CN101980712A

CN101980712A - 用于肝癌治疗的靶向微小rna

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Publication number: CN101980712A
Application number: CN2008801213169A
Authority: CN
Inventors: C·F·本内特; A·查朱特; C·埃索; E·G·马库森; N·耶鲁沙尔米
Original assignee: Rosetta Genomics Ltd; Regulus Therapeutics Inc
Current assignee: Regulus Therapeutics Inc
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2028-10-29
Also published as: WO2009058907A2; EP2217248A2; CA2704043A1; IL205307A; AU2008318778B2; US20140206854A1; IL205307A0; US8680067B2; US9150857B2; AU2008318778A1; US20180127755A1; JP5535076B2; US20120295962A1; US9845470B2; WO2009058907A3; US20100267814A1; JP2011501962A; CN101980712B; US20110251150A2; EP2217248B1

Abstract

本文提供用于治疗肝癌的方法。这些方法包括给予包含修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸靶向miRNA。本文还提供用于治疗肝癌的组合物。这类组合物包括包含修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸靶向miRNA。某些miRNA被鉴定为在肝癌(例如肝细胞癌)中过量表达，因此被选择为由修饰寡核苷酸靶向。此外，某些miRNA被鉴定为在暴露于二恶英的肝细胞癌细胞中过量表达，因此被选择为由修饰寡核苷酸靶向。已经发现反义抑制这些miRNA中的某一些将抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。

Description

用于肝癌治疗的靶向微小RNA

相关技术的描述

微小RNA(miRNA)，亦称“成熟miRNA”，是在植物和动物基因组中编码的小的(长度约18-24个核苷酸)非编码RNA分子。在某些情况下，高度保守、内源性表达的miRNA通过与特定mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)结合，来调节基因表达。已经在植物和动物中鉴定出1000多种不同的miRNA。某些成熟miRNA似乎源于长的内源性初级miRNA转录物(亦称pri-miRNA、pri-mirs、pri-miR或pri-pre-miRNA)，长度常常为几百个核苷酸(Lee等，EMBO J.，2002，21(17)，4663-4670)。

miRNA的功能分析表明，这些非编码小RNA对动物体中不同的生理学过程产生影响，包括发育时机、器官发生、分化、图式发育、胚胎发生、生长控制和程序性细胞死亡。其中miRNA参与的具体过程的实例包括干细胞分化、神经发生、血管生成、血细胞生成和胞吐作用(有关综述见Alvarez-Garcia和Miska，Development，2005，132，4653-4662)。在一些情况下，miRNA被认为在大多数真核生物中行使转录后调控，并且已在植物和动物以及某些病毒检出miRNA。

miRNA家族可以miRNA第2-8位的核苷酸为特征，这是一个被称为种子序列(seed sequence)的区域。Lewis等披露了若干个miRNA家族，以及特征在于相关种子序列的miRNA超家族(Lewis等，Cell.2005，120(1)：15-20)。

发明概述

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷(linked nucleoside)组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列(Nucleobasesequence)互补；或与同其有至少80％同一性的序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成并且具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列互补；或与同其有至少80％同一性的核碱序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱(Contiguousnucleobase)；或与之有至少80％同一性的序列。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的药物组合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补；或与同其有至少80％同一性的序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含修饰寡核苷酸的药物组合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成，并且具有的核碱序列与选自SEQ IDNO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列互补；或与同其有至少80％同一性的核碱序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的药物组合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ IDNO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱；或与之有至少80％同一性的序列。

在某些实施方案中，本发明提供包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补；或与同其有至少80％同一性的序列，用于治疗肝癌互补。

在某些实施方案中，本发明提供包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列互补；或与同其有至少80％同一性的序列互补，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱；或与之有至少80％同一性的序列，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗二恶英诱发的肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补，用于治疗二恶英诱发的肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗二恶英诱发的肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 38、39和40中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱；或与之有至少约80％同一性的序列。

在某些实施方案中，本发明提供包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 38、39和40中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱；或与之有至少约80％同一性的序列，用于治疗二恶英诱发的肝癌。

在某些实施方案中，二恶英诱发的肝癌是肝细胞癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成并且具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成并且具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成并且具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成并且具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成，并且具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成，并且具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成，并且具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 38、39和40中所记载的核碱序列中的核碱序列的至少15个连续核碱，用于治疗肝癌。

在某些实施方案中，本发明提供包含本发明的修饰寡核苷酸或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

在某些实施方案中，所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连接核苷组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列的错配不超过两个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列的错配不超过一个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列有一个错配。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列没有错配。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列的错配不超过两个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列的错配不超过一个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列有一个错配。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列没有错配。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的核碱序列的错配不超过两个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的核碱序列的错配不超过一个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的核碱序列有一个错配。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36和37的核碱序列没有错配。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少16个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少17个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少18个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少19个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少20个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少21个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少22个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列所记载的核碱序列的至少23个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的核碱序列组成：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQID NO 38、39和40中所记载的核碱序列的核碱序列的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个连续核碱。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰糖、核苷间键或核碱。在某些实施方案中，至少一个核苷间键是修饰核苷间键。例如，至少一个核苷间键可以是硫代磷酸酯核苷间键(phosphorothioateinternucleoside linkage)。在某些实施方案中，每个核苷间键是修饰核苷间键。例如，每个核苷间键可以是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰糖。在某些实施方案中，多个核苷中的每一个都包含修饰糖。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含修饰糖。在这些实施方案的每一个中，修饰糖可以是2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或双环糖部分。在某些实施方案中，多个核苷中的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖且多个核苷中的每一个都包含2’-氟糖。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少一个修饰核碱。在某些这类的实施方案中，修饰核碱是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在某些这类的实施方案中，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，肝癌是肝细胞癌。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，肝细胞癌是二恶英诱发的。

在某些实施方案中，本发明的化合物的给药包含静脉内给药、皮下给药、肿瘤内给药或化疗栓塞(chemoembolization)。

在某些实施方案中，本发明的方法还包括给予至少一种另外的疗法。另外的疗法可以是化疗药物。所述化疗药物可以选自5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔比星、丝裂霉素C、索拉非尼、依托泊苷、卡铂、表柔比星、伊立替康和奥沙利铂。另外的疗法可与本发明的化合物或药物组合物同时给予、可比本发明的化合物或药物组合物的给药较不频繁或更频繁。

在某些实施方案中，按选自以下的剂量给予修饰寡核苷酸：50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg和800mg。可以每天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，给予本发明的化合物导致肝肿瘤大小减小和/或肝肿瘤数减少。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止肿瘤大小增大和/或肿瘤数增加。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止、减慢和/或阻止转移进程。在某些实施方案中，给予本发明的化合物延长对象的总体生存时间。在某些实施方案中，给予本发明的化合物延长对象的无进展生存期。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止肝肿瘤的复发。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止肝肿瘤转移的复发。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止HCC衍生肿瘤的复发。在某些实施方案中，给予本发明的化合物防止HCC衍生肿瘤转移的复发。

在某些实施方案中，为治疗肝癌选出的对象患有肝病变。在某些实施方案中，为治疗肝癌选出的对象的血清甲胎蛋白升高和/或血清脱-γ-羧基凝血酶原(des-gamma-carboxyprothrombin)升高。在某些实施方案中，为治疗肝癌选出的对象的肝功能异常。

在某些实施方案中，给予本发明的化合物降低患有肝癌的对象的血清甲胎蛋白和/或血清脱-γ-羧基凝血酶原。在某些实施方案中，测定血清甲胎蛋白和/或血清脱-γ-羧基凝血酶原的水平以评价治疗功效。在某些实施方案中，给予本发明的化合物改善对象的肝功能。

结合下面的附图、发明内容和权利要求书，本发明的这些实施方案和其它实施方案将是显而易见的。

附图简述

图1.与正常肝组织样品相比，肝肿瘤样品中miRNA的差异表达分析。具有显著性p值的数据点用红色圆圈包围。稍后选用于进一步研究的某些miRNA靶用实心黄色圆圈表示。这些miRNA靶包括miR-21、miR-125a-5p(标为miR-125a)、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378(标为miR-422b)、miR-423-3p和miR-638。

图2.用靶向miRNA的修饰寡核苷酸处理后肝癌细胞系中的细胞增殖抑制。在用修饰寡核苷酸转染后，测定了SNU423(图2A)和Hep3B(图2B)两个细胞系的增殖。在转染后72小时进行了增殖实验。测定了增殖并与用阴性对照寡核苷酸处理的细胞的增殖和未转染细胞的增殖进行了比较。与miR-21、miR-125a、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378(标为miR-422b)、miR-423和miR-638互补的修饰寡核苷酸产生抗增殖活性。

图3.用靶向miRNA的修饰寡核苷酸处理后肝癌细胞中的细胞凋亡诱导。Hep3B细胞用修饰寡核苷酸转染。转染后24小时，通过测定胱天蛋白酶3/7活化，测定了诱导的细胞凋亡。使用与miR-21、miR-125a、miR-191、miR-210、miR-378(标为miR-422b)、miR-423和miR-638互补的修饰寡核苷酸的细胞处理导致胱天蛋白酶3/7活性显著升高，这就表示诱导了细胞凋亡。

图4.用修饰寡核苷酸治疗的小鼠中皮下肿瘤体积减小。给裸小鼠注射HepG2细胞诱导皮下肿瘤。相对于盐水对照处理，用与miR-21(图4a)和miR-210(图4b)互补的MOE-修饰寡核苷酸治疗显示肿瘤体积减小。

图5.HepG2细胞中miRNA的表达中位值(单位log(荧光))，其中X轴表示TCDD处理后48小时的细胞，Y轴表示未处理细胞。星散的平行线描绘了两者在任一方向上的倍数改变。中线描绘了两组细胞中相同的表达中位值。

处理细胞中具有相对高表达值的miRNA包括hsa-miR-191、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b和hsa-miR-181a*。

图6.双重萤光素酶报导分子测定(Dual-Luciferase Reporter Assay)的结果用直方图表示，其中Y轴表示对照载体的R/F％比率。各条形柱如下表示归一化发光：条形柱a-p191(仅在海肾萤光素酶(renillaluciferase)的3′UTR携带miR-191的反向互补序列而无修饰寡核苷酸的质粒)，条形柱b-p191ASO-miR-NC；条形柱c-p对照(对照质粒)ASO-miR-191；条形柱d-p191ASO-miR-191；条形柱e-p对照(无修饰寡核苷酸)。

图7.使用AhR的特异性抗体的ChIP(染色质免疫沉淀)测定。Y轴表示每1,000个细胞的结合事件，其中有斜线的条形柱代表用TCDD处理的细胞，有点的条形柱代表未处理细胞。左边的一对条形柱代表阴性对照。右边的两对条形柱代表CYP1A1上AhR/Arnt TF的两个结合部位。

发明详述

除非另有说明，否则本文所使用的所有科技术语都具有本发明所属领域专业人员通常所理解的含义。除非给出具体的定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药学化学的方法和技术联合使用的术语是本领域众所周知并且是经常使用的术语。在本文的术语存在多种定义的情况下，以本节的定义优先。对于化学合成、化学分析、药物制剂、剂型和递送以及对象的治疗可采用标准技术。某些这类技术和方法可参见例如“Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch”，Sangvi和Cook编辑，American Chemical Society，Washington D.C.，1994；以及“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，第18版，1990；所述文献特此引用予以结合以用于任何目的。当允许时，贯穿本文整个公开内容所提及的所有专利、专利申请、已公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它已发表的材料，都通过引用其全部结合，除非另有说明。要理解的是，当参考内容涉及URL或其它这类标识符或地址时，这类标识符可能发生改变，互联网的特定信息可能是指令运行的，但是通过搜索互联网可以找到等同信息。此处的参考内容表明这类信息的可利用性和公共传播程度。

要理解的是，在公开和描述本发明的组合物和方法前，本文所使用的术语仅用于描述具体的实施方案，而且并不是限制性的。必须注意，如所本说明书和随附权利要求书中所使用的一样，未使用数词的单数形式包括了复数，除非在上下文中有明确规定。

定义

“肝癌”是指肝脏恶变，或为原发癌或转移癌。在某些实施方案中，肝癌包括但不限于产生于肝细胞的癌，例如肝细胞瘤和肝细胞癌；纤维层癌；以及胆管细胞癌(或胆管癌)。

“肝细胞癌”是指产生于肝细胞的肝脏的原发癌。

“二恶英诱发的肝癌”是指由二恶英暴露引起的肝癌。在某些实施方案中，二恶英诱发的肝癌是二恶英诱发的肝细胞癌。

“对象”是指人或者为了治疗或疗法而选出的人或非人类动物。

“有需要的对象”是指确定为需要疗法或治疗的对象。在某些实施方案中，对象患有肝癌。在这类实施方案中，对象有肝癌的一种或多种临床表现或有发生肝癌的风险。

“给药/给予”是指向对象提供药物或组合物，包括但不限于由医学专业人员给药和自我给药。

“胃肠外给药”是指通过注射或输注给药。胃肠外给药包括但不限于皮下给药、静脉内给药或肌内给药。

“皮下给药”是指正好在皮肤下给药。

“静脉内给药”是指给入静脉中。

“肿瘤内给药”是指在肿瘤内部给药。

“化疗栓塞”是指其中以外科手术、机械方法或化学方法阻断向肿瘤供应血液的方法，并将化疗药物直接给入肿瘤内。

“持续时间”是指活性或事件持续的一段时间。在某些实施方案中，治疗的持续时间是给予各剂药物或药物组合物的一段时间。

“疗法”是指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括但不限于化学疗法、外科切除术、肝脏移植和/或化疗栓塞。

“治疗”是指一种或多种用于治愈或改善疾病的具体方法的应用。在某些实施方案中，具体方法是给予一种或多种药物。

“改善”是指降低病症或疾病的至少一项指标的严重程度。在某些实施方案中，改善包括延缓或减慢病症或疾病的一项或多项指标的发展。指标的严重程度可通过本领域技术人员已知的主观或客观测定法确定。

“预防”是指延迟或预先阻止病症或疾病的发生或发展或进程达到一段时间，包括数周、数月或数年。

“治疗剂”是指用于治愈、改善或预防疾病的药物。

“化疗药物”是指用于治疗癌症的药物。

“化学疗法”是指用一种或多种杀死癌细胞和/或减慢癌细胞生长的药物治疗对象。

“剂量”是指在单次给药时提供的药物的规定量。在某些实施方案中，剂量可以两次或更多次大丸剂(bolus)、片剂或注射剂给予。例如，在某些实施方案中，如果需要皮下给药，所需剂量需要单次注射不易容纳的体积。在这类实施方案中，可采用两次或更多次注射剂实现所需要的剂量。在某些实施方案中，剂量可以两次或更多次注射剂给予以使个体的注射部位反应降到最低。

“剂量单位”是指其中提供药物的形式。在某些实施方案中，剂量单位是装有冻干寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是装有重配寡核苷酸的小瓶。

“治疗有效量”是指为动物提供有治疗益处的药物的量。

“药物组合物”是指适于给予个体的包括药物在内的物质的混合物。例如，药物组合物可包含修饰寡核苷酸和无菌水溶液。

“药物”是指当给予对象时提供治疗效果的物质。

“活性药物成分”是指药物组合物中提供所需效果的物质。

“转移”是指癌从其最初发生原发性肿瘤的部位扩散到机体其它位置的过程。原发性肿瘤的转移进程反映出多个阶段，包括从邻近原发性肿瘤细胞中解离，在循环中存活，并在继发位置生长。

“总体生存时间”是指在诊断或治疗疾病后对象生存的时限。在某些实施方案中，所述疾病是癌症。

“无进展生存期”是指患病的对象在疾病不恶化的情况下生存的时限。在某些实施方案中，通过对疾病分期或评分来评价无进展生存期。在某些实施方案中，通过评价肿瘤大小、肿瘤数和/或转移，来评价患有肝癌的对象的无进展生存期。

“血液肿瘤标记”是指在患有癌症的对象的血液中升高或降低的生物标记。

“改善肝功能”是指肝功能朝正常极限值的改变。在某些实施方案中，通过测定于对象血液中发现的分子来评价肝功能。例如，在某些实施方案中，通过血液中肝转氨酶水平的降低来测定肝功能的改善。

“可接受的安全特征(Acceptable safety profile)”是指副作用的方式在临床可接受的极限值范围内。

“副作用”是指所需效果以外可归于治疗的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括而不限于注射部位反应、肝功能化验异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。可以直接或间接检测这类副作用。例如，血清中转氨酶水平升高可指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素升高可指示肝毒性或肝功能异常。

“注射部位反应”是指个体注射部位的炎症或皮肤异常发红。

“对象顺应性”是指对象对推荐疗法或处方疗法的服从性。

“服从”是指对象遵守推荐疗法。

“推荐疗法”是指由医学专业人员推荐的用于治疗、改善或预防疾病的治疗。

“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”全都指能够被反义化合物靶向的任何核酸。

“寻靶”是指设计和选择可与靶核酸杂交并引起所需效果的核碱序列的过程。

“被靶向(Targeted to)”是指具有可供与靶核酸杂交以引起所需效果的核碱序列。在某些实施方案中，所需效果是减少靶核酸。

“调节”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中，调节是指提高基因表达。在某些实施方案中，调节是指降低基因表达。

“表达”是指基因编码的信息被转换成在细胞中存在并起作用的结构的任何功能和步骤。

“5’靶位”是指与特定寡核苷酸最5’端的核碱互补的靶核酸的核碱。

“3’靶位”是指与特定寡核苷酸最3’端的核碱互补的靶核酸的核碱。

“区域/区”是指核酸内的一部分连接核苷。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与靶核酸区互补的核碱序列。例如，在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与miRNA茎-环序列区互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与miRNA茎-环序列区完全互补。

“区段(Segment)”是指较小的区域或区域的亚部分。

“核碱序列”是指连续核碱自5’至3’方向的顺序，不依赖于任何糖、键和/或核碱修饰。

“连续核碱”是指核酸中彼此直接邻接的核碱。

“核碱互补性”是指两个核碱通过氢键结合进行非共价配对的能力。

“互补”是指第一核碱序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱的区域内与第二核碱序列的互补序列有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。

“互补性”是指第一核酸和第二核酸之间的核碱配对能力。

“完全互补”是指第一核酸的每个核碱能够与第二核酸每个相应位置上的核碱配对。例如，在某些实施方案中，其中每个核碱与miRNA茎-环序列区内的核碱具有互补性的修饰寡核苷酸与该miRNA茎-环序列完全互补。在某些实施方案中，与miRNA或其前体完全互补的修饰寡核苷酸在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱的区域内具有与miRNA或其前体的互补序列相同的核碱序列。

“互补性百分比”是指核酸中互补的核碱数除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的互补性百分比是指与靶核酸互补的核碱数除以修饰寡核苷酸的长度。

“同一性百分比”是指与第二核酸相应位置上的核碱相同的第一核酸的核碱数除以第一核酸中的核碱数。

本文所使用的“基本上相同”可指第一核碱序列和第二核碱序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱的区域内有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

“杂交”是指通过核碱互补性产生的互补核酸的退火反应。

“错配”是指第一核酸的核碱不能够与第二核酸相应位置上的核碱配对。

“非互补核碱”是指两个不能够通过氢键结合进行配对的核碱。

“相同/同一性”是指具有相同的核碱序列。

“miR-21”是指具有SEQ ID NO：9所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-21茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：1所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-125a-5p”是指具有SEQ ID NO：10所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-125a茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：2所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-191”是指具有SEQ ID NO：11所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-191茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：3所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-210”是指具有SEQ ID NO：12所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-210茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：4所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-222”是指具有SEQ ID NO：13所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-222茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：5所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-378”是指具有SEQ ID NO：14所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-378茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：6所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-423-3p”是指具有SEQ ID NO：15所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-423茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：7所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-638”是指具有SEQ ID NO：16所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-638茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：8所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-181a”是指具有SEQ ID NO：31所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-181a*”是指具有SEQ ID NO：32所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-181b”是指具有SEQ ID NO：33所示核碱序列的成熟miRNA。

“miR-181a-1茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：34所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-181a-2茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：35所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-181b-1茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：36所示核碱序列的茎-环序列。

“miR-181b-2茎-环序列”是指具有SEQ ID NO：37所示核碱序列的茎-环序列。

“miRNA”或“miR”是指长度介于18个和25个核碱之间的非编码RNA，是pre-miRNA通过切酶切割的产物。成熟miRNA的实例参见称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。

“Pre-miRNA”或“pre-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，是pri-miR通过称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割的产物。

“茎-环序列”是指具有发夹结构并含有成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎-环序列可能重叠。茎-环序列的实例参见称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。

“Pri-miRNA”或“pri-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，其为双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物。

“miRNA前体”是指源自基因组DNA且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码结构性RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体是pri-miRNA。

“单顺反子转录物”是指含有单个miRNA序列的miRNA前体。

“多顺反子转录物”是指含有两个或更多个miRNA序列的miRNA前体。

“种子序列”是指得自成熟miRNA序列5’端的2-6位核苷酸或2-7位核苷酸。

“寡聚化合物”是指化合物含有连接的单体亚基的聚合物。

“寡核苷酸”是指连接核苷的聚合物，每个核苷可以彼此独立地经过修饰或未经修饰。

“天然存在的核苷间键”是指核苷之间的3’-5’磷酸二酯键。

“天然糖”是指存在于DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中的糖。

“天然核碱”是指相对于其天然存在的形式是未修饰的核碱。

“核苷间键”是指相邻核苷间的共价键。

“连接核苷(Linked nucleoside)”是指通过共价键连接的核苷。

“核碱”是指能够与另一个核碱进行非共价配对的杂环部分。

“核苷”是指与糖连接的核碱。

“核苷酸”是指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。

“修饰寡核苷酸”是指相对于天然存在的末端、糖、核碱和/或核苷间键具有一种或多种修饰的寡核苷酸。

“单链修饰寡核苷酸”是指未与互补链杂交的修饰寡核苷酸。

“修饰核苷间键”是指天然存在的核苷间键的任何改变。

“硫代磷酸酯核苷间键”是指核苷间的键，其中非桥接原子之一是硫原子。

“修饰糖”是指天然糖的取代和/或任何改变。

“修饰核碱”是指天然核碱的任何取代和/或改变。

“5-甲基胞嘧啶”是指被连接在5’位上的甲基修饰的胞嘧啶。

“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”是指在2’位上具有O-甲基修饰的糖。

“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”是指在2’位上具有O-甲氧基乙基修饰的糖。

“2’-O-氟”或“2-F”是指2’位具有氟修饰的糖。

“双环糖部分”是指被两个非环的原子桥接所修饰的糖。

“2’-O-甲氧基乙基核苷”是指具有2’-O-甲氧基乙基糖修饰的2’-修饰核苷。

“2’-氟核苷”是指具有2’-氟糖修饰的2’-修饰核苷。

“2’-O-甲基”核苷是指具有2’-O-甲基糖修饰的2’-修饰核苷。

“双环核苷”是指具有双环糖部分的2’-修饰核苷。

“基序”是指寡核苷酸中修饰和/或未修饰的核碱、糖和/或核苷间键的样式。

“完全修饰寡核苷酸”是指每个核碱、每个糖和/或每个核苷间键都是修饰的。

“一致修饰寡核苷酸”是指在整个修饰寡核苷酸中，每个核碱、每个糖和/或每个核苷间键都具有相同的修饰。

“gapmer”是指具有位于连接核苷的两个外部区域(external region)间的连接核苷的内部区域(internal region)的修饰寡核苷酸，其中内部区域的核苷包含的糖部分不同于各外部区域的核苷的糖部分。

“gap区段”是位于外部区域之间的gapmer的内部区域。

“翼区段(wing segment)”是位于内部区域5’端或3’端的gapmer的外部区域。

“对称gapmer”是指每个外部区域的每个核苷包含相同的糖修饰。

“不对称gapmer”是指一个外部区域的每个核苷包含第一种糖修饰，另一个外部区域的每个核苷包含第二种糖修饰。

“稳定性修饰”是指在核酸酶的存在下，相对于由通过磷酸二酯核苷间键连接的2’-脱氧核苷提供的稳定性，为修饰寡核苷酸提供的增强的稳定性的核苷修饰。例如，在某些实施方案中，稳定性修饰是稳定化核苷修饰。在某些实施方案中，稳定性修饰是核苷间键修饰。

“稳定性核苷”是指相对于2’-脱氧核苷提供的稳定性，为寡核苷酸提供提高的核酸酶稳定性的核苷修饰。在一个实施方案中，稳定性核苷是2’-修饰核苷。

“稳定性核苷间键”是指相对于由磷酸二酯核苷间键提供的稳定性，为寡核苷酸提供的提高核酸酶稳定性的核苷间键。在一个实施方案中，稳定性核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

概述

肝癌是全球男性和女性癌症死亡的一个常见原因。肝细胞癌(HCC)这种最常见的肝癌类型的发生率的上升与丙型肝炎病毒感染的发病率日益增加有关。某些HCC病例与慢性乙型肝炎感染、慢性丙型肝炎感染或肝硬化有关。

患有HCC的对象的预后非常差，自诊断日起的典型生存期中位值介于7-8个月，5年生存率小于5％。对于HCC可获得的治疗有限。患早期疾病的对象可通过肝切除术或肝脏移植术治疗。然而，约85％的对象在诊断出疾病时对于肝切除术或移植术为时已晚。患中期疾病的对象可以是化疗栓塞的候选者。然而，患晚期疾病的对象健康状况不佳，限制了化疗栓塞的使用。

已报告相对于非癌细胞，在癌细胞(包括肝癌细胞例如HCC)中，在miRNA表达形式方面有某些改变。有研究描述了与癌症有关的miRNA表达的增加和减少。据估计，人基因组中miRNA的总数的范围介于约500至数千之间。鉴于这样高的miRNA总数，对于通过抑制或增加miRNA的癌症疗法，为了鉴定可被靶向的miRNA，有必要鉴定出与特定癌症类型有关联的特定miRNA。

因此，存在对鉴定用于肝癌(包括HCC)治疗的可被抑制的miRNA的需要。还存在对用于肝癌(例如HCC)治疗的抑制剂的需求。此外，存在对治疗肝癌(例如HCC)的方法的需求，所述方法通过给予有需要的对象能够抑制miRNA的药物，所述miRNA被鉴定为与肝癌(例如HCC)有关的失调。因为癌症是由于不受控制的细胞增殖以及细胞存活延长所引起的疾病，所以用于肝癌治疗的药物的理想特征包括减少细胞增殖和/或诱导细胞凋亡的能力，其进而可减小肿瘤大小，减少肿瘤数，和/或防止或减慢肝癌细胞的转移。

在某些实施方案中，本文提供用于治疗肝癌(例如HCC)方法。这些方法可在患有肝癌的对象中产生一种或多种临床上令人满意的结果，例如减少肿瘤数和/或减小肿瘤大小，减缓转移进程，延长生存时间，和/或延长无进展生存时间。本文还提供可用于治疗肝癌(例如HCC)的药物，例如修饰寡核苷酸。

如本文所述，采用含有设计成针对约700种miRNA的探针的微阵列，将得自HCC肿瘤的肝样品与正常肝组织样品进行比较。在受测试的约700种miRNA中，发现相对于正常肝组织样品，在HCC样品中约90种上调。在HCC衍生的细胞系的下列体外实验中，选出以下8种miRNA作为用于HCC疗法的被靶向候选miRNA：miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378、miR-423-3p和miR-638。如本文所述，使用与所述miRNA互补的修饰寡核苷酸，在肝癌细胞系中抑制这8种miRNA后，观察到细胞增殖减少。此外，抑制7种miRNA引起肝癌细胞的细胞凋亡增加。因此，与这8种miRNA的每一种互补的修饰寡核苷酸是用于治疗肝癌(包括HCC)的药物。

如本文所述，在小鼠皮下肿瘤模型中，给予靶向被鉴定为在HCC中上调的微小RNA的修饰寡核苷酸引起肿瘤体积减小。因此，这类修饰寡核苷酸是用于治疗肝癌(包括HCC)的药物。

某些治疗

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的对象与miRNA互补的修饰寡核苷酸。在给予医学专业人员熟知的医学检验后，可以诊断患有肝癌的对象。肝癌可以是肝细胞癌(HCC)。肝细胞癌的诊断通常通过肝成像检测进行，例如腹部超声波、螺旋计算机体层摄影术(CT)扫描或三期CT扫描。这类成像检测可与血液甲胎蛋白水平和/或血液脱-γ-羧基凝血酶原水平的测定结合起来进行。在某些对象中，可以采用MRI代替CT扫描。肝成像检测允许评价肿瘤大小、数目、位置、肝外转移、由肿瘤引起的肝动脉和肝静脉的开放和/或侵袭。这种评价有助于确定适当的治疗性或治标性干预的方式。最终的诊断通常通过穿刺活检和组织病理学检查来证实。

因此，在某些实施方案中，肝癌是根据检查肿瘤的计算机体层摄影术(CT)扫描检查出来的。在某些实施方案中，肝癌是根据磁共振成像(MRI)检查出来的。在某些实施方案中，HCC特征为单发性原发性肿瘤。在某些实施方案中，HCC特征为多发性原发性肿瘤。在某些实施方案中，HCC特征为具有浸润性生长形式的边界不清的原发性肿瘤。在某些实施方案中，HCC是具有血管侵袭的单发性原发性肿瘤。在某些实施方案中，HCC特征为具有血管侵袭的多发性原发性肿瘤。在某些实施方案中，HCC转移到一个或多个淋巴结上。在某些这类的实施方案中，淋巴结是区域淋巴结。在某些实施方案中，HCC转移到一个或多个远端组织上。在某些实施方案中，HCC已转移到肝的其它区域、门静脉、淋巴结、肾上腺、骨骼或肺上。在某些实施方案中，存在纤维变性。

已利用多个系统预测HCC的预后，包括TNM系统、Okuda系统、Clinic Liver Cancer(BCLC)和CLIP评分。这些系统的每一个都包括被视为是生存的重要决定因素的4个特征：基础肝病的严重程度、肿瘤的大小、肿瘤向附近结构的延伸以及转移的存在。TNM系统将HCC归类为I期、II期、III期、IV期或V期。BCLC将HCC归类为A1期、A2期、A3期、A4期、B期、C期和D期，且包括Child-Pugh评分的考虑因素。

在某些实施方案中，肝癌被归类为1期、2期、3A期、3B期、3C期或4期。1期的特征在于癌的大小不大于2cm且未开始扩散。在2期，癌症累及肝中的血管，或者在肝中存在不只一个肿瘤。在3A期，癌的大小大于5cm，或者已扩散到肝附近的血管。在3B期，癌已扩散到附近器官，例如肠或胃，但尚未扩散到淋巴结。在3C期，癌可以是任何大小，并且已扩散到淋巴结附近。在4期，癌已扩散到更远离肝的机体部分，例如肺。

对象血液中的生物标记可以用来提高肝癌的诊断质量、给肝癌分期或开发生存的预后法。这类生物标记包括血液肿瘤生物标记，例如甲胎蛋白和脱γ羧基凝血酶原。在某些这类的实施方案中，对象的血液甲胎蛋白升高。在某些这类的实施方案中，对象的血液脱γ羧基凝血酶原升高。

患有肝癌的对象可能还患有肝功能异常。肝功能可通过肝功能化验来评价，肝功能化验包括测量血液肝转氨酶水平。在某些实施方案中，患有肝功能异常的对象的血液肝转氨酶升高。血液肝转氨酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。在某些实施方案中，患有肝功能异常的对象的血液胆红素升高。在某些实施方案中，对象的血液白蛋白水平异常。

在某些实施方案中，对象的肝功能通过Child-Pugh分类系统进行评价，该系统界定了肝功能的三种类型。在该分类系统中，为以下5个类别之一的测量值指定分数：胆红素水平、白蛋白水平、凝血酶原时间、腹水和脑病。给下列存在的特征中的每一个指定一分：血液胆红素小于2.0mg/dl；血液白蛋白大于3.5mg/dl；凝血酶原时间小于1.7国际标准化比值(INR)；腹水不存在；或脑病不存在。给下列存在的特征的每一个指定2分：血液胆红素为2-3mg/dl；血液胆红素为3.5-2.8mg/dl；凝血酶原时间1.7-2.3INR；腹水轻微至中等；或脑病轻微。给下列存在的特征的每一个指定3分：胆红素大于3.0mg/dl；血液白蛋白小于2.8mg/dl；凝血酶原时间大于2.3INR；腹水严重至不应；或脑病严重。将分数相加，5-6分的评分指定为A类，7-9分的评分指定为类B，10-15分的评分指定为类C。

患有肝癌的对象可能患有慢性丙型肝炎感染、慢性乙型肝炎感染或肝硬化。患有由丙型肝炎感染、乙型肝炎感染或肝硬化引起的肝癌的对象可以通过本文所述方法治疗。

对象对治疗的反应通过类似于用来诊断肝癌的检查来评价，包括而不限于CT扫描、MRI和穿刺活检。还可通过测定血液中的生物标记，与治疗前的生物标记水平进行比较，来评价对治疗的反应。

给予患有肝癌的对象本发明的药物组合物产生一种或多种临床上令人满意的结果。这类临床上令人满意的结果包括肿瘤数减少或肿瘤大小减小。另外的临床上令人满意的结果包括对象总体生存时间延长和/或对象的无进展生存时间延长。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物阻止肿瘤大小增大和/或肿瘤数增加。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物阻止转移进程。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物减慢或中止转移进程。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物防止肝肿瘤的复发。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物防止肝肿瘤转移的复发。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物防止HCC衍生的肿瘤的复发。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物防止HCC衍生的肿瘤转移的复发。

向包括HCC细胞在内的肝癌细胞给予本发明的药物组合物，可引起令人满意的表型效应。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸可中止、减慢或减少肝癌细胞不受控制的增殖。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸可诱导肝癌细胞的凋亡。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸可缩短肝癌细胞存活期。

miRNA与mRNA杂交调节mRNA及其蛋白质产物的表达。一般来讲，miRNA与其mRNA靶的杂交抑制mRNA的表达。因此，miRNA的抑制可引起miRNA核酸靶的表达增加。在某些实施方案中，miRNA的抑制引起由miRNA核酸靶编码的蛋白质的增加。例如，在某些实施方案中，miR-222的反义抑制引起p27^kip1的增加。

某些令人满意的临床结果可通过测量血液生物标记来评价。在某些实施方案中，给予本发明的药物组合物可引起血液甲胎蛋白和/或血液脱γ羧基凝血酶原降低。给予本发明的药物组合物可进一步引起肝功能的改善，正如血液ALT和/或AST水平降低所证实的一样。

某些化合物

本文提供用于治疗肝癌(例如HCC)的化合物。在某些实施方案中，所述化合物包含修饰寡核苷酸。在某些这类的实施方案中，所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

在某些这类的实施方案中，所述化合物包含与互补链杂交的修饰寡核苷酸，即所述化合物包含双链寡聚化合物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与互补链杂交形成至少一个平端。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与互补链的杂交在双链寡聚化合物的各末端形成平端。在某些实施方案中，与互补链的连接核苷数相比，修饰寡核苷酸的一端包含额外的一个或多个连接核苷数。在某些实施方案中，一个或多个额外的核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些实施方案中，一个或多个额外的核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。在某些实施方案中，一个或多个额外核苷中的核苷的至少一个核碱与靶RNA互补。在某些实施方案中，一个或多个额外核苷中的每个核苷的每个核碱与靶RNA互补。在某些实施方案中，与修饰寡核苷酸的连接核苷数相比，互补链的一端包含一个或多个额外的连接核苷。在某些实施方案中，一个或多个额外的连接核苷位于互补链的3’端。在某些实施方案中，一个或多个额外的连接核苷位于互补链的5’端。在某些实施方案中，两个额外的连接核苷与一端连接。在某些实施方案中，一个额外的核苷与一端连接。

在某些实施方案中，所述化合物包含与一个或多个部分缀合的修饰寡核苷酸，该部分提高所得到的反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。在某些这类的实施方案中，该部分是胆固醇部分或脂质部分。用于缀合的其它部分包括糖、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在某些实施方案中，缀合基团与修饰寡核苷酸直接连接。在某些实施方案中，缀合基团通过选自以下的连接部分与修饰寡核苷酸连接：氨基、羟基、羧酸、巯基、不饱和(例如双键或三键)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基和取代或未取代的C2-C10炔基。在某些这类的实施方案中，取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基(thioalkoxy)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

在某些这类的实施方案中，所述化合物包含具有一个或多个稳定性基团的修饰寡核苷酸，所述稳定性基团与修饰寡核苷酸的一端或两端连接以提高诸如核酸酶稳定性等性能。稳定性基团中包括帽结构(cap structure)。这些末端修饰保护修饰寡核苷酸免于外切核酸酶降解，并有助于在细胞内传递和/或定位。帽可存在于5’端(5’帽)或在于3’端(3’帽)，或者可以存在于两端。帽结构包括例如反向脱氧无碱基帽(inverted deoxy abasic cap)。

合适的帽结构包括4′，5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5-失水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏型-五醇呋喃糖基(pentofuranosyl)核苷酸、无环的3’，4′-开环核苷酸、无环的3，4-二羟基丁基核苷酸、无环3，5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸部分、′-3′-反向无碱基部分、3’-2’-反向核苷酸部分、3’-2’-反向无碱基部分、1，4-丁二醇磷酸酯、3’-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3’-磷酸酯、3’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥接甲基磷酸酯部分和非桥接甲基磷酸酯部分、5’-氨基-烷基磷酸酯、1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1，2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、5’-5’-反向核苷酸部分、5’-5’-反向无碱基部分、5’-氨基磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、5’-氨基、桥接5’-氨基磷酸酯和/或非桥接5’-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和5’-巯基部分。

某些核碱序列

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的序列。本文所述的成熟miRNA的核碱序列及其相应的茎-环序列是存在于miRBase的序列，miRBase是有关miRNA序列和注释的在线可搜索数据库，可参见http://microrna.sanger.ac.uk/。miRBase序列数据库中的条目表示预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)，以及有关在成熟miRNA序列中的位置和序列的信息。数据库中的miRNA茎-环序列不完全是前体miRNA(pre-miRNA)，在一些情况下可包括pre-miRNA和推测的初级转录物的一些旁侧序列。本文所述的miRNA核碱序列包括miRNA的任何形式，包括MiRBase序列数据库10.0版所披露的序列和miRBase序列数据库的任何早期版本所披露的序列。序列数据库版本可能导致给某些miRNA重新命名。例如，本文所述的10.0版中的miR-378旧称miR-422b。序列数据库版本可能导致成熟miRNA序列的变化。例如，10.0版的miR-125a-5p存在于miR-125a茎-环序列(SEQ ID NO：2)的第15-38个核碱上。之前数据库版本中miR-125a存在于miR-125a茎-环序列(SEQ ID NO：2)的第15-37个核碱上。本发明的组合物包括与本文所述miRNA的任何核碱序列形式互补的修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱序列，这就意味着修饰寡核苷酸的核碱序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱的区域内与miRNA或其前体的互补序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列相对于其靶miRNA或前体序列可具有一个或多个错配的碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体完全互补的核碱序列，这就意味着修饰寡核苷酸的核碱序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱的区域内与miRNA或其前体的互补序列有100％同一性。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与选自以下miRNA茎-环序列的核碱序列互补的序列：miR-21茎-环序列(SEQ ID NO：1)、miR-125a茎-环序列(SEQ ID NO：2)、miR-191茎-环序列(SEQ ID NO：3)、miR-210茎-环序列(SEQ ID NO：4)、miR-222茎-环序列(SEQ ID NO：5)、miR-378茎-环序列(SEQ ID NO：6)、miR-423茎-环序列(SEQ ID NO：7)和miR-638茎-环序列(SEQ ID NO：8)。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA的核碱序列互补的序列，其中miRNA的核碱序列选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-21茎-环序列(SEQID NO：1)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：1的核碱8-29区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-21(SEQ ID NO：9)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：9的核碱1-22互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ IDNO：17)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ ID NO：17)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-125a茎-环序列(SEQ ID NO：2)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：2的核碱15-37区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：2的核碱15-38区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-125-5p(SEQ ID NO：10)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：10的核碱1-23互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：10的核碱1-24互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含CACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA(SEQ ID NO：18)的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列CACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA(SEQ ID NO：18)组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列TCACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA(SEQ ID NO：19)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-191茎-环序列(SEQ ID NO：3)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：3的核碱16-37区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：3的核碱16-38区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-191(SEQ ID NO：11)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列AGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG(SEQ ID NO：20)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列AGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG(SEQ ID NO：20)组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由CAGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG(SEQ ID NO：21)的核碱序列组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-210茎-环序列(SEQ ID NO：4)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：4的核碱66-87区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-210(SEQ ID NO：12)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列TCAGCCGCTGTCACACGCACAG(SEQ ID NO：22)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列TCAGCCGCTGTCACACGCACAG(SEQ ID NO：22)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-222茎-环序列(SEQ ID NO：5)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：5的核碱69-89区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：5的核碱69-91区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-222(SEQ ID NO：13)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT(SEQ ID NO：24)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT(SEQ ID NO：24)组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT(SEQ ID NO：23)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-378茎-环序列(SEQ ID NO：6)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：6的核碱43-63区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：6的核碱44-65区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-378(SEQ ID NO：14)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列CCTTCTGACTCCAAGTCCAG(SEQ ID NO：25)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列GGCCTTCTGACTCCAAGTCCAG(SEQ ID NO：26)组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列CCTTCTGACTCCAAGTCCAGT(SEQ ID NO：27)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-423茎-环序列(SEQ ID NO：7)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：7的核碱53-75区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：7的核碱53-74区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-423-3p(SEQ ID NO：15)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列CTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT(SEQ ID NO：28)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列CTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT(SEQ ID NO：28)组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列TCTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT(SEQ ID NO：29)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-638茎-环序列(SEQ ID NO：8)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：8的核碱16-40区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-638(SEQ ID NO：16)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCCT(SEQ IDNO：30)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCCT(SEQ ID NO：30)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a-1茎-环序列(SEQ ID NO：34)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：34的核碱24-46区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a-2茎-环序列(SEQ IDNO：35)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：35的核碱39-61区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a(SEQ ID NO：31)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ ID NO：38)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ DD NO：38)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a-1茎-环序列(SEQ ID NO：34)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：34的核碱64-85区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a-2茎-环序列(SEQ IDNO：35)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：35的核碱77-98区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181a*(SEQ ID NO：32)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列GGTACAATCAACGGTCGATGGT(SEQ DD NO：39)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列GGTACAATCAACGGTCGATGGT(SEQ ID NO：39)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181b-1茎-环序列(SEQ DD NO：36)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：36的核碱36-58区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181b-2茎-环序列(SEQID NO：37)的区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：37的核碱16-38区域互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miR-181b(SEQ DD NO：33)的核碱序列互补的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列ACCCACCGACAGCAATGAATGTT(SEQ DD NO：40)。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列由核碱序列ACCCACCGACAGCAATGAATGTT(SEQ DD NO：40)组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与包含选自以下成熟miRNA的pre-miR序列的核碱序列互补：miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378、miR-423-3p和miR-638。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与包含选自以下成熟miRNA的pri-miR序列的核碱序列互补：miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378、miR-423-3p和miR-638。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与包含选自以下成熟miRNA的pri-miR序列的核碱序列互补：miR-181a、miR-181a*和miR-181b。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与包含选自以下成熟miRNA的pre-miR序列的核碱序列互补：miR-181a、miR-181a*和miR-181b。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同选自以下miR茎-环序列的核碱序列有至少80％同一性的核碱序列互补：SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7和8。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同选自以下miR茎-环序列的核碱序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％同一性或100％同一性的核碱序列互补：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同miRNA的核碱序列有至少80％同一性的核碱序列互补，所述miRNA具有选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同选自以下miRNA核碱序列的核碱序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％同一性或100％同一性的核碱序列互补：SEQ IDNO：9、10、11、12、13、14、15和16。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同选自以下miR茎-环序列的核碱序列有至少80％同一性的核碱序列互补：SEQ IDNO：34、35、36和37。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列同与选自以下miR茎-环序列的核碱序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％同一性或100％同一性的核碱序列互补：SEQ ID NO：34、35、36和37。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同miRNA的核碱序列有至少80％同一性的核碱序列互补，所述miRNA具有选自SEQ ID NO：31、32和33的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有的核碱序列与同选自以下miRNA核碱序列的核碱序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％同一性或100％同一性的核碱序列互补：SEQ ID NO：31、32和33。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与本文所列miRNA核碱序列或其前体完全互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有相对于成熟miRNA或其前体的核碱序列有一个错配的核碱序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有相对于成熟miRNA或其前体的核碱序列有两个错配的核碱序列。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸具有相对于成熟miRNA或其前体的核碱序列错配不超过两个的核碱序列。在某些这类的实施方案中，错配的核碱是连续的。在某些这类的实施方案中，错配的核碱是不连续的。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由等于与之互补的成熟miR长度的连接核苷数组成。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数小于与之互补的成熟miRNA的长度。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比与之互补的成熟miRNA的长度少一个。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在5’端少一个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在3’端少一个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在5’端少2个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在3’端少2个核苷。修饰寡核苷酸的连接核苷数小于miRNA的长度，其中修饰寡核苷酸的每个核碱与在miRNA的相应位置上的每个核碱互补，其被视为是具有与miRNA序列的一部分完全互补的核碱序列的修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数大于与之互补的miRNA的长度。在某些这类的实施方案中，额外核苷的核碱与miRNA茎-环序列的核碱互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比与之互补的miRNA的长度多一个。在某些这类的实施方案中，额外核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些这类的实施方案中，额外核苷修饰寡核苷酸的3’端。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比与之互补的miRNA的长度多两个。在某些这类的实施方案中，两个额外核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些这类的实施方案中，两个额外核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。在某些这类的实施方案中，一个额外核苷位于修饰寡核苷酸的5’端，另一个额外核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的一部分核碱序列与miRNA的核碱序列完全互补，但是整个修饰寡核苷酸与miRNA不完全互补。在某些这类的实施方案中，具有完全互补部分的修饰寡核苷酸的核苷数比miRNA的长度长。例如，由24个连接核苷构成的修饰寡核苷酸，其中核苷1～23的核碱各自与长为23个核碱的miRNA的相应位置互补，具有与miRNA的核碱序列完全互补的23个核苷部分，且与miRNA的核碱序列的总体互补性为约96％。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱序列与miRNA的部分核碱序列完全互补。例如，由22个连接核苷组成的修饰寡核苷酸，其中核苷1～22的核碱各自与长为23个核碱的miRNA的相应位置互补，与miRNA的核碱序列的22个核碱部分完全互补。这类修饰寡核苷酸与整个miRNA的核碱序列的总体互补性约为96％，且与miRNA的22个核碱部分有100％互补性。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的一部分核碱序列与miRNA或其前体的一部分核碱序列完全互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的15个连续核碱各自与miRNA或其前体的15个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的16个连续核碱各自与miRNA或其前体的16个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的17个连续核碱各自与miRNA或其前体的17个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的18个连续核碱各自与miRNA或其前体的18个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的19个连续核碱各自与miRNA或其前体的19个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的20个连续核碱各自与miRNA或其前体的20个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的22个连续核碱各自与miRNA或其前体的22个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的23个连续核碱各自与miRNA或其前体的23个连续核碱互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的24个连续核碱各自与miRNA或其前体的24个连续核碱互补。

本文所记载的核碱序列，包括但不限于见于实施例和序列表中的核碱序列，与核酸的任何修饰无关。因此，由SEQ ID NO限定的核酸可独立包含对一个或多个糖部分、对一个或多个核苷间键和/或对一个或多个核碱的一种或多种修饰。

尽管本文档随附的序列表按需要将每个核碱序列标为“RNA”或“DNA”，实际上，这些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域技术人员将容易地认识到，用“RNA”或“DNA”这种命名来描述修饰寡核苷酸有些武断。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可被描述为具有修饰糖的DNA(相对于天然DNA2’-H为2’-OH)或具有修饰碱基的RNA(相对于RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))。

因此，本文提供的核酸序列，包括但不限于序列表的核酸序列，意在包括含有天然或修饰的RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括但不限于具有修饰核碱的这类核酸。作为示例而非限制性的方式，具有核碱序列“ATCGATCG”的寡聚化合物包括具有这类不论修饰还是未修饰的核碱序列的任何寡聚化合物，包括但不限于包含RNA碱基的这类化合物，例如具有序列“AUCGAUCG”的化合物，和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基例如“AUCGATCG”的化合物，以及具有其它修饰碱基例如“AT^meCGAUCG”的寡聚化合物，其中^meC表示在5位包含甲基的胞嘧啶碱基。

本文通过Isis编号(Isis NO.)所述的核酸包含核碱序列和某些已鉴定的修饰的组合。

某些修饰寡核苷酸

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15-30个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19-24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21-24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由25个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由26个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由27个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由28个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由29个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由30个连接核苷组成。

某些修饰

本发明的修饰寡核苷酸包含对核碱、糖和/或核苷间键的一种或多种修饰。由于所需要的性质，例如细胞摄取增加、对其它寡核苷酸或核酸靶的亲和力提高和在核酸酶的存在下稳定性提高，可以选择优于未修饰形式的修饰的核碱、糖和/或核苷间键。

在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷。在某些这类的实施方案中，修饰核苷是稳定性核苷。稳定性核苷的实例是糖被修饰的核苷。

在某些实施方案中，修饰核苷是糖被修饰的核苷。在某些这类的实施方案中，糖被修饰的核苷可还包含天然或修饰的杂环碱基部分和/或天然或修饰的核苷间键，并可另包括独立于糖修饰的修饰。在某些实施方案中，糖被修饰的核苷是2’-修饰核苷，其中糖环在天然核糖或2’-脱氧-核糖的2’碳上被修饰。

在某些实施方案中，2’-修饰核苷具有双环糖部分。在某些这类的实施方案中，双环糖部分是α构型的D糖。在某些这类的实施方案中，双环糖部分是β构型的D糖。在某些这类的实施方案中，双环糖部分是α构型的L糖。在某些这类的实施方案中，双环糖部分是β构型的L糖。

在某些实施方案中，双环糖部分在2’碳原子和4′碳原子之间包含桥基(bridge group)。在某些这类的实施方案中，桥基包含1-8个连接的二价基团。在某些实施方案中，双环糖部分包含1-4个连接的二价基团。在某些实施方案中，双环糖部分包含2个或3个连接的二价基团。在某些实施方案中，双环糖部分包含2个连接的二价基团。在某些实施方案中，连接的二价基团选自-O-、-S-、-N(R₁)-、-C(R₁)(R₂)-、-C(R₁)＝C(R₁)-、-C(R₁)＝N-、-C(＝NR₁)-、-Si(R₁)(R₂)-、-S(O)₂-、-S(＝O)-、-C(＝O)-和-C(＝S)-；其中每个R₁和R₂独立地为H、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、杂环基、取代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、C₅-C₇脂环基、取代的C₅-C₇脂环基、卤素、取代氧基(-O-)、氨基、取代氨基、叠氮基、羧基、取代羧基、酰基、取代酰基、CN、巯基、取代巯基、磺酰基(S(＝O)₂-H)、取代磺酰基、亚磺酰基(S(＝O)-H)或取代亚磺酰基；且每个取代基独立地为卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、氨基、取代氨基、酰基、取代酰基、C₁-C₁₂氨基烷基、C₁-C₁₂氨基烷氧基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷氧基或保护基。

在一些实施方案中，双环糖部分在2’和4’碳原子之间被选自以下的二价基团桥接：-O-(CH₂)P-、-O-CH₂-、-O-CH₂CH₂-、-O-CH(烷基)-、-NH-(CH₂)P-、-N(烷基)-(CH₂)P-、-O-CH(烷基)-、-(CH(烷基))-(CH₂)p-、-NH-O-(CH₂)P-、-N(烷基)-O-(CH₂)_P-或-O-N(烷基)-(CH₂)_P-，其中p为1、2、3、4或5，每个烷基可被进一步取代。在某些实施方案中，p为1、2或3。

在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：卤素、烷基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF₃、OCF₃、O-、S-或N(R_m)-烷基；O-、S-或N(R_m)-烯基；O-、S-或N(R_m)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)或O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中每个R_m和每个R_n独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C₁-C₁₀烷基。这些2’-取代基可被独立选自以下的一个或多个取代基进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO₂)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH₂、N₃、OCF₃、O-CH₃、O(CH₂)₃NH₂、CH₂-CH＝CH₂、O-CH₂-CH＝CH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂和N-取代的乙酰胺(O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中每个R_m和每个R_n独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C₁-C₁₀烷基。

在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、OCF₃、O-CH₃、OCH₂CH₂OCH₃、2’-O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(CH₃)₂、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N-(CH₃)₂和O-CH₂-C(O)-N(H)CH₃。

在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH₃和OCH₂CH₂OCH₃。

在某些实施方案中，糖被修饰的核苷是4’-硫代修饰核苷。在某些实施方案中，糖被修饰的核苷是4’-硫代-2’-修饰核苷。4’-硫代修饰核苷具有β-D-核糖核苷，其中4’-O被4’-S置换。4’-硫代-2’-修饰核苷是2’-OH被2’-取代基置换的4’-硫代修饰核苷。合适的2’-取代基包括2’-OCH₃、2’-O-(CH₂)₂-OCH₃和2’-F。

在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含一个或多个核苷间酸间修饰。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键都是修饰核苷间键。在某些实施方案中，修饰核苷间键包含磷原子。

在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，修饰核苷间键不含磷原子。在某些这类的实施方案中，核苷间键由短链烷基核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键由环烷基核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键由混合的杂原子和烷基核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键由混合的杂原子和环烷基核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键由一个或多个短链杂原子核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键由一个或多个杂环核苷间键构成。在某些这类的实施方案中，核苷间键具有酰胺主链。在某些这类的实施方案中，核苷间键具有混合的N、O、S和CH₂组成部分。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核碱。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个胞嘧啶都包含5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，修饰核碱选自5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤。在某些实施方案中，修饰核碱选自7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施方案中，修饰核碱选自5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

在某些实施方案中，修饰核碱包含多环杂环。在某些实施方案中，修饰核碱包含三环杂环。在某些实施方案中，修饰核碱包含吩噁嗪衍生物。在某些实施方案中，吩噁嗪可被进一步修饰形成本领域称为G封条(G-clamp)的核碱。

某些寡核苷酸基序

用于本发明的修饰寡核苷酸的合适基序包括但不限于完全修饰、一致修饰、位置修饰和gapmer。可设计具有完全修饰基序(包括一致修饰基序)的修饰寡核苷酸以靶向成熟miRNA。或者，可设计具有完全修饰基序(包括一致修饰基序)的修饰寡核苷酸以靶向pri-miRNA或pre-miRNA的某些位点，以阻断miRNA前体加工成成熟miRNA。具有完全修饰基序或一致修饰基序的修饰寡核苷酸是miRNA活性的有效抑制剂。

在某些实施方案中，完全修饰寡核苷酸包含每个核苷上的糖修饰。在某些这类的实施方案中，多个核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷，其余核苷是2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，多个核苷中的每一个都是2’-O-甲氧基乙基核苷，且多个核苷中的每一个都是双环核苷。在某些这类的实施方案中，完全修饰寡核苷酸还包含至少一个修饰核苷间键。在某些这类的实施方案中，糖完全修饰的寡核苷酸的每个核苷间键都是修饰核苷间键。在某些实施方案中，糖完全修饰的寡核苷酸还包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些这类的实施方案中，糖完全修饰的寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，完全修饰寡核苷酸在每个核苷间键上被修饰。在某些这类的实施方案中，完全修饰寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，一致修饰寡核苷酸在每个核苷上都包括同样的糖修饰。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖修饰。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-O-甲基糖修饰。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-氟糖修饰。在某些这类的实施方案中，一致修饰寡核苷酸还包含至少一个修饰核苷间键。在某些这类的实施方案中，糖一致修饰的寡核苷酸的每个核苷间键都是修饰核苷间键。在某些实施方案中，糖一致修饰的寡核苷酸还包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些这类的实施方案中，糖一致修饰的寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，一致修饰寡核苷酸始终包含同样的核苷间键修饰。在某些这类的实施方案中，一致修饰寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

表1表示与本文所述的miRNA互补的某些一致修饰寡核苷酸。每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖，每个核苷间键都是硫代磷酸酯，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包含连接核苷的区域，其中每个区域的每个核苷都包含同样的糖部分，且每个区域的每个核苷都包含不同于相邻区域的糖部分。

在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包含至少10个2’-氟修饰核苷。这类位置修饰寡核苷酸可用下式I表示：

5’-T₁-(Nu₁-L₁)n₁-(Nu₂-L₂)n₂-Nu₂-(L₃-Nu₃)n₃-T₂-3’，其中：

每个Nu₁和每个Nu₃独立地为稳定性核苷；

至少10个Nu₂为2’-氟核苷；

L₁、L₂和L₃的每一个独立地为核苷间键；

每个T₁和每个T₂独立地为H、羟基保护基、任选连接的缀合基或封端基团；

n₁为0～约3；

n₂为约14～约22；

n₃为0～约3；

且前提条件是如果n₁为0，则T₁不为H或羟基保护基，且如果n₃为0，则T₂不为H或羟基保护基。

在某些这类的实施方案中，n₁和n₃各自独立地为1～约3。在某些实施方案中，n₁和n₃各自独立地为2～约3。在某些实施方案中，n₁为1或2，n₃为2或3。在某些实施方案中，n₁和n₃各自为2。在某些实施方案中，n₁和n₃中的至少一个大于零。在某些实施方案中，n₁和n₃各自大于零。在某些实施方案中，n₁和n₃之一大于零。在某些实施方案中，n₁和n₃之一大于1。

在某些实施方案中，n₂为16～20。在某些实施方案中，n₂为17～19。在某些实施方案中，n₂为18。在某些实施方案中，n₂为19。在某些实施方案中，n₂为20。

在某些实施方案中，约2～约8个Nu₂核苷是稳定性核苷。在某些实施方案中，约2～约6个Nu₂核苷是稳定性核苷。在某些实施方案中，约3～约4个Nu₂核苷是稳定性核苷。在某些实施方案中，3个Nu₂核苷是稳定性核苷。

在某些实施方案中，每个Nu₂稳定性核苷与Nu₃稳定性核苷被2～约8个2’-氟核苷分隔开来。在某些实施方案中，每个Nu₂稳定性核苷与Nu₃稳定性核苷被3～约8个2’-氟核苷分隔开来。在某些实施方案中，每个Nu₂稳定性核苷与Nu₃稳定性核苷被5～约8个2’-氟核苷分隔开。

在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含2～约6个Nu₂稳定性核苷。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含3个Nu₂稳定性核苷。

在某些实施方案中，每个Nu₂稳定性核苷在一个连续序列中连接在一起。在某些实施方案中，至少两个Nu₂稳定性核苷与被至少一个2’-氟核苷分隔开来。在某些实施方案中，每个Nu₂稳定性核苷都被至少一个2’-氟核苷分隔开来。

在某些实施方案中，Nu₂2’-氟核苷的至少两个连续序列被至少一个稳定性核苷分隔分来，其中每个连续序列具有相同数目的2’-氟核苷。

在某些实施方案中，T₁和T₂各自独立地为H或羟基保护基。在某些实施方案中，T₁和T₂中的至少一个是4，4’-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，T₁和T₂中的至少一个是任选连接的缀合基。在某些实施方案中，T₁和T₂中的至少一个是封端基团。在某些实施方案中，封端基团是反向脱氧无碱基基团。

在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包含至少一个修饰核苷间键。在某些这类的实施方案中，位置修饰寡核苷的每个核苷间键是修饰核苷间键。在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在某些这类的实施方案中，位置修饰寡核苷酸的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在某些实施方案中，位置修饰基序由下式II表示，它表示由以下连接核苷组成的修饰寡核苷酸：

T₁-(Nu₁)n₁-(Nu₂)n₂-(Nu₃)n₃-(Nu₄)n₄-(Nu₅)n₅-T₂，其中：

Nu₁和Nu₅独立地为2’稳定性核苷；

Nu₂和Nu₄为2’-氟核苷；

Nu₃为2’-修饰核苷；

n₁和n₅的每一个独立地为0-3；

n₂加n₄的和介于10和25之间；

n₃介于0和5之间；

每个T₁和每个T₂独立地为H、羟基保护基、任选连接的缀合基或封端基团。

在某些实施方案中，n₂和n₄之和为16。在某些实施方案中，n₂和n₄之和为17。在某些实施方案中，n₂和n₄之和为18。在某些实施方案中，n₁为2；n₃为2或3；n₅为2。

在某些实施方案中，Nu₁和Nu₅独立地为2’-修饰核苷。

在某些实施方案中，Nu₁为O-(CH₂)₂-OCH₃，Nu₃为O-(CH₂)₂-OCH₃，Nu₅为O-(CH₂)₂-OCH₃，T₁为H，T₂为H。

在某些实施方案中，与miRNA互补且由21个连接核苷组成的修饰寡核苷酸具有选自表2的式II，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，具有选自表2的式II的修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO 24和27中所记载的核碱序列的核碱序列。

在某些实施方案中，与miRNA互补且由22个连接核苷组成的修饰寡核苷酸选自表3中的式II，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，具有选自表3中式II的修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO：17、20、22、26和28中所记载的核碱序列的核碱序列。

在某些实施方案中，与miRNA互补且由23个连接核苷组成的修饰寡核苷酸具有选自表4中的式II，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，具有选自表4中式II的修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO 18、21和23中所记载的核碱序列的核碱序列。

在某些实施方案中，与miRNA互补且由24个连接核苷组成的修饰寡核苷酸选自表5中的式II，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，具有选自表5中式II的修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO 19和23中所记载的核碱序列的核碱序列。

在某些实施方案中，与miRNA互补且由25个连接核苷组成的修饰寡核苷酸选自表6中的式II，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，具有选自表6中式II的修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO 30中所记载的核碱序列。

具有gapmer基序的修饰寡核苷酸可具有由连接的2’-脱氧核苷酸构成的内部区域和由连接2’-修饰核苷构成的外部区域。这类gapmer可设计成诱导RNA酶切割的miRNA前体。内部的2’-脱氧核苷区域用作RNA酶的底物，允许切割修饰寡核苷酸所靶向的miRNA前体。在某些实施方案中，各外部区域的每个核苷包含同样的2’-修饰核苷。在某些实施方案中，一个外部区域一律由第一2’-修饰核苷组成，另一个外部区域一律由第二2’-修饰核苷组成。

具有gapmer基序的修饰寡核苷酸在每个核苷上可具有糖修饰。在某些实施方案中，内部区域一律由第一2’-修饰核苷组成，各翼一律由第二2’-修饰核苷组成。在某些这类的实施方案中，内部区域一律由2’-氟核苷组成，每个外部区域一律由2’-O-甲氧基乙基核苷组成。

在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的2’-O-甲氧基乙基核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的2’-O-甲基核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由2’-氟核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的双环核苷组成。

在某些实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，另一个外部区域的每个核苷包含不同的2’-修饰。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，另一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，另一个外部区域的每个核苷都包含2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷，另一个外部区域的每个核苷都包含2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，另一个外部区域的每个核苷都包含双环核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域中的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷，另一个外部区域的每个核苷都包含双环核苷。

在某些实施方案中，一个外部区域的核苷包含两种或更多种糖修饰。在某些实施方案中，每个外部区域的核苷包含两种或更多种糖修饰。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含双环糖部分。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含双环糖部分。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖且同一外部区域的至少一个核苷包含双环糖部分。

在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由相同数目的连接核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的一个外部区域由多个不同于另一外部区域的连接核苷组成。

在某些实施方案中，外部区域独立包含1-6个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含1个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含2个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含3个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含4个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含5个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含6个核苷。在某些实施方案中，内部区域由17-28个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由17-21个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由18个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由19个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由21个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由22个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由24个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由25个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由26个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由27个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由28个连接核苷组成。

某些其它的疗法

癌症治疗常常包括一种以上的疗法。因此，在某些实施方案中，本发明提供用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含与miRNA或其前体互补的修饰寡核苷酸的化合物，并且还包括给予至少一种另外的疗法。

在某些实施方案中，还可设计另外的疗法以治疗肝癌(例如HCC)。另外的疗法可以是化疗药物。合适的化疗药物包括5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔比星、丝裂霉素C、索拉非尼、依托泊苷、卡铂、表柔比星、伊立替康和奥沙利铂。另外合适的化疗药物包括用于治疗癌症的本发明修饰寡核苷酸以外的修饰寡核苷酸。另外的疗法可以是肝肿瘤的外科切除术、肝脏移植术或化疗栓塞。

在某些实施方案中，可以设计另外的疗法以治疗肝癌(包括HCC)以外的疾病。在某些这类的实施方案中，另外的疗法可以治疗丙型肝炎感染或乙型肝炎感染。

在某些实施方案中，另外的疗法是治疗丙型肝炎感染。用于治疗丙型肝炎感染的治疗剂包括干扰素类，例如干扰素α-2b、干扰素α-2a和复合α干扰素。可以使用聚乙二醇化干扰素(干扰素与显著改善其药代动力学特征的聚乙二醇部分连接)达到较小的干扰素给药频率。研究表明干扰素α-2b(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)和利巴韦林的联合疗法对一些患者群是有效的。目前正开发的其它药物包括RNA复制抑制剂(例如ViroPharma的VP50406系列)、反义药物(antisense agent)(例如抗miR-122)、治疗性疫苗、蛋白酶抑制剂、解旋酶抑制剂和抗体疗法(单克隆和多克隆)。

在某些实施方案中，另外的疗法可以是提高机体免疫系统的药物，包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补充剂(例如抗氧化剂，包括维生素A、C、E、β-胡罗卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10和echinacea)和疫苗，例如免疫刺激复合物(ISCOM)，其包含多聚体呈递的抗原与佐剂混合的疫苗制剂。

在某些这类的实施方案中，选择另外的疗法以治疗或改善一种或多种本发明药物组合物的副作用。这类副作用包括而不限于注射部位反应、肝功能化验异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。例如，血清转氨酶水平升高可表示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素升高可表示肝毒性或肝功能异常。

在某些实施方案中，可以同时给予一种或多种本发明的药物组合物和一种或多种其它药物。在某些实施方案中，在不同的时间给予一种或多种本发明的药物组合物和一种或多种其它药物。在某些实施方案中，将一种或多种本发明的药物组合物和一种或多种其它药物一起制备在单一剂型中。在某些实施方案中，将一种或多种本发明的药物组合物和一种或多种其它药物分开制备。

某些药物组合物

在某些实施方案中，将本文所述的包含与miRNA或其前体互补的修饰寡核苷酸的化合物制成用于治疗肝癌(包括HCC)的药物组合物。合适的给药途径包括但不限于口服、直肠、经黏膜、肠、小肠内、局部、栓剂、经吸入、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内、眼内、肿瘤内和胃肠外(例如静脉内、肌内、髓内和皮下)。另外合适的给药途径包括化疗栓塞。在某些实施方案中，给予鞘内用药物(pharmaceuticalintrathecal)以实现局部暴露而非全身暴露。例如，可将药物组合物直接注射到需要治疗效果的区域(例如注射到肿瘤内)。

在某些实施方案中，以剂量单位(例如片剂、胶囊剂、大丸剂等)的形式给予本发明的药物组合物。在某些实施方案中，这类药物组合物包含选自以下剂量的修饰寡核苷酸：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg和800mg。在某些这类的实施方案中，本发明的药物组合物包含选自以下剂量的修饰寡核苷酸：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg和800mg。

在某些实施方案中，药物是用合适的稀释剂重配的无菌冻干修饰寡核苷酸，稀释剂例如为注射用无菌水或注射用无菌盐水。在稀释到盐水中后，将重配产物以皮下注射或以静脉内输注给予。冻干药物由修饰寡核苷酸组成，其已制备在注射用水中或者注射用盐水中，制备期间用酸或碱调节至pH 7.0-9.0，然后冻干。冻干修饰寡核苷酸可以是25-800mg的修饰寡核苷酸。要了解的是，这包括了25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775和800mg冻干的修饰寡核苷酸。可将冻干药物包装在2mL I型透明玻璃小瓶(经过硫酸铵处理)中，用溴化丁基橡皮塞塞住，并用FLIP-铝顶封盖密封。

在某些实施方案中，本发明的组合物还可按其领域确定的使用水平，含有常规存在于药物组合物中的其它辅助成分。因此，例如组合物可含有其它相容的药学活性材料，例如止庠药、收敛药、局部麻醉药或抗炎药，或者可含有用于实际配制各种本发明组合物的剂型的其它材料，例如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、乳浊剂、增稠剂和稳定剂。然而，这类材料当加入时，不应过多干扰本发明组合物的组分的生物活性。可将所述剂型灭菌，需要时可与不会与剂型的寡核苷酸进行有害相互作用的辅助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味料和/或芳香物质等。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂。在某些这类的实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物采用已知技术制备，包括但不限于混合、溶解、制粒、制锭(dragee-making)、研碎、乳化、包胶囊、包封或压片工序。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物是液体剂(例如混悬剂、酏剂和/或溶液剂)。在某些这类的实施方案中，液体药物组合物采用本领域已知成分制备，包括但不限于水、二醇类、油、醇类、矫味剂、防腐剂和着色剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物是固体剂(例如散剂、片剂和/或胶囊剂)。在某些这类的实施方案中，包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物采用本领域已知成分制备，包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物被制成贮库制剂。某些这类的贮库制剂的作用通常比非贮库制剂的作用更长久。在某些实施方案中，这类制剂通过植入(例如皮下或肌内)或者通过肌内注射给予。在某些实施方案中，贮库制剂采用合适的聚合材料或疏水材料(例如可接受的油中的乳液)或离子交换树脂制备，或者作为微溶衍生物，例如作为微溶盐。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的药物组合物。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂，例如二甲亚砜。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，所述分子被设计成将一种或多种本发明的药物递送到特定的组织或细胞类型中。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括用组织特异性抗体包被的脂质体。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含助溶剂系统。这类助溶剂系统的某一些包含例如苄甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在某些实施方案中，这类助溶剂系统被用于疏水化合物。这类助溶剂系统的非限制性实例是VPD助溶剂系统，这是一种包含3％(w/v)苄甲醇、8％(w/v)非极性表面活性剂Polysorbate80TM和65％(w/v)聚乙二醇300的无水乙醇溶液。在不显著改变其溶解度和毒性特征的情况下，可对这类助溶剂系统的比例作相当大的改动。此外，还可改变助溶剂组分的特性：例如，可以使用其它表面活性剂代替Polysorbate 80^TM；可以改变聚乙二醇的分数大小；可以使用其它生物相容性聚合物替换聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及可以使用其它糖或多糖替换葡萄糖。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含缓释系统。这类缓释系统的非限制性实例是固体疏水聚合物的半渗透基质。在某些实施方案中，取决于其化学性质，缓释系统可在数小时、数天、数周或数月的时间段内释放药物。

在某些实施方案中，制备本发明的药物组合物用于口服给药。在某些这类的实施方案中，通过将一种或多种包含修饰寡核苷酸的化合物与一种或多种药学上可接受的载体组合来制备药物组合物。这类载体的某一些能够使药物组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，用于对象口服摄入。在某些实施方案中，用于口服用途的药物组合物通过将寡核苷酸和一种或多种固体赋形剂混合而获得。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方案中，这类混合物任选是磨碎的，并任选添加助剂。在某些实施方案中，使药物组合物成形，得到片剂芯或锭剂芯。在某些实施方案中，添加崩解剂(例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠)。

在某些实施方案中，提供有包衣的锭剂芯。在某些这类的实施方案中，可使用浓缩的糖溶液，该溶液可任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或锭剂包衣中。

在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物是由明胶制成的两节式(push-fit)胶囊剂。这类两节式胶囊剂的某一些包含一种或多种本发明的药物，与一种或多种填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)及任选稳定剂相混合。在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物是软的密封胶囊剂，用明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成。在某些软质胶囊剂中，可将一种或多种本发明的药物溶于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于口腔给药。这类药物组合物的某一些是以常规方式制备的片剂或糖锭剂。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过注射给药(例如静脉内、皮下、肌内等)。在某些这类的实施方案中，药物组合物包含载体，并且在水溶液中配制，例如水或生理上相容的缓冲液，例如Hanks溶液、林格液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其它成分(例如有助溶解的或用作防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用合适的液体载体、悬浮剂等制备注射用混悬剂。用于注射的某些药物组合物以单位剂型提供，例如用安瓿或用多剂量容器提供。用于注射的某些药物组合物是油性溶媒或含水溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有调配剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油(例如芝麻油)、合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)和脂质体。含水注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选这类混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加药物溶解度以供制备高度浓缩溶液的物质。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于经黏膜给药。在某些这类的实施方案中，在这种剂型中使用适合有待透过的屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域已知的。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过吸入给药。将用于吸入的这类药物组合物的某一些制成在加压包装或喷雾器中的气雾剂形式。这类药物组合物的某一些包含抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在使用压缩气雾剂的某些实施方案中，可以用递送计量的阀确定剂量单位。在某些实施方案中，可以制备用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒。这类剂型的某一些包含本发明的药物和合适的粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉状混合物。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于直肠给药，例如栓剂或滞留型灌肠剂。这类药物组合物的某一些包含已知成分，例如可可脂和/或其它甘油酯。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于局部给药。这类药物组合物的某一些包含温和的湿润基料，例如软膏剂或乳膏剂。示例性的合适的软膏剂基料包括但不限于矿脂、矿脂加挥发性硅酮，以及羊毛脂和油包水乳液。示例性的合适的软膏剂基料包括但不限于冷膏和亲水性软膏。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长待治疗的对象的生存期。治疗有效量的确定尽在本领域技术人员掌握之中。

在某些实施方案中，将一种或多种本发明的修饰寡核苷酸制成前药。在某些实施方案中，当体内给药时，前药以化学方法转化成修饰寡核苷酸在生物学、药学或治疗上更有活性的形式。在某些实施方案中，前药是有益的，因为前药比相应的活性形式较易给药。例如，在某些情况下，前药比起相应的活性形式可能具有更高的生物利用度(例如经口服给药)。在某些情况下，前药比起相应的活性形式可具有改进的溶解度。在某些实施方案中，前药比相应的活性形式较不溶于水。在某些情况下，这类前药具有更好的跨细胞膜传送能力，在此处水溶性不利于移动。在某些实施方案中，前药是酯。在某些这类的实施方案中，酯在给予时经代谢作用水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物是相应的活性形式。在某些实施方案中，前药包含与酸基结合的短肽(聚氨基酸)。在某些这类的实施方案中，肽在给药时被裂解形成相应的活性形式。

在某些实施方案中，通过对有药学活性的化合物进行修饰产生前药，使得当体内给药时将重新产生活性化合物。可以设计前药，改变药物的代谢稳定性或转运特征，掩蔽副作用或毒性，改善药物的味道或者改变药物的其它特征或性质。一旦发现某一种药学活性化合物，本领域技术人员就可凭借对体内药效动力学进程和药物代谢的认识，设计该化合物的前药(参见例如，Nogrady(1985)Medicinal Chemistry ABiochemical Approach，Oxford University Press，New York，第388-392页)。

某些实验模型

在某些实施方案中，本发明提供在实验模型中使用和/或测试本发明的修饰寡核苷酸的方法。在某些实施方案中，使用实验模型评价用于治疗肝癌(包括HCC)的本发明修饰寡核苷酸的疗效。本领域的技术人员能够选择和修改用于评价本发明药物的这类实验模型的方案。

一般来讲，先在培养细胞中测试修饰寡核苷酸。合适的细胞类型包括这类细胞，即与需要体内向其递送修饰寡核苷酸的细胞类型相关。例如，用于研究治疗肝癌的修饰寡核苷酸的合适细胞类型包括衍生自肝癌的细胞类型，例如HepG2、Hep3B、SK-Hep1、7721、SNU-398、SNU423、SNU449、Huh7、HCCLM3和MHT细胞。

在某些实施方案中，在培养的细胞中评价修饰寡核苷酸干扰miRNA活性的程度。在某些实施方案中，可通过测定miRNA的水平来评价对miRNA活性的抑制。或者，可以测定预测的或经证实的miRNA靶的水平。miRNA活性的抑制可引起miRNA靶的mRNA和/或蛋白质增加。此外，在某些实施方案中，可以测定某些表型结果。例如，合适的表型结果包括细胞增殖的抑制、细胞死亡的诱导和/或细胞凋亡的诱导。其它合适的表型结果包括在细胞周期的任一点上停滞细胞，例如G1/S转换、S期、G2/M转换、有丝分裂或胞质分裂。

在体外鉴定出有效抑制miRNA活性的修饰寡核苷酸后，在体内实验模型中进一步测试修饰寡核苷酸。用于测试化疗药物(包括本文所述的与miRNA互补的修饰寡核苷酸)的合适的实验模型包括：皮下异种移植物小鼠模型、同位肝异种移植物小鼠模型、SV40t/T转基因小鼠模型、TGF-α/c-myc转基因小鼠模型和化学诱发的致癌(二乙基亚硝胺)小鼠模型。

用于测试本发明修饰寡核苷酸的合适的体内实验模型包括皮下异种移植物小鼠模型。在这个模型中，从培养物中取出细胞，并将细胞注射到小鼠皮下。合适的细胞包括例如Hep3B细胞。合适的小鼠包括例如BALB/c裸小鼠。合适的注射部位为例如小鼠胁腹。将溶于盐水的修饰寡核苷酸，以每周2-3次的频率给予小鼠。在植入前、与植入同时或在植入后给予修饰寡核苷酸。合适的给药途径包括腹膜内给药和肿瘤内给药。修饰寡核苷酸剂量的范围为5-50mg/kg。对动物进行治疗达3-4周，之后测量肿瘤大小、肿瘤数和肝重。可用数字测径器进行测量。使用盐水处理的动物作为对照组。化疗药物(例如5-氟尿嘧啶)可用作抑制肿瘤大小或肿瘤数的阳性对照。评价各个终点，包括肿瘤大小、肿瘤数和肝重。将修饰寡核苷酸治疗的小鼠与相同终点的对照处理的小鼠进行比较。应用统计分析以鉴别任何终点上的显著性差异。皮下异种移植物模型是用于体内评价化疗药物(包括修饰寡核苷酸)的现有技术中普遍接受的模型。参见例如Roller等，Cancer Res.，2006，66，2059-2066和Cheng等，Cancer Res.，2007，67，309-317。

用于测试本发明的修饰寡核苷酸的合适体内实验模型是HCCLM3同位肝异种移植物模型。在这个模型中，将约1百万个HCCLM3细胞(高度转移性的人HCC细胞系)注射到BALB/c裸小鼠胁腹皮下。一旦肿瘤呈适当大小(例如1mm³)，取出肿瘤碎片，植入其它BALB/c裸小鼠肝内。这时，将溶于盐水的修饰寡核苷酸以每周2-3次的频率给予小鼠。或者，在植入后开始给予修饰寡核苷酸几天(例如10天)。合适的给药途径包括腹膜内给药和肿瘤内给药。修饰寡核苷酸剂量的范围为5-50mg/kg。对动物进行治疗达3-4周作为短期研究，之后测量肿瘤大小、肿瘤数和肝重。或者，对动物进行治疗达8-30周作为长期研究，之后评价各个终点，包括肿瘤大小、肿瘤数、肝重，可对转移数和生存期进行测定。测定了组织(例如肺组织)中的转移。肿瘤大小和重量的测定可用数字测径器进行。使用盐水处理的动物作为对照组。化疗药物(例如5-氟尿嘧啶)可用作抑制肿瘤大小或肿瘤数的阳性对照。将在修饰寡核苷酸治疗的小鼠中观察到的终点与对照处理小鼠的相同终点进行了比较。应用统计分析以鉴别任何终点上的显著性差异。同位异种移植物模型是用于体内评价化疗药物(包括修饰寡核苷酸)的现有技术普遍接受的模型。参见例如Li等，Clin.Cancer Res.，2006，12，7140-7148。作为HCCLM3细胞的一个选择，HepG2细胞可用来建立同位模型。

另外合适的体内实验模型是SV40t/T转基因小鼠模型。对转基因小鼠进行了工程改造以在肝特异性C-反应蛋白启动子控制下表达SV40大T抗原(SV40t/T小鼠)(Ruther等，Oncogene，1993，8，87-93)。可通过注射细菌脂多糖来瞬时诱导SV40大T抗原的表达，并且引发肝细胞癌。此处，将溶于盐水的修饰寡核苷酸以每周2-3次的频率给予小鼠。修饰寡核苷酸的剂量范围为5-50mg/kg。合适的给药途径包括腹膜内给药和肿瘤内给药。对动物进行治疗达3-4周作为短期研究，之后测量肿瘤大小、肿瘤数和肝重。或者，对动物进行治疗达8-30周作为长期研究，之后测定各个终点，包括肿瘤大小、肿瘤数、肝重、转移数和生存期。测定了组织(例如肺组织)中的转移。肿瘤大小和重量的测定可用数字测径器进行。使用盐水处理的动物作为对照组。化疗药物(例如5-氟尿嘧啶)可用作抑制肿瘤大小或肿瘤数的阳性对照。将在修饰寡核苷酸治疗的小鼠中观察到的终点与对照处理小鼠的相同终点进行了比较。应用统计分析以鉴别任何终点上的显著性差异。

合适的体内实验模型是化学诱发的致癌小鼠模型。在这个模型中，肝癌是通过给予致癌物二乙基亚硝胺(DEN)诱发的。经腹膜内给注射小鼠5mg/kg或25mg/kg DEN。将溶于盐水的修饰寡核苷酸以每周2-3次的频率给予小鼠。修饰寡核苷酸的剂量范围为5-50mg/kg。合适的给药途径包括腹膜内给药和肿瘤内给药。对动物进行治疗达4-8周作为短期研究，之后测量肿瘤大小、肿瘤数和肝重。或者，对动物进行治疗达8-30周作为长期研究，之后可对肿瘤大小、肿瘤数、肝重、转移数和生存期进行了测定。测定了组织(例如肺组织)中的转移。肿瘤大小和重量的测定可用数字测径器进行。使用盐水处理的动物作为对照组。化疗药物(例如5-氟尿嘧啶)可用作抑制肿瘤大小或肿瘤数的阳性对照。将在修饰寡核苷酸治疗的小鼠中观察到的终点与对照处理小鼠的相同终点进行了比较。应用统计分析以鉴别任何终点上的显著性差异。使用DEN诱发的HCC模型以研究HCC。参见例如Maeda等，Cell，2005，121，977-990。

二恶英类

二恶英类是环境污染物(例如2，3，7，8-四氯二苯并-对-二恶英(TCDD))家族，已知具有多种危险作用。已知TCDD是最强的致癌物，而且还引起其它的有害生物反应。二恶英诱导的作用包括但不限于皮肤病、出生缺陷、流产、发育缺陷、畸形形成、免疫毒性和癌症。当有机材料在氯的存在下燃烧时，便会产生少量的二恶英类。这个过程常常发生在各种工业生产方法(例如纸张漂白)当中，但是二恶英类还可从天然来源产生，例如火山和森林火灾。由于二恶类的亲脂性质，二恶英类主要通过食物摄入(除草剂)进入母体，不过还通过吸入进入。二恶英暴露后的普遍治疗法是膳食脂肪以将其从机体内排除，因为二恶英是极亲脂性的。用于降低二恶英的其它方法包括矿物油(Moser和McLachlan，1999)、活性碳(Araki，1974)、米糠油(Ilda，1995)或脂肪代用品Olestra(Geusau等，1999，2002)的膳食摄取，然而这些治疗的疗效甚微。

尚未完全了解二恶英类致癌效应的机制，然而已知二恶英类是芳香烃受体(AhR)配体，一般认为大多是通过AhR的活化介导的，即使不完全是它的作用。

AhR属于配体活化转录因子碱性螺旋-环-螺旋/Per-Arnt-Sim(bHLH/PAS)家族，介导在异生素代谢中起作用的一组酶的转录活化。当配体结合时，AhR转运到核中，并且与配偶体蛋白Arnt缔合形成异二聚体。异二聚体与在DNA指定的异生素反应元件(XRE)上的增强子位点结合，负责调节多种参与异生素代谢和其它功能的酶的转录活化。受AhR转录调节的基因之一是还可与Arnt形成异二聚体并与XRE结合的AhR阻抑蛋白(AhRR)，然而这形成了转录阻抑作用。因为AhRR转录受AhR调节，AhR和AhRR形成调节反馈环。

由于AhR的活化，由CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、NQO1、ALHD3A1、UGT1A2和GSTA1组成的I期和II期代谢酶的“AhR基因系列(AhR gene battery)”上调。据推测，这种反应进化成能够发现大量的化学制品(由AhR底物的广泛范围所表明)，并且促进其进行生物转化和排除作为解毒过程。

然而，AhR活化还诱导毒性反应。毒性产生于两个不同的AhR信号转导途径。第一个是当诱导的代谢酶引起有毒中间代谢物产生时的途径。毒性的第二途径是在“AhR基因系列”中所观察到的转录以外的整体基因转录的异常改变的结果。基因表达的这些整体改变引起细胞过程和功能的不利变化。

为了阐明机制和了解TCDD经AhR活化的所致毒性和致癌性而进行的多项研究得出自相矛盾结果。已经报告了反复不一致的结果，显示出TCDD激活的AhR细胞反应中凋亡作用和抗凋亡作用两者兼有，通常解释为治疗方案和受测模型的差异。

尽管由二恶英类诱导的AhR已得到充分表征，但是其毒性某一些的功能和机制尚未得知，在许多文章中出现的自相矛盾和相互抵触的结果表明了进一步研究TCDD致癌机制的必要性。

迄今为止，对任何表达受二恶英类直接调节的miR或对这类调节的功能后果还没有明确的描述；Moffat等人(Toxicol Sci.2007年10月；99(2)：470-87)指出，在啮齿目动物模型中miR在响应TCDD时仅有十分适度的改变，并得到微小RNA在二恶英毒性中不起作用的结论。

如本文所证实的一样，在HCC中上调的hsa-miR-191，在AhR转录因子的TCDD活化后，连同miR-181a和hsa-miR-181b一起上调，hsa-miR-181a*上调的程度较小。因此，AhR转录因子负责对在其启动子上具有AhR TFBS基序的miR的表达进行调节。除通过AhR的转录活化以外，miR参与TCDD活性的机制可解释表达阵列中所观察到的若干基因的下调。

某些定量测定法

可通过本领域已知的各种方法，评价在给予修饰寡核苷酸后miRNA的反义抑制效应。在某些实施方案中，应用这些方法在体外或体内定量测定细胞或组织中的miRNA水平。在某些实施方案中，miRNA水平的变化通过微阵列分析测定。在某些实施方案中，miRNA水平的变化通过若干市售的PCR测定试剂之一测定，例如

MicroRNA Assay(Applied Biosystems)。在某些实施方案中，通过测定miRNA靶的mRNA和/或蛋白质水平评价miRNA的反义抑制。miRNA的反义抑制一般引起miRNA靶的mRNA和/或蛋白质水平升高。

为了更全面说明本发明的一些实施方案，提供了下面的实施例。然而，这些实施例绝不应解释为是对本发明广大范围的限制。

实施例

实施例1：测定组织样品中miRNA的表达谱

为了鉴定与癌症有关的失调的miRNA，对得自患有肝细胞癌(HCC)的对象肝样品中的miRNA表达谱进行了分析，并且与正常肝中的表达谱进行了比较。经分析的样品包括：得自人HCC对象的37个肝样品；得自HCC附近正常肝的39个肝样品；以及得自正常人肝的2个肝样品。HCC附近正常肝39个样品中，36个得自人HCC对象。

还从在C-反应蛋白启动子控制下表达SV40t/T抗原的转基因小鼠中采集了肝样品。该启动子引起致廇SV40t/T抗原的肝细胞特异性表达，最终导致以肝细胞癌为组织学特征的肝肿瘤的发生。经分析的样品包括：得自正常小鼠肝的12个样品；得自SV40转基因小鼠的18个HCC样品。

同样经分析的还有HCC相关细胞系，包括HepG2、Hep3B、SK-Hep1、7721、SNU-398、SNU423、SNU449、Huh7和MHT。MHT细胞分离自SV40t/T抗原转基因小鼠的肝脏。同样还对猴肝细胞进行了分析。

按照生产商的说明书，使用miRvana miRNA分离试剂盒(Ambion)从样品中提取RNA，并且与微小RNA阵列杂交。通过印制代表约700种miRNA的DNA寡核苷酸探针，包括得自Sanger数据库9版和另外经Rosetta genomics证实和预测的miR的miRNA，来制成定制的微阵列。除用来使探针与包被的载玻片偶联的氨基以外，按一式三份印制的各个探针在miRNA的互补序列的3’端带有最多22-nt接头。将20μM各个探针溶于2X SSC+0.0035％SDS，并且按照MicroGrid生产商的说明书，使用Genomic

BioRobotics MicroGrid II，以一式三份点样到SchottSlide E包被的微阵列载玻片上。使用不同miRNA的有义序列，设计出64种阴性对照探针。设计两组阳性对照探针与miRdicator^TM阵列杂交：(1)在进行标记前，将合成spikes小RNA添加到RNA上以验证标记效率，和(2)将大量小RNA(例如小核RNA(U43、U49、U24、Z30、U6、U48、U44)、5.8s和5s核糖体RNA)的探针点样到阵列中以验证RNA质量。将载玻片在含有50mM乙醇胺、1M Tris(pH 9.0)和0.1％SDS的溶液中在50℃下封闭20分钟，然后，用水充分漂洗，并旋转干燥。

通过将RNA-接头p-rCrU-Cy-染料(Thomson等，2004，NatMethods 1，47-53)(Dharmacon)与具有Cy3或Cy5的3’端连接，对5μg总RNA进行了标记。标记反应含有总RNA、spikes(0.1-20fmoles)、300ng RNA-接头-染料、15％DMSO、1x连接酶缓冲液和20单位T4RNA连接酶(NEB)，在4℃下进行1小时后，接着在37℃下进行1小时。将已标记的RNA与3x杂交缓冲液(Ambion)混合，加热至95℃3分钟，然后加到miRdicator^TM阵列上面。载玻片进行杂交12-16小时，接着用1xSSC和0.2％SDS洗涤两次，最后用0.1xSSC洗涤。

使用Agilent微阵列扫描仪Bundle G2565BA(在100％功率下分辨率为10μm)，对阵列进行了扫描。应用SpotReader软件(Niles Scientific)对阵列图像进行了分析。

使miRNA信号的原始数据归一化，并应用T-检验鉴定有统计显著性的差异表达的miRNA。

选择94种miRNA作为候选miRNA用于进一步的研究。根据下列一个或多个标准选择这些miRNA：人肝肿瘤样品与正常人肝样品相比的差异表达；小鼠HCC样品与正常小鼠肝样品相比的差异表达；或人肝组织中的高表达。图1表示肝肿瘤样品中表达升高的8种miRNA。

实施例2：癌细胞系的miRNA表达谱

将各种癌细胞系中miRNA的miRNA表达谱与人肝癌样品的miRNA表达谱进行了比较。发现在人肝癌样品的许多miRNA同样在人癌细胞系中高表达。这些miRNA包括例如miR-21和miR-191。因此，人肝癌细胞系可用于鉴定和研究作为治疗肝癌候选药物的修饰寡核苷酸。

实施例3：修饰寡核苷酸的抗增殖作用

为了确定候选miRNA参与细胞增殖，使用修饰寡核苷酸来抑制候选miRNA的活性。

采用MTS细胞增殖测定法(CellTiterAQueous One SolutionCell Proliferation Assay Promega Corporation Madison，WI)，对细胞增殖的能力进行了测定。MTS测定法是测定由活细胞的线粒体将四唑鎓组分(MTS试剂)还原为不溶解的甲

产物的比色测定法。在将细胞与MTS试剂孵育约2小时～4小时后，样品使用ELISA读板仪在490nM波长下读数。所产生的颜色的量与细胞数正相关。

设计并合成了与选定miRNA互补的修饰寡核苷酸。每种修饰寡核苷酸的每个核苷都具有2’-O-甲氧基乙基糖，每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键，并且所有胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。受试的其它修饰寡核苷酸包括在每个核苷上具有2’-O-甲氧基乙基糖和磷酸二酯核苷间键的修饰寡核苷酸。

测定了修饰寡核苷酸在Hep3B细胞和SNU423细胞中的抗增殖作用。按一式三份样品，用20nM、40nM、70nM、150nM或300nM修饰寡核苷酸处理细胞4小时，之后把培养基更换为正常生长培养基。使用Oligofectamine作为转染试剂。未处理细胞，以及用相对于hsa-mir-122有6个错配的修饰寡核苷酸转染用作对照。作为抑制增殖的对照，细胞用已知抑制细胞增殖的修饰寡核苷酸处理。在加入修饰寡核苷酸后48小时～72小时进行了增殖测定法。

将修饰寡核苷酸处理样品的细胞数与未处理对照样品的细胞数进行了比较。以这种方式，测定了细胞的增殖。比较结果显示，miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378、miR-423-3p和miR-638的反义抑制导致细胞增殖的抑制(图2)。因此，与选自miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-222、miR-378、miR-423-3p和miR-638的miR互补的修饰寡核苷酸在HCC细胞系中具有抗增殖作用。如图1所示，相对于正常肝组织样品，在肝肿瘤样品中这8种miRNA的每一种的表达都升高。因此，这类修饰寡核苷酸是用于治疗HCC的治疗剂。这类修饰寡核苷酸的实例见表1。

实施例4：修饰寡核苷酸的细胞凋亡活性

为了确定候选miRNA参与细胞存活，使用修饰寡核苷酸抑制miRNA的活性，并且使用胱天蛋白酶活性作为细胞凋亡的指示剂。

通过测定胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活性来评价细胞凋亡。将荧光底物加到细胞各孔中。当这种底物被活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7裂解时，便产生荧光信号。在荧光读板仪定量测定该信号，并且用来确定胱天蛋白酶活化的程度。

测定了表1所显示的修饰寡核苷酸在Hep3B细胞中对胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7活性的作用。样品按一式三份，用50nM、100nM、150nM或200nM的修饰寡核苷酸处理细胞24小时。使用Oligofectamine作为转染试剂。未处理细胞，以及用相对于has-miR-122有6个错配的修饰寡核苷酸转染用作对照。

将寡核苷酸处理样品中的胱天蛋白酶3/7活性与未处理对照样品中的胱天蛋白酶3/7活性进行了比较。以这种方式，测定了对细胞凋亡的诱导。比较结果显示，miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-378、miR-423-3p和miR-638的反义抑制导致胱天蛋白酶3/7活性提高(图3)。因此，与选自miR-21、miR-125a-5p、miR-191、miR-210、miR-378、miR-423-3p和miR-638的miR互补的修饰寡核苷酸在Hep3B细胞中诱导细胞凋亡。因此，这类修饰寡核苷酸是用于治疗HCC的治疗剂。

实施例5：修饰寡核苷酸的体内抗肿瘤作用

为了测定靶向miRNA的修饰寡核苷酸对肿瘤生长的作用，在肝细胞癌小鼠模型中对修饰寡核苷酸进行了评价。在该小鼠模型中，给裸小鼠注射HCC衍生的细胞以形成肿瘤，并且测定了修饰寡核苷酸减缓和/或抑制肿瘤生长的能力。

为了诱导肿瘤形成，将悬浮于基质胶(Matrigel)的含有约5x 10⁶个HepG2细胞的溶液注射到裸小鼠皮下。

在这个模型中受测试的修饰寡核苷酸包括：MOE修饰的抗miR-21，这是一种靶向miR-21的修饰寡核苷酸，其在每个糖上具有2’-MOE修饰，全部为硫代磷酸酯核苷间键，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶；以及具有MOE修饰的抗miR-210，其在每个糖上具有2’-MOE修饰，全部为硫代磷酸酯核苷间键，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为对照处理。

各治疗组如下：(1)对照；(2)50mg/kg MOE修饰的抗miR21；(3)50mg/kg MOE修饰的抗miR-210。各治疗组包括10只小鼠。从肿瘤诱发第4天起，给小鼠腹膜内注射对照或修饰寡核苷酸，并且每隔一天继续共12次注射(即第4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26天)。在肿瘤诱发后第12、15、18、22、25和28天，用测径器监测肿瘤大小。肿瘤体积按(L*W²)/2计算，其中L＝长(mm)，W＝宽(mm)。将修饰寡核苷酸治疗组的平均肿瘤体积与对照处理组的平均肿瘤体积进行了比较；平均肿瘤体积的倍数变化见表7和图4。P-值通过t-检验计算。

如表7所示，用50mg/kg MOE修饰的抗miR-21治疗，相对于对照处理小鼠的肿瘤大小，在肿瘤诱发后第12、15、18和22天导致肿瘤大小在统计上显著较小。在肿瘤诱发后第25和28天同样观察到肿瘤大小的减小。同样，用50mg/kg MOE修饰的抗miR-210治疗，相对于对照处理的小鼠的肿瘤大小，在肿瘤诱发后第12、15、18和22天导致肿瘤大小在统计上显著较小。在肿瘤诱发后第25和28天同样观察到肿瘤大小的减小。因此，与miR-21和miR-210互补的修饰寡核苷酸是用于治疗HCC的治疗剂。

实施例6：由TCDD所致AhR TF活化诱导miR表达

在微阵列(微阵列分析按照实施例1中所述方法进行)上对用TCDD处理的HCC细胞的miR表达进行了研究。如图5所表明的一样，与未处理细胞相比，48小时后，TCDD处理细胞中hsa-miR-191、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b和hsa-miR-181a*每一种的表达升高超过两倍。

实施例7：miR-191的双重萤光素酶报导分子测定法

进行双重萤光素酶报导分子测定法以评价miR-191活性。设计定制的长为42个核苷酸的互补寡核苷酸(IDT)，插入psiCHECK-2载体(Promega)中的海肾萤光素酶3’UTR；这些寡核苷酸包括选定miR的反向互补序列。将互补寡核苷酸退火，产生NotI和NotI黏性末端。所述序列包括有关的反向互补miR序列和一个阴性对照。设计这些插入序列以产生miR结合部位，将每个插入序列克隆至psiCHECK-2载体的海肾萤光素酶的3’UTR上。在以下三个阶段验证所述克隆：(1)菌落PCR，(2)利用与插入序列一起添加的位点的HindIII的限制，和(3)测序。使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，目录号11668027)，将SNU423细胞按一式三份用载体之一转染，或用载体和ASO共转染。24小时和48小时后，按照生产商说明书，应用双重萤光素酶报导分子测定法系统(Promega，目录号E1961)，在“The Reporter”微量培养板发光计(Turner designs)上测定发光。将结果归一化至得自同一载体的组成型表达的萤火虫萤火素酶，用各种处理与用非修饰载体转染细胞之间的比率表示。

正如图6所表明的一样，内源hsa-miR-191(条形柱a)的确使报道分子表达下调，报道分子载体与抑制hsa-miR-191的反义寡核苷酸的共转染几乎完全消除这种作用(条形柱b)。直方图进一步显示反应的特异性，因为另一对照ASO不能消除报道分子的miR调节(条形柱c)，并且内源miR无法改变具有经改变的3’UTR但具有非相关序列的对照质粒上的报道分子的表达，无论含ASO(条形柱d)或不含ASO(条形柱e)。

实施例8：AhR/Arnt和hsa-miR-191的调节

自hsa-miR-191的转录起始位点位置+/-1000bp处搜索转录因子结合部位(TFBS)基序。预测AhR/Arnt TFBS位于下列位置上：

进行了ChIP(染色质免疫沉淀)测定法以证实所预测的TFBS和该TF参与hsa-miR-191的转录调节。

如下进行ChIP测定法：

HepG2细胞用10nM浓度的TCDD处理。然后，当将新制备的11％甲醛溶液加入现有培养基时，将细胞固定。

通过加入甘氨酸溶液停止固定。然后，将细胞从培养物表面刮下，在冰冷的PBS-Igepal中洗涤后，用1mM PMSF处理。最后将细胞离心，使沉淀速冻。

免疫沉淀在Genepathway进行，通过qPCR定量测定了染色质与沉淀TF的结合。

使用具有已知拷贝数的基因组DNA的标准曲线，得到数据值。阳性对照是含有已知的待查因子结合部位的基因组区域，阴性对照是不与待查因子结合的基因组区域。分析按一式三份进行。

输入DNA值(非沉淀基因组DNA)用来计算每个引物对相对于标准曲线中使用的引物对的引物效率比(Primer Efficiency Ratio)。对于每个受试基因组区域，数据表示为结合事件/1000细胞。这些数值，是从每项试验的一式三份qPCR值的平均值，考虑了免疫沉淀测定的染色质量加上通过qPCR测定的比率，并对引物效率归一化。还计算了各项试验的标准差，以同样方式归一化作为试验值。

Genpathway表明，可以在各种生物系统中可再现地测定因子结合低至1.3X的改变。因此，具有1.5或更大倍数差异的基因组区域视为显著。

因为TCDD是AhR的已知配体，并激活该TF以诱导CYP1蛋白的表达，所以TCDD处理被计作TF的激活物，并且选择CYP1A1作为ChIP测定的对照基因。对于待测的AhR/Arnt TF两者，CYP1A1具有两个TFBS。

如图7中所示，该表概括使用AhR TF特异性抗体的ChIP测定法的结果，发现AhR与hsa-miR-191转录物的启动子结合。当ChIP测定法用抗Arnt的抗体进行时，得到相同的结果，这就表明异二聚体AhR/Arnt的活性。

前面具体实施方案的描述如此全面地提供了本发明的总体性质，使得无需过多实验，并且在不无需偏离一般构思的情况下，有关人员就能够应用现在知识，容易地修改和/或改编这类具体实施方案用于各种应用。因此，这类改编和修改应当并意在被解释为在所公开的实施方案的等同含义和范围内。尽管本发明结合其具体实施方案进行了描述，但是显而易见的是许多选择、修改和变动对于本领域技术人员而言是显然的。因此，本发明意在包括落入随附权利要求书的精神和大范围内的所有这类选择、修改和变动。

序列表

<110>Isis Pharmaceuticals，Inc.

Bennett，C.Frank

Chajut，Ayelet

Esau，Christine

Marcusson，Eric

Yerushalmi，Noga

<120>用于肝癌治疗的靶向微小RNA

<130>REG-0003WO

<150>60/983,231

<151>2007-10-29

<160>40

<170>用于Windows 4.0版的FastSEQ

<210>1

<211>72

<212>RNA

<213>人(H.sapiens)

<400>1

ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60

ggcugucuga ca 72

<210>2

<211>86

<212>RNA

<213>人

<400>2

ugccagucuc uaggucccug agacccuuua accugugagg acauccaggg ucacagguga 60

gguucuuggg agccuggcgu cuggcc 86

<210>3

<211>92

<212>RNA

<213>人

<400>3

cggcuggaca gcgggcaacg gaaucccaaa agcagcuguu gucuccagag cauuccagcu 60

gcgcuuggau uucguccccu gcucuccugc cu 92

<210>4

<211>110

<212>RNA

<213>人

<400>4

acccggcagu gccuccaggc gcagggcagc cccugcccac cgcacacugc gcugccccag 60

acccacugug cgugugacag cggcugaucu gugccugggc agcgcgaccc 110

<210>5

<211>110

<212>RNA

<213>人

<400>5

gcugcuggaa gguguaggua cccucaaugg cucaguagcc aguguagauc cugucuuucg 60

uaaucagcag cuacaucugg cuacuggguc ucugauggca ucuucuagcu 110

<210>6

<211>66

<212>RNA

<213>人

<400>6

agggcuccug acuccagguc cuguguguua ccuagaaaua gcacuggacu uggagucaga 60

aggccu 66

<210>7

<211>94

<212>RNA

<213>人

<400>7

auaaaggaag uuaggcugag gggcagagag cgagacuuuu cuauuuucca aaagcucggu 60

cugaggcccc ucagucuugc uuccuaaccc gcgc 94

<210>8

<211>100

<212>RNA

<213>人

<400>8

gugagcgggc gcggcaggga ucgcgggcgg guggcggccu agggcgcgga gggcggaccg 60

ggaauggcgc gccgugcgcc gccggcguaa cugcggcgcu 100

<210>9

<211>22

<212>RNA

<213>人

<400>9

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210>10

<211>24

<212>RNA

<213>人

<400>10

ucccugagac ccuuuaaccu guga 24

<210>11

<211>23

<212>RNA

<213>人

<400>11

caacggaauc ccaaaagcag cug 23

<210>12

<211>22

<212>RNA

<213>人

<400>12

cugugcgugu gacagcggcu ga 22

<210>13

<211>21

<212>RNA

<213>人

<400>13

agcuacaucu ggcuacuggg u 21

<210>14

<211>21

<212>RNA

<213>人

<400>14

acuggacuug gagucagaag g 21

<210>15

<211>23

<212>RNA

<213>人

<400>15

agcucggucu gaggccccuc agu 23

<210>16

<211>25

<212>RNA

<213>人

<400>16

agggaucgcg ggcggguggc ggccu 25

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>17

tcaacatcag tctgataagc ta 22

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>18

cacaggttaa agggtctcag gga 23

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>19

tcacaggtta aagggtctca ggga 24

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>20

agctgctttt gggattccgt tg 22

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>21

cagctgcttt tgggattccg ttg 23

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>22

tcagccgctg tcacacgcac ag 22

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>23

gagacccagt agccagatgt agct 24

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>24

acccagtagc cagatgtagc t 21

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>25

ccttctgact ccaagtccag 20

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

ggccttctga ctccaagtcc ag 22

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>27

ccttctgact ccaagtccag t 21

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>28

ctgaggggcc tcagaccgag ct 22

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>29

tctgaggggc ctcagaccga gct 23

<210>30

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>30

aggccgccac ccgcccgcga tccct 25

<210>31

<211>23

<212>RNA

<213>人

<400>31

aacauucaac gcugucggug agu 23

<210>32

<211>22

<212>RNA

<213>人

<400>32

accaucgacc guugauugua cc 22

<210>33

<211>23

<212>RNA

<213>人

<400>33

aacauucauu gcugucggug ggu 23

<210>34

<211>110

<212>RNA

<213>人

<400>34

ugaguuuuga gguugcuuca gugaacauuc aacgcugucg gugaguuugg aauuaaaauc 60

aaaaccaucg accguugauu guacccuaug gcuaaccauc aucuacucca 110

<210>35

<211>110

<212>RNA

<213>人

<400>35

agaagggcua ucaggccagc cuucagagga cuccaaggaa cauucaacgc ugucggugag 60

uuugggauuu gaaaaaacca cugaccguug acuguaccuu gggguccuua 110

<210>36

<211>110

<212>RNA

<213>人

<400>36

ccugugcaga gauuauuuuu uaaaagguca caaucaacau ucauugcugu cgguggguug 60

aacugugugg acaagcucac ugaacaauga augcaacugu ggccccgcuu 110

<210>37

<211>89

<212>RNA

<213>人

<400>37

cugauggcug cacucaacau ucauugcugu cgguggguuu gagucugaau caacucacug 60

aucaaugaau gcaaacugcg gaccaaaca 89

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>38

actcaccgac agcgttgaat gtt 23

<210>39

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>39

ggtacaatca acggtcgatg gt 22

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>40

acccaccgac agcaatgaat gtt 23

Claims

1.一种用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补的核碱序列；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

2.权利要求1的方法，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

3.权利要求1或2的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述对象是人。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列的错配不超过两个。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列的错配不超过一个。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列有一个错配。

8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核碱序列与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列没有错配。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中至少一个核苷间键是修饰核苷间键。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中每个核苷间键是修饰核苷间键。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰糖。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中多个核苷中的每一个包含修饰糖。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中每个核苷都包含修饰糖。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。

17.权利要求1-15中任一项的方法，其中多个核苷中的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖，且多个核苷中的每一个都包含2’-氟糖修饰。

18.权利要求15的方法，其中每个修饰糖独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或双环糖部分。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由15个连接核苷组成。

20.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。

21.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。

22.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。

23.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。

24.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。

25.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由21个连接核苷组成。

26.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。

27.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。

28.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由24个连接核苷组成。

29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述给药包含静脉内给药、皮下给药、肿瘤内给药或化疗栓塞。

30.权利要求1-29中任一项的方法，还包括给予至少一种另外的疗法。

31.权利要求30的方法，其中至少一种另外的疗法是化疗药物。

32.权利要求31的方法，其中所述化疗药物选自5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔比星、丝裂霉素C、索拉非尼、依托泊苷、卡铂、表柔比星、伊立替康和奥沙利铂。

33.权利要求30-32中任一项的方法，其中至少一种另外的疗法与所述修饰寡核苷酸同时给予。

34.权利要求30-32中任一项的方法，其中给予至少一种另外的疗法比给予所述修饰寡核苷酸较不频繁。

35.权利要求30-32中任一项的方法，其中给予至少一种另外的疗法比给予所述修饰寡核苷酸更频繁。

36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸按选自以下的剂量给予：50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg和800mg。

37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸每天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予。

38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述给药导致肿瘤大小减小。

39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药引起肿瘤数减少。

40.权利要求1-39中任一项的方法，其中所述给药防止肿瘤大小增大。

41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述给药防止肿瘤数增加。

42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述给药阻止转移进程。

43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述给药减慢或中止转移进程。

44.权利要求1-43中任一项的方法，其中所述给药延长对象的总体生存时间。

45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述给药延长对象的无进展生存期。

46.权利要求1-45中任一项的方法，还包括选出患有肝病变的对象。

47.权利要求1-46中任一项的方法，还包括选出患有血清甲胎蛋白升高或血清脱-γ-羧基凝血酶原升高的对象。

48.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述给药降低血清甲胎蛋白或血清脱-γ-羧基凝血酶原。

49.权利要求1-48中任一项的方法，还包括选出患有肝功能异常的对象。

50.权利要求1-49中任一项的方法，其中所述给药改善对象的肝功能。

51.一种化合物，所述化合物包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸，具有与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的核碱序列互补的核碱序列；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

52.权利要求51的化合物，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

53.权利要求51或52的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列的错配不超过两个。

54.权利要求51或52的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列的错配不超过一个。

55.权利要求51或52的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列有一个错配。

56.权利要求51或52的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列没有错配。

57.权利要求51-56中任一项的化合物，其中至少一个核苷间键是修饰核苷间键。

58.权利要求51-57中任一项的化合物，其中每个核苷间键是修饰核苷间键。

59.权利要求51-58中任一项的化合物，其中至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

60.权利要求51-59中任一项的化合物，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

61.权利要求51-60中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰糖。

62.权利要求51-61中任一项的化合物，其中多个核苷中的每一个都包含修饰糖。

63.权利要求51-62中任一项的化合物，其中每个核苷都包含修饰糖。

64.权利要求51-63中任一项的化合物，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。

65.权利要求51-63中任一项的化合物，其中多个核苷中的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖，且多个核苷中的每一个都包含2’-氟糖。

66.权利要求62或63的化合物，其中每个修饰糖都独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或双环糖部分。

67.权利要求51-66中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰核碱。

68.权利要求67的化合物，其中所述修饰核碱是5-甲基胞嘧啶。

69.权利要求51-68中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

70.权利要求69的化合物，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。

71.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由15个连接核苷组成。

72.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。

73.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。

74.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。

75.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。

76.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。

77.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由21个连接核苷组成。

78.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。

79.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。

80.权利要求51-70中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由24个连接核苷组成。

81.一种用于治疗肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少15个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

82.权利要求81的方法，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

83.权利要求81或82的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌。

84.权利要求81-83中任一项的方法，其中所述对象是人。

85.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少16个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

86.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少17个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

87.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少18个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

88.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少19个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

89.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少20个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

90.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少21个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

91.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少22个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

92.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含核碱序列选自以下核碱序列中所记载的至少23个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

93.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列由选自SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列的核碱序列组成。

94.权利要求81-93中任一项的方法，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

95.权利要求81-94中任一项的方法，其中至少一个核苷间键是修饰核苷间键。

96.权利要求81-95中任一项的方法，其中每个核苷间键都是修饰核苷间键。

97.权利要求81-96中任一项的方法，其中至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

98.权利要求81-97中任一项的方法，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

99.权利要求81-98中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰糖。

100.权利要求81-99中任一项的方法，其中多个核苷中的每一个都包含修饰糖。

101.权利要求81-100中任一项的方法，其中每个核苷都包含修饰糖。

102.权利要求81-101中任一项的方法，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。

103.权利要求81-102中任一项的方法，其中多个核苷中的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖，且多个核苷中的每一个都包含2’-氟糖。

104.权利要求100或101的方法，其中每个修饰糖都独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或双环糖部分。

105.权利要求81-104中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰核碱。

106.权利要求81-105中任一项的方法，其中所述修饰核碱是5-甲基胞嘧啶。

107.权利要求81-106中任一项的方法，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

108.权利要求81-107中任一项的方法，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。

109.权利要求81-108中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、肿瘤内给药或栓塞。

110.权利要求81-109中任一项的方法，其还包括给予至少一种另外的疗法。

111.权利要求110中的方法，其中至少一种另外的疗法是化疗药物。

112.权利要求111的方法，其中所述化疗药物选自5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔比星、丝裂霉素C、索拉非尼、依托泊苷、卡铂、表柔比星、伊立替康和奥沙利铂。

113.权利要求110-112中任一项的方法，其中至少一种另外的疗法与所述寡核苷酸同时给予。

114.权利要求110-112中任一项的方法，其中给予至少一种另外的疗法比给予所述寡核苷酸较不频繁。

115.权利要求110-112中任一项的方法，其中给予至少一种另外的疗法比给予所述寡核苷酸更频繁。

116.权利要求81-115中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸按选自以下的剂量给予：50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg和800mg。

117.权利要求81-116中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸每天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予。

118.权利要求81-117中任一项的方法，其中所述给药导致肿瘤大小减小。

119.权利要求81-118中任一项的方法，其中所述给药引起肿瘤数减少。

120.权利要求81-119中任一项的方法，其中所述给药防止肿瘤大小增大。

121.权利要求81-120中任一项的方法，其中所述给药防止肿瘤数增加。

122.权利要求81-121中任一项的方法，其中所述给药阻止转移进程。

123.权利要求81-122中任一项的方法，其中所述给药减慢转移进程。

124.权利要求81-123中任一项的方法，其中给药延长动物的总体生存时间。

125.权利要求81-124中任一项的方法，其中给药延长动物的无进展生存期。

126.权利要求81-125中任一项的方法，还包含选出患有肝病变的动物。

127.权利要求81-126中任一项的方法，还包括选出患有血清甲胎蛋白升高或血清脱-γ-羧基凝血酶原升高的动物。

128.权利要求81-127中任一项的方法，其中所述给药降低血清甲胎蛋白或血清脱-γ-羧基凝血酶原。

129.权利要求81-128中任一项的方法，还包括选出患有肝功能异常的动物。

130.权利要求81-129中任一项的方法，其中给药改善动物的肝功能。

131.一种化合物，所述化合物包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸，并且具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少15个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

132.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少16个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

133.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少17个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

134.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少18个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

135.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少19个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

136.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少20个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

137.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少21个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

138.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少22个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

139.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自以下核碱序列中所记载的核碱序列的至少23个连续核碱：SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

140.权利要求131的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列由选自SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中所记载的核碱序列的核碱序列组成。

141.权利要求131-140中任一项的化合物，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

142.权利要求131-141中任一项的化合物，其中至少一个核苷间键是修饰核苷间键。

143.权利要求131-142中任一项的化合物，其中每个核苷间键都是修饰核苷间键。

144.权利要求131-143中任一项的化合物，其中至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

145.权利要求131-144中任一项的化合物，其中每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

146.权利要求131-145中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰糖。

147.权利要求131-146中任一项的化合物，其中多个核苷中的每一个都包含修饰糖。

148.权利要求131-147中任一项的化合物，其中每个核苷都包含修饰糖。

149.权利要求131-148中任一项的化合物，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。

150.权利要求131-149中任一项的化合物，其中多个核苷中的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基，多个核苷中的每一个都包含2’-氟糖。

151.权利要求147或148的化合物，其中每个修饰糖都独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或双环糖部分。

152.权利要求131-151中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰核碱。

153.权利要求152中任一项的化合物，其中所述修饰核碱是5-甲基胞嘧啶。

154.权利要求131-153中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

155.权利要求154的化合物，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。

156.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求51-80中任一项的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

157.权利要求156的药物组合物，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

158.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求131-155中任一项的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

159.权利要求158的药物组合物，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。

160.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自以下的核碱序列互补：SEQ ID NO：1的核碱8-29区域；SEQ ID NO：2的核碱15-37区域；SEQ ID NO：2的核碱15-38区域；SEQ ID NO：3的核碱16-37区域；SEQ ID NO：4的核碱66-87区域；SEQ ID NO：5的核碱69-89区域；SEQ ID NO：5的核碱69-91区域；SEQ ID NO：6的核碱43-63区域；SEQ ID NO：6的核碱44-65区域；SEQ ID NO：7的核碱53-75区域；SEQ ID NO：7的核碱53-74区域；和SEQ ID NO：8的核碱16-40区域。

161.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自以下核碱序列中所记载的核碱序列互补：SEQ IDNO 9、10、11、12、13、14、15和16。

162.权利要求51-80中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自以下核碱序列互补：SEQ ID NO：1的核碱8-29区域；SEQ ID NO：2的核碱15-37区域；SEQ ID NO：2的核碱15-38区域；SEQ ID NO：3的核碱16-37区域；SEQ ID NO：4的核碱66-87区域；SEQ ID NO：5的核碱69-89区域；SEQ ID NO：5的核碱69-91区域；SEQ ID NO：6的核碱43-63区域；SEQ ID NO：6的核碱44-65区域；SEQ ID NO：7的核碱53-75区域；SEQ ID NO：7的核碱53-74区域；和SEQ ID NO：8的核碱16-40区域。

163.权利要求51-80中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15和16的核碱序列中所记载的核碱序列互补。

164.一种用于治疗二恶英诱发的肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

165.一种用于预防二恶英诱发的肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列与选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的序列互补；或与同其有至少约80％同一性的序列互补。

166.一种用于预防二恶英诱发的肝癌的方法，所述方法包括给予有需要的对象包含由15-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有的核碱序列包含选自SEQ ID NO 38、39和40的核碱序列所记载的核碱序列的至少15个连续核碱；或与之有至少约80％同一性。

167.权利要求164-166中任一项的方法，其中所述二恶英诱发的肝癌是肝细胞癌。

168.权利要求164-167中任一项的方法，其中所述对象是人。

169.权利要求164-168中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、肿瘤内给药或化疗栓塞。