CN104083775B

CN104083775B - 磷酸化dcbld2y750在诊断和治疗神经胶质瘤中的应用

Info

Publication number: CN104083775B
Application number: CN201410325300.7A
Authority: CN
Inventors: 冯海忠
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2034-07-09
Also published as: CN104083775A

Abstract

本发明提供了p‑DCBLD2^Y750在诊断和治疗神经胶质瘤中的应用。本发明提供了新的神经胶质瘤的分子标记，针对该分子标记，本发明还设计了分子标记试剂盒，可以用于判别神经胶质瘤的恶性程度以及对肿瘤患者的生存期进行预测，未来还有望开发出特异性针对p‑EGFR^Y1172/p‑DCBLD2^Y750信号通路的新型神经胶质瘤治疗药物并验证其疗效。

Description

磷酸化DCBLD2Y750在诊断和治疗神经胶质瘤中的应用

技术领域

本发明涉及磷酸化DCBLD2^Y750(p-DCBLD2^Y750)在诊断和治疗神经胶质瘤中的应用。

背景技术

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，主要包含4种病理类型：星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性胶质瘤。根据美国脑肿瘤注册中心统计，恶性胶质瘤约占原发性恶性脑瘤的70％。在恶性胶质瘤中，间变性星形细胞瘤(AA，WHO III级)和多形性胶质母细胞瘤(GBM，WHO IV级)最常见，其中GBM约占所有胶质瘤的50％。目前，神经胶质瘤的诊断主要依靠CT及MRI。一些新的MRI，如DTI、DWI、PWI、MRS、fMRI有助于提高诊断水平和判断预后。PET、SPECT有助于鉴别肿瘤复发与放射性坏死。但是最终，仍然需通过肿瘤切除术或活检术来明确神经胶质瘤的病理学诊断。也就是说：形态观察始终是对神经胶质瘤进行病理诊断和分级的基础。神经胶质瘤分级的基本原则为以下7项：瘤细胞密度；瘤细胞的多形性或非典型性，包括低分化和未分化成分；瘤细胞核的高度异形性或非典型性，出现多核和巨核；高度的核分裂活性；血管内皮细胞增生(出现肾小球样血管增生)；坏死(假栅状坏死)和Ki-67增殖指数升高。

为配合胶质瘤患者的治疗、疗效观察及判断预后，《2012版中国中枢神经系统胶质瘤诊断、治疗指南》要求我国各级医院依据实际情况，因地制宜对胶质瘤进行选择性的分子生物学标记。LGG检测IDH1基因突变和染色体1p/19q杂合性缺失对临床预后判断具有重要意义。具有向星形胶质细胞分化特征的胶质瘤及60％-70％少突胶质细胞瘤对GFAP呈阳性表达。少突胶质细胞特异性核转录因子(Olig2)对鉴别少突胶质细胞瘤及星形细胞来源的胶质瘤具有一定的参考价值。Ki-67增殖指数与肿瘤的分化程度、浸润或转移及预后有密切关联，是判断肿瘤预后的重要参考指标之一。神经元特异核蛋白(NeuN)对判断肿瘤中的神经元成份具有重要意义，主要用于胶质神经元肿瘤及神经细胞瘤的诊断及鉴别诊断。此外，根据信号转导通路相关的分子生物学标记，又能将髓母细胞瘤分成若干种分子亚型，如Wnt型、Shh型和非Wnt/Shh型。这种分类对于临床制定更优化的治疗方案及准确判断预后有重要意义，但还有待于大样本量临床病理的进一步验证。

目前，神经胶质瘤的治疗以手术切除为主，并结合放疗和化疗等。替莫唑胺(TMZ)同步放疗联合辅助化疗已成为新诊断GBM的标准治疗方案。如何预知恶性胶质瘤对化疗药物的反应性，降低化疗抗性是化疗的治疗焦点。内源性O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)甲基化水平及染色体1p/19q杂合性缺失可分别用于预测GBM和少突胶质细胞瘤的化疗反应及预后。不同类型的神经胶质瘤对放射治疗的敏感性亦有所不同，一般认为分化差的肿瘤较分化好的为高。以髓母细胞瘤对放疗最为敏感，其次为室管膜母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤仅中度敏感，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体细胞瘤等更差些。对髓母细胞瘤及室管膜瘤，因易随脑脊液播散，应包括全椎管照射。

因此，唯有肿瘤分子病理学和遗传学方面的不断进展才能为神经胶质瘤的诊断提供更详尽的信息，为临床肿瘤的分级和治疗方式的选择做出指导作用，并对患者的预后做出更为精准的评估。但在我国，特别是一些中小医院由于缺乏熟练的神经病理医师，手术后病理诊断不够精确，部分地区还没有采用WHO分类，使患者手术后的后续治疗缺乏可靠的病理学依据。这对患者的综合治疗和疗效的提高是非常不利的，同时也使其临床疗效评估更加困难。而在另一方面，高度异质性的神经胶质瘤势必需要大量新的神经胶质瘤分子标记的不断发掘，才能对神经胶质瘤的治疗实现个体化综合策略、优化和规范治疗方案，以期达到最大治疗效益，尽可能地延长患者无进展生存期，提高生存质量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的神经胶质瘤的分子标记，用于诊断和治疗神经胶质瘤。

为了解决上述技术问题，本发明提供了p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤的恶性程度的诊断试剂中的应用。

本发明还提供了p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。

本发明还提供了p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤的治疗药物中的应用。

本发明还提供了p-EGFR^Y1172和p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。

本发明还提供了一种神经胶质瘤的恶性程度诊断试剂盒，其特征在于，包含p-EGFR^Y1172的抗体和p-DCBLD2^Y750的抗体。

本发明还提供了一种神经胶质瘤的患者的生存期预测试剂盒，其特征在于，包含p-EGFR^Y1172的抗体和p-DCBLD2^Y750的抗体。

本发明的原理如下：

人类肿瘤的一个重要特点是通过扩增或者高表达致癌基因从而异常活化致癌信号通路。在人的神经胶质瘤中，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)频繁扩增并且经常与其组成型激活突变体(△EGFR，又名EGFRVIII或de2-7EGFR)共表达。这种活化的致癌EGFR信号通路导致肿瘤的发生、发展及其对治疗的抗性。一般而言，EGFR主要通过激活Akt通路诱发肿瘤，继而刺激肿瘤细胞增殖、存活并耐药。在人的神经胶质瘤，Akt通路的活化大多源于EGFR扩增和突变、PI3KCA突变或PTEN缺失。在前列腺癌和乳腺癌，Akt蛋白可以分别通过胰岛素样生长因子-肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumornecrosis factor receptor-associated factor6，TRAF6)或HER2-Skp2轴所诱导的泛素化修饰被激活。除了异常激活的EGFR-Akt信号轴和其它在神经胶质瘤中被确定的致癌途径，很有可能还有其它基因通过参与或者在平行于上述公认的致癌信号传导通路中发挥作用而促进肿瘤发生。

Discoidin、CUB和LCCL的基因结构域蛋白2(Discoidin，CUB and LCCL domain-containing protein2，DCBLD2也被称为CUB、LCCL-同源性凝血因子V/VIII同源结构域蛋白1(CLCP1)以及内皮细胞和平滑肌细胞衍生的神经纤毛蛋白样蛋白(ESDN))是一种神经菌毛素样膜蛋白，最初是在血管损伤中作为上调蛋白被鉴定出。在血管平滑肌细胞，DCBLD2通过影响c-Cb1E3连接酶对PDGFRβ的泛素化而调节PDGFRβ的激活。在肺癌，DCBLD2在具有体内高转移表型的LNM35细胞中上调并且在转移病灶特别频发的肺癌标本中高表达。在另一方面，DCBLD2在胃和神经内分泌癌临床标本中低表达。在胃癌细胞株外源性表达DCBLD2能够抑制肿瘤细胞的集落形成和细胞侵袭，提示了DCBLD2 在这些癌症中的肿瘤抑制作用。DCBLD2也与其它一些人类疾病有关。迄今为止，关于DCBLD2在癌症和其他人类疾病中的作用尚且存疑并且非常有限。通过对EGFR/EGFRVIII刺激的不同类型癌细胞进行蛋白质组学研究，已经确定了DCBLD2是在几个酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白，这表明DCBLD2可能在EGFR刺激的癌细胞行为中发挥作用。

本发明使用数字核型分析和荧光原位杂交分析检测神经胶质瘤标本，发现DCBLD2基因在临床胶质瘤肿瘤标本中的基因组学表达水平升高，在胶质瘤衍生癌细胞株中，EGF刺激其细胞增殖和存活必需由DCBLD2介导，DCBLD2是EGFR驱动肿瘤形成的必需因素，EGFR磷酸化DCBLD2的Y750位点，而不是Y621位点，是EGFR驱动肿瘤形成的关键环节。本发明在国内外率先发现在胶质瘤中EGFR导致DCBLD2的Y750残基发生酪氨酸磷酸化(p-DCBLD2^Y750)，本发明识别和证实了DCBLD2蛋白的碳端PAPDELVYQ(PxExxAr/Ac)氨基酸743-751(p-Y750)区域是关键的作用基序。EGFR/EGFRvIII诱导其Y750区域的磷酸化(p-Y750)。本发明所发现的这一新颖的DCBLD2信号通路成为EGFR致癌信号通路的关键中转站。本发明研究表明同时高表达活化型的EGFR(p-EGFR^Y1172)与Y750残基发生酪氨酸磷酸化的DCBLD2(p-DCBLD2^Y750)的神经胶质瘤，其肿瘤恶性程度更高、患者生存期显著缩短。在神经胶质瘤中，WHO病理分级级别越高(恶性程度越高)，其p-EGFR^Y1172与p-DCBLD2^Y750的表达水平也越高。

本发明还提供了基于p-DCBLD2^Y750和p-EGFR^Y1172的免疫组织化学肿瘤检测试剂盒，可以半定量地衡量二个指标在患者神经胶质瘤标本中的表达水平，从而对肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准的预测。此新型神经胶质瘤诊断试剂盒可供病理学工作者快速、准确地掌握p-DCBLD2^Y750与p-EGFR^Y1172二大指标的免疫组织化学染色操作方法，从而准确检测二种蛋白的表达水平，对肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准的预测。本发明的癌症筛查方法可容易地与其它方法结合，以提供更为可靠的诊断或预测指标，由此提供多标记检查。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了新的神经胶质瘤的分子标记，针对该分子标记，本发明还设计了分子标记试剂盒，可以用于判别神经胶质瘤的恶性程度以及对肿瘤患者的生存期进行预测，未来还有望开发出特异性针对p-EGFR^Y1172/p-DCBLD2^Y750信号通路的新型神经胶质瘤治疗药物并验证其疗效。

附图说明

图1A.数字化核型分析显示染色体上的一个焦点区域3q12.1的拷贝数高，表明有基因扩增(*表示)。此扩增的区域包括两种基因，ST3GAL6和DCBLD2。

图1B.荧光实时定量PCR(Q-PCR)确认在28例临床胶质瘤标本中，DCBLD2，而不是ST3GAL6，在14例标本中表达增加(Q-PCR中DCBLD2的阳性率为50％)。

图1C.基因表达序列分析(SAGE)进一步证实DCBLD2在胶质瘤标本中的表达显著高于正常脑组织。而ST3GAL6在胶质瘤标本和正常脑组织之间的表达无差异。

图1D.SAGE进一步证实，在WHOII-IV级胶质瘤中，随着胶质瘤病理分级的级别不断升高，DCBLD2的表达也逐渐升高，其表达水平均高于正常脑组织。

图1E.DCBLD2在来自TCGA数据库的116例胶质瘤标本的基因组学表达水平显示，DCBLD2在间充质型胶质瘤(38例)的表达水平高于神经元型(19例)、前神经元型(37例)和经典型(22例)

图1F.临床胶质瘤肿瘤标本的原位杂交荧光检测(FISH)显示，DCBLD2基因显著扩增(箭头表示)。

图2A.使用shRNA-shD2显著降低SNB19和U87细胞中DCBLD2的表达水平。EGF刺激不影响shD2对DCBLD2表达水平的影响。shD2处理和EGF刺激均不影响SNB19和U87细胞中EGFR的表达水平。EGF刺激能够激活SNB19和U87中p-EGFR的表达。shD2降低DCBLD2表达后，EGF刺激仍然能够激活SNB19和U87中p-EGFR的表达。这说明DCBLD2位于EGFR/p-EGFR通路的下游。

图2B.降低SNB19和U87中的DCBLD2，能够抑制EGF刺激的SNB19和U87的细胞增殖。

图2C.降低SNB19和U87中的DCBLD2，能够抑制EGF刺激的SNB19和U87的细胞存活。

图3A.降低内源性过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)的DCBLD2表达(本实验中使用了两个shD2质粒转染以便于更好地验证DCBLD2降低对后续信号通路的影响，分别为#1和#2。经过SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2的多重证明)后，EGFRvIII的表达水平不受影响。

图3B.内源性过表达EGFRvIII(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)能够比亲本对照细胞(SNB19/P/shC和U87/P/shC)显著提高胶质瘤细胞株的体外增殖能力。而在内源性过表达EGFRvIII的基础上降低DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，EGFRvIII无法再促进细胞株的体外增殖能力。

图3C.内源性过表达EGFRvIII(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)能够比亲本对照细胞(SNB19/P/shC和U87/P/shC)显著减少胶质瘤细胞株的细胞凋亡比例。而在内源性过表达EGFRvIII的基础上降低DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，EGFRvIII无法再减少细胞株的细胞凋亡比例。

图3D.内源性过表达EGFRvIII能够显著增加胶质瘤细胞株的细胞克隆形成率。而在内源性过表达EGFRvIII的基础上降低DCBLD2表达后，EGFRvIII无法再增加细胞株的细胞克隆形成率。

图3E.U87亲本对照细胞(U87/P/shC)在裸鼠脑内不成瘤。内源性过表达EGFRvIII并且不降低DCBLD2表达的U87细胞(U87/vIII/shC)可以不依赖于EGF配体而组成型激活EGFR突变体，把该细胞移植到裸鼠脑内可以诱发肿瘤。降低U87/vIII的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1和U87/vIII/shD2#2)，能够抑制U87/vIII在裸鼠脑内的成瘤能力。

图3F.U87/vIII/shC组裸鼠脑内成瘤的大小比U87/P/shC显著增大、Ki-67染色阳性的增殖细胞数目显著增多、TUNEL阳性的凋亡细胞数目显著减少。而降低U87/vIII的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1和U87/vIII/shD2#2)，U87/vIII无法在裸鼠脑内成瘤，其Ki-67增殖细胞显著减少、TUNEL凋亡细胞显著增多。

图4A.U87亲本细胞(U87/P)只表达DCBLD2蛋白，不能与p-Y-DCBLD2和p-EGFR共沉淀。只有在U87/vIII细胞中能够检测到p-Y-DCBLD2时，才能够同时检测到p-EGFR。而降低U87/vIII的EGFRvIII活性的U87/vIII-DK细胞，其p-Y-DCBLD2和p-EGFR的表达水平均显著降低。因此，p-Y-DCBLD2和p-EGFR 存在密不可分的关联。

图4B.EGF(50ng/ml，购自Sigma，E9644)刺激U87/vIII细胞能够诱导其表达p-EGFR和p-Y-DCBLD2。使用EGFR酪氨酸激酶的抑制剂(Erlotinib)后，EGF无法再诱导U87/vIII细胞表达p-EGFR和p-Y-DCBLD2。

图4C.发明采用真核生物蛋白质功能位点的线性基序数据库(http：//elm.eu.org)识别出DCBLD2有两个TRAF6相互作用基序，分别位于639-647和743-751位点的氨基酸残基FKPEEGKEA和PAPDELVYQ(PxExxAr/Ac)。这两个保守的序列紧邻或者包含在EGFR诱导DCBLD2磷酸化的位点。

图4D.U87/P经过DCBLD2共沉淀后，未检测到EGFR的共沉淀，也未检测到p-Y-DCBLD2共沉淀。而在U87/vIII细胞，DCBLD2、p-Y-DCBLD2均与EGFR共沉淀。但是在F621和F750双突变的U87/vIII^F621/F750细胞，只能检测到EGFR的共沉淀，未检测到p-Y-DCBLD2共沉淀。因此同时突变Y621和Y750终止了EGFR诱导的酪氨酸磷酸化，而单独突变Y621或Y750只是部分减少了DCBLD2的酪氨酸磷酸化(p-Y)。

图4E.在U87/P降低DCBLD2表达对p-Akt表达影响不大，而在U87/vIII中p-Akt表达水平显著升高。在U87/vIII中使用shD2降低DCBLD2表达(U87/vIII/shD2)后，p-Akt的表达水平也显著降低。F621点突变后U87/vIII^F621仍然高表达p-Akt。在F750和F621/F750点突变的U87/vIII(U87/vIII^F750和U87/vIII^F621/F750)中，其p-Akt的表达水平与U87/vIII/shD2组相似，均比U87/vIII组显著降低。

图4F.只有U87/vIII、U87/vIII^F621、U87/vIII^WT能够诱导裸鼠脑内肿瘤，而U87/vIII/shD2以及U87/vIII/shD2^F750和U87/vIII/shD2F621/F750在裸鼠脑内无法诱导肿瘤形成。

图4G.只有U87/vIII、U87/vIII^F621、U87/vIII^WT能够诱导裸鼠脑内肿瘤，其增殖细胞多、凋亡细胞少，而U87/vIII/shD2以及U87/vIII/shD2^F750和U87/vIII/shD2^F621/F750相反。

因此，F750是DCBLD2信号通路的最关键位点。

图5A.免疫组织化学染色临床神经胶质瘤患者的肿瘤标本，其中p-DCBLD2^Y750和p-EGFR^Y1172染色阳性的胶质瘤标本如图5A所示。

图5B.免疫组织化学染色同时高表达p-DCBLD2^Y750、p-EGFR^Y1172(占胶质瘤患者的35％)的临床胶质瘤患者的生存期显著缩短。

图5C.免疫组织化学染色p-DCBLD2^Y750在WHOII-IV级的胶质瘤标本中的染色强度不断升高。尤以WHOIV级胶质瘤的染色强度较之对照组正常脑组织显著升高。

图5D.免疫组织化学染色在不同WHO分级之间以及与对照组正常脑组织相比，p-EGFR^Y1172的染色强度均有显著性差异。

图5E.免疫印迹法检测19例临床胶质瘤标本中有8例为EGFR阳性。在8例EGFR阳性标本中，又有6例共表达了p-DCBLD2^Y750(占胶质瘤患者的32％)。这说明通过免疫印迹法也能检测到EGFR与p-DCBLD2^Y750的共表达，进一步在临床标本中通过另一种实验方法确证了本发明关于p-DCBLD2^Y750与EGFR信号通路密切相关的理论。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：DCBLD2基因在临床胶质瘤肿瘤标本中的基因组学表达水平升高

(1)数字化核型分析：在胶质瘤患者的肿瘤切除术或活检术中，留取10mg左右的肿瘤组织保存至冻存管，快速置于液氮中长期储存(大于1年)。收集10例临床胶质瘤的肿瘤标本，按照www.digitalkaryotyping.org所述的实验方法提取DNA并检测。采用SageGenieDKVie(http：//cgap.nci.nih.gov/SAGE/DKViewHome)查看实验标签的序列。采用加州大学圣克鲁兹分校的HG16基因组浏览器鉴别出候选基因。结果如图1A显示：染色体上的一个焦点区域3q12.1的拷贝数高，表明有基因扩增。此扩增的区域包括两种基因，ST3GAL6和DCBLD2。

(2)在胶质瘤患者的肿瘤切除术或活检术中，留取10mg左右的肿瘤组织保存至冻存管，每管组织中加入1毫升Trizol(Invitrogen，15596026)，快速置于液氮中长期储存(大于1年)。取28例临床胶质瘤标本，按照Trizol试剂盒的操作步骤提取RNA，再按照Takara公司的反转录试剂盒(RR037A)说明书，将RNA反转录为CDNA。采用AppliedBiosciences7900HT实时PCR系统进行实时定量 PCR来检测DCBLD2和ST3GAL6基因表达水平。GAPDH为内参。实用Applied Biosystems SDS软件2.2.2计算阈值循环数。

引物序列分别为：

DCBLD2序列1Forward Sequence：CCTGCAAAAGCAGTGGACCATG

序列2Reverse Sequence：CTCCTACCAGTGGCTGAGCATA

ST3GAL6序列3Forward Sequence：CTGACCTCAAGAGTCCTTTGCAC

序列4Reverse Sequence：TCTTGAGTCAAGTTGATTACGAGG

GAPDH序列5Forward Sequence：CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA

序列6Reverse Sequence：GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC

Q-PCR反应体系：引物终浓度为0.2μM，反应总体积为50μl

蒸馏水	18μl
		SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix	25μl
引物Forward	1μl
		引物Reverse	1μl
样品溶液	5μl
		Total	50μl

Q-PCR反应条件：

实验重复3次。结果如图1B所示，确认在28例临床胶质瘤标本中，DCBLD2，而不是ST3GAL6，在14例标本中表达增加(Q-PCR中DCBLD2的阳性率为50％)。

(3)通过SAGE精灵(http：//cgap.nci.nih.gov/SAGE)对The Cancer GenomeAnatomy Project的网上现有数据进行SAGE数据分析。使用双尾t-检验与韦尔奇校正分析两组之间的显著性。结果如图1C和1D所示，方框内的数据显示为含有中位数的25-75百分位数。线段代表最大值和最小值。基因表达序列分析(SAGE)进一步证实DCBLD2在WHO II-IV级胶质瘤中的表达均高于正常脑组织(图1C、1D)。而ST3GAL6在胶质瘤标本和正常脑组织之间的表达无差异(图1C)。

(4)比较不同亚型胶质瘤的基因表达和基因组学变化。数据来源于TCGA(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)数据库。根据Verhaak(1)法分类胶质瘤亚型。通过Genome_Wide_SNP_6/log2的比率分析拷贝数。使用安捷伦G4502_07芯片的肿瘤/正常脑组织的比率取Log2值来代表基因在肿瘤和正常组织的表达水平，其数值代表肿瘤与正常脑标本中基因表达值的比率取Log2值。结果如图1E所示，DCBLD2在来自TCGA数据库的116例胶质瘤标本的基因组学表达水平显示，DCBLD2在间充质型胶质瘤(38例)的表达水平高于神经元型(19例)、前神经元型(37例)和经典型(22例)。

(5)临床胶质瘤肿瘤标本的原位杂交荧光检测(FISH)：

5.1取3例胶质瘤肿瘤标本，常规方法制成石蜡切片。

5.2临床胶质瘤肿瘤标本的原位杂交荧光检测(FISH)

FISH试剂：

1)1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；

2)20×SSC(pH7.0)：800ml水中溶解175g NaCl和88g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L

3)2×SSC：由20×SSC溶液稀释而成；

4)25mg/ml蛋白酶K消化液；

5)变性溶液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

6)杂交后水洗溶液：20×SSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

5.3脱蜡

1)二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2)100％酒精两次，每次2min；

3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

5.4蛋白酶处理：

1)每个染色缸加入40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：取40ml2×SSC倒入50ml离心管，在水浴槽中预热到37℃。将蛋白酶K(1g)加入离心管内，摇动直到酶溶解。

2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K消化溶液。将切片在37℃孵育20min。

3)2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

5.5变性：

1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2)78℃水浴槽中平衡预热染色缸及其中的变性溶液；

3)将切片加入染色缸中，78℃孵育8min；

4)即移入含有-20℃预冷70％酒精的染色缸内2min，再依次移入80％、90％和100％的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

5)空气干燥。

5.6杂交：

1)准备探针；用细菌人工染色体克隆(Invitrogen公司)RP11-79M2(123，351，114-123，538，059MB)和RP11-297J9(168937657-169120179MB)，分别作为DCBLD2和3号染色体参考对照的探针，使用Invitrogen公司的探针制备试剂盒(F32949)分别将DCBLD2和对照染色体标记上生物素和地高辛，获得生物素-DCBLD2和地高辛-3号染色体参考对照，终浓度均为1ng/μl。

2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4)盖上湿盒盖，37℃孵育16h。

5)镊子小心去除盖玻片；

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；

8)切片放入染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10)每张切片使用60μl FITC-亲和素(Vector Laboratories，SP-2040)和鼠源的地高辛抗体(Molecular Biochemicals，11333062910)，室温下孵育20min；

11)把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。

12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

13)每张切片滴60μl抗-亲和素(Vector Laboratories，BA-0300)和TRITC-兔抗小鼠抗体(Sigma，T4280)，室温孵育20min；

14)把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

15)1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5.7细胞核染色及观察：

1)1张切片加20μl DAPI(Sigma，D9564)，覆盖盖玻片并在室温下孵育5min；

2)尽可能快地在荧光显微镜下观察。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。结果如图1F所示，DCBLD2(FITC)相比3号染色体参考对照(TRITC)显著扩增。细胞核被染成蓝色(DAPI)。箭头，DCBLD2探针。实心三角形，3号染色体对照探针。DCBLD2和3号染色体对照的探针重叠产生白色的盘状结构由*表示。

实施例2：在胶质瘤衍生癌细胞株中，EGF刺激其细胞增殖和存活必须由DCBLD2介导

(1)使用fugen-6试剂盒(购自Roche，04709705001)按照说明书的实验步骤将DCBLD2的shRNA病毒质粒(shD2，Dhamarcon，Thermo Fisher Scientific，货号TRCLentiviral Human DCBLD2shRNA)和shRNA对照病毒质粒(shC，Dhamarcon，Thermo FisherScientific，TRC Lentiviral eGFP shRNA positive control)分别与psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid12259)共转染到SNB19和U87细胞中(购自ATCC，ATCC编号分别为CRL-2219^TM和HTB-14^TM)。

1.1293T细胞包装慢病毒：

293T细胞(购自ATCC，ATCC编号为CRL-3216^TM)培养于DMEM培养基：含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM培养液(Gibco，10564011)。

第一天，取对数生长末期的293T细胞(细胞数约为5×10⁶)，吸掉培养基。加入2mlDPBS(Invitrogen，14190250)在培养皿轻轻晃匀，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散293T细胞)。加入1ml0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养基终止消化。计数293T，铺到六孔板(Coming，3516)，细胞数约为5×10⁵，让其生长24h，转化前的细胞汇合度应该在80-90％。

第二天，按照fugen-6试剂盒的说明书操作。将DCBLD2的shRNA病毒质粒、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid12259)共转染293T细胞。单个孔分别需要病毒质粒1ug、psPAX20.75ug、pMD2G0.25ug，即4∶3∶1。同样方法将shRNA对照病毒质粒、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid12259)共转染293T细胞。

第三天，转染后的24h，更换成每孔3ml新鲜DMEM培养基，开始富集病毒。

第四天，转染后的48h收集病毒上清，即48h组分。用5ml注射器收集病毒上清后，经由0.45μm滤器(Millipore公司，SLHV013SL)过滤后，分装于1.5ml离心管，在4℃保存3-7天，应尽快使用。将转染病毒的293T继续更换为3ml新鲜DMEM培养基，再过24h，即为转染后72h，收集72h组分，按照48h组分相同的操作步骤，富集病毒上清。

1.2慢病毒转染SNB19和U87实验方法：

1)慢病毒转染前18-24h，将SNB19和U87以1×10⁵/孔铺到24孔板中，加入新鲜DMEM培养基进行培养，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁵/孔左右。SNB19和U87的新鲜DMEM培养基成分为含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)的DMEM培养液(Gibco，10564011)。

2)第二天，用含有6μg/ml polybrene(Sigma，H9628)的2ml新鲜DMEM培养基替换原培养基，加入100微升48h或者72h病毒悬液。37℃孵育。

3)24小时后，用新鲜DMEM培养基替换含有病毒的培养基。

4)继续培养。由于该慢病毒含有GFP荧光蛋白，一般转染48h后可见明显荧光表达，72h后更加明显。该慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，转染3天后开始加嘌呤霉素(Sigma，P8833，终浓度为400-600ng/ml)，细胞长满即可传代。期间每3天更换一次含有相同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选2星期后，即在显微镜下观察到80-90％GFP阳性细胞(即代表shRNA敲除成功细胞)。

1.3免疫印迹法验证shRNA敲除DCBLD2的效率及其对EGFR、p-EGFR表达的影响

1)收集蛋白样品

使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)裂解SNB19和U87。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

2)电泳

a、SDS-PAGE凝胶配制

使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

b、样品处理

在收集的蛋白样品中按比例加入浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，P0015)。沸水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。

c、上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，使用预染蛋白质分子量标准(P0066)判断蛋白分子量大小。

电泳时使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A)。

电泳时在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。

电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

3)转膜

选用碧云天生产PVDF膜(FFP36/FFP39)。

使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为60分钟。在转膜过程中会有非常严重的发热现象，因此把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

4)封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(碧云天，P0023C)中，漂洗2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(碧云天，P0023B)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。

5)一抗孵育

参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(碧云天，P0023A)稀释一抗。EGFR抗体(Ab-1，Oncogene Science，1∶1000)、p-EGFR抗体(Y1172，SignalwayAntibody，1∶1500)、DCBLD2抗体(E1781，Sigma，1∶1000)和β-actin(I19，Santa Cruz Biotechnology，1∶2000)。用滴管吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液(碧云天，P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6)二抗孵育

参考二抗-碧云天辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L(A0216)、山羊抗兔IgG(H+L)(A0217)的说明书，按照1∶1000的比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用滴管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7)蛋白检测

参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)ECL试剂来检测蛋白。使用X光片自动洗片机洗片。

结果如图2A所示，与对照慢病毒质粒shC相比，shD2能够显著降低SNB19和U87细胞中DCBLD2的表达水平。采用EGF(在细胞培养基中的终浓度为50ng/ml，购自Sigma，E9644)连续刺激细胞三天，收集蛋白，同时按照如上的实验步骤检测各蛋白的表达水平。EGF刺激不影响shD2对细胞DCBLD2表达水平的影响。shD2处理和EGF刺激均不影响SNB19和U87细胞中EGFR的表达水平。shD2降低DCBLD2表达后，EGF刺激仍然能够激活SNB19和U87中p-EGFR的表达。这说明DCBLD2位于EGFR/p-EFGR通路的下游。

(2)降低SNB19和U87中的DCBLD2，能够抑制EGF刺激的SNB19和U87的细胞增殖。

使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测SNB19和U87癌细胞株的体外增殖能力。结果如图2B表明EGF刺激能够显著提高SNB19和U87的细胞增殖能力。使用shD2降低SNB19和U87中的DCBLD2表达后，EGF无法再刺激SNB19和U87的细胞增殖。

(3)降低SNB19和U87中的DCBLD2，能够抑制EGF刺激的SNB19和U87的细胞存活。

使用TUNEL试剂盒(购自Roche，11684817910)按照说明书检测癌细胞株的活力。结果如图2C所示，表明EGF刺激能够显著降低SNB19和U87的细胞凋亡比例，促进细胞存活。使用shD2降低SNB19和U87中的DCBLD2表达后，EGF无法再降低SNB19和U87中的细胞凋亡比例。

实施例3：DCBLD2是EGFR驱动肿瘤形成的必需因素

(1)在人的神经胶质瘤中，表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)频繁扩增并且经常与其组成型激活突变体(△EGFR，又名EGFRVIII或de2-7EGFR)共表达。这种活化的致癌EGFR信号通路导致肿瘤的发生、发展及其对治疗的抗性。按照实施例2(1)1.1-1.2相同的实验方法，将过表达EGFRvIII(pcDNA3-EGFRvIII，Addgene，P13031)的病毒质粒转入SNB19和U87细胞，经过与实施例2(1)1.2中第4)步相似(步骤相同，仅抗生素种类及浓度有别)的筛选方法用新霉素(Sigma，N1142，终浓度为400ng/ml)获得内源性EGF刺激-过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII和U87/vIII)(80-90％GFP阳性细胞)。使用shD2进一步降低SNB19/vIII和U87/vIII以及无内源性EGFRvIII表达的亲本细胞(SNB19/P和U87/P)的DCBLD2表达(转染步骤及筛选步骤、筛选标准同实施例2中(1)的1.1-1.2)后，按照实施例2(1)1.3中的免疫印迹法检测各蛋白的表达水平。SNB19/P/shC代表在无内源性EGFRvIII表达的亲本细胞中转染shD2的对照质粒shC。SNB19/vIII/shC代表在内源性EGFRvIII过表达的SNB19/vIII细胞中转染shD2的对照质粒shC。SNB19/vIII/shD2代表在内源性EGFRvIII过表达的SNB19/vIII细胞中转染shD2，本实验中使用了两个shD2质粒转染以便于更好地验证DCBLD2降低对后续信号通路的影响，分别为#1和#2(Dhamarcon，Thermo Fisher Scientific，货号TRC Lentiviral Human DCBLD2shRNA)。同样的方法适用于U87细胞。其中DCBLD2抗体(E1781，Sigma，1∶1000)和EGFRvIII抗体(DH8.3，Santa CruzBiotechnology，1∶1000)。β-actin(I19，Santa Cruz Biotechnology，1∶2000)作为参比对照。结果如图3A所示，表明降低内源性过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII和U87/vIII)的DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，EGFRvIII的表达水平不受影响。

(2)降低内源性过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII和U87/vIII)的DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)，能够抑制EGFRvIII刺激的SNB19和U87的细胞增殖。

与实施例2(2)相同，使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测SNB19和U87癌细胞株的体外增殖能力。结果如图3B所示，表明内源性过表达EGFRvIII(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)能够显著提高细胞株的体外增殖能力。而在内源性过表达EGFRvIII(SNB19/vIII和U87/vIII)的基础上降低DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，EGFRvIII无法再促进细胞株的体外增殖能力。

(3)降低内源性过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII和U87/vIII)的DCBLD2表达，能够抑制EGFRvIII刺激的SNB19和U87的细胞存活。

与实施例2(3)相同，使用TUNEL试剂盒(购自Roche，11684817910)检测癌细胞株的活力。结果如图3C所示，表明内源性过表达EGFRvIII(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)能够显著减少细胞株的细胞凋亡比例。而在内源性过表达EGFRvIII的基础上降低DCBLD2表达(SNB19/vIII/shD2#1、 SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，EGFRvIII无法再减少细胞株的细胞凋亡比例。

(4)降低内源性过表达EGFRvIII的SNB19和U87细胞(SNB19/vIII/shC和U87/vIII/shC)的DCBLD2(SNB19/vIII/shD2#1、SNB19/vIII/shD2#2和U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)表达，能够抑制EGFRvIII刺激的SNB19和U87的克隆形成能力。

软琼脂培养克隆形成试验：

1)取对数生长期细胞，按照实施例2(1)1.1所述，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×10⁶细胞/L。

2)用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的琼脂液(BD，214220)，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

3)按1∶1比例使1.2％的琼脂液和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的胎牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

4)按1∶1比例让0.7％的琼脂液和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL(细胞数为5×10⁴/ml)的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养10天。

5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。

结果如图3D所示，表明内源性过表达EGFRvIII能够显著增加细胞株的细胞克隆形成率。而在内源性过表达EGFRvIII的基础上降低DCBLD2表达后，EGFRvIII无法再增加细胞株的细胞克隆形成率。

(5)内源性过表达EGFRvIII的U87细胞(U87/vIII)不依赖于EGF配体就可以组成型激活EGFR，把该细胞移植到裸鼠脑内可以诱发肿瘤。降低U87/vIII的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)，能够抑制U87/vIII在裸鼠脑内的成瘤能力。

5.1裸鼠脑内成瘤实验：

每组6只裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉，固定于脑立体定位仪上，消毒皮肤，头顶部正中切口，暴露前囟，按小鼠脑立位图谱，于前囟后1.5mm，中线右侧0.8mm处，Hamilton微量注射器(701-N)自脑表面垂直进针2.8mm，向单侧脑实质缓慢注入5μl细胞(共5×10⁵细胞，重悬于DPBS中)，注射时间5min，留针2min，缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行，缝合伤口。将裸鼠放回SPF层流架饲养，观察记录裸鼠生存期。

5.2裸鼠脑取材、OCT包埋、冰冻切片：

2-5周后，待裸鼠出现体型明显消瘦，背部高度弯曲等脑瘤征象时，使用干冰麻醉裸鼠。迅速断颈。剪开头顶部皮肤，剥离颅骨及软脑膜，暴露出整个鼠脑。轻轻地将鼠脑移出，切除嗅球及小脑后，包埋于OCT(Sakura，14-373-65)，迅速置于-80℃冰箱。次日，将包埋块经冰冻切片机切片，厚度为7微米。切片放置于-80℃冰箱保存。

5.3冰冻切片HE染色：

将切片自-80℃冰箱取出，室温平衡至水滴干燥，使用碧云天生产的HE染色试剂盒染色切片。

结果如图3E所示，U87/P/shC代表在无内源性EGFRvIII表达的亲本细胞中转染shD2的对照质粒shC。U87/vIII/shC代表在内源性EGFRvIII过表达的U87/vIII细胞中转染shD2的对照质粒shC。U87/vIII/shD2代表在内源性EGFRvIII过表达的U87/vIII细胞中转染shD2，shD2质粒有两个亚克隆，分别为1#和2#。U87亲本对照细胞(U87/P/shC)在裸鼠脑内不成瘤，过表达EGFRvIII并转染shD2对照shC后，U87/vIII/shC能在裸鼠脑内诱发肿瘤，而降低U87/vIII中的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，U87/vIII/shD2不能在裸鼠脑内诱发肿瘤。

(6)按照说明书，使用Leica公司的Ki-67染色试剂盒(NCL-Ki-67p)测定细胞增殖，采用实施例2(3)、实施例3(3)相同的TUNEL试剂盒(购自Roche，11684817910)检测细胞凋亡。

采用Olympus BX53显微镜(Olympus DP72数码相机)采集图片。每个小鼠脑切片随机收集5张图片，计数、统计Ki-67和TUNEL阳性细胞的数量和百分比。结果如图3E所示，表明过表达EGFRvIII后，U87/vIII/shC的Ki-67染色增多、而TUNEL染色降低，表明增殖细胞多、凋亡细胞少，而降低U87/vIII中的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)后，U87/vIII中的Ki-67增殖细胞减少、TUNEL凋亡细胞增多。

(7)使用Graphpad prism5.0软件，通过单因素方差分析比较各个指标在U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2和U87/vIII/shC与对照组U87/P/shC的统计学差异，结果如图3F所示：U87/vII/shC组裸鼠脑内成瘤的大小比U87亲本对照细胞(U87/P/shC)显著增大、Ki-67染色阳性的增殖细胞数目显著增多、TUNEL阳性的凋亡细胞数目显著减少。而降低U87/vIII的DCBLD2表达(U87/vIII/shD2#1、U87/vIII/shD2#2)，U87/vIII无法在裸鼠脑内成瘤，其Ki-67增殖细胞显著减少、TUNEL凋亡细胞显著增多。

实施例4：EGFR磷酸化DCBLD2的Y750位点，而不是Y621位点，是EGFR驱动肿瘤形成的关键环节

(1)EGFRvIII能导致SNB19和U87的DCBLD2的磷酸化。

1.1质粒转染：

按照实施例2(1)1.1-1.2所述的方法将抑制EGFRvIII活性的diacylglycerolkinase delta突变型病毒质粒EGFRvIII-DK(pcDNA3-EGFRvIII-DK，Addgene，P13034)包装293T细胞并转染U87细胞，传代筛选培养出U87/vIII的EGFRvIII活性降低的U87/vIII-DK细胞(筛选方法及筛选标准同实施例2(1)1.2)。SNB19/P和SNB19/vIII为实施例3(1)所制备。

1.2免疫共沉淀：

1)待细胞长满六孔板的单孔后，加入预冷的RIPABuffer(碧云天，P0013B，0.5ml/60cm2培养瓶)，冰上孵育30min；

2)用预冷的细胞刮子将细胞从培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中；

3)4℃，12000rpm离心10min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

4)准备Protein G/Aagarose(Invitrogen，15918-014)，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度，建议剪掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；

5)每1ml总蛋白中加入100μl Protein G/A琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(EP管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；

6)4℃，12000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中；

7)BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)测定蛋白浓度，定量，分装后，可以在-80℃保存一个月；

8)加入一定体积(2ug)的DCBLD2抗体(E1781，Sigma，1∶1000)到500μl总蛋白中；

9)4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；

10)加入50μl Protein G/A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物5h；

11)2000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，彻底吸尽上清；

12)用60μl1×上样缓冲液(碧云天P0011)将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀；

13)将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

14)按照实施例2(1)1.3所述的电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、蛋白检测方法检测使用DCBLD2抗体(E1781，Sigma，1∶1000)共沉淀后，各个蛋白表达水平。

采用抗酪氨酸的p-Y-DCBLD2抗体(4G10，1∶100)和p-EGFR^Y1045(Cell SignalingTechnology，1∶100)抗体分别标记p-Y-DCBLD2和p-EGFR，EGFR抗体与β-actin抗体同实施例2(1)1.3的免疫印迹法部分。

结果如图4A所示，表明U87亲本细胞(U87/P)只表达DCBLD2蛋白，不能与p-Y-DCBLD2和p-EGFR共沉淀。只有在U87/vIII细胞中能够检测到p-Y-DCBLD2时，才能够同时检测到p-EGFR。而降低U87/vIII的EGFRvIII活性的U87/vIII-DK细胞，其p-Y-DCBLD2和p-EGFR的表达水平均显著降低。因此，p-Y-DCBLD2和p-EGFR存在密不可分的关联。

实施例2、3的结果均表明降低DCBLD2的表达水平不影响细胞中EGFR或者EGFRvIII的表达水平。但是即使通过EGF刺激激活了p-EGFR的表达，DCBLD2自身的表达水平仍然不受影响。而本实施例进一步证实，降低U87/vIII 的EGFRvIII活性的U87/vIII-DK细胞，其共沉淀的p-EGFR和p-Y-DCBLD2的含量均显著降低。这表明p-Y-DCBLD2的表达水平特异性地受到p-EGFR调控。

(2)将EGF(50ng/ml，购自Sigma，E9644)添加在U87/vIII细胞的DMEM培养基中，连续刺激3天收集细胞。另有一组，在EGF刺激同时，使用EGFR酪氨酸激酶的抑制剂(Erlotinib，5ng/ml，183321-74-6，LC Laboratories)。将U87/vIII不使用EGF刺激、使用EGF刺激、使用EGF和Erlotinib同时处理的三种细胞培养3天后，按照实施例4(1)1.2的实验操作对蛋白质进行免疫共沉淀检测。结果如图4B所示，EGF刺激U87/vIII细胞能够诱导其表达p-EGFR和p-Y-DCBLD2。使用EGFR酪氨酸激酶的抑制剂(Erlotinib)后，EGF无法再诱导U87/vIII细胞表达p-EGFR和p-Y-DCBLD2。

(3)如图4C所示，DCBLD2的跨膜区域内没有任何信号调节结构域。本发明采用真核生物蛋白质功能位点的线性基序数据库(http：//elm.eu.org)识别出DCBLD2有两个TRAF6相互作用基序，分别位于639-647和743-751位点的氨基酸残基(序列9)FKPEEGKEA和(序列10)PAPDELVYQ(PxExxAr/Ac)。这两个保守的序列紧邻或者包含在EGFR诱导DCBLD2磷酸化的位点。

(4)为了验证Y621和Y750位点的酪氨酸磷酸化(p-Y)是否直接参与EGFR/EGFRvIII驱动的肿瘤形成，本发明先将pMXI-Flag-Myc DCBLD2质粒转染到目的细胞。这些细胞就可以通过Flag抗体共沉淀出DCBLD2以及其它与DCBLD2共沉淀的蛋白质。

4.1pMXI-Flag-Myc DCBLD2质粒制备：

使用DNA聚合酶(NEB，M0530S)由引物扩增出DCBLD2的cDNA，将该cDNA使用Asc I和Rsr II(NEB公司，R0558V和R0501V)按照说明书，通过双酶切插入pMXI-Flag-Myc vector(Adegene，41833)获得pMXI-Flag-Myc DCBLD2质粒。

序列7Forward Sequence：CGGCGCGCCATGGCGAGCCGGGCGGTG

序列8Reverse Sequence：GGACGGTCCGTGAAGGATTTCTTTAAAAAC

Q-PCR反应体系：引物终浓度为0.2μM，反应总体积为50μl

蒸馏水	38μl
		DNA聚合酶	5μl

引物Forward	1μl
		引物Reverse	1μl
样品溶液	5μl
		Total	50μl

PCR反应条件：

94℃，3min(预变性)；

94℃，20s——60℃，20s——72℃，60s(35循环)；

72℃，10min；

4℃，forever。

4.2pMXI-Flag-Myc DCBLD2质粒点突变：

本发明使用Invitrogen公司的点突变诱导试剂盒，按照说明书的步骤将pMXI-Flag-Myc DCBLD2的两个磷酸化位点替换为不能磷酸化的苯丙氨酸，F621和F750，获得pMXI-Flag-Myc DCBLD2^WT、pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621、pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F750和pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621/F750四种质粒。

4.3质粒转染：

按照实施例2(1)1.1-1.2所述的方法将将MXI-Flag-Myc DCBLD2质粒转染到U87/P、U87/vIII细胞，获得表达Flag-Myc DCBLD2的各株细胞。可以通过Flag抗体共沉淀出这些细胞中的Flag-DCBLD2、p-Y-Flag-DCBLD2以及其它与DCBLD2共沉淀的蛋白质。

将pMXI-Flag-Myc DCBLD2^WT、pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621、pMXI-Flag-MycDCBLD2^F750和pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621/F750四种质粒及其对照质粒(ADDGENE，PMXI-GFP，P13000)按照实施例2(1)1.1-1.2的实验方法分别与psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid12260)、pMD2G(外壳质粒，Addgene，Plasmid12259)包装293T细胞，继而转染到U87/P和U87/vIII，使用嘌呤霉素筛选至对照质粒转染组80-90％为GFP阳性细胞时，收集各组转染细胞，按照实施例4(1)1.2的步骤，免疫共沉淀。使用Flag抗体(Sigma，F9291)替换4(1)1.2第8)步中的DCBLD2抗体进行IP共沉淀。后续的实验方法相同。

结果如图4D所示，表明U87/P经过FIag-DCBLD2共沉淀后，未检测到EGFR的共沉淀，也未检测到p-Y-DCBLD2共沉淀。而在U87/vIII细胞，DCBLD2与EGFR共沉淀。但是在F621和F750双突变的U87/vIII^F621/F750细胞，只能检测到EGFR的共沉淀，未检测到p-Y-DCBLD2共沉淀。因此同时突变Y621和Y750终止了EGFR诱导的酪氨酸磷酸化，而单独Y621或Y750突变只是部分减少了DCBLD2的酪氨酸磷酸化(p-Y)。

(5)使用免疫印迹法(实施例2(1)1.3的步骤处理)进一步检测DCBLD2对于EGFR下游信号分子p-Akt抗体(Cell signaling，Ser473，#4060和Thr308，#2965，1∶1000)与anti-Akt(Cell signaling，#9272，1∶1000)的表达水平。结果如图4E所示，在U87/P降低DCBLD2表达(U87/P/shD2)对p-Akt表达影响不大，而在U87/vIII中p-Akt表达水平显著升高。在U87/vIII中使用shD2降低DCBLD2表达(U87/vIII/shD2)后，p-Akt的表达水平也显著降低。F621点突变后U87/vIII^F621中仍然高表达p-Akt。在F750和F621/F750点突变的U87/vIII(U87/vIII^F750和U87/vIII^F621/F750)中，其p-Akt的表达水平与U87/vIII/shD2组相似，均比U87/vIII组显著降低。

(6)在实施例3，将U87/vIII经过shD2降低DCBLD2表达(U87/vIII/shD2)后，在此细胞及其对照U87/vIII/shControl)的基础上，在实施例4(4)的4.3中按照实施例2(1)中1.1-1.2的方法，将pMXI-Flag-Myc DCBLD2^WT、pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621、pMXI-Flag-MycDCBLD2^F750和pMXI-Flag-Myc DCBLD2^F621/F750四种质粒包装293T细胞并转染到U87/vIII/shD2，将其对照质粒pMXI-Flag-Myc DCBLD2转染到U87/vIII/shD2和U87/vIII/shControl。使用实施例3的(5)5.1-5.3中的实验方法，将6种细胞分别脑立体定位注射到裸鼠脑内，经过冰冻切片、HE染色，结果如图4F所示，只有U87/vIII、U87/vIII^F621、U87/vIII^WT能够诱导裸鼠脑内肿瘤，而U87/vIII/shD2以及U87/vIII/shD2^F750和U87/vIII/shD2^F621/F750在裸鼠脑内无法诱导肿瘤形成。

(7)同时表达DCBLD2^WT和DCBLD2^F621的U87/vIII/shD2，而不是DCBLD2^F750和DCBLD2^F621/F750促进U87/vIII细胞增殖，抑制U87/vIII细胞凋亡。采用实施例实施例2(3)、实施例3(3)、实施例3(6)中的的TUNEL检测方法和实施例3(5)中的Leica公司的Ki-67染色试剂盒(NCL-Ki-67p)，结果如图4G所示，表明只有U87/vIII、U87/vIII^F621、U87/vIII^WT能够诱导裸鼠脑内肿瘤，其增殖细胞多、凋亡细胞少，而U87/vIII/shD2以及U87/vIII/shD2^F750和U87/vIII/shD2^F621/F750相反。因此，F750是DCBLD2信号通路的最关键位点。

实施例5：在临床胶质瘤标本中共表达p-DCBLD2^Y750与p-EGFR^Y1172的患者生存期显著缩短

(1)收集132例WHO II-IV级的临床胶质瘤标本切片行免疫组化染色：

1.1收集132例人的胶质瘤肿瘤标本(包括31例WHO II级，23例WHOIII级，78例WHOIV级胶质瘤肿瘤)和4例没有明显病理损伤和病史的正常脑组织。常规方法制成石蜡切片。

1.2对石蜡切片进行免疫组化染色(二步法)如下：

试剂：0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、双蒸水、梯度酒精、二甲苯、柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)、3％H₂O₂溶液(碧云天)；浓缩型DAB试剂盒(Dako，K340811)、中性树胶、p-DCBLD2^Y750抗体(Rabbit polyclonal to p-DCBLD2^Y750，Pacific immunology，1∶100)、p-EGFR^Y1172抗体(Rabbit polyclonal to p-EGFR^Y1172，Signalway Antibody，1∶50))、阴性对照(不含一抗的PBS)、抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂(PV-6001，中杉金桥生物技术有限公司)。

仪器：切片架；孵育盒；烤箱；移液器；小玻璃染色缸；水浴锅

具体步骤：

1)石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片30分钟。

2)二甲苯脱蜡：I、II各20分钟。

3)梯度酒精脱蜡：100％酒精I、100％酒精II、95％酒精、90％酒精、80％酒精各5分钟，双蒸水洗5分钟×2次。

4)抗原热修复：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在98℃左右，并持续15分钟。取出容器，室温冷却30分钟(不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗5分钟×3次。

5)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴3％H₂O₂，放入孵育盒中，盒底部放少量双蒸水。把盒子放入37℃水浴箱中孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗5分钟×3次。

6)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴(30～50ul)适当比例稀释的一抗，37℃孵育2小时，PBS洗5分钟×3次。

7)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(按照说明书在每500μl A液中加入2.5μl B液)，显色5分钟，显微镜下掌握显色程度，见黄褐色斑，放入双蒸水中终止显色。

8)苏木素复染3分钟，自来水冲洗30秒钟，盐酸酒精(盐酸：酒精的体积比为1∶100)分化5秒钟，自来水冲洗15分钟。

9)梯度酒精脱水：80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精I、100％酒精II各5分钟。

10)二甲苯透明：I、II各10分钟。

11)中性树胶封片。

12)放入60℃烘箱中烤干，显微镜下观察，p-DCBLD2^Y750抗体和p-EGFR^Y1172抗体染色阳性的胶质瘤标本如图5A中的黑色箭头所示。

(2)使用Graphpad Prism5.0对免疫组化染色的评分和患者生存期进行Kaplan-Meier survival分析。根据信号分子阳性细胞所占的百分比对标本计分：-，所有肿瘤细胞都检测不到信号，0％；±，低表达或者无信号，＜1％阳性细胞；1+，～5-25％阳性细胞；2+，～25％阳性细胞；3+，～50％阳性细胞。-或者±染色的肿瘤被认为是低表达肿瘤，而1+到3+的肿瘤是高表达肿瘤。结果如图5B-5D所示。如图5B所示，同时高表达p-DCBLD2^Y750、p-EGFR^Y1172(占胶质瘤患者的35％)的临床胶质瘤患者的生存期显著缩短(虚线表示)。如图5C所示，p-DCBLD2^Y750抗体在WHO II-IV级的胶质瘤标本中的染色强度不断升高。尤以WHOIV级胶质瘤的染色强度较之对照组正常脑组织显著升高。如图5D所示，在不同WHO分级之间以及与对照组正常脑组织相比，p-EGFR^Y1172抗体的染色强度均有显著性差异。肿瘤恶性程度越高，p-EGFR^Y1172抗体的染色强度越强。

(3)在胶质瘤患者的肿瘤切除术或活检术中，留取10mg左右的肿瘤组织保存至冻存管，快速置于液氮中长期储存(大于1年)。收集19例临床胶质瘤标本，按照实施例2(1)1.3的实验步骤行免疫印迹法分析。结果如图5E所示，19 例临床胶质瘤标本中有8例为EGFR(Ab-1，Oncogene Science)阳性。在8例EGFR阳性标本中，又有6例共表达了p-DCBLD2^Y750(占胶质瘤患者的32％)。这说明通过免疫印迹法也能检测到EGFR与p-DCBLD2^Y750的共表达，进一步在临床标本中通过另一种实验方法确证了本发明关于p-DCBLD2^Y750与EGFR信号通路密切相关的理论。这些结果都反复揭示了p-DCBLD2^Y750与p-EGFR^Y1172在胶质瘤中的共表达关联。

Claims

1.p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤的恶性程度的诊断试剂中的应用。

2.p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。

3.p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤的治疗药物中的应用。

4.p-EGFR^Y1172和p-DCBLD2^Y750在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。

5.一种神经胶质瘤的恶性程度诊断试剂盒，其特征在于，包含p-EGFR^Y1172的抗体和p-DCBLD2^Y750的抗体。

6.一种神经胶质瘤的患者的生存期预测试剂盒，其特征在于，包含p-EGFR^Y1172的抗体和p-DCBLD2^Y750的抗体。