CN109200288A - Msh3蛋白抑制剂在制备逆转mtx耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MSH3蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以MSH3为靶点，降低基因扩增程度，消减细胞内的DMs和HSR，同时，干扰MSH3可抑制HR、NHEJ和A‑EJ对DSBs的修复作用从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。此外，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。

Description

MSH3蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物 中的应用

技术领域

本发明涉及MSH3蛋白抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，特别涉及MSH3蛋白抑制剂在制备通过降低细胞对DNA双链断裂的修复能力，下调DHFR基因扩增，进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)作为一种抗代谢类抗肿瘤药物，广泛应用于急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、头颈部癌、膀胱癌和肺癌等疾病的治疗。MTX可通过竞争性地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活力，使二氢叶酸生成四氢叶酸的合成受损，导致DNA的合成受抑制，最终引起细胞死亡。但部分患者会在MTX治疗过程中产生获得性耐药，导致化疗失败。而MTX的主要靶酶DHFR的活性增高及其基因的扩增是使肿瘤对MTX产生耐药的主要机制之一。

基因扩增是染色体限制性区域拷贝数的增加，普遍存在于多种肿瘤中。细胞遗传学分析表明，基因扩增主要以染色体上的均质染色区(homogeneously staining regions,HSRs)和染色体外的双微体(double minute chromosomes,DMs)两种形式存在，其所承载的癌基因或耐药基因对肿瘤的进展与耐药具有驱动作用。关于HSR的形成机制主要有“断裂-融合-桥”模型，和DMs重新插入染色体模型。DMs的形成机制主要包括复制叉断裂模型、染色体环出模型、“断裂-融合-桥”模型和“易位-断裂-扩增”模型。虽然HSR和DMs的形成机制目前还存在较多的争议，但其本质事件均是DNA双链的断裂以及再连接。DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是一种致死性的DNA损伤，细胞中主要存在三种DSBs的修复途径，同源重组(homologous recombination，HR)、非同源末端连接(non-homologous endjoining，NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining，A-EJ)。

DNA错配修复(Mismatch repair，MMR)作为基因组的看管系统在生物的进化过程中高度保守，MMR能够检测和纠正复制过程中错误插入的核苷酸，进而保证复制的准确性。参加真核生物错配修复的蛋白包括：MSH2和MSH6形成的异源二聚体MutSα、MSH2和MSH3形成的异源二聚体MutSβ、EXOⅠ、MLH1和PMS2形成的异源二聚体MutLα、复制因子C(Replicationfactor C，RFC)、增殖细胞核抗原(proliferating cellular nuclear antigen,PCNA)滑动夹、单链DNA结合蛋白RPA、DNA聚合酶δ(polymeraseδ,polδ)和DNA连接酶Ⅰ。真核生物中的错配修复主要包括以下步骤：(1)错配的识别：RFC将PCNA装载到DNA链上，PCNA与MutSα或MutSβ异源二聚体结合，协助其识别到错配位置并招募MutLα二聚体。(2)核酸内切酶作用：MutSα或MutSβ和PCNA激活MutLα的核酸内切酶功能。(3)错误核苷酸的移除：MutSα与EXOⅠ形成复合物并激活EXOⅠ剪切大概200个碱基后，RPA会替代该复合物结合至DNA上，导致EXOⅠ无法继续剪切，直至EXOⅠ再次被MutSα激活。EXOⅠ每次剪切200个碱基，这个过程循环进行，直至移去错配部分。整个剪切过程的进度受RPA单链结合蛋白的调控。核苷酸的消化是一个双向的过程，既可以从错配的5′端开始也可以从错配的3′端开始。(4)修复合成：当移除错误的核苷酸后，在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成正确配对的DNA双链。此外，MMR在DSBs的修复中也发挥了重要作用。在HR修复途径中，MMR蛋白可识别异源链中的错配，抑制部分同源重组；真核生物MSH3还可识别并结合至HR过程中链侵袭或链退火形成的DNA分支结构的3′尾，招募并协助Rad1-Rad10对3′尾剪切。在NHEJ修复过程中，连接链之间往往也会存在碱基错配，MSH3可与MLH1和MSH2相互作用共同检测错配，阻止含有错配的DNA末端连接，招募核酸外切酶降解含错配的DNA末端。在A-EJ介导的抗体类别转换重组的过程中也需要MMR蛋白的参与。

本发明以MMR关键蛋白MSH3为靶点进行干扰后发现，干扰MSH3能够加快细胞周期进程，使含有DHFR扩增基因的微核外排增多；同时抑制DSBs的修复，减少DMs和HSRs的形成，导致细胞内DHFR基因剂量减少，细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转MTX耐药肿瘤细胞的耐药情况。因此，MSH3有望成为治疗MTX耐药肿瘤及其他含基因扩增的肿瘤的新靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对肿瘤化疗药物MTX常因在治疗过程中产生耐药而导致化疗失败的现象，提供以MSH3蛋白为靶点逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的方法。

本发明发明人前期构建人结肠癌细胞系HT29 MTX耐药的进化模型。本发明选用的细胞为对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的人结肠癌细胞，此时细胞中同时存在DMs和HSRs两种扩增形式，且以DMs为主。

本发明的技术方案是利用Western Blot检测HT29亲本及HT29 MTX耐药细胞中MMR关键蛋白MSH3、MSH2、MSH6和MLH1的表达水平。随后应用慢病毒载体在含DMs的MTX耐药细胞中稳定转染shMSH3，建立单克隆细胞系；并利用Western Blot检测干扰MSH3后MMR通路其他关键蛋白表达变化。随后利用Realtime PCR和Western Blot检测干扰MSH3后细胞中DHFR基因拷贝数、蛋白表达水平变化以及与DHFR位于同一扩增子上的其他7个与DMs和HSR形成相关基因：MSH3、ZFYVE16、XRCC4、POLK、CAST、CCNH和GLRX扩增水平的改变；并利用FISH技术检测干扰MSH3后DHFR的扩增形式，及含有DHFR的微核(micronuclei,MN)的外排情况是否发生变化。接下来利用报道质粒系统检测干扰MSH3后DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)修复通路：同源重组(homologous recombination,HR)、非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)及选择性非同源末端连接(alternative non-homologousend joining,A-EJ)修复能力的改变。最后利用MTS法检测干扰MSH3后细胞对MTX敏感程度的变化。

本发明在含DMs的MTX耐药细胞中，发现干扰MSH3可通过促进微核外排影响HSRs和DMs的稳定存在；同时，干扰MSH3可抑制HR、NHEJ和A-EJ对DSBs的修复，进而减少HSRs和DMs的形成。提示MSH3在基因扩增的过程中发挥重要作用。干扰MSH3可提高含DMs的MTX耐药细胞对MTX的敏感性，提示MSH3在肿瘤对MTX耐药进程中至关重要，为以MSH3为靶点逆转肿瘤细胞对MTX的耐药性提供科学依据。

具体的，为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

1.细胞培养构建进化模型

用浓度逐渐增加的MTX连续培养人结肠癌HT29细胞，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药，然后再用其进行后续试验。

2.MMR关键蛋白的表达分析

提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测MSH3及其他MMR关键蛋白MSH2、MSH6和MLH1在HT29亲本及含DMs的MTX耐药细胞中的表达情况。与HT29亲本细胞相比，对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的含DMs的HT29 MTX耐药细胞中MSH2与MSH3高表达，MSH6蛋白表达水平下降。

3.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3的单克隆的构建

确定含DMs的HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的含DMs的HT29 MTX耐药细胞接种于24孔培养板，待细胞长至80％时，进行稳定转染。细胞转染分两组进行：第一组转染慢病毒MSH3 shRNA；第二组转染慢病毒Control shRNA。培养72小时后，每个孔中加入相应浓度的嘌呤霉素进行稳定筛选，连续换液培养15天左右，当形成肉眼可见大小的克隆时，挑取单克隆。对照组克隆命名为DM-containing control，干扰组克隆命名为DM-sh-MSH3。

4.检测MSH3蛋白表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果

应用Western Blot方法检测MSH3在含DMs的HT29 MTX耐药细胞的对照克隆及干扰MSH3的克隆中的表达情况。经检测，干扰克隆中MSH3的表达量明显低于对照克隆中的表达量，证明我们成功地在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中建立了稳定干扰MSH3的单克隆。

5.稳定干扰MSH3改变MMR通路其他关键蛋白的表达水平

我们利用Western Blot技术在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，检测干扰MSH3前后MMR通路其他关键蛋白的表达变化。结果发现在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3后，细胞中的MSH6蛋白表达水平明显升高，MSH2的蛋白表达水平明显下降，MLH1蛋白表达水平无明显变化。

6.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3后基因扩增的变化

(1)利用Real-time PCR技术检测干扰MSH3前后DHFR基因拷贝数的变化，发现与对照组相比，在稳定干扰MSH3的克隆中DHFR基因拷贝数下降30％。并应用Western Blot比较了干扰MSH3前后DHFR蛋白表达水平的变化，发现与DM-containing control克隆相比，DHFR蛋白在DM-sh-MSH3克隆中的表达情况明显下降。

(2)采用Real-time PCR技术分析除DHFR外的其他7个与DMs和HSR形成相关基因的拷贝数变化情况，发现稳定干扰MSH3后，MSH3、ZFYVE16、POLK、XRCC4、GLRX、CAST和CCNH的拷贝数均发生明显下降。表明在含DMs的HT29MTX耐药细胞中，MSH3可能参与HSR和DMs的形成。

(3)应用FISH技术分析DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆中期染色体核型。我们将DHFR基因的BAC DNA标记为带有红色信号的荧光探针，并分别与DM-containingcontrol和DM-sh-MSH3克隆的中期核型特异性杂交。随后我们统计在两组克隆核型中含有DHFR信号的DMs和HSR的数目。发现干扰MSH3后，含DMs的HT29 MTX耐药细胞中含DHFR的DMs和HSR数目显著下降。

(4)微核外排是导致HSR和DMs数目减少的原因之一，我们应用FISH技术标记DHFR，随后分别随机拍摄了DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆中的细胞核。并将得到的细胞核图像按照有无微核外排分为两类，随后我们又将有微核外排的细胞核根据形成的微核是否含有DHFR信号分为两类。发现稳定干扰MSH3会促进微核的外排。

7.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3后DSBs修复能力变化

(1)我们在DM-containing control和DM-sh-MSH3两组克隆中加入MTX诱导DSBs，随后应用Western Blot技术检测γ-H2AX在细胞核中的表达水平，发现与对照组相比，干扰MSH3后细胞核中的γ-H2AX显著升高，说明在含DMs的HT29MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3可增加DSBs在细胞内的累积。

(2)报道质粒DR-GFP可用来检测HR的修复能力，DR-GFP由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-SceⅠ的酶切识别位点，而第二个GFP的序列缺少3′和5′端，因而均不能表达GFP。我们利用RNAi技术瞬时干扰含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的MSH3，其中对照组命名为si-Control，MSH3干扰组命名为si-MSH3。随后通过质粒转染使细胞中表达I-SceⅠ，此时第一个GFP被切断，并可利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，进而表达GFP。随后我们利用流式细胞仪检测GFP阳性比率，判断细胞的HR修复能力。发现瞬时转染抑制MSH3后，HT29 MTX耐药细胞的GFP阳性表达率明显下降，表明抑制MSH3可降低HR通路的修复能力。

(3)我们应用报道质粒EJ5-GFP来检测抑制MSH3后细胞NHEJ能力的变化。在质粒EJ5-GFP中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-SceⅠ识别位点，若细胞中表达I-SceⅠ且诱导DSBs，细胞可通过NHEJ途径修复该DSBs，并表达GFP。我们在HT29 MTX耐药细胞中稳定转染EJ5-GFP质粒，比较干扰MSH3前后细胞GFP表达比率的变化，结果显示与si-Control相比，si-MSH3组NHEJ修复能力显著下降。表明NHEJ修复过程需要MSH3的参与。

(4)我们采用EJ2-GFP对A-EJ的修复能力进行评估。该质粒包含了一个N末端被标记的融合GFP，且其N末端和GFP中间隔有一个跟随着终止密码子的I-SceⅠ识别位点，同时在I-SceⅠ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。若I-SceⅠ位点被识别且被切断形成的DSBs被A-EJ修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框，从而表达GFP，并造成35个碱基的缺失。我们利用稳定表达EJ2-GFP报道质粒的HT29 MTX耐药细胞评估干扰MSH3后，细胞A-EJ的修复能力。结果显示si-MSH3组较si-Control组阳性细胞比率明显下降，说明抑制MSH3可降低HT29 MTX耐药细胞的A-EJ修复能力。

8.HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3细胞对MTX的敏感性增强

我们采用MTS法比较了MTX对干扰MSH3前后含DMs的细胞的IC₅₀值(半数致死浓度)，结果显示在HT29 MTX耐药细胞中，对照组克隆的IC₅₀值是MSH3干扰组的1.85倍，说明抑制MSH3后细胞对MTX的敏感性增加。表明MSH3有望成为逆转MTX耐药肿瘤细胞的新靶点。

在上述研究的基础上，本发明提出了MSH3蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

其中，优选的，所述的MSH3蛋白抑制剂为在转录水平上抑制MSH3蛋白表达的药物。

其中，优选的，所述的药物为含有MSH3 shRNA的干扰载体。

其中，优选的，所述的含有MSH3 shRNA的干扰载体为含有MSH3 shRNA的慢病毒载体。

其中，优选的，所述的MSH3 shRNA的靶序列为SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体的MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体的人结肠癌HT29 MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

其中，优选的，所述的药物通过下调DHFR基因扩增，降低细胞对DNA双链断裂的修复能力，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。本发明针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以MSH3为靶点，降低基因扩增程度，消减细胞内的DMs和HSR，抑制细胞对DSBs的修复从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。进而全面揭示肿瘤耐药细胞中MSH3参与DMs和HSRs形成以及和肿瘤耐药的机制，有助于更全面了解因DSBs引发的肿瘤发生发展及耐药的过程，为逆转肿瘤耐药提供新策略。

附图说明

图1为MMR关键蛋白在HT29亲本及含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的表达情况的Western Blot图及柱状图；

图2为鉴定HT29 MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的Western Blot图及柱状图；

图3为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致MMR关键蛋白表达变化的WesternBlot图及柱状图；

图4为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致细胞内DHFR基因扩增量下降的实时定量PCR柱状图；

图5为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致细胞内DHFR蛋白表达量下降的Western Blot图及柱状图；

图6为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致5号染色体同一扩增子内DMs和HSR形成相关基因扩增程度下降的实时定量PCR柱状图；

图7为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致细胞内含DHFR基因的双微体数目下降的荧光原位杂交图(A)及统计图(B)；

图8为在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致γH2AX表达升高的Western Blot图；

图9为在HT29 MTX耐药细胞中瞬时转染siRNA后MSH3干涉效果的Western Blot图；

图10为质粒DR-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致HR修复能力下降的柱状图(B)；

图11为质粒EJ5-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致NHEJ修复能力下降的柱状图(B)；

图12为质粒EJ2-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致A-EJ修复能力下降的柱状图(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，以便更明确的阐述其优点和特点。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.细胞培养

将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验。

HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX。所有细胞均培养在5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中。

2.MMR关键蛋白在HT29亲本细胞及MTX耐药细胞中的表达水平

通过Western Blot检测HT29亲本细胞及对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的含DMs的HT29 MTX耐药细胞中MMR通路关键蛋白MSH3、MSH2、MSH6和MLH1的表达水平。

(1)细胞总蛋白的提取

取处于对数生长期的细胞，弃掉培养基，用4℃预冷的PBS冲洗细胞3次，吸净PBS。并将细胞培养皿置于冰上，按RIPA buffer：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂的体积比为10:1:1的比例配制细胞裂解液，取适量加入细胞中作用3-5分钟。用细胞刮刮下细胞并收集细胞悬液至Eppendorf管中。涡旋15秒后冰上静置20分钟，期间每10分钟涡旋一次。14000转/分，4℃离心40分钟。将上清收集于新的Eppendorf管，用BCA法测定蛋白浓度，并用RIPA buffer将样品调至统一浓度，加入1/4蛋白体积的5×loading buffer，于沸水中变性7分钟，保存于-20℃冰箱。

(2)SDS-PAGE凝胶电泳

按甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺＝1:29的比例配置30％凝胶储备液，并利用此储备液制作SDS-PAGE胶，根据目的蛋白的大小配制不同浓度分离胶。取混匀的蛋白样品，瞬时离心后上样。配制电泳液(100mL 10×电泳液+10mL 10％SDS+去离子水定容至1000mL)，先以80伏恒压电泳，当蛋白marker进入分离胶后，将电压升至120伏，恒压电泳至与目的蛋白分子量接近的marker条带达到分离胶1/3处，停止电泳。

(3)湿转法转膜

配制转膜缓冲液(100mL 10×电泳液+200mL甲醇+去离子水定容至1000mL)。取下凝胶于转膜缓存液中。根据凝胶大小剪取PVDF膜，并在甲醇中浸泡30秒激活PVDF膜。按阴极、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、阳极的顺序组装转膜装置，并将其转移至含转膜缓冲液的转膜槽中，转膜槽中放冰盒降温。300毫安恒流转膜。

(4)免疫反应

转膜结束后，将PVDF膜放于杂交盒中，加入TBS-T于摇床上洗膜3次，每次5-10分钟。弃掉TBS-T并加入含5％脱脂奶粉的TBS-T溶液(封闭液)，摇床上室温封闭1-2小时。弃掉封闭液，加入稀释好的一抗，4℃摇床杂交过夜。第2天回收一抗，TBS-T洗膜3次，每次10分钟，随后加入稀释的二抗，室温避光杂交1小时，回收二抗并用TBS-T洗膜三次，最后应用Odyssey Infrared Imaging System扫膜并获得结果图像。(抗体稀释比例如下：MSH2，1:500；MSH3，1:500；MSH6，1:500；GAPDH，1:10000)

结果表明，与HT29亲本细胞相比，MSH3和MSH2在HT29 MTX耐药细胞中的蛋白表达水平显著增加，MSH6的蛋白表达水平显著下降，而MLH1的表达无明显变化。表明MMR与耐药及基因扩增可能相关(图1)。

3.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3的单克隆的构建

(1)确定HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性

取生长情况良好的含DMs的HT29 MTX耐药细胞，胰酶消化处理后用培养基制成单细胞悬液。计数并按每孔10⁵个细胞的密度种于12孔板。待细胞贴壁后更换培养基，分别按终浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL、1.1μg/mL和1.2μg/mL加入相应嘌呤霉素。观察发现嘌呤霉素浓度为0.4μg/mL时，细胞在第7天恰好全部死亡。因而选0.4μg/mL的浓度作为细胞稳定转染时的适宜药物筛选浓度。

(2)稳定转染

MSH3 shRNA慢病毒载体及阴性对照病毒载体购自GeneCopoeia(广州复能基因)有限公司。MSH3 shRNA慢病毒载体名称为：HSH011492-2-LVRH1GP(OS213314)，其靶序列为：cttctaccagctatcttct(SEQ ID NO.1所示)。

培养含DMs的细胞至对数生长期，准备24孔培养板，每孔接种8×10⁴个细胞，添加培养基至500μL。第2天，冰浴融化慢病毒颗粒，按MOI值为10计算出转染时每孔需加慢病毒12μL，弃掉24孔板中的旧培养基并加入488μL的新培养基及12μL慢病毒颗粒。感染12-16小时后更换新鲜培养基，继续培养。感染72-96小时后观测荧光表达，评估慢病毒颗粒感染效率。

(3)稳定转染干扰MSH3单克隆的建立

感染慢病毒颗粒后进行药物筛选。将感染后的细胞按每孔3000个的数量接种于6孔板中。培养24小时待细胞贴壁后，更换为含适宜浓度嘌呤霉素的新鲜培养基，继续培养。每2天更换一次培养基，培养20天左右至细胞形成肉眼可见克隆后，胰酶消化并用枪头挑取单克隆，继续培养。HT29 MTX耐药细胞的对照组克隆命名为DM-containing control，干扰组克隆命名为DM-sh-MSH3。

4.检测MSH3蛋白表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果

由于MSH3是MMR通路中最为关键的蛋白之一，并且在HT29耐药细胞中蛋白表达水平升高，因此我们通过shRNA慢病毒载体在HT29 MTX耐药细胞中构建稳定干扰MSH3的单克隆细胞系。并利用Western Blot技术检测MSH3蛋白的干涉效果。如图2所示，与对照相比，MSH3的蛋白表达水平在sh-MSH3干扰组显著下降，证明我们成功地在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中建立了稳定干扰MSH3的单克隆。

5.稳定干扰MSH3改变MMR通路其他关键蛋白的表达水平

因为MSH3在MMR通路的错配识别过程发挥重要作用，我们利用Western Blot技术在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，检测干扰MSH3前后MMR通路其他关键蛋白的表达变化(实验方法和条件同上)。结果如图3所示，在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3后，细胞中的MSH6蛋白表达水平明显升高，MSH2的蛋白表达水平明显下降，MLH1蛋白表达水平无明显变化。

6.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3后基因扩增的变化

(1)为明确MSH3是否与DMs及HSRs的形成相关联，我们在含DMs的HT29MTX耐药细胞中，利用Real-time PCR技术检测了干扰MSH3前后DHFR基因拷贝数的变化。

a细胞基因组DNA提取

应用QIAmp DNA mini kit，并按照说明书步骤进行DNA提取。取细胞数量不超过5×10⁶的生长情况良好的细胞，PBS冲洗、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心。弃上清得到细胞沉淀。将沉淀弹开并加入200μL PBS、20μL蛋白酶K和200μL Buffer AL混匀后56℃水浴10分钟。随后加入200μL无水乙醇，涡旋混匀。将液体吸出并加入到QIAmpmini离心柱，8000转/分离心1分钟并更换收集管。向柱子中加入500μL Buffer AW1离心并更换收集管，条件同上。再加入500μL Buffer AW2，14000转/分全速离心3分钟。将柱子转移至新的1.5mL Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组DNA。测定DNA浓度并统一配平至50ng/μL。

b Real-time PCR

20μL PCR反应体系：

PCR的反应条件：

95℃ 6分钟，95℃ 20秒，Tm 20秒，72℃ 20秒，进行45个循环反应；融解曲线为95℃ 5秒，65℃ 1分钟，97℃。

进行三次独立重复实验，应用2^-ΔΔt法分析实验结果，并用内参基因ACTIN对目的基因结果进行归一化处理，最后用t检验进行统计分析。比较sh-Control和sh-MSH3组中目的基因的基因扩增量的变化，用倍数表示其差异结果。计算P值，当P<0.05时，两组具有统计学差异。

结果如图4所示，与对照组相比，在稳定干扰MSH3的克隆中DHFR基因拷贝数下降30％。

(2)为明确在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，抑制MSH3是否会影响DHFR的蛋白表达水平，我们应用Western Blot比较了干扰MSH3前后DHFR蛋白表达水平的变化(抗体稀释比例为DHFR，1:1000。GAPDH，1:10000)。结果如图5所示，与DM-containing control克隆相比，DHFR蛋白在DM-sh-MSH3克隆中的表达情况明显下降。

(3)本发明发明人前期对HT29亲本及HT29 MTX耐药细胞进行array CGH芯片分析，发现HT29 MTX耐药细胞中基因DHFR、MSH3、ZFYVE16、POLK、XRCC4、GLRX、CAST和CCNH共定位于5号染色体上的同一扩增子上，且这些基因存在于HSR上，而基因MSH3、ZFYVE16和DHFR也存在于DMs上，PLK2未在HT29MTX耐药细胞中发生扩增，选取该基因作为阴性对照。为进一步明确MSH3与HSR和DM形成的关联，我们采用Real-time PCR技术分析了除DHFR外的其他8个同HSR和DMs形成相关基因的拷贝数变化情况，其中Real-time PCR结果如图6所示，稳定干扰MSH3后，MSH3、ZFYVE16、POLK、XRCC4、GLRX、CAST和CCNH的拷贝数均发生明显下降。表明在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，MSH3可能参与HSR和DMs的形成。

(4)在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，干扰MSH3使DM和HSR上扩增基因拷贝数下降，为进一步明确干扰MSH3是否会影响基因扩增的形式。我们应用FISH技术分析了DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆的中期染色体核型。我们将DHFR基因的BAC DNA标记为带有红色信号的荧光探针，并分别与DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆的中期核型特异性杂交。随后我们在两组克隆核型中随机选取至少80个，统计其中含有DHFR信号的DMs的数目。

a中期染色体核型制备

培养细胞至有丝分裂旺盛时期，向细胞中加入秋水仙素(0.2μg/mL)作用1小时。1000转/分离心5分钟收集胰酶消化细胞和原培养基中的细胞。将细胞沉淀弹开并加入10mL预热的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液)，放于37℃水浴锅中作用15分钟。随后向离心管中加入1mL固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，1500转/分离心7分钟。弃上清再向弹开的沉淀中加入10mL固定液，室温固定1小时后离心，条件同上。重复上一步，之后再次弃上清，温柔弹开细胞沉淀并加入适宜量的固定液，将胞悬液垂直的滴在预冷的载玻片上。将玻片放于室温老化两天后储存于-20℃。

b BAC DNA的提取

制备LB培养液：200mL去离子水溶解酵母提取物1g、胰蛋白胨2g和NaCl 2g，利用高温高压对配置好的LB灭菌，待LB降温至室温后加入终浓度为25μg/mL的氯霉素。将BAC菌液加入LB中，37℃、220转/分摇菌14–18小时。应用无内毒素质粒大提试剂盒，根据说明书步骤提取BAC DNA。首先向吸附柱中加入2.5mL平衡液，8000转/分离心2分钟。将过夜培养的菌液加入离心管，室温8000转/分离心3分钟收集菌液，可通过多次离心的方法将菌体收集到一个离心管中。弃上清，向菌体沉淀中加8mL P1，充分涡旋振荡菌体沉淀。随后向离心管中加入8mL P2，翻转8次裂解菌体，并于室温放置5分钟。随后再加入8mL P4，再次翻转8次，于室温放置10分钟，8000转/分离心10分钟，将上清转移至过滤器中。并向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，混匀后将溶液倒入吸附柱中。8000转/分离心2分钟，弃掉废液。将吸附柱转移至新的离心管中，并加入10mL漂洗液，8000转/分离心2分钟，再重复此步骤，随后向吸附柱中加入3mL 无水乙醇，8000转/分离心2分钟弃废液。最后将吸附柱转移至一个新的50mL离心管中，向吸附柱中滴加1–2mL洗脱缓冲液，室温放置5分钟后8000转/分离心2分钟。离心管中收集得到的液体即为BAC DNA。应用紫外分光光度计测定BAC DNA的浓度，并将原液稀释至40–60ng/μL储存于-20℃。

c FISH探针标记

以上述得到的BAC DNA为模板，用随机引物法标记探针：向1μL BAC DNA中加入4μL随机引物，将混合物95℃反应10分钟后立即置于冰上2分钟。之后逐步加入1.6μL缺T的dNTPs、3.2μL Cy3/Cy5/Green dUTP和0.2μL Klenow fragment。将混合液放入37℃水浴锅中反应3小时，随后加入1μL Stop Buffer。

取3μL标记好的探针，加入3μL ssDNA，3μL Human CotⅠ，41μL去离子水，5μL3mol/L的醋酸钠和110μL预冷的无水乙醇。混和好后放置于-80℃冰箱沉淀20分钟，随后12000转/分离心10分钟，小心洗净上清后加入110μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，12000转/分再次离心10分钟，吸净上清，避光干燥5-10分钟。向沉淀中加入9μL杂交液后37℃反应2小时溶解探针。随后将探针转移至75℃水浴锅反应8分钟使其变性，变性后立即置于冰上2分钟，随后再次转移至37℃水浴锅反应30分钟，进行探针的预复性。

d FISH玻片处理流程

用钻石笔圈出滴有中期核型的区域，随后将玻片放入1×PBS中洗5分钟，再逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟进行梯度脱水。将玻片扇干后，将100μL RNase工作液加到核型区域，盖上PE手套小块后，将玻片放入湿盒并放入37℃孵箱反应40分钟。随后移去PE手套，用2×SSCⅠ溶液清洗玻片2次，每次洗3分钟；再将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟。扇干玻片再向核型区域上加入100μL胃蛋白酶工作液，用PE手套小块覆盖反应区域，将玻片放入湿盒并放入37℃孵箱反应15分钟。随后将玻片放入1×PBS中洗5分钟，再将玻片放入1％多聚甲醛中固定10分钟，再次用1×PBS洗玻片5分钟，随后再次将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟。扇干玻片后将玻片放入75℃甲酰胺溶液中反应3分钟。随后再将玻片放入4℃预冷的2×SSCⅠ溶液中洗两次并将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟。

e FISH杂交流程

将9μL预复性的探针滴加到标记核型的区域，并盖上20mm×20mm的盖玻片，用rubber cement封片，并将封好的片子放于湿盒中，并放入37℃孵箱中。

隔天反应结束后，揭掉rubber cement封片剂，并将玻片放入44℃的50％甲酰胺溶液中晃动至盖玻片脱落，随后计时15分钟。之后用2×SSCⅠ溶液洗两次玻片，并将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟，并扇干玻片。在标记区域滴加5μL DAPI染色，并在标记区域盖上24mm×32mm规格的盖玻片。最后用荧光显微镜观察中期核型及细胞核。

f FISH图像采集

利用Imaging System采集并分析图像。

结果如图7所示，干扰MSH3后，含DMs的HT29 MTX耐药细胞中含DHFR的DMs数目显著下降。

POLK、XRCC4、GLRX、CAST和CCNH的拷贝数显著下降，同时这些基因均共定位于5号染色体上的HSRs上，为了进一步明确干扰MSH3后是否会改变HSR的数目，我们应用FISH技术标记DHFR，随机分析了DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆的各50个中期染色体核型，并将核型按是否有含DHFR信号的HSRs分成两类。结果如下表1所示，HSRs的数目在干扰MSH3后显著下降。

表1.在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致细胞内含DHFR基因的HSR数目下降的统计表；

***P<0.001

(5)微核外排是导致HSR和DMs数目减少的原因之一，为了进一步明确在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3所引起的HSR和DMs数目的减少，是否是通过增加微核外排所导致的，我们应用FISH技术标记DHFR，随后分别随机拍摄了DM-containing control和DM-sh-MSH3克隆中600个以上的细胞核。并将得到的细胞核图像按照有无微核外排分为两类，随后我们又将有微核外排的细胞核根据形成的微核是否含有DHFR信号分为两类。结果如表2所示，发现稳定干扰MSH3会促进微核(MN)的外排(n>600，χ²检验，***P<0.001)。

表2.在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致微核外排增多的统计表

***P<0.001

7.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3后DSBs修复能力变化

(1)γ-H2AX是细胞中DSBs的标志物，我们在DM-containing control和DM-sh-MSH3两组克隆中加入MTX诱导DSBs，随后应用Western Blot技术检测γ-H2AX在细胞核中的表达水平，结果如图8所示，发现与对照组相比，干扰MSH3后细胞核中的γ-H2AX显著升高(抗体稀释比例如下：γH2AX，1:1000；GAPDH，1:10000)。结果表明，在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3可增加DSBs在细胞内的累积。核蛋白提取步骤如下：

吸净培养皿中的培养基，用预冷的PBS洗3遍，并用移液器吸净PBS。加入400μLCEB-A，用细胞刮刮取细胞至1.5mL Eppendorf管中。涡旋30s，冰上静置15分钟，每5分钟涡旋一次。加入20μL CEB-B，涡旋10s，冰上静置1min。1000g，4℃离心5分钟。弃上清，加入100μL CEB-A清洗沉淀，1000g，4℃离心5分钟。弃上清加入50μL NEB，涡旋10s。冰上静置30分钟，每10分钟涡旋15秒。12000g，4℃离心5分钟。上清即为细胞核蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，并用NEB将样品调至统一浓度，加入1/4蛋白体积的5×loading buffer，于沸水中变性7分钟，保存于-20℃冰箱。

(2)HR是细胞修复DSBs的主要途径之一，为检验干扰MSH3后是否会影响HR途径对DSBs的修复，我们引进了一系列基于绿色荧光蛋白的报道质粒系统。报道质粒DR-GFP可用来检测HR的修复能力，DR-GFP由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-SceⅠ的酶切识别位点，而第二个GFP的序列缺少3′和5′端，因而均不能表达GFP。首先我们利用RNAi技术瞬时干扰含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的MSH3，干扰效果如图9所示，其中对照组命名为si-Control，MSH3干扰组命名为si-MSH3。随后通过质粒转染使细胞中表达I-SceⅠ，此时第一个GFP被切断，并可利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，并表达GFP。随后我们利用流式细胞仪检测GFP阳性比率，判断细胞的HR修复能力。如图10所示，瞬时转染抑制MSH3后，含DMs的HT29 MTX耐药细胞的GFP阳性表达率明显下降，表明抑制MSH3可降低HR通路的修复能力。

a含报道质粒系统细胞系的构建

将生长状态良好的HT29 MTX耐药细胞按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行转染。首先配制混合液A(10μL LIPO2000和240μL Opti-MEM)和250μL混合液B(4μg质粒DNA和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。同时弃掉6孔板中的培养基并加入1.5mL新鲜培养基。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。72小时后待细胞状态稳定，用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，连续培养获得稳定表达报道质粒的细胞系。

b瞬转siRNA

将生长状态良好的含上述报道质粒的细胞按4×10⁵个/孔的密度接种于12孔板中。同时配制混合液A(2μL DharmaFECT 1Transfection Reagent和98μLOpti-MEM)和混合液B(2μL siRNA和98μL Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。随后将混合液加入到12孔板中的细胞悬液中，培养24小时后将12孔板中的细胞传代至6孔板。

c共转染I-SceⅠ质粒和siRNA

配制混合液A(10μL LIPO2000和240μL Opti-MEM)和250μL混合液B(5μLsiRNA、4μgI-SceⅠ质粒和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并室温放置20分钟。同时弃掉6孔板中的培养基并加入1.5mL新鲜培养基。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。I-SceⅠ表达后可识别报道质粒上相应的酶切位点并产生DSBs。

d流式分析

I-SceⅠ质粒和siRNA共转染后72小时，用胰酶消化6孔板中的细胞，收集细胞沉淀，用PBS洗2次细胞沉淀后，用1mL PBS重悬细胞沉淀。应用流式细胞仪检测含有绿色荧光蛋白信号的细胞，比较si-Control和si-MSH3两组细胞绿色荧光蛋白表达阳性率，进而明确干扰MSH3后细胞对DSBs修复能力的变化。

(3)NHEJ不需要同源链，可对细胞周期中各个时期产生的DSBs进行修复，因而是真核细胞修复DSBs的又一主要途径，为检验干扰MSH3是否会影响NHEJ对DSBs的修复，我们应用报道质粒EJ5-GFP来检测抑制MSH3后细胞NHEJ能力的变化。在质粒EJ5-GFP中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-SceⅠ识别位点，若细胞中表达I-SceⅠ且诱导DSBs，细胞可通过NHEJ途径修复该DSBs，并表达GFP。因而我们在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定转染EJ5-GFP质粒，比较干扰MSH3前后细胞GFP表达比率的变化，从而判断NHEJ修复能力的变化。结果如图11所示，与si-Control相比，si-MSH3组NHEJ修复能力显著下降。表明NHEJ修复过程需要MSH3的参与。

(4)A-EJ是不依赖于KU蛋白的新型DSBs修复途径，当细胞中的HR和NHEJ修复能力受损时，A-EJ作为后备修复途径对DSBs进行修复。但A-EJ易在修复过程中产生错误，易提高基因组的不稳定性并促进肿瘤发生。为了进一步明确MSH3被抑制是否会影响A-EJ对DSBs的修复能力，我们采用EJ2-GFP对A-EJ的修复能力进行评估。该质粒包含了一个N末端被标记的融合GFP，且其N末端和GFP中间隔有一个跟随着终止密码子的I-SceⅠ识别位点，同时在I-SceⅠ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。若I-SceⅠ位点被识别且被切断形成的DSBs被A-EJ修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框，从而表达GFP，并造成35个碱基的缺失。我们利用稳定表达EJ2-GFP报道质粒的HT29 MTX耐药细胞评估干扰MSH3后，细胞A-EJ的修复能力。结果如图12所示，si-MSH3组较si-Control组阳性细胞比率明显下降，。说明抑制MSH3可降低HT29 MTX耐药细胞的A-EJ修复能力。

8.HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3细胞对MTX的敏感性增强

DHFR基因的扩增是细胞发展为MTX耐药的主要原因，在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰MSH3，可导致DHFR拷贝数和蛋白表达水平的下降，为了证实干扰MSH3是否会改变细胞对MTX的敏感性，我们采用MTS法比较了MTX对干扰MSH3前后含DMs的细胞的IC₅₀值(半数致死浓度)，结果如下表3所示，在含DMs的MTX耐药细胞中，对照组克隆的IC₅₀值是MSH3干扰组的1.85倍，说明抑制MSH3后细胞对MTX的敏感性增加。表明MSH3有望成为逆转MTX耐药肿瘤细胞的新靶点。

MTS法评估细胞半数致死浓度方法如下：

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，用培养基重悬细胞并计数，并以每孔5000个细胞的密度将细胞接种于96孔板中。应用倍比稀释法配制连续浓度梯度的含MTX培养基，并将相应药物浓度的培养基加入到细胞中，每个药物浓度设置6个副孔。连续培养细胞72个小时后，弃掉96孔板中的培养基，向每个孔加入100μL培养基及20μL MTS，在37℃孵箱中孵育2–4小时后，应用酶标仪检测每个孔在OD 492nm处的吸光值。根据未加MTX的对照孔和加入MTX的加药孔的吸光值，计算出每个浓度MTX对细胞的生长抑制率，最后根据抑制率算出MTX对细胞的半数致死浓度。

表3.在HT29 MTX耐药细胞中干扰MSH3导致细胞对MTX敏感性增加的统计表

***P<0.01

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> MSH3蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用

<160>1

<170>Patent-In 3.5

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213> MSH3

<400>1

cttctaccag ctatcttct 19

Claims (9)

1.MSH3蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的MSH3蛋白抑制剂为在转录水平上抑制MSH3蛋白表达的药物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为含有MSH3shRNA的干扰载体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的含有MSH3shRNA的干扰载体为含有MSH3shRNA的慢病毒载体。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的MSH3shRNA的靶序列为SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为含双微体的MTX耐药细胞。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为含双微体的人结肠癌HT29MTX耐药细胞。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物通过降低细胞对DNA双链断裂的修复能力，下调DHFR基因扩增，从而达到逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的目的。