CN112007043A - 抗结直肠癌的药物或组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗结直肠癌的药物或组合物。本发明首次发现，在结直肠癌发生、发展过程中，过表达特定序列小分子RNA(如ath‑miR158a或其变体)可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖并促进结直肠癌细胞的凋亡，从而发挥高效的抗肿瘤作用，对结直肠癌肿瘤的治疗具有重要意义。

Description

抗结直肠癌的药物或组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种抗结直肠癌的药物或组合物。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球普遍可见的消化系统高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，并且死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。另外，随着人口老龄化、环境污染及饮食习惯的改变，结直肠癌的发病人数呈逐年上升的趋势。结直肠癌发病和致死的主要原因是癌细胞转移，但目前对CRC的转移机制尚不清楚，使得对结直肠癌的预防和治疗更加困难。目前有四种标准化的结直肠癌治疗手段：外科手术、放疗、化疗和靶向药物治疗。市场上用于治疗结直肠癌的药物主要有：常用的西药包括卡培他滨、氟尿嘧啶以及伊立替康等但大都不完全有效。因此，亟需探明结直肠癌发生发展的分子机制及积极寻找治疗结直肠癌的新的治疗靶点。

小分子RNA(Special sRNA)主要包括miRNA和siRNA以及人工合成的miRNA/RNAmimic。miRNA(microRNA)是一类20～22nt的小分子非编码RNA，miRNA可以通过转录后水平参与mRNA的调节作用。目前，在许多生物功能及疾病发生中发挥重要的作用，哺乳动物细胞核中，miRNA首先由RNA聚合酶II转录出较长的初始miRNA(pri-miRNA)，接着在Drosha作用下形成前体miRNA(pre-miRNA)，并被复合体转运出细胞核。在细胞质中，在Dicer的剪切下形成双链miRNA，与AGO蛋白相结合，双链miRNA会被去除其中一条链进而形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，从而调节基因的表达。siRNA和miRNA有着类似的作用，但是siRNA结合的AGO蛋白又区别于miRNA。miRNA在互补配对的原则下，引导RISC复合体寻找相应的靶基因，通过对下游靶基因的切割或者翻译抑制而达到降低靶基因的表达及翻译水平。在动物中，miRNA主要通过转录抑制作用，其核心的序列是从成熟序列5’开始的1-8位，第一位碱基的序列影响着miRNA所结合的AGO蛋白，而2-8位则影响了miRNA对下游靶基因翻译的抑制效率。siRNA几乎与下游靶基因完全配对，其核心区域从第一个碱基到最后一个碱基都非常重要。miRNA和siRNA在经过Dicer剪切后形成的复合体都能结合上AGO蛋白，它们都会对下游靶基因特异性的识别并抑制下游靶基因的表达或翻译。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗结直肠癌的药物或组合物。

本发明的另一目的是提供ath-miR158a在制备用于抑制结直肠癌细胞生长与迁移的药物以及结直肠癌治疗中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物或其衍生物或含有ath-miR158a的生物材料在制备抗结直肠癌的药物或组合物中的应用。

本发明中，所述ath-miR158a可以是ath-miR158a-3p和/或ath-miR158a-5p。

优选地，所述ath-miR158a为ath-miR158a-5p，序列为：5’-CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA-3’(SEQ ID NO:1)。

进一步地，ath-miR158a-5p的变体是指SEQ ID NO:1所示序列的第2-13位发生1或2个碱基取代。

进一步地，ath-miR158a-5p的变体可选自①～⑤中的任一个(SEQ ID NO:2-6)：

①5’-CUUUGUCCACAAUUUUGGAAA-3’；

②5’-CUUUGUUCACAAUUUUGGAAA-3’；

③5’-CUUUGUCUAUAAUUUUGGAAA-3’；

④5’-CUUUGUCUACAACUUUGGAAA-3’；

⑤5’-CUUUGUCUACAUUUUUGGAAA-3’。

本发明中，ath-miR158a的模拟物(RNA mimics)是根据ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体的序列设计的双链RNA。

优选地，所述双链RNA含有ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体的序列和/或其互补序列。

本发明中，ath-miR158a的衍生物是指ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物序列中一个或多个核糖核苷酸被LNA、甲基化和/或磷酸化修饰。

本发明中，所述生物材料可以是重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分等。

第二方面，本发明提供ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物或其衍生物或含有ath-miR158a的生物材料在抑制结直肠癌细胞的生长与迁移以及结直肠癌治疗中的应用。

第三方面，本发明提供抗结直肠癌的药物或组合物，其有效成分为ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物或其衍生物或含有ath-miR158a的生物材料。

优选地，所述药物或组合物中还含有化疗剂。ath-miR158a和化疗剂可以同时给药或先后给药。

优选地，所述药物或组合物还包含药学及免疫学上可接受的载体。

优选地，所述药物或组合物可以是冻干粉针、注射剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂或贴剂等剂型。

所述药物或组合物的递送方式包括：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装法。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现，在结直肠癌发生、发展过程中，过表达特定序列小分子RNA(如ath-miR158a或其变体)可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖并促进结直肠癌细胞的凋亡，从而发挥高效的抗肿瘤作用，对结直肠癌肿瘤的治疗具有重要意义。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中用CCK-8法检测Special sRNA对HCT116细胞增殖活性的影响。

图2为本发明较佳实施例中用Transwell法检测Special sRNA对HCT116细胞迁移活性的影响。

图3为本发明较佳实施例中通过蛋白质免疫印迹检测上皮细胞间质转化相关蛋白标志物Ecadherin(E-cad)和MMP9蛋白质表达差异。

具体实施方式

本发明提供一类特定序列的小分子RNA(Special sRNA)或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠癌药物以及治疗结直肠癌中的应用，特定序列的小分子RNA包括miRNA，siRNA，RNA mimic等小分子RNA物质。

特定序列RNA序列从5’端开始，主要包括1-13位碱基序列；特定序列的小分子RNA物质包括，miRNA，siRNA以及合成的miRNA/RNA mimic等物质。包括任何应用特定序列的药物、植物、食物等，所述序列如SEQ ID NO:1-6所示。本发明通过体外实验发现双链的序列5‘-CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA-3’可以抑制结直肠癌细胞的生长，阻碍结直肠癌细胞的迁移，同时很多癌症相关的标记蛋白的表达显著性降低。

优选地，所述小分子为拟南芥成熟的ath-miR158a；更优选地，所述小分子RNA为ath-miR158a-3p或ath-miR158a-5p；最优选ath-miR158a-5p。

所述小分子RNA模拟物含有SEQ ID NO:1-6所示序列和/或其互补序列。

所述小分子RNA的促进剂为对外源ath-miR158a-5p进行细胞内表达或其活性的物质或基因工具；优选地，所述小分子RNA的促进剂为含有ath-miR158a-5p核酸片段的载体；更优选地，所述含有小分子RNA核酸片段的载体为含有ath-miR158a-5p核酸片段的质粒。

所述小分子RNA可以来源于人、鼠、猴、兔、植物，或者由化学或生物合成。

本发明还提供一种抗结直肠癌的药物组合物，包含特定序列小分子RNA或其模拟物或其促进剂，所述药物组合物还含有化疗剂。

所述药物组合物还包含药学和免疫学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物的制剂形式为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂。

所述药物组合物的递送方法有:直接RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装法。

本发明还提供一种食疗的组合办法，包含小分子RNA的食用疗法；优选地，包含所述小分子RNA的植物或经过基因改造的食用菌的食用；更优选地，包含ath-miR528a序列的植物或经过基因改造的食用菌的食用；最优选地，包含ath-miR528a-5p序列的植物或基因改造食用菌的食用。

在本发明的一个具体实施方式中，提供一种通过靶向结直肠癌细胞递送抑制结直肠癌细胞生长的小分子RNA，该小分子RNA(具体化学式为双链RNA mimic，senseCUUUGUCUACAAUUUUGGAAA；antisense:UUUCCAAAAUUGUAGACAAAG)。

发明人通过研究发现，在体外过表达特定序列的小分子RNA mimic(sense:CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA；antisense:UUUCCAAAAUUGUAGACAAAG)能够明显抑制结直肠癌细胞的增殖和促进结直肠癌细胞的凋亡,其中，所述的特定小分子RNA可以是人工合成的双链miRNA/RNA mimic，也可以是成熟的miRNA和siRNA，也可以是前体RNA(pri-miRNA，pri-siRNA)或初级转录物(pre-miRNA，pre-siRNA)。

本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供特定小分子RNA序列(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。

所述特定小分子RNA模拟物(RNA mimics)是模式植物拟南芥的ath-miR158a-5p序列，运用化学合成的方法合成，在人体结直肠癌细胞中进行异位表达。具体地，所述特定序列的小分子RNA模拟物是根据ath-miR158a-5p的序列设计的小片段双链RNA，作用是在人体细胞中表达外源性的特定小分子序列(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)，通过结合人体中的AGO1、AGO2、AGO3和AGO4中的一个而发挥着类似于人体内源性miRNA及siRNA的作用。

其中，所述特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)促进剂为增加该小分子表达量或活性的物质或基因工具。所述增加特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的表达量或活性的物质或基因工具，是那些能够增强外源小分子(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)表达量或者提高该小分子活性的物质或者基因工具，无论是通过直接作用的方法，还是间接作用的方式，都可以称为本发明中的特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)促进剂。

作为一种可以选择的实施方式，所述的特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的任意一个或多个核糖核苷酸被修饰。

作为一种可以选择的实施方式，所述特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)为成熟的miRNA、成熟的siRNA、前体miRNA、前体siRNA、miRNA初级转录物或者是siRNA初级转录物。

作为一种可以选择的实施方式，所述特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的促进剂为增加特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)表达量或其活性的物质或基因工具。

作为一种优选的实施方式，所述特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的促进剂为含有特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)核酸片段的载体。作为一种更为优选的实施方式，所述含有特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)核酸片段的载体为含有特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)核酸片段的质粒。作为一种可以选择的实施方式，所述特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)来源于人、鼠、猴、兔或者化学或生物合成。

另一方面，本发明提供一种抗结直肠癌的药物组合物，包含特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)或其前体或其模拟物或其促进剂，所述药物组合物还含有化疗剂。作为一种可以选择的实施方式，所述药物组合物还包含药学和免疫学上可接受的载体。

作为一种可以选择的实施方式，所述的药物组合物的制剂形式为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂。

作为一种可以选择的实施方式，所述药物组合物的递送方法有：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒包装表达RNA法、纳米材料组装法。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

作为一种可以选择的实施方式，所述药物组合的递送方法包括：食疗包含特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的miRNA，siRNA等的天然或基因改造过的植物、动物以及微生物等食物，或通过添加特定序列小分子RNA(CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA)的任何通过食用进入体内的食品。

本发明中，所述“互补”可以是完全互补，也可以是部分互补。所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。

本发明中，所述特定序列的小分子RNA是指单链的寡核糖核苷酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。

所述碱基可以是无修饰碱基，也可以是修饰碱基。其中，所述修饰碱基，是指碱基连接基团包括但不限于NH₂、生物素、胺基、低级胺基烷基、低级烷基、NHCOCH₃、乙酰基、2'-氧基-甲基(2'O-Me)、DMTO、荧光素、硫醇或吖啶。

所述核糖可以是无修饰核糖，也可以是修饰核糖。所述修饰核糖是指核糖连接基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、Cl、Br、CN、OCN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环氨基烷基、氨基烷基、聚氨基烷基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、嵌入剂、用于改善微小RNA的药代动力学性质的基团或用于改善微小RNA的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。另外，糖取代基包括2'-O-2-甲氧基乙基(2'-OCH₂CH₂OCH₃)、2'-二甲基氨氧基乙氧基[2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂]、烯丙基(-CH₂-CH═CH₂)、O-烯丙基(-O-CH₂-CH-CH₂)、甲氧基(-O-CH₃)、氨基丙氧基(-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和氟(F)等。

本发明中，所述“修饰”是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的核糖和/或碱基连接任何一种或多种基团或其组合。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1细胞培养和转染

1、细胞培养

人结直肠癌细胞株HCT116用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养，2-3天换液，在达到90％以上细胞融合后用含有0.25％EDTA的胰酶消化传代。

2、小分子RNA化合物转染

将4×10⁴-5×10⁴个细胞接种在6孔细胞培养板上，每孔加入0.5mL含10％FBS无抗生素的RPMI1640细胞培养基培养12-24h，转染按照转染试剂lipofectamine 3000(Invitrogen,USA)说明书进行。

将实验分为三组：对照组(microRNA-NC，序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)和实验组(Special sRNA，即ath-miR158a-5p，序列为：5’-CUUUGUCUACAAUUUUGGAAA-3’)，同时分别进行转染。

实施例2 CCK-8检测细胞增殖活性

用CCK-8法检测Special sRNA对HCT116细胞增殖活性的影响。具体如下：

1、细胞培养

将HCT116细胞按1×10³个/孔接种入96孔板中，以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养。

2、细胞转染步骤同实施例1。

3、CCK-8检测

按照100μL培养基含10μL CCK-8的完全培养基，除去旧培养液，每孔加入100μL含CCK-8的细胞培养液，37℃细胞培养箱中继续培养2h。

在酶标仪462nm波长下测定各孔吸光度，根据所测得的OD值绘制细胞生长曲线，取其平均值，以OD值的相对数目表示肿瘤细胞的增殖能力。

结果如图1所示，与对照组相比，转染Special sRNA组的细胞增殖显著下降。

实施例3 Transwell法检测细胞迁移能力的差异

1、用Transwell法检测Special sRNA对HCT116细胞迁移活性的影响

细胞接种：往小室中加入200μL的细胞悬液(含1×10⁴个细胞)，用枪轻轻打匀成单个细胞。下室中加入500μl含15％FBS的RPMI1640完全培养基，置37℃5％CO₂细胞培养箱继续培养24h。

细胞染色及拍照：弃孔内培养基，将小室取出，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500μL甲醇的24孔细胞培养板中，在上室中加入200μL甲醇，固定10分钟。后弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500μL 0.01％结晶紫染液的24孔细胞培养板中，染色15分钟。将小室转移至新的24孔细胞培养板中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。自然干燥，用倒置显微镜观察迁移到下室膜面的细胞，200×光镜下随机计数，以迁移到下室膜面的细胞相对数目表示HCT116细胞的迁移穿透能力。

结果如图2所示，与对照组相比，转染Special sRNA组的细胞迁移能力显著下降。

2、蛋白质免疫印迹检测上皮细胞间质转化相关蛋白标志物：Ecadherin和MMP9蛋白质表达差异

采用4℃预冷的PBS洗涤细胞三次后，加入适量RIPA裂解液，4℃旋转摇床孵育30min，充分裂解后移入离心管中，4℃，12000rpm离心10min，上清即为总蛋白质，CBA法测定浓度后备用。

蛋白质样品按照20-50μg蛋白质/孔上样，电泳SDS-PAGE胶，120V恒压电泳；电泳结束后转膜，4℃，300mA恒流转膜1.5h。

转膜后添加特异性Ecadherin和MMP9的一抗，4℃摇床孵育过夜，添加二抗后室温孵育1h，ELC化学曝光利用化学发光型凝胶成像系统拍照。

结果如图3所示，与对照组(microRNA-NC)结直肠癌细胞HCT116相比，Ecadherin蛋白在实验组(Special sRNA)结直肠癌细胞HCT116中表达上调，MMP9蛋白在实验组(SpecialsRNA)结直肠癌细胞HCT116中表达下调，差异具有统计学意义(p<0.05)。与对照组相比，转染ath-miR158a-5p组的细胞上皮间质转化能力显著上升。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>谢琦

<120>抗结直肠癌的药物或组合物

<130> KHP201115099.8

<160>6

<170>SIPOSequenceListing1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cuuugucuac aauuuuggaa a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cuuuguccac aauuuuggaa a 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cuuuguucac aauuuuggaa a 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cuuugucuau aauuuuggaa a 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cuuugucuac aacuuuggaa a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cuuugucuac auuuuuggaa a 21

Claims (10)

1.ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物或其衍生物或含有ath-miR158a的生物材料在制备抗结直肠癌的药物或组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ath-miR158a为ath-miR158a-3p和/或ath-miR158a-5p。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ath-miR158a为ath-miR158a-5p，序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，ath-miR158a-5p的变体是指SEQ ID NO:1所示序列的第2-13位发生1或2个碱基取代。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，ath-miR158a-5p的变体选自SEQ ID NO:2-6中的任一条序列。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，ath-miR158a的模拟物是根据ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体的序列设计的双链RNA；

优选地，所述双链RNA含有ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体的序列和/或其互补序列。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，ath-miR158a的衍生物是指ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物序列中一个或多个核糖核苷酸被LNA、甲基化和/或磷酸化修饰。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。

9.抗结直肠癌的药物或组合物，其特征在于，有效成分为ath-miR158a或其前体或其初级转录物或其变体或其模拟物或其衍生物或含有ath-miR158a的生物材料。

10.根据权利要求所述的药物或组合物，其特征在于，还含有化疗剂；

优选地，所述药物或组合物的剂型为冻干粉针、注射剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂或贴剂。

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