CN110684846A - 人ptp4a3基因的用途及其相关药物 - Google Patents

人ptp4a3基因的用途及其相关药物 Download PDF

Info

Publication number
CN110684846A
CN110684846A CN201910943415.5A CN201910943415A CN110684846A CN 110684846 A CN110684846 A CN 110684846A CN 201910943415 A CN201910943415 A CN 201910943415A CN 110684846 A CN110684846 A CN 110684846A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ptp4a3
gene
human
nucleic acid
plko
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910943415.5A
Other languages
English (en)
Inventor
朱向莹
孙琴
谭畅
张晓慧
金杨晟
瞿红花
曹跃琼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Original Assignee
SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI GENECHEM CO Ltd filed Critical SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Priority to CN201910943415.5A priority Critical patent/CN110684846A/zh
Publication of CN110684846A publication Critical patent/CN110684846A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了人PTP4A3基因的用途及其相关药物。本发明公开了人PTP4A3基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人PTP4A3基因小分子干扰RNA、人PTP4A3基因干扰核酸构建体、人PTP4A3基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人PTP4A3基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PTP4A3基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人PTP4A3基因的用途及其相关药物
本申请是原申请的分案申请，原申请的申请日为：2014-03-19；申请号为：201410103464.5；发明创造名称为：人PTP4A3基因的用途及其相关药物。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人PTP4A3基因的用途及其相关药物。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA 能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(Tuschl T,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to23 nucleotide intervals.Cell 2000；101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来， RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005；579:5996-6007.)。
PTP4A3/PRL-3是与肿瘤转移相关的磷酸酶。最早是Saha等通过SAGE技术发现其在结肠癌的肝转移病人中唯一存在持续高表达的基因[Saha,S.；Bardelli,A.；Buckhaults,P.； Velculescu,V.E.；Rago,C.,St.；Croix,B.；Romans,K.E.；Choti,M.A,Lengauer,C.；Kinzler,K.W.； Vogelstein,B.A Phosphatase Associated with Metastasis ofColorectal Cancer.Science 2001,294, 1343–1346.Sager,J.；Benvenuti,S.；Bardelli,A.PRL-3:a phosphatase for metastasis Cancer Biol. Ther.2004,3,952–953.ReuvenReich,Shany Hadar；Ben Davidson.Expression and Clinical Role of Protein ofRegenerating Liver(PRL)Phosphatases in Ovarian Carcinoma.Int.J.Mol.Sci. 2011,12,1133-1145]。此外，PRL-3的高表达与其他的肿瘤的转移具有相关性，如在胃癌病人的肝转移中发现PRL-3的上调[Xing X,Lian S,Hu Y,Li Z,Zhang L,Wen X,Du H,Jia Y, ZhengZ,Meng L,Shou C,Ji J.Phosphatase of regenerating liver-3(PRL-3)is associatedwith metastasis and poor prognosis in gastric carcinoma.Journal ofTranslational Medicine 2013, 11:309]，肝癌组织样本的基因表达图谱显示PRL-3高表达[Abudureheman Mayinuer,MD1, Mahmut Yasen.Upregulation of Protein TyrosinePhosphatase Type IVA Member 3(PTP4A3/PRL-3)is Associated with TumorDifferentiation and a Poor Prognosis in Human Hepatocellular Carcinoma.AnnSurg Oncol.2013 January,20(1):305–317]，在侵入性结肠癌和乳腺癌肿瘤血管中检测到[PRL-3 St Croix B,Rago C,Velculescu V,Traverso G,Romans KE, Montgomery E,LalA,Riggins GJ,Lengauer C,Vogelstein B,Kinzler KW.Genes expressed in humantumor endothelium.Science.2000 Aug 18；289(5482):1197-202]。
也有报道证实PRL-3促进小鼠黑色素瘤细胞的入侵与转移[Wu X,Zeng H,ZhangX,Zhao Y, Sha H,Ge X,Zhang M,Gao X,Xu Q.Phosphatase of regenerating liver-3promotes motility and metastasis of mouse melanoma cells.Am J Pathol.2004Jun；164(6):2039-54]。因此PRL-3的蛋白结构、功能及其与肿瘤相关性也成了今年来研究的热点。
PRL-3位于染色体8q24.3，相对分子质量约为22KD，与PRL-1，PRL-2同属于蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs(Protein Tyrosine Phosphatases)。PRLs共同拥有氨基末端的PTP催化活性结构域和羧基末端的异戊二烯化修饰位点CAAX序列，其中PTP结构域是PRLs 的酶活性区域，包含CX5R活性序列和参与磷酸转移的WPD环；羧基端CAAX序列的异戊二烯化修饰与PRLs蛋白的细胞内定位有关[Li WJ,Xing XF,Qu LK,Meng L,Shou CC. Construction andexpression of PRL-3 plasmid with C104S point mutation and CAAX deletion.Beijing Da Xue Xue Bao.2009 Oct 18；41(5):516-20]。PRLs以异戊烯化依赖方式存在于浆膜和内体(endosome)结构，这一生物化学特征提示它们在细胞信号传递中发挥作用[Peng L,Li Y， Meng L et al.Preparation and characterization of monoclonalantibody against protein tyrosine phosphatase PRL-3.Hybrid Hybridomies 2004；23(l):23-27]。PRL-3有29％的氨基酸序列与酵母Sc.serevisiaeCdc 14P相同，而后者与细胞周期调节相关并在细胞核分裂中具有重要的作用[Waterhouse PM,Wang MB,LoughT.Gene silencing as an adaptive defence against viruses.Nature.2001 Jun 14；411(6839):834-42]。
目前关于PRL-3的研究侧重于它在肿瘤转移方面的作用。PRL-3表达的细胞促进细胞的运动能力，转移与侵袭能力增强。PRL-3可以调节肿瘤细胞与细胞外基质的粘附[Wu X,Zeng H,Zhang X,Zhao Y,Sha H,Ge X,Zhang M,Gao X,Xu Q.Phosphatase ofregenerating liver-3promotes motility and metastasis of mouse melanomacells.Am J Pathol.2004 Jun；164(6): 2039-54.]，还有研究表明PRL-3可以阻止AngII的调节蛋白P130 Cas磷酸化，从而阻止由 AngII诱导的胞内钙动员[Matter WF,Estridge T,Zhang C。Role of PRL-3,a human muscle-specific tyrosine phosphatase,inangiotensin-II signaling.Biochem Biophys Res Commun. 2001 May 25；283(5):1061-8]。
PRL-3相关的信号通路有PRL-3可以下调整合素酪氨酸磷酸化水平和上调Erk1/2的磷酸化水平。因为整合素介导的细胞黏附可以激活包括Erk1/2、c-jun激酶和p38的有丝分裂原激活蛋白酶(miogen-activated protein kinase,MAPK)家族,因此推断PRL-3可能通过影响MAPK信号转导通路而在侵袭和转移发挥作用。有报道TGFβ信号通路的缺失足以激活 PRL-3介导的细胞存活通路，促进细胞的入侵与转移能力[Jiang Y,Liu XQ,Rajput A,Geng L, Ongchin M,Zeng Q,Taylor GS,Wang J.Phosphatase PRL-3 is a directregulatory target of TGFbeta in colon cancer metastasis.Cancer Res.2011 Jan1；71(1):234-44]。同时，PRL-3能诱导EMT现象,有报道PRL-3的表达下调E-cadherin，γ-catenin和integrinβ3等分子的表达。[Wang H,Quah SY,Dong JM,Manser E,Tang JP,ZengQ.PRL-3 down-regulates PTEN expression and signals through PI3K to promoteepithelial-mesenchymal transition.Cancer Res. 2007Apr 1；67(7):2922-6.Liu Y,Zhou J,Chen J,Gao W,Le Y,Ding Y,Li J.PRL-3 promotes epithelial mesenchymaltransition by regulating cadherin directly.Cancer Biol Ther.2009 Jul；8(14):1352-9.Lai W,Liu L,Zeng Y,Wu H,Xu H,Chen S,Chu Z.KCNN4 channels participatein the EMT induced by PRL-3 in colorectal cancer.Med Oncol.2013；30(2):566]。Fiordalisi等[Fiordalisi JJ,Keller PJ&Cox AD.PRL tyrosine phosphatasesregulate the family GTPases to promote invasion and motility.Cancer Res 2006；66:3153-3161]发现在结肠肿瘤细胞 SW480中,表达了PRL-3的同时,有活性的RhoA和RhoC蛋白表达量增长了4-7倍,通过对Rho激酶的重要效应器的药理抑制,PRL-3介导的细胞活力和基质的侵袭力下降。总的来看，PRL-3参与的信号集中在PI-3MAKT信号通路、整合素相关信号途径及Rho家族信号途径，目前获得证实的相互作用蛋白或底物有3个，它们分别为ezrin[Forte E，Orsatti L, Talamo F,Barbato G,De Francesco R&Tomei L.Ezrin is aspecific and direct target of protein tyrosine phosphatase PR-3.BiochimBiophys Acta 2008；1783:334-344]、整合素α1[Peng L,Jin G, Wang L，Guo J，Meng L&Shou C.Identification of integrin alphal as aninteracting protein of proteintyrosine phosphatase PRL-3.Biochem Biophys,Res Commun2006；342:179-183]及CDH22。
PRL-3与肿瘤转移的相关研究已经取得一定的成果，但其分子机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于公开与人PTP4A3基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰(RNAi) 为手段研究PTP4A3基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。
本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了PTP4A3基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制PTP4A3基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PTP4A3 蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
所述的肿瘤选自其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤，较佳的，所述肿瘤为一种恶性肿瘤：肺癌。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低PTP4A3基因的转录或翻译，或者足够降低PTP4A3蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述PTP4A3基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
进一步的，所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有PTP4A3基因的启动子序列或PTP4A3 基因的信息序列。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与 PTP4A3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人PTP4A3基因的表达。
进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与PTP4A3基因中的靶序列基本相同。较优的，所述PTP4A3基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-13中之任一序列。
所述PTP4A3基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默PTP4A3基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的PTP4A3基因中的片段。
较佳的，所述PTP4A3基因来源于人。
本发明第一方面还公开了一种分离的人PTP4A3基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
进一步的，所述的肿瘤选自其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤，较佳的，所述肿瘤为一种恶性肿瘤：肺癌。
所述将分离的人PTP4A3基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人PTP4A3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人PTP4A3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
所述将人PTP4A3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将人PTP4A3基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内人PTP4A3基因的表达水平。
所述将人PTP4A3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将人PTP4A3基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人PTP4A3基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的人PTP4A3基因小分子干扰RNA即是以人PTP4A3基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将PTP4A3 基因及其蛋白作为作用对象。
所述将人PTP4A3基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人PTP4A3基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
通过免疫组织化学的方法检测PTP4A3基因在肿瘤组织、正常组织和肿瘤周围正常组织中的表达水平。研究发现：PTP4A3基因在肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织和肿瘤周围正常组织。提示PTP4A3基因可能作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用； PTP4A3基因的表达水平可能成为肿瘤诊断的标志。
所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制PTP4A3基因的转录或翻译，或能够特异性抑制 PTP4A3蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中PTP4A3基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过分离的PTP4A3基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人PTP4A3基因的转录或翻译，或者足够降低人 PTP4A3蛋白的表达或活性的剂量。以使人PTP4A3基因的表达至少被降低50％、80％、90％、 95％或99％。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人PTP4A3基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人PTP4A3基因表达水平的物质给药于患者。
本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中PTP4A3基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与PTP4A3基因杂交的核苷酸序列；或者
b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与PTP4A3基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PTP4A3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与PTP4A3基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与PTP4A3基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PTP4A3基因中的靶序列基本相同。
所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：25所示，具体为:GCUCACCUACCUGGAGAAA。
SEQ ID NO：25所示的siRNA为以SEQ ID NO:2所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人PTP4A3基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源PTP4A3基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PTP4A3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源PTP4A3基因表达的作用。
更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PTP4A3基因中的靶序列基本相同。
较佳的，所述正义链片段与PTP4A3基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与PTP4A3基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列选自以下任一：UCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以UUCAAGAGA 为茎环。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:26所示，具体为：5’-GCUCACCUACCUGGAGAAA UUCAAGAGAUUUCUCCAGGUAGGTGAGC-3’。
shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人PTP4A3 基因表达的作用。
编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO:1-13中之任一序列及其互补序列。
所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与PTP4A3基因中的靶序列基本相同，所述PTP4A3基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默PTP4A3基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的PTP4A3基因中的片段。
较佳的，所述PTP4A3基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-13之任一序列。
进一步的，所述PTP4A3基因来源于人。
本发明第三方面，公开了一种人PTP4A3基因干扰核酸构建体，包含编码本发明所述分离的人PTP4A3基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达所述人PTP4A3基因小分子干扰RNA。
所述的人PTP4A3基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PTP4A3基因小分子干扰 RNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体为人PTP4A3基因干扰慢病毒载体。
本发明的PTP4A3基因干扰慢病毒载体是将编码所述人PTP4A3基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，PTP4A3基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述人PTP4A3基因小分子干扰RNA，用于特异性沉默PTP4A3基因的表达。
进一步的，所述PTP4A3基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人PTP4A3基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA。
本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤，较佳的，所述肿瘤为一种恶性肿瘤：肺癌。
本发明的PTP4A3基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。PTP4A3基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述PTP4A3基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第四方面，公开了一种人PTP4A3基因干扰慢病毒，由前述人PTP4A3基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对人PTP4A3基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。该PTP4A3基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。所述的肿瘤选自其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤，较佳的，所述肿瘤为一种恶性肿瘤：肺癌。
本发明第五方面，还公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，PTP4A3基因干扰核酸构建体或PTP4A3基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。
进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％如前所述的双链RNA、shRNA、PTP4A3基因干扰核酸构建体或PTP4A3基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤治疗药物中的应用。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤选自其肿瘤细胞的增殖与人PTP4A3基因的表达相关的任一种肿瘤。较佳的，所述肿瘤为一种恶性肿瘤：肺癌。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的PTP4A3基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，PTP4A3基因干扰核酸构建体，和/或所述的PTP4A3基因干扰慢病毒。
综上所述，本发明设计了针对人PTP4A3基因的13个RNAi靶点序列，构建相应的PTP4A3 RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：3的RNAi载体pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA 能够显著下调PTP4A3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA能够靶向地将针对PTP4A3基因的RNAi序列高效导入人肺癌H1299细胞，降低PTP4A3基因的表达水平，显著抑制肺癌H1299细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的PTP4A3基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人 PTP4A3基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PTP4A3 基因的表达，促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱
图2表示PTP4A3-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，PTP4A3 mRNA的表达水平显著降低
图3表示PTP4A3-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制
图4为克隆形成实验检测人肺癌H1299细胞感染PTP4A3-RNAi慢病毒后克隆形成能力结果示意图
图5为TTP检测人肺癌H1299细胞感染PTP4A3-RNAi慢病毒后凋亡情况示意图
具体实施方式
本发明基于PTP4A3在多种肿瘤组织中高表达，认为PTP4A3可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。
本发明涉及了一组针对人PTP4A3基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人PTP4A3 mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源PTP4A3基因的表达。
发明人发现，采用RNAi方法下调人PTP4A3基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，可以有效地控制肿瘤的生长进程。这一研究成果表明PTP4A3基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对PTP4A3基因的siRNA，筛选出了可有效抑制PTP4A3的表达进而抑制人肺癌H1299细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一系列干扰人PTP4A3基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默PTP4A3基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人PTP4A3基因设计的小干扰 RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调PTP4A3基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明PTP4A3基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默PTP4A3基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
本发明的设计思路为：
本发明通过如下方法来筛选获得一种人PTP4A3基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人 PTP4A3基因序列；预测siRNA位点；合成针对PTP4A3基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达PTP4A3基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(PackingMix，Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默PTP4A3基因的慢病毒。
基于上述方法，本发明提供了13个干扰PTP4A3基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO1-13 所示)，构建了特异干扰人PTP4A3基因的慢病毒。
同时本发明还公开一种人PTP4A3基因RNAi慢病毒(PTP4A3-RNAi)及其制备与应用。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低PTP4A3基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，PTP4A3基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，PTP4A3基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的PTP4A3基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1：针对人PTP4A3基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人PTP4A3基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取PTP4A3(NM_032611)基因信息；设计针对PTP4A3基因的有效的siRNA靶点。表1列出了其中13条针对PTP4A3基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人PTP4A3基因的siRNA靶点序列
Figure RE-GDA0002305436920000121
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：2为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体 (上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物：上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO： 18)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO：19)，进行PCR 鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO.2的RNAi载体，命名为 pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：20)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA。
表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
Figure RE-GDA0002305436920000132
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体
表4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
试剂 体积(μl)
pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
100×BSA 0.5
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H<sub>2</sub>O 40.5
Total 50.0
表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)
线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 - 1.0
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0
T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0
dd H<sub>2</sub>O 16.0 17.0 16.0
Total 20.0 20.0 20.0
表6-1 PCR反应体系
试剂 体积(μl)
10×buffer 2.0
dNTPs(2.5mM) 0.8
上游引物 0.4
下游引物 0.4
Taq聚合酶 0.2
模板 1.0
ddH<sub>2</sub>O 15.2
Total 20.0
表6-2 PCR反应体系程序设定
Figure RE-GDA0002305436920000151
3.包装PTP4A3-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板， 37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION LentiviralPackaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中， 37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore) 纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm 滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO:25所示。对照慢病毒的包装过程同PTP4A3-siRNA慢病毒，仅以 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-PTP4A3-siRNA载体。
实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测PTP4A3基因的沉默效率
处于对数生长期的人肺癌H1299细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为 5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，H1299:1)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV 操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表6，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。PTP4A3基因的引物如下：上游引物5’-GATGGCATCACCGTTGTGGA-3’(SEQ ID NO：21)和下游引物 5’-CGTACTTCATCCCGCTCTCAAT-3’(SEQ ID NO：22)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO：23)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：24)。按表8中的比例配置反应体系。
表7逆转录反应体系
试剂 体积(μl)
5×RT buffer 4.0
10mM dNTPs 2.0
RNasin 0.5
M-MLV-RTase 1.0
DEPC H<sub>2</sub>O 3.5
Total 11.0
表8 Real-time PCR反应体系
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 10.0
上游引物(2.5μM)： 0.5
下游引物(2.5μM)： 0.5
cDNA 1.0
ddH<sub>2</sub>O 8.0
Total 20.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了PTP4A3 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图2)表明，人肺癌H1299细胞中PTP4A3 mRNA的表达水平下调了80.9％。
实施例3：检测侵染PTP4A3-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人肺癌H1299细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml) 接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，H1299:1)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目下降了66.3％，表明PTP4A3基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。
实施例4侵染PTP4A3-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测
将人肺癌H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将PTP4A3-siRNA慢病毒按照MOI(MOI，H1299: 1)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(200个细胞/孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途隔3day进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后，Giemsa染色，拍照。
如图4结果所示克隆形成实验检测肿瘤细胞感染PTP4A3-siRNA后克隆形成能力结果示意图，以人肺癌H1299细胞为例，与对照干扰(control)相比，RNA干扰降低PTP4A3 基因的表达(KD组)后，肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小；表明PTP4A3沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。
平板克隆形成实验检测降低PTP4A3的表达后，肺癌H1299细胞肿瘤细胞的克隆形成能力下降。
实施例5侵染PTP4A3-siRNA慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测
将人肺癌H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将PTP4A3-siRNA慢病毒按照MOI(MOI，H1299: 1)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；接种于96孔板，每孔100ul；置37℃5％CO2培养箱培养；培养36h后，弃培养液，4℃预冷的85％乙醇固定细胞；PBS洗板两次；RNase处理细胞后，Annexin-V染色，避光15min。将96孔板在 TTP仪器上，使用预设的分析subG1期的template进行扫描分析，得到结果。
如图5中TTP检测肿瘤细胞感染PTP4A3-siRNA后凋亡情况示意图结果所示，以H1299 细胞为例。Annexin-V染色-TTP法检测降低PTP4A3的表达后，H1299细胞肿瘤细胞的细胞凋亡小体(subG1期)比例的变化。发现下调PTP4A3基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与对照干扰(control)，RNA干扰降低PTP4A3基因的表达(KD组)后，凋亡肿瘤细胞产生的凋亡小体的数目显著增多；表明PTP4A3沉默导致肿瘤细胞凋亡。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海吉凯基因化学技术有限公司
<120> 人PTP4A3基因的用途及其相关药物
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatctcgtt ctcctcatt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcacctac ctggagaaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagaggctg cggttcaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgttctcg gcaccttaa 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctacaaacac atgcgcttcc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctcggcacc ttaaattatt a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaaacacat gcgcttcctc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accgttgtgg actggccgtt t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgtgtgtgt gaagtgacct a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagacccgg tgctgcgtta t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaacagagg ctgcggttca a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctcaccta cctggagaaa t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgtgtgaag tgacctatga c 21
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctcacctac ctggagaaat tcaagagatt tctccaggta ggtgagc 47
<210> 15
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctcacctac ctggagaaat ctcttgaatt tctccaggta ggtgagc 47
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttctccgaac gtgtcacgtt tcaagagaac gtgacacgtt cggagaa 47
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttctccgaac gtgtcacgtt ctcttgaaac gtgacacgtt cggagaa 47
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctatttccc atgattcctt cata 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtaatacggt tatccacgcg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatggcatca ccgttgtgga 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgtacttcat cccgctctca at 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgacttcaac agcgacaccc a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccctgttg ctgtagccaa a 21
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcucaccuac cuggagaaa 19
<210> 26
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcucaccuac cuggagaaau ucaagagauu ucuccaggua ggugagc 47

Claims (13)

1.一种分离的人PTP4A3基因在制备或筛选肺癌治疗药物，或者在制备肺癌诊断药物中的用途。
2.一种降低肺癌细胞中PTP4A3基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与PTP4A3基因杂交的核苷酸序列；或者
b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与PTP4A3基因杂交的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PTP4A3基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PTP4A3基因中的靶序列基本相同。
4.如权利要求2或3所述分离的核酸分子，其特征在于，所述PTP4A3基因的靶序列含有SEQ ID NO:1-13中任一序列。
5.如权利要求2或3所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：25所示。
6.如权利要求2或3所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：26所示。
7.一种人PTP4A3基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求2-6任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
8.如权利要求7所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体为人PTP4A3基因干扰慢病毒载体。
9.如权利要求8所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自：
pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
10.一种人PTP4A3基因干扰慢病毒，由权利要求7-9任一权利要求所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
11.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求2-6任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求7-9任一权利要求所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体和/或权利要求10所述人PTP4A3基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.如权利要求11所述药物组合物在制备治疗肺癌药物中的应用。
13.一种用于降低肺癌细胞中人PTP4A3基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：存在于容器中的，权利要求2-6任一权利要求所述人PTP4A3基因小分子干扰RNA，权利要求7-9任一权利要求所述人PTP4A3基因干扰核酸构建体和/或权利要求10所述人PTP4A3基因干扰慢病毒。
CN201910943415.5A 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物 Pending CN110684846A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910943415.5A CN110684846A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410103464.5A CN104928354A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物
CN201910943415.5A CN110684846A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410103464.5A Division CN104928354A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110684846A true CN110684846A (zh) 2020-01-14

Family

ID=54115779

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410103464.5A Pending CN104928354A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物
CN201910943413.6A Pending CN110684845A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物
CN201910943415.5A Pending CN110684846A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410103464.5A Pending CN104928354A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物
CN201910943413.6A Pending CN110684845A (zh) 2014-03-19 2014-03-19 人ptp4a3基因的用途及其相关药物

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN104928354A (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107881236B (zh) * 2017-11-28 2021-04-06 侯琳 一种预防或治疗乳腺癌的药物与人rrs1基因的应用
CN111474364B (zh) * 2020-03-17 2022-05-20 福建中医药大学 人rab22a的用途及相关产品

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2685954A1 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 Agency For Science, Technology And Research Antibodies binding to an intracellular prl-1 or prl-3 polypeptide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YI-XIN LIAN等: "Effect of protein-tyrosing phosphatase 4A3 by small interfering RNA on the proliferation of lung cancer", 《GENE》 *
钟琰: "短发夹RNA沉默PRL-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104928354A (zh) 2015-09-23
CN110684845A (zh) 2020-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018333072B2 (en) Methods for treating triple-negative breast cancer
CN105586391B (zh) 人gtpbp4基因的用途及其相关药物
CN110564727B (zh) 人gpd2基因抑制剂及其应用
CN107523569B (zh) Pdcd1基因的用途及其相关药物
CN109288855B (zh) 试剂在制备药物中的用途、干涉片段、抑制肝癌肿瘤干细胞自我更新方法和治疗肝癌药物
WO2013091293A1 (zh) 人nlk基因相关的用途及其相关药物
CN103656674B (zh) 人eIF5B基因的用途及其相关药物
CN110684846A (zh) 人ptp4a3基因的用途及其相关药物
CN103468785B (zh) 人sema4c基因的用途及其相关药物
CN110917357A (zh) 人gsdmb基因的用途及相关产品
CN104894224B (zh) 人ckip1基因的用途及其相关药物
US9434949B2 (en) Uses of the human ZFX gene and drugs associated with same
CN110643705A (zh) 人dgkz基因的用途及其相关药物
CN103667430B (zh) 一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物
CN105803053B (zh) 人rbm17基因的用途及其相关药物
CN106267208B (zh) Rps15a基因的用途及其相关药物
CN105803056B (zh) 人iars2基因的用途及其相关药物
CN105582548B (zh) 人uba2基因的用途及其相关药物
CN105648041B (zh) 人kiaa0101基因的用途及其相关药物
CN103667422B (zh) 人cul4b基因的用途及其相关药物
CN105648042B (zh) 人yeats4基因的用途及其相关药物
CN113917145A (zh) 人capn7基因的用途及相关产品
CN108342389A (zh) Plekho1基因的用途及其相关药物
CN110882390B (zh) 人lsm5基因的用途及相关产品
CN110863047B (zh) 人ccdc154基因的用途及相关产品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District

Applicant after: Shanghai Jikai gene Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District

Applicant before: SHANGHAI GENECHEM Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200114

RJ01 Rejection of invention patent application after publication