瘤进行早期筛查，有助于肿瘤的早期介入和预防。
附图说明
图1为利用RNA-seq发现鼻咽癌存在新的融合基因BCL6-SPECC1L，1A为转录组测序发现融合基因及跨融合断裂位点序列，1B为运用sanger测序方法鉴定转录组和基因组融合位点，1C为预测断裂基因组断裂方式，1D为预测蛋白转录融合方式；
图2为鉴定出融合基因BCL6-SPECC1L的mRNA全长，并预测出蛋白序列，并设计出特异性抗体，2A为阳性样品cDNA进行PCR验证融合基因胶图，2B为阳性样品基因组DNA进行融合基因验证胶图，2C&2D为预测转录本和蛋白编码序列，2E为设计特异性针对特异表位的抗体anti-BS与阳性对照抗体对比图；
图3为过表达融合基因BCL6-SPECC1L和BCL6发现融合基因丢失BCL6的抑癌作用，3A为融合基因BCL6-SPECC1L失去BCL6在HNE1中对增殖的抑制作用，3B为融合基因定位发生核浆的改变，3C为融合基因失去对含有BCL6结合位点luciferase的抑制作用。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1融合基因BCL6-SPECC1L的发现
本申请发明人采用paired-end RNA-seq方法对10例鼻咽癌组织RNA进行全转录组分析。经过强大计算机集群对测序的海量数据进行预处理后，利用融合基因检测流程，在测序样品271中发现新融合基因BCL6-SPECC1L，具体实验步骤如下：
1)收集新鲜10例鼻咽癌组织组织，置于RNA later溶液中，4℃浸泡过夜后，在-80℃长期储存；
2)利用OMEGA生物制剂公司的E.Z.N.A.total DNA/RNA分离试剂盒(R6731-02，200次)提取及纯化组织的总RNA和DNA；
具体步骤如下：
(1)研磨组织：
a)洗净所用的研钵和研杵，然后浸泡在医用消毒液中过夜(约12个小时左右)，次日用清水冲洗干净后擦干，用锡箔纸包裹好研钵和研杵，放入烤箱中用180℃烘烤3个小时备用。(用锡箔纸包裹是防止研钵和研杵在烘烤过后使用前，有异物或RNA酶污染。)从-80℃冰箱取出所需的组织，放入研钵中，加入液氮冷冻组织后将组织研磨成粉末，标记好组织编号。此步骤需注意：先研磨非癌组织，再研磨肿瘤组织，尽量避免交叉污染；
b)每20-30mg的组织加入700μl的GTC Lysis Buffer，收集入1.5ml EP管中，用10ml的一次性注射器反复抽打，使组织更好的裂解；
c)13000×g室温离心5min，将上清移至已经插入2ml收集管的HiBindTMDNA Column中，离心一分钟，13000×g/min；
d)将收集管里的液体分别移到1.5ml的EP管中，此步骤之后DNA和RNA就分开提取。
(2)RNA提取：
a)加入与1.5ml EP管中等体积的70％的乙醇(约350μl)，此时可看到白色沉淀，上下颠倒几次后用震荡器剧烈震荡15sec以上；
b)将液体转移至HiBindTM RNA分离柱中，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；
c)向HiBindTM RNA分离柱中加入500μl RNAWash BufferⅠ，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；
d)向HiBindTM RNA分离柱中加入500μl RNAWash BufferⅡ，≥10000×g离心1min，弃掉收集管中离心出来的液体；
e)重复第d)的步骤；
f)将空的HiBindTM RNA分离柱，离心，≥10000×g，2min；
g)丢掉上一步所用的收集管，将HiBindTM RNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向HiBindTM RNA分离柱中心滴加40μl的DEPC水，室温孵育3min后离心，≥10000×g，2min。离心下来的为RNA，分装后放入-80℃中保存。
(3)DNA提取：
a)将HiBindTM DNA分离柱插入新的2ml的收集管中；
b)向HiBindTM DNA分离柱中加入500μl的HB Buffer，离心，≥10000×g，1min；弃去收集管里的液体；
c)向HiBindTM DNA分离柱中加入700μl DNAWash Buffer，离心，≥10000×g，1min；弃去收集管里的液体；
d)将空的HiBindTM DNA分离柱中离心，≥10000×g，2min；
e)将HiBindTM DNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向每个HiBindTM DNA分离柱中心滴加60μl Elution Buffer。室温孵育3min后离心，≥10000×g，2min。提取的DNA分装后放在-80℃保存。
3)将纯化好的总RNA干冰运送到深圳华大基因公司，利用agilent 2100检测，质检合格后进行测序文库的构建与测序：
(1)总RNA用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；
(2)加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段；
(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链；
(4)经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头；
(5)琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，约200bp，进行PCR扩增；
(6)在Illumina HiSeqTM 2000平台进行paird-end测序；
4)利用生物信息分析方法，对测序数据进行处理，利用一套成熟的流程检测样品中的融合基因，并发现融合基因BCL6-SPECC1L，见图1A。
实施例2鼻咽癌新融合基因BCL6-SPECC1L的鉴定
根据RNA-seq reads比对结果，本发明的发明人在RNA融合位点两端设计引物，联用PCR扩增以及sanger测序在测序样品271中验证BCL6-SPECC1L的存在，引物序列：
BCL6-SPECC1L-RT-sense：
5’-ATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTA-3’；
BCL6-SPECC1L-RT-antisense：
5’-TCAGGAACTCATGATGGAAGAGGTG-3’。
实验步骤如下：
1)RNA逆转录cDNA
使用Invitrigen公司的M-MLV逆转录试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA.C28025-032)，按说明书用Oligo(dT)为逆转录引物，取1μg总RNA进行逆转录，逆转录体系共20μl冰上操作，配置体系如下：
共10μl体系，在PCR仪中完成变性过程，65℃5min，4℃至少1min；取出反应体系立即置于冰上，立即配置如下反应体系：
加入标记好的EP管中各10μl，在PCR仪中完成如下步骤：
37℃50min；70℃终止反应15min；4℃forever将上述逆转录好的cDNA分装保存-20℃备用。
2)PCR扩增
使用TaKaRa公司TaqTM Hot Start Version，按说明书使用BCL6-SPECC1L检测引物，配置50μl PCR体系如下：
在PCR热循环仪上完成PCR过程：预变性95℃5min变性95℃30sec退火60℃30sec延伸72℃1min 72℃10min 4℃forever循环数：45cycles；
3)取5μl PCR产物跑琼脂糖电泳鉴定特异性扩增，结果见图2A；
4)剩下PCR产物送去Invitrogen公司，在3500遗传分析仪平台进行sanger测序，测序鉴定见图1B上；
5)对测序结果进行比对分析，证实新融合基因BCL6-SPECC1L存在。
实施例3基因组融合位点的鉴定
为了进一步证明BCL6与SPECC1L间的融合是由于染色体重排产生的，利用TaKaRa公司的TaKaRa LA
Hot Start Version，以基因组DNA为模板，使用同一对引物进行long Range PCR扩增，对扩增产物进行sanger测序，鉴定基因组融合位点，实验步骤如下：
设计基因组引物：BS-genomic-f：CAGCGAGAGCCACTCACCACTCTAC；BS-genomic-r：GATTTAAAATTGGCTCTACCCCACC。
1)配置50μl PCR反应体系：
2)PCR扩增：
95℃5min 95℃30sec 58℃30sec 72℃5min 10cycles 5min+10sec/cycle35cycles 72℃10min 4℃forever；
3)取5μl PCR产物跑琼脂糖电泳，明确扩增出特异条带；
4)剩下PCR产物送到Invitrogen公司，在3500遗传分析仪平台进行sanger测序分析；
5)测序结果进行比对分析，明确基因组融合位点。
从图1B的下图可知，琼脂糖电泳结果显示以测序样品271的DNA为模板，利用longrange PCR特异地扩增出约4.5kb的片段，见图2B，测序结果证实BCL6与SPECC1L间的融合发生在DNA水平(测序鉴定见图1B下)，具体基因组融合序列为：AAATTTGCATGGCATTAAAGATGTTCCTATTCTGATCATTGTT，融合位点为chr3:187446134-chr22:24669692(hg19)。
6)预测融合形式及全长序列
通过转录组基因组融合位点的鉴定，预测染色体融合形式如图1C。预测mRNA融合形式见图1D上，编码蛋白RNA序列见图2C；预测蛋白结构域融合形式见图1D下，具体序列见图2D。
实施例4融合基因及野生型基因功能研究
通过功能性实验，发明人认为BCL6-SPECC1L融合基因可通过破坏BCL6抑癌基因的功能从而促进肿瘤进展
(1)引物设计与合成(Invitrogen公司)
BCL6-SPECC1L-full length-sense：
5’-CGGGATCCCAGCGAGAGCCACTCACCACTCTAC-3’；
BCL6-SPECC1L-full length-antisense：
5’-CGGAATTCGATTTAAAATTGGCTCTACCCCACC-3’；
(2)PCR扩增
采用Takara公司的primer start高保真DNA聚合酶，模板是包含该融合方式的鼻咽癌标本cDNA，反应体系如下：
(3)琼脂糖电泳以及胶回收
配置1％琼脂糖胶；
1g琼脂糖粉；
100ml 1XTAE电泳缓冲液；
胶回收用的是天根公司的胶回收试剂盒(DP209)，并按照说明书操作。
(4)胶回收的PCR以及pCDNA3.1(+)空载体酶切
50μl酶切体系配置：
37℃孵育30min以上；
(5)琼脂糖电泳及胶回收，步骤同上，其中回收产物用20μl ddH2O洗脱，空载用50μl ddH2O洗脱。
(6)连接
15μl连接体系
16℃连接30min以上。
(7)连接产物转化
根据天根公司的DH5α感受态细胞(CB101)转化步骤进行。
(8)挑单克隆
10μl枪头挑至少2个菌落至含100ng/ml氨苄抗生素的LB培养基，37℃摇床培养12-20h。
(9)小提质粒
按照天根公司小提质粒的试剂盒说明书的步骤进行。
(10)酶切鉴定
酶切体系同上。
(11)琼脂糖电泳，目的片段大小判断；
(12)鉴定正确的质粒送测序，鉴定没有突变；
(13)质粒大量提纯：
测序鉴定没有突变的质粒，需要经行质粒的大量提取，本发明人所在实验室采用氯化铯密度梯度离心法。
(14)磷酸钙转染和磷酸钙包装逆转录病毒
a)提前一天铺293FT细胞,因为细胞贴壁不牢，培养皿需要用明胶预先处理：在10cm培养板中加2-3ml 0.1％的明胶覆盖培养皿底部在37度放置至少15min；
b)消化293FT细胞，吸走培养皿中的明胶，10cm培养皿铺1-1.2x106细胞数，放培养箱内培养
c)24h后，待细胞密度达40％左右时，进行磷酸钙转染：
加反应体系：
I.目的质粒稀释至1ug/ul，病毒包装质粒PIK也稀释至1ug/ul；
II.取1.5ml离心管，每管加20-25ul目的质粒，然后加等量PIK；
III.加100ul超纯水；
IV.加50ul 1M的CaCl2；
V.加200ul HBS(PH＝6.75)，缓慢逐滴加入，混匀。
d)EP管在室温下静置15-30min；
e)将待转染的293FT细胞取出，吸走部分培养基，是剩下的培养基4-5ml；
f)将待转染的质粒(DNA-磷酸钙沉淀)均匀滴入转染细胞培养皿，轻轻摇动使混匀；
g)每培养皿中加40ul氯喹(终浓度25uM)，轻轻混匀；
h)37度，5％CO2培养箱中培养6小时；
i)6小时候后，从培养箱中取出细胞，小心吸去培养基；
j)用1x的solution A洗细胞两次，轻轻摇晃，至沉淀全部溶解；
k)培养皿加入含10％FBS的新鲜培养基6.5ml在37度，5％CO2培养箱中培养。
(15)病毒收集和细胞感染
a)18小时后，开始收集病毒，每4小时收集一次，用注射器吸取培养皿上清，0.45um过滤器进行过滤。病毒液可以直接用于感染细胞；
b)病毒液也可以保存于病毒冻存管中，-80度保存。
2×HBS(PH＝6.75)：
50mmol/L HEPES，
130mmol/L NaCl，
1.5mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4
调PH＝6.75
过滤后分装4度保存
1mol/L CaCl2：111g CaCl2溶于900ml水中，搅拌溶解，定容至1000ml，过滤。
(16)建立稳定细胞株
病毒2天内感染3次后，加入含抗生素puromycin(1ug/ml)培养基培养5天,注意每隔两天换液，待细胞生长正常后收取蛋白和RNA用于鉴定。
(17)MTT assay
a)消化细胞并计数；
b)取200μl细胞悬液含2000cell加入96孔板内，每组设6个平行的复孔，连续测6天；
c)5％CO2、37℃培养；
d)实验中止前4h加入5mg/ml MTT液20μl，继续培养4h；
e)弃去培养液，每孔加入200μl DMSO，37℃10分钟，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测490nm波长下每孔的OD值；
f)待6天检测完后，利用每天的OD值做生长曲线。见图3A可以看出融合基因失去了BCL6在鼻咽癌细胞株中HNE1的抑制增殖的功能。
(18)免疫荧光实验
a)在24孔板中放入经消毒的盖薄片
b)消化细胞，每孔接种的细胞数为5*104
c)24小时后，弃去培养基，PBS洗，5min*2次(摇床快洗)
d)4％多聚甲醛固定10min,PBS洗，5min*2次(摇床快洗)
e)5％BSA室温封闭20分钟
f)用PBST(T为Triton X-100，配置PBST的浓度为0.1％)冰上破膜10min
g)然后用5％BSA稀释一抗anti-flag(1:100)，4℃过夜。
h)PBST(T为吐温)(洗液的PBST中T均为吐温)洗，5min*5次
i)用PBS稀释荧光二抗anti-mouse(1:1000)，室温45min(避光)
j)PBST(T为吐温)洗，5min*5次(避光)
k)DAPI孵育，室温5min，PBST(T为吐温)洗，5min*1次(避光)
l)antifade(抗淬灭剂)封片，荧光显微镜或荧光共聚焦下观察拍照，结果见图3B，发现融合基因为细胞浆定位，而BCL6定位与细胞核，说明融合基因发生了核浆定位改变从而失去了BCL6在细胞核中影响基因表达的转录因子功能。
(19)荧光素酶报告基因实验
a)消化293T细胞成单个，计数，24孔板，1*105个/well；
b)24h后，用lipo3000转染质粒进入293T细胞中；
c)培养24h后，吸去培养基，用PBS洗弃一次；
d)每孔加入100ul细胞裂解液PLB，室温裂解摇15min，然后转入EP管中；
e)然后放在荧光发光仪上，分别加入LAR2和STOP&Glo来检测萤光虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性；
f)最后见过见图3C，发现融合基因与BCL6的DNA结合功能域缺失突变体BCL61-513一样，失去了对BCL6-reporter的抑制功能。
(20)特异性抗体的制备
根据融合基因BCL6-SPECC1L会特异性表达蛋白序列VFLGKIPTKPFSSGTSSIMSS，并且该序列并没有在人类蛋白组上有同源序列，因此根据该特异性序列与艾比玛特生物医药(上海)有限公司合作，针对该多肽设计兔多克隆抗体，得到多克隆抗体anti-BS，然后通过WB实验，见图2E，验证发现该抗体能特异结合融合基因BCL6-SPECC1L。说明该抗体具有靶向特异性检测与靶向治疗的潜力。
实施例5BCL6-SPECC1L在多种上皮肿瘤的临床标本上表达
进一步验证BCL6-SPECC1L是否为鼻咽癌特异性的融合基因，本发明人采用PCR扩增和sanger法测序联用的方法，在47例头颈鳞癌、143例食管癌以及206例鼻咽癌临床标本检测BCL6-SPECC1L的表达。结果显示：头颈鳞癌和食管癌发现1例标本表达该融合基因，证实BCL6-SPECC1L并不是鼻咽癌特异性的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种用于诊断鼻咽癌肿瘤的分子标志 ，其特征在于，所述分子标志为融合基因BCL6-SPECC1L，所述融合基因同时是由基因BCL6的部分序列和基因SPECC1L的部分序列构成；其中，基因BCL6的部分序列为：
ATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGATGTTCTTCTCAACCTTAATCGTCTCCGGAGTCGAGACATCTTGACTGATGTTGTCATTGTTGTGAGCCGTGAGCAGTTTAGAGCCCATAAAACGGTCCTCATGGCCTGCAGT；
基因SPECC1L的部分序列为：
GTGTTCTTGGGGAAGATCCCGACTAAGCCATTTTCCAGTGGCACCTCTTCCATCATGAGTTCCTGA；
所述融合基因BCL6-SPECC1L的融合形式为BCL6exon 7：SPECC1L exon 2。
2.一种诊断制剂，所述的诊断制剂用于肿瘤临床病理特征，其特征在于，所述制剂中含有可检测权利要求1所述的分子标志或其表达产物的试剂。
3.如权利要求2所述的诊断制剂，其特征在于，所述肿瘤选自鼻咽癌、食管癌或头颈鳞癌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611201582.5A CN106755409B (zh) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | 一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611201582.5A CN106755409B (zh) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | 一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106755409A CN106755409A (zh) | 2017-05-31 |
| CN106755409B true CN106755409B (zh) | 2020-10-20 |
Family
ID=58897353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611201582.5A Active CN106755409B (zh) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | 一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106755409B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021102283A1 (en) * | 2019-11-21 | 2021-05-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Chemically inducible polypeptide polymerization |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104975071A (zh) * | 2014-04-02 | 2015-10-14 | 中山大学附属肿瘤医院 | 用于肿瘤诊断和治疗的分子标记 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140315199A1 (en) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Life Technologies Corporation | Gene fusions and gene variants associated with cancer |
-
2016
- 2016-12-22 CN CN201611201582.5A patent/CN106755409B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104975071A (zh) * | 2014-04-02 | 2015-10-14 | 中山大学附属肿瘤医院 | 用于肿瘤诊断和治疗的分子标记 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Design of antisense oligonucleotides and short interfering RNA duplexes (siRNA) targeted to BCL6 mRNA: towards rational drug development for specific lymphoma subsets;Kalota A等;《Blood cells， molecules & diseases》;20070127;第38卷(第3期);正文第199页第1-2段 介绍，表2，第201页第4段 蛋白质印迹 * |
| ESRRA-C11orf20 Is a Recurrent Gene Fusion in Serous;Julia Salzman;《PLOS BIOLOGY》;20110930;第9卷(第9期);e1001156 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106755409A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108251423B (zh) | CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用 | |
| CN111778338B (zh) | 一种环状rna生物标志物的应用 | |
| WO2019206341A1 (zh) | 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用 | |
| CN109678967B (zh) | 一种用于治疗骨肉瘤的靶向多肽及其应用 | |
| CN108841955B (zh) | C22orf41作为胰腺癌肿瘤标记物的应用 | |
| CN106755409B (zh) | 一种用于诊断和治疗上皮肿瘤的分子标记 | |
| CN105586391B (zh) | 人gtpbp4基因的用途及其相关药物 | |
| CN106978418B (zh) | 人PYCR1基因的shRNA干扰序列及其应用 | |
| CN110960677B (zh) | Sage1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途 | |
| CN110317878B (zh) | 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用 | |
| CN110974963B (zh) | 用于调节sage1-ints3复合物表达和/或功能的物质的用途 | |
| CN113528528B (zh) | 一种促进耐伊马替尼慢性髓细胞白血病细胞K562/G01凋亡shRNA及其应用 | |
| CN113265463B (zh) | Fam84b在制备食管鳞癌预后评估试剂以及在靶向治疗食管鳞癌药物的筛选中的应用 | |
| CN110117585B (zh) | 一种细菌RNase E截短体及其应用 | |
| CN112458089B (zh) | 一种长链非编码基因及其相关生物材料与应用 | |
| US20140275219A1 (en) | Uses of the human zfx gene and drugs associated with same | |
| CN112481261B (zh) | 一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用 | |
| CN111621569B (zh) | Cenpk基因在胃癌诊断与治疗中的应用 | |
| CN113248619A (zh) | 一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体 | |
| CN110684846A (zh) | 人ptp4a3基因的用途及其相关药物 | |
| CN111454944B (zh) | 一种分离的rna及其dna模板的合成方法 | |
| CN111593124B (zh) | Ugt3a2基因及其编码的蛋白在上消化道肿瘤辅助诊断中的应用 | |
| CN108342389A (zh) | Plekho1基因的用途及其相关药物 | |
| CN112980956B (zh) | 抑制肺癌生长的靶标与诊断标志物uc.336及其应用 | |
| CN111228292B (zh) | 人tpt1/tctp基因在制备抗肿瘤药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |