CN110433171A - miRNA-1293在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及miRNA‑1293或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。本发明首次发现了miRNA‑1293能够抑制结直肠肿瘤细胞的增殖以及促进结直肠肿瘤细胞的凋亡，这对降低结直肠肿瘤的死亡率具有重要的意义。

Description

miRNA-1293在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及miRNA-1293或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。
背景技术
结直肠肿瘤是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的发病率和死亡率，已成为严重威胁民众卫生健康的重要公共问题。最新数据显示，全球每年约有140万的结直肠肿瘤新发病例，有接近70万人死于结直肠肿瘤。广州结直肠肿瘤的发病率为36.81/10万，平均每天有7.5人被诊断为结直肠肿瘤。而且随着生活质量的改善和饮食习惯的改变，结直肠肿瘤患者越来越多。
此外，与西方国家相比，我国结直肠肿瘤早诊率低，约90％的患者被诊断时已处于中晚期，其中局部进展(II/III)期的患者接受以外科为主的综合治疗后仍有30％发生远处转移，而晚期(IV)患者5年生存率低于20％。发生远处转移仍然是导致结直肠肿瘤死亡的最主要原因。目前，结直肠肿瘤的治疗是以手术为主，超过半数的患者需要接受手术前后的化学药物治疗，然而很多临床回顾分析指出很大部分接受化疗的患者其实是对化疗药物不敏感甚至是有害无益的，甚至产生了肿瘤耐药。体现在一旦肿瘤细胞产生耐药性，化疗药物就不能发挥完全的抗肿瘤作用杀死肿瘤细胞，即使大多数的肿瘤细胞被杀死，而这一小部分具有抗药性的肿瘤细胞依然会继续生长，造成肿瘤复发，因此肿瘤耐药等问题大大限制了结直肠肿瘤化疗方案的治疗效果。miRNAs是大小约20-23bp广泛存在于真核生物中的一类内源性的非编码单链小分子RNA，它们通过与靶基因3’端非编码区域结合在转录后水平对基因表达进行调控，从而参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢等过程。miRNAs的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，并在肿瘤的发生、发展过程中充当着抑癌基因或癌基因的角色。研究表明基于miRNA的基因治疗方法可以作为一种有效的肿瘤治疗手段。
发明内容
本发明目的在于提供一种抑制结直肠肿瘤发展的miRNA分子药物在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。
发明人通过研究发现，在体外过表达miRNA-1293能够明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和促进结直肠肿瘤细胞的凋亡。
其中，所述的miRNA-1293可以是成熟的miRNA，也可以是前体RNA(pri-miRNA)或初级转录物(pre-miRNA)。Pri-miRNA长度从几百到几千个碱基不等，带有5’帽子和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹茎环结构，pri-miRNA经转运出核后，由Dicer酶剪切成为pre-miRNA，pre-miRNA经进一步剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明提供了miRNA-1293或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。
另外，所述的miRNA-模拟物(miRNA mimics)是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。具体地，所述的miRNA-1293模拟物为针对miRNA-1293的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA，作用与体内成熟的miRNA-1293是一样，可以上调细胞内相应miRNA-1293的含量，增强内源性miRNA-1293的功能。
其中，所述的miRNA-1293促进剂为增加miRNA-1293表达量或活性的物质或基因工具。所述增加miRNA-1293的表达量或活性的物质或基因工具，可以是在miRNA-1293正常表达的情况下，进一步增加miRNA-1293表达量或活性；也可以是在miRNA-1293受到抑制时，解除miRNA-1293抑制的物质或物质工具；还可以是遗传物质突变，导致miRNA-1293不能正常表达时，修复miRNA-1293正常表达的物质或者基因工具。总之，那些能够增加miRNA-1293表达量或者提高miRNA-1293活性的物质或者基因工具，无论是通过直接作用的方法，还是间接作用的方式，都可以称为本发明中的miRNA-1293促进剂。
作为一种可以选择的实施方式，所述的miRNA-1293的任意一个或多个核糖核苷酸被修饰。
作为一种可以选择的实施方式，所述miRNA-1293为成熟的miRNA、前体miRNA或初级转录物。
作为一种优选的实施方式，所述miRNA-1293为前体miRNA。
作为一种可以选择的实施方式，所述miRNA-1293模拟物含有SEQ IDNO.3UGGGUGGUCUGGAGAUUUGUGC和/或其互补序列。
作为一种优选的实施方式，所述miRNA-1293含有SEQ ID NO.5(SEQ ID NO.5:AGGUUGUUCUGGGUGGUCUGGAGAUUUGUGCAGCUUGUACCUGCACAAAUCUCCGGACCACUUAGUCUUUA)所示的序列。
作为一种可以选择的实施方式，所述miRNA-1293的促进剂为增加miRNA-1293表达量或其活性的物质或基因工具。
作为一种优选的实施方式，所述miRNA-1293的促进剂为含有miRNA-1293核酸片段的载体。
作为一种更为优选的实施方式，所述含有miRNA-1293核酸片段的载体为含有miRNA-1293核酸片段的质粒。
作为一种可以选择的实施方式，所述miRNA-1293来源于人、鼠、猴、兔或者化学或生物合成。
另一方面，本发明提供了一种抗结直肠肿瘤的药物组合物，包含miRNA-1293或其前体或其模拟物或其促进剂，所述药物组合物还含有化疗剂。作为一种可以选择的实施方式，所述药物组合物还包含药学和免疫学上可接受的载体。
作为一种可以选择的实施方式，所述的药物组合物的制剂形式为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂。
作为一种可以选择的实施方式，所述药物组合物的递送方法有：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装法。
还有一方面，本发明提供了一种检测miRNA-1293的试剂在制备诊断和预示结直肠肿瘤试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明其中一个实施例的有益技术效果：
本发明首次发现，在结直肠肿瘤发生、发展过程中，过表达miRNA-1293可以明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖并促进结直肠肿瘤细胞的凋亡，从而发挥高效的抗肿瘤作用，对结直肠肿瘤的治疗具有极大的意义。
附图说明
图1 Mimics能够模拟miRNA-1293的表达：(A)miRNA-1293mimics转染HCT 116细胞，miRNA-1293的表达量上升；(B)miRNA-1293mimics转染RKO细胞，miRNA-1293的表达量上升。
图2 RTCA技术测定miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力：(A)过表达miRNA-1293抑制HCT 116细胞的增殖能力；(B)过表达miRNA-1293抑制RKO细胞的增殖能力。
图3 CCK8法测定miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力：(A)过表达miRNA-1293抑制HCT 116细胞的增殖能力；(B)过表达miRNA-1293抑制RKO细胞的增殖能力。
图4 克隆形成实验测定miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力：(A)过表达miRNA-1293抑制HCT 116细胞的增殖能力；(B)过表达miRNA-1293抑制RKO细胞的增殖能力。
图5 EdU荧光显微镜检测法检测miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力：(A)过表达miRNA-1293抑制HCT 116细胞的增殖能力；(B)过表达miRNA-1293抑制RKO细胞的增殖能力。
图6 Western Blot法检测miRNA-1293促进结直肠肿瘤细胞的凋亡能力：(A)过表达miRNA-1293促进HCT 116细胞的凋亡；(B)过表达miRNA-1293促进RKO细胞的凋亡。
图7 流式细胞技术检测miRNA-1293促进结直肠肿瘤细胞的凋亡能力：(A)阴性对照NC mimics组HCT 116细胞的凋亡流式结果；(B)miRNA-1293mimics组HCT 116细胞的凋亡流式结果；(C)阴性对照NC mimics组RKO细胞的凋亡流式结果；(D)miRNA-1293mimics组RKO细胞的凋亡流式结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明中，所述的“互补”可以是完全互补，也可以是部分互补。所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。
本发明中的RNA为微小RNA(microRNA，或miRNA)，其是指单链的寡核糖核苷酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。
所述碱基，可以是无修饰碱基，也可以是修饰碱基。其中，所述修饰碱基，是指碱基连接基团包括但不限于NH2、生物素、胺基、低级胺基烷基、低级烷基、NHCOCH3、乙酰基、2'-氧基-甲基(2'O-Me)、DMTO、荧光素、硫醇或吖啶。
所述核糖，可以是无修饰核糖，也可以是修饰核糖。所述修饰核糖，是指核糖连接基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环氨基烷基、氨基烷基、聚氨基烷基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、嵌入剂、用于改善微小RNA的药代动力学性质的基团或用于改善微小RNA的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。另外的糖取代基包括2'-O-2-甲氧基乙基(2'-OCH2CH2OCH3)、2'-二甲基氨氧基乙氧基[2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2]、烯丙基(-CH2-CH═CH2)、O-烯丙基(-O-CH2-CH-CH2)、甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)和氟(F)等。
本发明中，所述“修饰”，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的核糖和/或碱基连接任何一种或多种基团或其组合。
实施例1结直肠肿瘤细胞培养
将人结直肠肿瘤细胞HCT 116和RKO(购买于ATCC，即美国模式培养物保藏所)培养于含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞汇合度达80％-90％时用0.25％胰酶对细胞进行消化传代。
实施例2细胞转染
1、用RNAiMAX转染试剂将miRNA-1293的模拟物miRNA-1293mimics和阴性对照NC mimics分别转染HCT 116和RKO细胞：
miRNA-1293mimics和阴性对照NC mimics(购买于吉玛基因公司)具体序列如下：
NC mimics：
SEQ ID NO.1 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’
SEQ ID NO.2 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’
miR-1293mimics：
SEQ ID NO.3 5’-UGGGUGGUCUGGAGAUUUGUGC-3’
SEQ ID NO.4 5’-ACAAAUCUCCAGACCACCCAUU-3’
2、具体实验步骤如下：
(1)将生长状态良好的、处于对数生长期的HCT 116和RKO细胞用胰酶消化后，分别按HCT 116细胞每孔3×105个、RKO细胞每孔3×105个的细胞密度种于6孔板，培养在RPMI-1640和DMEM培养基中，并置于二氧化碳培养箱内培养24h；
(2)培养过夜后，用125μL的Opti-MEM培养液稀释5μL RNAiMAX；用125μL的Opti-MEM培养液稀释1μL mimics；
(3)将稀释后的mimics加入稀释后的RNAiMAX中，总体积为250μL，轻轻吹吸3次混匀，室温静置15min，以便形成脂质体复合物。将250μL的脂质体复合物滴加入对应的6孔板中(miRNA 模拟物的终浓度为10nM)，左右前后轻柔摇晃培养板，放入培养箱培养过夜；
(4)次日，更换培养基，根据需要进行相关功能实验。
实施例3 Q-PCR检测miRNA-1293的表达水平
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞后(实施例2中步骤(4)得到的细胞)，提取RNA，进行加尾逆转，用Q-PCR检测其表达量。具体步骤如下：
1、用Trizol试剂分别收集转染48h后的HCT 116和RKO细胞，提取RNA：
(1)吸掉孔板中的培养基，用PBS洗2-3遍，尽量去除残留培养基，然后每孔加入1mLTrizol试剂对细胞进行裂解，用移液器不停地吹打均匀至清亮，将裂解液移入1.5mL离心管中，室温放置5min；
(2)每管加入200μL氯仿，充分混合，室温静置3min；
(3)4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相至另一新的1.5mL离心管中；
(4)每管加入0.5mL异丙醇混匀，4℃静置20min；
(5)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，RNA沉于管底；
(6)每管加入0.5mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，轻柔倾斜弃去上清；
(7)每管再加入0.5mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，12000rpm离心5min，弃上清；
(8)室温倒扣晾干约10min，用适量DEPC水溶解RNA；
(9)用超微量生物检测仪检测RNA浓度。
2、用试剂盒Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR Kit(Takara)逆转录miRNA：
表1配制10μL逆转录反应体系
逆转录反应条件：37℃60min，85℃5min。
3、使用SYBR Green的Real-time PCR法检测miRNA-1293的表达水平，按照Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR Kit(Takara)试剂盒的说明书进行操作。使用ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。
表2配制样本Real-time PCR反应体系
表3配制内参U6Real-time PCR反应体系
Real-time PCR反应条件：预变性95℃30sec；45个循环95℃5sec，60℃30sec；溶解曲线95℃60sec，55℃30sec，95℃30sec。
实验结果：如图1A和图1B所示，qPCR仪器分析出HCT 116miRNA-1293的Mean Ct值为15.204，RKO miRNA-1293的Mean Ct值为13.905，利用相对定量法，计算相对模板量(2^-ΔΔCt)分别为23946.447(标准差为1831.23)和3193.836(标准差为144.39)。
结果表明，miRNA-1293mimics转染HCT 116和RKO后细胞中miRNA-1293的表达量显著性上升，证明mimics能够模拟miR-1293的表达。
实施例4 miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力
1、RTCA技术(细胞实时动态分析技术)验证miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞后，使用的培养基分别为含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基，采用xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统分析细胞增殖能力，具体实验步骤如下：
(1)在E-Plate 16板的孔中加入100μL培养基后，将E-Plate 16板置于RTCA DP仪器上，检测基线，确保所有孔的接触正常(所有孔的Cell Index低于0.063)；
(2)取出E-Plate 16板，将转染后的HCT 116和RKO细胞(实施例2中步骤(4)转染24h后的细胞)消化并接种于E-Plate 16板中，HCT 116和RKO细胞接种量均为2000个；
(3)将E-Plate 16板置于培养箱中放置30min；
(4)将加入细胞的E-Plate 16板置于RTCA DP仪器上，并在培养箱连续观察5-6天，进行实时动态的细胞增殖检测：
表4 RTCA程序设置如下：
实验结果，如图2A和图2B所示，RTCA实时细胞分析系统显示，HCT 116细胞铺板后，NC和miRNA-1293处理细胞分别在108h和120h进入平台期，细胞指数分别为4.57和4.28；RKO细胞铺板后，NC和miRNA-1293处理细胞144h仍未进入平台期，但miRNA-1293的增殖曲线的细胞指数读值比NC低，细胞指数分别为2.33和1.13。
上述结果表明，miRNA-1293mimics能够明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。即本发明证明miRNA-1293能够明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。
2、CCK8法验证miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞后，使用的培养基分别为含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基，采用CCK8法验证细胞的增殖能力，按照DOJINDO Cell Counting Kit-8CK04-500试剂盒的说明书操作，具体实验步骤如下：
(1)将转染后的HCT 116和RKO细胞(实施例2中步骤(4)转染24h后的细胞)消化并接种于96孔板中，HCT 116和RKO细胞接种量分别为5000个；
(2)放置在二氧化碳培养箱内培养至对照孔密度汇合率达80％；
(3)向各孔中加入10μL CCK-8；
(4)放置在二氧化碳培养箱内培养1-4h；
(5)用酶标仪测定450nm处的OD值；
(6)活力计算：活力比值＝样品孔平均值/对照孔平均值。
实验结果：如图3A和图3B所示，酶标仪分析出HCT 116miRNA-1293的OD值为0.43(标准差为0.05)，RKO miRNA-1293的OD值为0.78(标准差为0.07)。
上述结果表明，miRNA-1293mimics能够明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。即本发明证明miRNA-1293能够明显抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。
3、克隆形成实验验证miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT116细胞和RKO细胞后，采用细胞克隆实验验证细胞的增殖能力，具体实验步骤如下：
(1)细胞接种：将转染后的HCT 116和RKO细胞(实施例2中步骤(4)转染24h后的细胞)消化并接种于6孔板中，使用的培养基分别为含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基，HCT 116和RKO细胞接种量均为500个。接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使细胞尽量均匀分布；
(2)细胞培养：细胞按常规条件培养，第5天更换培养基，观察克隆形成情况；
(3)克隆染色：当细胞形成肉眼可见的克隆时终止培养(本实施方案是在第8天和第9天终止培养)，弃培养基。用PBS小心清洗细胞2次，弃PBS。每孔加入甲醇1mL，固定5min，弃固定液，以流水缓慢冲洗干净。每孔加入考马斯亮蓝1mL，染色15min，以流水缓慢洗去染色液，放置通风橱中干燥；
(4)克隆计数：计算克隆形成的细胞面积，每个样品取三个孔进行计数后取均值。
实验结果：如图4A和图4B所示，利用Image-Pro Plus软件分析，取三个孔的细胞面积计数，HCT 116NC和miRNA-1293面积平均值分别为52895.33(标准差为4131.14)和17452.67(标准差为339.96)，RKO NC和miRNA-1293面积平均值分别为55137.67(标准差为3480.40)和7719.00(标准差为2894.27)。
上述结果表明，miRNA-1293能明显抑制结直肠肿瘤细胞的克隆形成能力。即miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖
4、EdU荧光显微镜检测法验证miRNA-1293抑制结直肠肿瘤细胞的增殖
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞后，采用EdU荧光镜检法验证细胞的增殖能力，按照Cell-LightTM EdU荧光显微镜检测试剂盒的说明书操作。具体实验步骤如下：
(1)细胞培养：将转染后的HCT 116和RKO细胞(实施例2中步骤(4)转染24h后的细胞)消化并接种于24孔板中，HCT 116和RKO细胞接种量均为1×105个/孔，使用的培养基分别为含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基，.培养至细胞处于对数生长期；
(2)EdU标记细胞：弃培养基，每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃培养基，用PBS清洗细胞1-2次(用相应培养基按1:1000的比例稀释试剂A EdU溶液，制备50μM EdU培养基)；
(3)细胞固定化：每孔加入100μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液。每孔加入100μL 2mg/mL甘氨酸孵育10min，弃甘氨酸。用PBS清洗2次，弃PBS。每孔加入200μL渗透剂(即含0.5％TritonX-100的PBS)透化细胞10min，弃渗透剂。用PBS冲洗1次，弃PBS；
(4)EdU的检测：每孔加入200μL的1x染色反应液，避光，室温孵育30min，弃反应液。每孔加入200μL渗透剂(即含0.5％TritonX-100的PBS)清洗2次，弃去。每孔加入100μL甲醇清洗5min，弃去。用PBS冲洗1次，弃PBS：
表五染色反应液的配置比例(总体积10mL为例，现用现配)
(5)DNA染色：每孔加入200μL的1 x Hoechst33342反应液(用去离子水按100:1的比例稀释试剂F Hoechst33342)，避光，室温孵育30min，弃染色反应液。用PBS冲洗3次，弃PBS；
(6)图像获取及分析：用激光共聚焦显微镜采用Hoechst 33342及643进行DNA复制活性检测：
表六荧光染料的相关波长信息
实验结果：如图5A和图5B所示，利用Imag J软件分析，取四个视野计数，HCT 116NC和miRNA-1293细胞阳性率平均值分别为54.83％(标准差为3.99)和32.55％(标准差为2.30)，RKO NC和miRNA-1293细胞阳性率平均值分别为89.25％(标准差为6.06)和42.63％(标准差为2.82)。
综上结果表明，miRNA-1293能够抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。
实施例5 miRNA-1293促进结直肠肿瘤细胞的凋亡能力
1、Western Blot验证miRNA-1293促进结直肠肿瘤细胞的凋亡
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞(实施例2中步骤(4)得到的细胞)48h后，收集蛋白，通过Western Blot实验检测细胞中蛋白表达水平验证细胞的凋亡情况。具体实验步骤如下：
(1)蛋白提取：将转染后的HCT 116和RKO细胞消化离心收集下来(含上清)，转移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min，弃上清。用PBS清洗离心后弃上清。加入细胞裂解液，冰上放置30min。超声破碎后，4℃14000rpm离心5min，吸取上清用BCA法测蛋白浓度。计算出上样蛋白体积，以裂解液调平，按1：4体积加入5x蛋白上样缓冲液。100℃变性10min，冰上放置10min，防止复性。细胞裂解液配制方式为100μL RIPA加入1μL蛋白酶抑制剂(100mM)和2μL磷酸酶抑制剂(50mM)；
(2)SDS-PAGE凝胶的配制：配制浓度为10％和15％的SDS-PAGE分离胶，倒制凝胶后用异丙醇覆盖凝胶顶层以隔绝空气，静置约30min，待分离胶凝固后移除异丙醇，将浓缩胶注入分离胶上端并插入样品梳，静置约30min；
(3)上样：将制备好的凝胶放入电泳槽，往电泳槽里外槽加入1x电泳缓冲液。拔走样品梳，通过吹打方式洗净点样孔，并移除凝胶碎片，然后依次加入10μL蛋白Marker和20μg或40μg蛋白；
(4)电泳：80V预电泳30min、150V电泳直至溴酚蓝染料到达凝胶末端处停止；
(5)转膜：电泳完成后取出凝胶，采用湿转法将蛋白从凝胶转至PVDF膜；
(6)封闭：按需要切割PVDF膜，加入封闭液(即含5％脱脂牛奶的TBST)，摇床振荡，室温封闭1h；
(7)抗体孵育：弃封闭液，加入TBST清洗3次，每次10min。加入一抗稀释液稀释的一抗，4℃孵育过夜。回收一抗，然后用TBST洗膜3次，每次10min。加入HRP标记二抗(1:5000)，室温孵育2h。弃去二抗，然后用TBST洗膜3次，每次10min；
(8)ECL显影：将ECL化学发光试剂A、B液按照1:1的比例避光混匀，滴加到PVDF膜上，避光反应适当时间；
(9)成像扫描：将PVDF膜置于化学发光成像仪成像，扫描条带。
实验结果：如图6A和图6B所示，利用Image J软件进行条带灰度值分析，HCT116miRNA-1293的PARP/length PARP相对表达水平值为2.690，cleaved-cas 3/cas 3相对表达水平值为23.658；RKO miRNA-1293的PARP/length PARP相对表达水平值为3.232，cleaved-cas 3/cas 3相对表达水平值为2.158。
2、流式细胞技术验证miRNA-1293促进结直肠肿瘤细胞的凋亡
用NC mimics和miRNA-1293mimics分别转染HCT 116细胞和RKO细胞后(实施例2中步骤(4)得到的细胞)，加入5-Fu处理48h，通过流式细胞术检测细胞的凋亡情况，按照Annexin V-FITC/PI凋亡双染试剂盒的说明书操作。
(1)将转染后的HCT 116和RKO细胞用不含EDTA的胰酶消化离心收集下来(含上清)；
(2)用PBS洗涤细胞2次，2000rpm离心5min收集1-5×105细胞；
(3)加入500μL的Binding Buffer来悬浮细胞；
(4)加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；
(5)避光，室温反应5-15min；
(6)流式细胞仪检测分析：Annexin V-FITC单阳性和Annexin V-FITC/PI双阳性的细胞计为凋亡细胞。激发波长Ex＝488nm、发射波长Em＝530nm。其中Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光(流式Ex＝488nm、Em＝630nm)通过FL2或FL3通道检测。
实验结果：如表7、图7所示，HCT 116NC和miRNA-1293凋亡率分别为6.94％和26.1％，RKO NC和miRNA-1293凋亡率分别为3.70％和22.54％。
表7细胞流式细胞仪检测结果
综上结果表明，miRNA-1293具有能够促进结直肠肿瘤细胞的凋亡能力。
序列表
<110> 中山大学附属第六医院
广州生物马达核酸纳米技术开发有限公司
<120> miRNA-1293在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NC模拟物正向链
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NC模拟物反向链
<400> 2
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRNA-197-3p模拟物正向链
<400> 3
uggguggucu ggagauuugu gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRNA-197-3p模拟物反向链
<400> 4
acaaaucucc agaccaccca uu 22

Claims (10)

1.miRNA-1293或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miRNA-1293的任意一个或多个核糖核苷酸被修饰。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-1293为成熟的miRNA、前体miRNA或初级转录物；
优选地，所述miRNA-1293为前体miRNA。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-1293模拟物含有SEQ ID NO.3所示的序列和/或其互补序列；
优选地，所述miRNA-1293含有SEQ ID NO.5所示的序列。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-1293的促进剂为增加miRNA-1293表达量或其活性的物质或基因工具；
优选地，所述miRNA-1293的促进剂为含有miRNA-1293核酸片段的载体；
更为优选地，所述含有miRNA-1293核酸片段的载体为含有miRNA-1293核酸片段的质粒。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-1293来源于人、鼠、猴、兔或者化学或生物合成。
7.一种抗结直肠肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含miRNA-1293或其模拟物或其促进剂，所述药物组合物还含有化疗剂；
优选地，所述miRNA-1293如权利要求2或3或6所述；
或优选地，所述miRNA-1293模拟物如权利要求4所述；
或优选地，所述miRNA-1293促进剂如权利要求5所述。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学和免疫学上可接受的载体；
优选地，所述的药物组合物的制剂形式为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的递送方法有：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装法。
10.检测miRNA-1293的试剂在制备诊断和预示结直肠肿瘤试剂盒中的应用。
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