CN107607727B

CN107607727B - H3K23ac在胶质瘤诊断中的应用

Info

Publication number: CN107607727B
Application number: CN201711031034.7A
Authority: CN
Inventors: 冯海忠; 吕德官; 张伟伟
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: CN107607727A

Abstract

本发明提供了H3K23ac和p‑EGFR^Y1172在胶质瘤诊断中的应用。本发明提供了新的神经胶质瘤分子标记H3K23ac，针对该分子标记，本发明还设计了分子标记试剂盒，可以用于判别神经胶质瘤的恶性程度以及对肿瘤患者的生存期进行预测，通过检测结果将病人进行更加细致的分型，未来还有望开发出特异性针对H3K23ac信号通路的新型神经胶质瘤治疗药物，从而更加有针对性和有效的用药，治愈或者提高病人生存期，改善胶质瘤患者生存质量。

Description

H3K23ac在胶质瘤诊断中的应用

技术领域

本发明涉及H3K23ac和p-EGFR^Y1172共表达在诊断神经胶质瘤中的应用。

背景技术

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，主要包含4种病理类型：星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性胶质瘤。根据美国脑肿瘤注册中心统计，恶性胶质瘤约占原发性恶性脑瘤的70％。在恶性胶质瘤中，间变性星形细胞瘤(AA，WHO III级)和多形性胶质母细胞瘤(GBM，WHO IV级)最常见，其中GBM约占所有胶质瘤的50％。目前，神经胶质瘤的诊断主要依靠CT及MRI。一些新的MRI，如DTI、DWI、PWI、MRS、fMRI有助于提高诊断水平和判断预后。PET、SPECT有助于鉴别肿瘤复发与放射性坏死。但是最终，仍然需通过肿瘤切除术或活检术来明确神经胶质瘤的病理学诊断。也就是说：形态观察始终是对神经胶质瘤进行病理诊断和分级的基础。神经胶质瘤分级的基本原则为以下7项：瘤细胞密度；瘤细胞的多形性或非典型性，包括低分化和未分化成分；瘤细胞核的高度异形性或非典型性，出现多核和巨核；高度的核分裂活性；血管内皮细胞增生(出现肾小球样血管增生)；坏死(假栅状坏死)和Ki-67增殖指数升高。

为配合胶质瘤患者的治疗、疗效观察及判断预后，《2012版中国中枢神经系统胶质瘤诊断、治疗指南》要求我国各级医院依据实际情况，因地制宜对胶质瘤进行选择性的分子生物学标记。LGG检测IDH1基因突变和染色体1p/19q杂合性缺失对临床预后判断具有重要意义。具有向星形胶质细胞分化特征的胶质瘤及60％-70％少突胶质细胞瘤对GFAP呈阳性表达。少突胶质细胞特异性核转录因子(Olig2)对鉴别少突胶质细胞瘤及星形细胞来源的胶质瘤具有一定的参考价值。Ki-67增殖指数与肿瘤的分化程度、浸润或转移及预后有密切关联，是判断肿瘤预后的重要参考指标之一。神经元特异核蛋白(NeuN)对判断肿瘤中的神经元成份具有重要意义，主要用于胶质神经元肿瘤及神经细胞瘤的诊断及鉴别诊断。此外，根据信号转导通路相关的分子生物学标记，又能将髓母细胞瘤分成若干种分子亚型，如Wnt型、Shh型和非Wnt/Shh型。这种分类对于临床制定更优化的治疗方案及准确判断预后有重要意义，但还有待于大样本量临床病理的进一步验证。

目前，神经胶质瘤的治疗以手术切除为主，并结合放疗和化疗等。替莫唑胺(TMZ)同步放疗联合辅助化疗已成为新诊断GBM的标准治疗方案。如何预知恶性胶质瘤对化疗药物的反应性，降低化疗抗性是化疗的治疗焦点。内源性O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)甲基化水平及染色体1p/19q杂合性缺失可分别用于预测GBM和少突胶质细胞瘤的化疗反应及预后。不同类型的神经胶质瘤对放射治疗的敏感性亦有所不同，一般认为分化差的肿瘤较分化好的为高。以髓母细胞瘤对放疗最为敏感，其次为室管膜母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤仅中度敏感，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体细胞瘤等更差些。对髓母细胞瘤及室管膜瘤，因易随脑脊液播散，应包括全椎管照射。

因此，唯有肿瘤分子病理学和遗传学方面的不断进展才能为神经胶质瘤的诊断提供更详尽的信息，为临床肿瘤的分级和治疗方式的选择做出指导作用，并对患者的预后做出更为精准的评估。但在我国，特别是一些中小医院由于缺乏熟练的神经病理医师，手术后病理诊断不够精确，部分地区还没有采用WHO分类，使患者手术后的后续治疗缺乏可靠的病理学依据。这对患者的综合治疗和疗效的提高是非常不利的，同时也使其临床疗效评估更加困难。而在另一方面，高度异质性的神经胶质瘤势必需要大量新的神经胶质瘤分子标记的不断发掘，才能对神经胶质瘤的治疗实现个体化综合策略、优化和规范治疗方案，以期达到最大治疗效益，尽可能地延长患者无进展生存期，提高生存质量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的神经胶质瘤的分子标记，用于诊断和治疗神经胶质瘤。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种神经胶质瘤的恶性程度诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测H3K23ac蛋白、或EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂。

本发明还提供了一种神经胶质瘤患者的生存期预测试剂盒，其特征在于，包括用于检测H3K23ac蛋白、或EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂。

本发明还提供了用于检测H3K23ac蛋白、或EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂在制备神经胶质瘤的恶性程度的诊断试剂中的应用。

本发明还提供了用于检测H3K23ac蛋白、或EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。

优选地，所述的EGFR蛋白为p-EGFR^Y1172。

本发明还提供了一种神经胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测H3K23ac蛋白、或EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂。

优选地，所述的EGFR蛋白为p-EGFRY¹¹⁷²。

本发明的原理如下：

人类肿瘤的一个重要特点是扩增或者高表达致癌基因从而异常活化致癌信号通路。在人神经胶质瘤中，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)频繁扩增并且经常与其组成型激活突变体(△EGFR，又名EGFRVIII或de2-7EGFR)共表达。这种活化的致癌EGFR信号通路参与肿瘤的发生、发展及其对治疗的抗性。一般而言，EGFR主要通过激活Akt通路诱发肿瘤，继而刺激肿瘤细胞增殖、存活并耐药。在人的神经胶质瘤，Akt通路的活化大多源于EGFR扩增和突变、PI3KCA突变或PTEN缺失。在前列腺癌和乳腺癌，Akt蛋白可以分别通过胰岛素样生长因子-肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosisfactor receptor-associated factor 6，TRAF6)或HER2-Skp2轴所诱导的泛素化修饰被激活。除了异常激活的EGFR-Akt信号轴和其它在神经胶质瘤中被确定的致癌途径，很有可能还有其它更加关键的基因通过参与或者在平行于上述公认的致癌信号传导通路中发挥作用而促进肿瘤发生。

组蛋白翻译后修饰(PTM)在许多细胞过程中起关键作用，包括转录。组蛋白可以通过各种化学修饰发生共价改变，包括甲基化和乙酰化。由于乙酰化可以中和赖氨酸残基的正电荷，最初提出乙酰化蛋白通过减弱带负电荷的DNA与核小体的蛋白核心的关联而促进染色质结构的开放。随后的工作确定，乙酰化的蛋白质结合含有溴结构域(BRD)的乙酰化赖氨酸阅读蛋白，证明PTM也可以通过招募染色质结合蛋白来调节各种细胞功能从而发挥其作用。尽管已经有大量的组蛋白乙酰化的特征和生物学功能的报道，但是组蛋白乙酰化对癌症贡献的机制在很大程度上是未知的。

近来研究发现在胶质瘤中，EGFR能够影响表观遗传重塑从而调控胶质瘤的发生发展。也有研究揭示，在EGFR高表达的情况下，组蛋白乙酰化的表达更加丰富。这均提示EGFR可能够调节组蛋白乙酰化水平参与胶质瘤发生发展。组蛋白3的23位赖氨酸残基乙酰化(H3K23ac)在胞内非常丰富，并有研究发现参与了乳腺癌和前列腺癌的进展，与二者不良预后明显相关。而在白血病中，H3K23ac参与了白血病耐药产生。

通过对EGF或EGFR/EGFRVIII刺激的不同类型癌细胞进行蛋白质组学研究，已经证实了H3K23ac蛋白表达水平都会显著上调，这表明H3K23ac可能在EGFR刺激的癌细胞行为中发挥作用。

本发明使用免疫组织化学法检测神经胶质瘤标本，发现H3K23ac基因在临床胶质瘤肿瘤标本中的蛋白组学表达水平升高，H3K23ac传递EGFR信号参与相关癌基因表达调控，H3K23ac是EGFR驱动肿瘤形成的关键因素。本发明在国内外率先发现在胶质瘤中磷酸化激活的EGFR特异性上调H3K23ac蛋白表达水平，而对H3K27ac，H3K27me3，H3K4me3表达无影响。本发明所发现的这一新颖的H3K23ac信号通路成为EGFR致癌信号通路的关键中转站。本发明研究表明同时高表达活化型的EGFR(p-EGFR^Y1172)与H3K23ac的神经胶质瘤，恶性程度越高、患者生存期显著缩短。

本发明还提供了以H3K23ac和p-EGFR^Y1172为指标的免疫组织化学肿瘤检测试剂盒，可以半定量地衡量二个指标在患者神经胶质瘤标本中的表达水平，从而对肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准的预测。此新型神经胶质瘤诊断试剂盒可供病理学工作者快速、准确地掌握H3K23ac与p-EGFR^Y1172二大指标的免疫组织化学染色操作方法，从而准确检测二种蛋白的表达水平，对肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准的预测。本发明的癌症筛查方法可容易地与其它方法结合，以提供更为可靠的诊断或预测指标，由此提供多标记检查。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了新的神经胶质瘤分子标记H3K23ac，针对该分子标记，本发明还设计了分子标记试剂盒，可以用于判别神经胶质瘤的恶性程度以及对肿瘤患者的生存期进行预测，通过检测结果将病人进行更加细致的分型，未来还有望开发出特异性针对H3K23ac信号通路的新型神经胶质瘤治疗药物，从而更加有针对性和有效的用药，治愈或者提高病人生存期，改善胶质瘤患者生存质量。

附图说明

图1a.免疫蛋白印迹表明，本发明成功在Ug7MG和LN229胶质瘤细胞中过表达外源性的EGFRvIII，过表达EGFRvIII能够显著增加胶质瘤细胞中H3K23ac的表达，而对H3K27ac，H3K27me3，H3K4me3表达无影响。表明EGFR特异性增加H3K23ac表达，H3K23ac是EGFRvIII下游重要的信号传递者。

图1b.免疫蛋白印迹进一步表明，表皮生长因子(EGF)刺激能够引起胶质瘤细胞中H3K23ac的表达，而对H3K27ac，H3K27me3，H3K4me3表达无影响。而EGF的作用可以被EGFR的抑制剂Erlotinib取消，表明EGF依赖EGFR促进H3K23ac。

图1c.免疫蛋白印迹表明EGFR只有在磷酸化激活后才能促进H3K23ac，而非活化的EGFR本身不能促进H3K23ac表达。

图2a.免疫组织化学染色分析临床神经胶质瘤患者的肿瘤标本，p-EGFR染色强阳性的组织H3K23ac染色也为强阳性，而p-EGFR染色阴性的组织H3K23ac染色也为阴性。提示EGFR-H3K23ac高表达为伴随发生。而且同时高表达p-EGFR与H3K23ac的临床神经胶质瘤肿瘤标本的恶性程度更高，其病理表型(栅栏样坏死、核分裂等)显著多于低表达p-EGFR与H3K23ac的临床神经胶质瘤肿瘤标本。

图2b.免疫组织化学染色同时高表达p-EGFR^Y1172和H3K23ac的临床胶质瘤患者的生存期显著缩短。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：在胶质瘤衍生癌细胞株中，EGF，EGFR/EGFRvIII促进H3K23ac表达

(1)使用fugen-6试剂盒(购自Roche，04709705001)按照说明书的实验步骤将EGFRvIII(病毒载体，Addgene，Plasmid 20737)分别与psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)形成的病毒感染到LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞中(LN229，U87细胞购自ATCC，ATCC编号分别为CRL-2611^TM和HTB-14^TM)。

1. 1293T细胞包装慢病毒颗粒：

将293T细胞(购自ATCC，ATCC编号为CRL-3216^TM)培养于DMEM培养基：含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)，于37℃，5％CO₂无菌培养箱(thermo)培养。

第一天，取接种到10cm培养皿对数生长末期的293T细胞(细胞数约为5×10⁶)，吸掉培养基。用2ml DPBS(Invitrogen，14190250)轻轻洗涤细胞以去除残留培养基，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散293T细胞)，重复3次。加入1ml0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化，用吸管或者1000ml替补头重复吹打细胞使细胞分散均匀，用血小板计数板计数293T，然后吸取合适体积细胞悬液铺到六孔板(Corning，3516)，细胞数约为5×10⁵，让其生长24h，转染前的细胞汇合度应该在80％。

第二天，按照fugen-6试剂盒的说明书操作。将EGFRvIII病毒质粒(病毒载体，Addgene，Plasmid 20737)、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。单个孔分别需要病毒质粒1ug、psPAX20.75ug、pMT24G 0.25ug，即4∶3∶1。

第三天，转染后的24h，更换成每孔3ml新鲜DMEM培养基，开始富集病毒。

第四天，转染48h后，收集培养基即病毒上清。用5ml注射器吸取收集的病毒上清，经由0.45μm过滤器(Millipore公司，SLHV013SL)过滤后，分装于1.5ml离心管，即为转染48h病毒悬液，在4℃保存3-7天或者-80℃长期保持以备后用。

将转染病毒的293T细胞继续更换为3ml新鲜DMEM培养基，再过24h，即为转染后72h，收集病毒上清液，按照与转染48h相同的操作步骤，去除病毒液中的293T细胞，得到转染72h病毒悬液，保存备用。

1.2慢病毒感染LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞实验方法：

1)慢病毒感染前18-24h，将LN229和U87细胞以1×10⁵/孔铺到24孔板中，加入新鲜DMEM培养基进行培养，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁵/孔左右。新鲜DMEM培养基成分为含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)的DMEM培养液(Gibco，10564011)。

2)第二天，用含有6μg/ml polybrene(Sigma，H9628)的2ml新鲜DMEM培养基替换原培养基，加入100微升1.1节所获得的转染48h或者72h病毒悬液。37℃孵育。

3)24小时后，用新鲜DMEM培养基替换含有病毒颗粒的培养基。

4)继续培养。由于该慢病毒含有GFP荧光蛋白，一般转染48h后可见明显荧光表达，72h后更加明显。该慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，转染3天后开始加嘌呤霉素(Sigma，P8833，终浓度为400-800ng/m1)，细胞长满即可传代。期间每3天更换一次含有相同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选2星期，得到LN229/EGFRvIII，U87/EGFRvIII细胞。

1.3免疫印迹法验证EGFRvIII感染效率以及对H3K23ac表达的影响

1)收集蛋白样品

使用加有20微升蛋白酶抑制剂(cocktail，Roche，17938100)的碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)冰上裂解LN229，U87，LN229/EGFRvIII，U87/EGFRvIII细胞十分钟，然后4℃，12000rmp/min，离心10分钟。收集裂解液上清至新EP管中并做好标记，蛋白样品收集后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，按照BCA定量试剂盒操作说明书，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

2)电泳

a、SDS-PAGE凝胶配制

使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。将制备凝胶所需要的玻璃板，夹子，硅胶垫等洗干净，然后37℃烘干。将玻璃板夹好加入去离子水检漏，根据说明书的配制表将适量的去离子水，30％聚丙烯酰胺，分离胶缓冲液，10％APS以及TEMED混合配制所需要浓度的分离胶，倒掉玻璃板里面的去离子水，将分离胶小心的加入玻璃板中防止气泡产生，加入去离子水封闭30min等待胶凝固。等分离胶凝固以后，根据说明书配制表配制浓缩胶。将适量的去离子水，30％聚丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液，10％APS以及TEMED混合配制浓缩胶，倒掉分离胶上层的水，加入浓缩胶，快速而轻轻的插入梳子，得到SDS-PAGE胶板。

b、样品处理

在收集的蛋白样品中按比例加入浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X，P0015))。沸水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。

c、上样与电泳

等样品冷却到室温后，将制备好的SDS-PAGE胶板从夹子上取下，固定在电泳装置上。在电泳槽内加入1X碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A)，将梳子两边垂直均匀用力拔出。

把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，使用预染蛋白质分子量标准(P0066)判断蛋白分子量大小。

电泳时外槽也使用碧云天生产的1xSDS-PAGE电泳液(P0014A)。

电泳时在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X，P0015))中含有的溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置，低电压可以设置在80V，高电压可以设置在120V。

电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

3)转膜

选用碧云天生产PVDF膜(FFP36/FFP39)。

将裁剪好的PVDF膜放入适量甲醇中浸泡活化，切去浓缩胶，将浸泡好的PVDF膜和分离胶共同放到转膜夹的三明治结构中(滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸)，将转膜夹插入转膜槽中，加入预冷的转膜液(碧云天，P0021A)，恒定300毫安电流转膜约90min。

注：PVDF膜在电源正极，凝胶在电源负极，防止放反蛋白无法转移到膜上。在转膜过程中会有非常严重的发热现象，因此把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

4)封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(碧云天，P0023C)中，漂洗2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(碧云天，P0023B)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-2h。

5)一抗孵育

参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(碧云天，P0023A)稀释一抗。一抗详细信息如下：p-EGFR(Y1173)抗体(53A5，Cell Signaling Technology，1∶1000)，EGFR抗体(Ab-1，Oncogene Science，1∶1000)，三甲基组蛋白H3(Lys4)(#9727，CellSignaling Technology，1∶1000)，三甲基组蛋白H3(Lys27)(#9733，Cell SignalingTechnology，1∶1000)，乙酰化组蛋白H3(K27)

(#4353，Cell Signaling Technology，1,000)，乙酰化组蛋白H3(K23)抗体(#07-355.Millipore-Upstate，1∶1,000)，组蛋白H3抗体(FL-136，Santa Cruz Biotechnology，1∶500)和β-actin(I19，Santa Cruz Biotechnology，1∶2000)。用滴管吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液(碧云天，P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6)二抗孵育

参考二抗-碧云天辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L(A0216)、山羊抗兔IgG(H+L)(A0217)的说明书，按照1∶1000的比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用滴管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7)蛋白检测

参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)ECL试剂来检测蛋白。使用X光片自动洗片机洗片。

结果如图1A所示，正常亲本U87，LN229细胞相比，EGFRvIII能够显著增加LN229和U87细胞中EGFRvIII，p-EGFR和H3K23ac的表达水平，表明我们构建细胞系成功且有效，并且说明H3K23ac位于EGFR通路的下游。

(2)按照实施例1(1)1.1所述的方法将EGFR-WT(Pbabe-puro-EGFR，Addgene，Plasmid#11011)和psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染至293T细胞包装成病毒颗粒并感染U87细胞。按照实施例1(1)1.2所述感染筛选阳性细胞，得到U87/EGFR细胞，按照实施例1(1)1.3进行蛋白印迹。

将EGF(50ng/ml，购自Sigma，E9644)添加在U87/EGFR细胞的DMEM培养基中，连续刺激3天收集细胞。另有一组，在EGF刺激同时，使用EGFR酪氨酸激酶的抑制剂-Erlotinib(5ng/ml，183321-74-6，LC Laboratories)。将U87/EGFR不使用EGF刺激、使用EGF刺激、使用EGF和Erlotinib同时处理的三种细胞培养3天后，按照实施例1(1)1.3的实验操作对蛋白质进行蛋白印迹检测。结果如图1b所示，在U87，LN229细胞中成功过表达EGFR，EGF刺激能够明显增加H3K23ac的表达，而对H3K27ac，H3K27me3，H3K4me3表达无影响。而EGFR抑制剂Erlotinib能够阻断EGF的作用，说明EGF调控H3K23ac是依赖其受体EGFR，并且EGFR的作用依赖本身的赖氨酸激酶活性。

(3)按照实施例1(1)1.1所述的方法将EGFRvIII(病毒载体，Addgene，Plasmid20737)或抑制EGFRvIII活性的diacylglycerol kinase delta突变型病毒质粒EGFRvIII-DK(pcDNA3-EGFRvIII-DK，Addgene，P13034)和psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染至293T细胞包装成病毒颗粒。按照实施例1(1)1.2所述的方法感染并筛选U87细胞，传代筛选培养出高表达EGFRvIII的U87/vIII或者EGFRvIII活性降低的U87/vIII-KD细胞，按照实施例1(1)1.3进行蛋白印迹，表明vIII-KD不能够激活EGFR，由此造成的EGFR失活无法增加H3K23ac，提示EGFR促进H3K23ac依赖其激酶活性，亦即EGFR只有在磷酸化激活后才能促进H3K23ac，而非活化的EGFR本身不能促进H3K23ac表达。

实施例2：在临床胶质瘤标本中共表达H3K23ac与p-EGFR^Y1172的患者生存期显著缩短，肿瘤恶性程度更高

一种用于诊断神经胶质瘤的恶性程度或预测神经胶质瘤患者生存期的试剂盒，包含用于检测EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白的表达水平的试剂，用于检测EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白的表达水平的试剂分别为p-EGFR^Y1172抗体(Rabbit polyclonal to p-EGFR^Y1172，Signalway Antibody，1∶50))和H3K23ac抗体(Rabbit polyclonal toH3K23ac，，1∶200)。

(1)收集132例WHO II-IV级的临床胶质瘤标本切片行免疫组化染色：

1.1收集132例人的胶质瘤肿瘤标本(包括31例WHO II级，23例WHOIII级，78例WHOIV级胶质瘤肿瘤)和7例没有明显病理损伤和病史的正常脑组织。常规方法制成石蜡切片。

组织石蜡包埋和切片步骤：

1)取材：病理组织来仁济医院确认的胶质瘤患者，患者均已签署知情同意书。

2)固定：将取下来的病理组织马上投入到固定液(10％的福尔马林或者4％多聚甲醛)中固定过夜，进行固定的目的是防止组织自身发生代谢等破坏组织本身的结构。

3)洗涤：将充分固定的组织轻轻取出，放入包埋小盒中，然后再放入烧杯中，用小流量的自来水冲洗一个小时，将固定液冲洗干净。

4)脱水：因为组织里面含有大量水分，水与石蜡是不混溶的，所以要脱去组织中的水分才能进行石蜡固定。酒精为常用的脱水剂。洗涤完成后的组织放入70％的酒精里面过夜脱水。将样品从70％样品中取出，依次通过80％，90％，95％，100％的酒精进行脱水，80％，90％，95％酒精各脱水30min，100％酒精脱水1h。样品不可以在后续浓度中过分脱水或者长久保持，后续浓度会引起组织变硬。

5)透明：经过脱水处理，样品中的水分被酒精所取代，但是酒精跟石蜡仍然是不相混溶，所以接下来使用既可以溶于酒精又可以溶于石蜡的二甲苯进行透明。将脱水后的组织浸泡二甲苯，使二甲苯取代酒精进入组织称为透明。首先要过二甲苯与酒精1∶1的溶液30分钟，然后在放入纯二甲苯中至透明，完成透明过程。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片。如果组织出现透明和发黑现象，说明透明成功，如果组织出现白色，说明脱水不完全，需要重新脱水。

6)浸蜡：透明完全的组织，则可以进行浸蜡操作，让石蜡进入组织内部，起到支撑固定作用，利于组织切片。分别放入熔融的石蜡I、II、III处理。

7)包埋：把浸蜡完成的组织拿到包埋机处进行包埋，在预热的模具里面加入熔融的干净石蜡，然后将预热的组织迅速转移到模具里面去，用包埋盒盖在模具上面，并把模具放在冰上冷却15分钟后轻轻扣下蜡块即可。

8)切片：将彻底凝固的蜡块进行切片，制作切片标本。将蜡块放到石蜡切片机(LEICA，RM2235)卡扣里面，调整刀头位置，放置蜡块，然后按切片机操作规范切片，将完整而较平整的组织片轻轻挑入热水中，用载玻片将平展良好的切片45°角轻轻捞起，将载玻片斜向上摇动除去多余的水，使切片牢牢贴在载玻片上，然后37℃烘箱烘干后备用。

1.2对石蜡切片进行免疫组化染色(二步法)如下：

试剂：0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、双蒸水、梯度酒精、二甲苯、柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)(碧云天)、3％H₂O₂溶液(碧云天)；浓缩型DAB试剂盒(Dako，K340811)、中性树胶、p-EGFR^Y1172抗体(Rabbit polyclonal to p-EGFR^Y1172，Signalway Antibody，1∶50))、H3K23ac抗体(Rabbit polyclonal toH3K23ac，proteintech group，1∶200)，阴性对照(不含一抗的PBS)、抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂(PV-6001，中杉金桥生物技术有限公司)。仪器：切片架；孵育盒；烤箱；移液器；小玻璃染色缸；水浴锅。

具体步骤：

1)石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片30分钟。

2)纯二甲苯脱蜡：I、II各20分钟。

3)梯度酒精脱蜡：100％酒精I、100％酒精II、95％酒精、90％酒精、80％酒精各5分钟，双蒸水洗5分钟×2次。

4)抗原热修复：将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液(碧云天，P0081)的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在98℃左右，并持续15分钟。取出容器，室温冷却30分钟(不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗5分钟×3次。

5)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴3％H₂O₂，放入孵育盒中，盒底部放少量双蒸水。把盒子放入37℃水浴箱中孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗5分钟×3次。

6)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴(30～50ul)按照1/100稀释的一抗，37℃孵育2小时，PBS洗5分钟×3次。

7)滴加100μL酶标羊抗兔IgG聚合物(抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂2，中杉金桥生物技术有限公司PV-6001)，室温孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

8)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(按照说明书在每500μl A液中加入2.5μl B液)，显色5分钟，显微镜下掌握显色程度，见黄褐色斑，放入双蒸水中终止显色。

8)苏木素复染3分钟，自来水冲洗30秒钟，盐酸酒精(盐酸：酒精的体积比为1∶100)分化5秒钟，自来水冲洗15分钟。

9)梯度酒精脱水：80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精I、100％酒精II各5分钟。

10)二甲苯透明：I、II各10分钟。

11)中性树胶封片。

12)放入60℃烘箱中烤干，显微镜下观察，H3K23ac抗体和p-EGFR^Y1172抗体染色阳性的胶质瘤标本如图2A中所示，p-EGFR染色强阳性的组织H3K23ac染色也为强阳性，而p-EGFR染色阴性的组织H3K23ac染色也为阴性。提示EGFR-H3K23ac高表达为伴随发生。而且同时高表达p-EGFR与H3K23ac的临床神经胶质瘤肿瘤标本的恶性程度更高，其病理表型(假栅状坏死、核分裂等)显著多于低表达p-EGFR与H3K23ac的临床神经胶质瘤肿瘤标本。

(2)使用Graphpad Prism5.0对免疫组化染色的评分和患者生存期进行Kaplan-Meier survival分析。根据信号分子阳性细胞所占的百分比对标本计分：-，所有肿瘤细胞都检测不到信号，0％；±，低表达或者无信号，＜1％阳性细胞；1+，～5-25％阳性细胞；2+，～25％阳性细胞；3+，～50％阳性细胞。-或者±染色的肿瘤被认为是低表达肿瘤，而1+到3+的肿瘤是高表达肿瘤，结果如图2b所示。如图2b所示，同时高表达H3K23ac、p-EGFRY1172(占胶质瘤患者的35％)的临床胶质瘤患者的生存期显著缩短。本发明研究表明同时高表达活化型的EGFR(p-EGFR^Y1172)与H3K23ac的神经胶质瘤，恶性程度越高、患者生存期显著缩短。

Claims

1.一种用于诊断神经胶质瘤的恶性程度或预测神经胶质瘤患者生存期的试剂盒，其特征在于，包含用于检测EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂，所述的EGFR为p-EGFR^Y1172。

2.权利要求1所述的用于诊断神经胶质瘤的恶性程度或预测神经胶质瘤患者生存期的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测EGFR蛋白和H3K23ac蛋白的表达水平的试剂为EGFR的抗体和H3K23ac的抗体。

3.用于检测EGFR蛋白以及H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂在制备神经胶质瘤的恶性程度的诊断试剂或神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用，所述的EGFR为p-EGFR^Y1172。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于检测EGFR蛋白和H3K23ac蛋白的表达水平的试剂为EGFR的抗体和H3K23ac的抗体。

5.一种神经胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测p-EGFR^Y1172蛋白和H3K23ac蛋白、或H3K23ac蛋白以及EGFRVIII蛋白的表达水平的试剂。