CN108026528A - 治疗肝疾病和病症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了可用于治疗疾病和病症的方法和化合物。提供了向细胞、组织和/或对象施用一种或更多种微RNA抑制剂化合物或一种或更多种微RNA增强化合物作为疾病或病症之治疗的方法。

Description

治疗肝疾病和病症的方法和组合物
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2015年8月20日提交的美国临时申请序列号62/207,456的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明部分涉及可用于治疗疾病和病症(例如影响肝脏的疾病和病症)的方法和化合物。
背景技术
肝病学是一个持续发展的领域：慢性肝病的流行病学正在以极高的速度变化，其中非酒精性脂肪性肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver disease，NAFLD)占据了先前被病毒性肝炎占据的位置并且作为代谢综合征相关死亡率提高的原因而挑战心血管疾病。NAFLD是临床病理学术语，其涵盖从脂肪堆积(脂肪肝)到各种程度的炎症和纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，最后到隐源性肝硬化及其临床后遗症(肝细胞癌、肝失代偿(liver decompensation))的大范围的病理状况。研究和干预已经极大地影响了肝炎和心血管疾病，但对于NAFLD发展为肝硬化和癌症中涉及的机制的理解仍不充分。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了用于在细胞和/或对象中治疗肝疾病和病症的方法。在一些方面，本发明的方法可包括以在所述细胞和/或对象中有效治疗肝疾病或病症的量分别向需要这样的治疗的细胞和/或对象施用一种或更多种微RNA(microRNA)化合物的抑制剂。
根据本发明的一个方面，提供了用于在对象中治疗肝疾病或病症的方法。所述方法包括以在对象中有效治疗肝疾病或病症的量向需要这样的治疗的对象施用微RNA抑制剂化合物。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物降低对象中至少一种细胞中的微RNA活性。在某些实施方案中，降低微RNA活性包括降低微RNA水平或功能。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物降低对象中至少一种细胞中的微RNA活性并提高甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)酶活性。在一些实施方案中，肝疾病或病症是以下中的一种或更多种：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪堆积(脂肪肝)、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化(cryptogeniccirrhosis)及其临床后遗症(肝细胞癌、肝失代偿)、脂肪性肝炎和化学抗性。在某些实施方案中，治疗肝疾病或病症包括与GNMT活性的对照水平相比提高对象中至少一种细胞中的GNMT活性。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物以药物组合物施用，并且任选地所述药物组合物另外地包含可药用载体。在某些实施方案中，微RNA抑制剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂。在一些实施方案中，靶向剂是肝靶向剂。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物(miRNA spongecompound)、反义抑制剂分子和变体miRNA分子。在某些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。在某些实施方案中，肝疾病或病症不是癌症。在某些实施方案中，所述方法还包括向对象施用用于治疗以下的一种或更多种的另外的治疗：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪堆积(脂肪肝)、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎、或化学抗性。在一些实施方案中，在向对象施用miRNA-抑制剂化合物之前、同时和之后的一个或更多个时间向对象施用一种或更多种另外的治疗。在一些实施方案中，一种或更多种另外的治疗独立地选自放射治疗、手术治疗、化学治疗、分子靶向治疗、细胞抑制治疗和细胞毒性治疗。在某些实施方案中，施用miRNA-抑制剂化合物和一种或更多种另外的治疗对对象中的肝疾病或病症产生协同治疗作用。在一些实施方案中，miRNA抑制剂化合物是外源性miRNA抑制剂化合物。在一些实施方案中，miRNA抑制剂化合物的施用方式包括以下中的一种或更多种：经口施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、肝内施用、经鼻施用、表面施用、经皮施用、植入物施用和输注施用。在某些实施方案中，miRNA抑制剂化合物的施用制剂包括以下中的一种或更多种：缓释制剂、纳米颗粒、微粒、水凝胶、可吸收载体、可植入制剂和生物可降解基质。在一些实施方案中，所施用的miRNA抑制剂化合物减少对象中至少一种细胞的去分化。在一些实施方案中，至少一种细胞是肝细胞。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。
根据本发明的另一方面，提供了提高细胞中的GNMT酶活性的方法。所述方法包括使细胞与有效提高细胞中的GNMT酶活性的量的miRNA-抑制剂化合物接触，并且其中GNMT酶活性的提高减少了细胞中的DNA超甲基化。在某些实施方案中，提高GNMT酶活性包括提高细胞中GNMT酶的水平或功能。在一些实施方案中，细胞是体外或离体细胞。在一些实施方案中，细胞是体内细胞。在某些实施方案中，体内细胞在对象中，并且接触包括向对象施用miRNA抑制剂化合物。在一些实施方案中，miRNA-抑制剂化合物以药物组合物施用，并且任选地，药物组合物另外地包含可药用载体。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂，其中任选地靶向剂是肝靶向剂。在某些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物、反义抑制剂化合物和经修饰的miRNA分子。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。在某些实施方案中，细胞是肝细胞。在一些实施方案中，细胞是以下中的一种或更多种：肝癌细胞、转移癌细胞、癌前肝细胞、肝硬化肝细胞、癌症后肝细胞、纤维化肝细胞、肝细胞、炎性肝癌细胞和化学抗性肝细胞。在一些实施方案中，细胞不是癌细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括使细胞与用于治疗以下的一种或更多种的另外的治疗接触：肝癌、转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪堆积(脂肪肝)、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化及其临床后遗症(例如肝细胞癌、肝失代偿)、脂肪性肝炎或化学抗性。在一些实施方案中，在使细胞与miRNA抑制剂化合物接触之前、同时和之后的一个或更多个时间使细胞与一种或更多种另外的治疗接触。在一些实施方案中，一种或更多种另外的治疗独立地选自放射治疗、手术、化学治疗、分子靶向癌症治疗、细胞抑制治疗和细胞毒性治疗。在某些实施方案中，与miRNA抑制剂化合物和一种或更多种另外的治疗的接触导致miRNA抑制剂化合物和/或一种或更多种另外的治疗对细胞的协同作用。在一些实施方案中，miRNA抑制剂化合物是外源性miRNA抑制剂化合物。在一些实施方案中，miRNA抑制剂化合物减少所接触细胞的去分化。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。
根据本发明的另一方面，提供了降低细胞中GNMT酶活性的方法。所述方法包括使细胞与有效降低细胞中GNMT酶活性的量的miRNA增强剂化合物接触。在一些实施方案中，降低细胞中GNMT酶活性提高了细胞中的DNA超甲基化。在某些实施方案中，降低GNMT酶活性包括降低细胞中GNMT酶的水平或功能。在一些实施方案中，细胞是体外细胞或离体细胞。在一些实施方案中，细胞是体内细胞。在某些实施方案中，miRNA增强剂化合物在药物组合物中，并且任选地，药物组合物还包含可药用载体。在一些实施方案中，微RNA增强剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂。在一些实施方案中，微RNA增强剂化合物包含微RNA序列。在某些实施方案中，微RNA增强剂化合物包含miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种、或其功能变体。在某些实施方案中，所施用的miRNA增强剂化合物增加所接触细胞的去分化。在一些实施方案中，所接触细胞是肝细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了鉴定在细胞中改变miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的miRNA调节化合物的方法。所述方法包括：(a)使细胞接触候选miRNA调节化合物；(b)确定细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量；以及(c)分别将对于miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者确定的活性的量与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性对照量相比较，其中分别与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性的对照量相比，所接触细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量降低鉴定所述候选miRNA调节化合物为miRNA抑制化合物，并且其中分别与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性的对照量相比，所接触细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量增加鉴定所述候选miRNA调节化合物为miRNA增强化合物。在一些实施方案中，确定细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量包括将所接触细胞中的GNMT酶活性与未和所述候选miRNA调节剂化合物接触的对照细胞中的GNMT活性相比较，其中与对照细胞相比，所接触细胞中GNMT酶活性的提高鉴定所述候选miRNA调节剂为miRNA抑制剂化合物，并且其中与对照细胞相比，所接触细胞中GNMT酶活性的降低鉴定所述候选miRNA调节剂为miRNA增强剂化合物。在某些实施方案中，细胞是体外细胞或离体细胞。在一些实施方案中，细胞是体内细胞。在一些实施方案中，所接触细胞是肝细胞。在某些实施方案中，所接触细胞是以下中的一种或更多种：肝癌细胞、转移癌细胞、癌前肝细胞、肝硬化肝细胞、癌症后肝细胞、纤维化肝细胞、肝细胞、炎性肝癌细胞、化学抗性肝细胞和正常细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括以药物组合物ct向对象施用所鉴定的miRNA抑制化合物。在一些实施方案中，对象患有肝疾病或病症。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。
根据本发明的另一个方面，提供了用于在对象中治疗肝疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物包含在对象中有效治疗肝疾病或病症的量的至少一种miRNA调节化合物。在一些实施方案中，miRNA调节化合物是miRNA活性抑制化合物。在某些实施方案中，miRNA抑制化合物抑制对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中至少一种的活性。在一些实施方案中，抑制miRNA活性包括降低所述miRNA的水平或功能。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物、反义抑制剂分子和变体miRNA分子。在某些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。在一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。在一些实施方案中，肝疾病或病症是：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎或化学抗性。在某些实施方案中，miRNA调节化合物是miRNA活性增强化合物，并且其中增强miRNA活性包括提高对象中miRNA的水平或功能。在一些实施方案中，药物组合物还包含可药用载体。在某些实施方案中，药物组合物还包含靶向剂。在一些实施方案中，肝疾病或病症中的至少一种不是癌症并且对象未患有癌症。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。
本发明不旨在限于必须满足本发明的任何所述目的或特征中的一个或更多个的组合物或方法。注意到本发明不限于本文中描述的示例性或主要实施方案也是重要的。本领域普通技术人员作出的修改和替换被认为是在本发明的范围内。
序列简述
SEQ ID NO：1：MIR-873-5p的智人(Homo sapiens)序列，称为：hsa-miR-873-5p：gcaggaacuugugagucuccu，其具有miRBase登录号：MIMAT0004953。
SEQ ID NO：2：MIR-873-5p的小家鼠(Mus musculus)序列，称为：mmu-miR-873a-5p：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：3：MIR-873-5p的褐家鼠(Rattus novergicus)序列，称为：rno-miR-873-5p：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：4：MIR-873-5p的毛果杨(Populus trichocarpa)序列，称为：ptr-miR-873：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：5：MIR-873-5p的牛(Bos taurus)序列，称为：bta-miR-873：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：6：MIR-873-5p的马(Equus caballus)序列，称为：eca-miR-873：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：7：MIR-873-5p的婆罗洲猩猩(Pongo pygmaeus)序列，称为：ppy-miR-873：gcaggaacuugugagucuccu。
SEQ ID NO：8：MIR-518d-5p的智人序列，称为：hsa-miRNA-518d-5p：cucuagagggaagcacuuucug，其具有miRBase登录号：MIMAT0005456。
SEQ ID NO：9：MIR-526a的智人序列，称为：hsa-miR-526a：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：10：MIR-520c-5p的智人序列，称为：hsa-miR-520c-5p：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：11：MIR-526a的毛果杨序列，称为：ptr-miR-526a：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：12：MIR-518d-5p的大猩猩(Gorilla gorilla)序列，称为：ggo-miRNA-518d-5p：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：13：MIR-520C的大猩猩序列，称为：ggo-miR-520cd：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：14：MIR-526a的大猩猩序列，称为：ggo-miR-526a：cucuagagggaagcacuuucug。
SEQ ID NO：15：MIR-518g-5p的婆罗洲猩猩序列，称为：ppy-miRNA-518g-5p：cucuagagggaagcacuuucug。
附图说明
图1A至F示出了指示miR-873-5p靶向肝中的GNMT表达的结果的图。图1A示出了肝肿瘤(左图)和肝硬化患者组(右图)中的miR-873-5p表达水平与GNMT表达水平之间的相关性研究的结果的两个图。图1B示出了出生后1天的小鼠肝和成年小鼠肝中的GNMT(左图)和miR-873-5p(右图)的qPCR分析结果。图1C示出了培养时在不同时间点的肝细胞中的GNMT(左图)和miR-873-5p的qPCR分析结果。图1D示出了在BDL的不同时间点的GNMT(左图)和miR-873-5p的qPCR分析结果。图1E示出了在原代肝细胞的脱氧胆酸处理下GNMT(左图)和miR-873-5p的qPCR分析结果。图1F示出了miR-873-5p过表达后肝细胞中(左图)和miR-873-5p抑制后BCLC3肝癌细胞中(右图)的GNMT表达的萤光素酶报道子测定结果。统计分析表示：p＜0.05*；p＜0.01**；p＜0.001***。
图2A至D提供了证明miR-873-5p抑制阻止肝细胞去分化的结果的图。这些图示出了培养时在去分化的不同时间点在对照和miR-873-5p被抑制的肝细胞中通过qPCR对所指定的基因的mRNA表达进行分析的结果。图2A示出了GNMT的结果。图2B示出了HNF4α(左)、白蛋白(中)和HK4(右)的结果。图2C示出了PKM2(左)、AFP(中)和HGF(右)的结果。图2D示出了CYP2E1(左)、CYP3A11(中)和CYP2B10(右)的结果。统计分析表示：p＜0.05*；p＜0.01**；p＜0.001***。#24小时与48小时比较(miR-对照)。黑条表示经miR-Ctrl处理的，白条表示经miR-873-5p-inh处理的。
图3A至F示出了证明在小鼠胆管结扎后miR-873-5p抑制使纤维化表型退化的结果的图、印迹和显微图像。图3A是示出通过mRNA和蛋白质水平测量的GNMT表达的图和Western印迹。图3B示出了由PARP切割介导的凋亡分析。图3C是Kaplan Meier曲线，其描绘了BDL后miR-Ctrl小鼠和miR-873-5p抑制的小鼠下的小鼠的存活率。图3D示出了在BDL第7天时在miR-Ctrl对照小鼠和miR-873-5p抑制的小鼠下胱天蛋白酶3(C3)活性水平的分析结果。图3E示出了在BDL第7天时在miR-Ctrl小鼠和miR-873-5p抑制的小鼠下转氨酶(ALT和AST)水平的分析结果。图3F示出了在BDL第7天时来自miR-Ctrl小鼠和miR-873-5p抑制的小鼠的肝切片中天狼星红、F4/80、aSMA和CK19染色的显微图像，并且提供了BDL的对照与miR-873-5p抑制中的变化的对应图。(数值是平均值±SEM。*P＜0.05，**P＜0.01，[对照vs873-Inh)。
图4A至C示出了证明BDL后在miR-873-5p抑制的小鼠中肝损伤减弱的结果的图。图4A至C示出了在对照小鼠和miR-873-5p抑制的小鼠中通过qPCR对所指定基因进行分析的结果。图4A示出了TGFβ(左)和MMP9(右)的结果。图4B示出了FXR、HNF1α、Abcg5和Abcg8HGF(从左到右)的结果。图4C示出了iNOS(上排左)、SAA1(上排中)和CXCL1(上排右)以及TNFα(下排左)和IL-6(下排右)的结果。(数值是平均值±SEM。*P＜0.05，**P＜0.01，[对照vs873-5p-Inh])。黑条表示无BDL，白条表示miR-Ctrl BDL，以及灰条表示miR-837-5p-inh BDL。
图5A至D示出了证明在原代肝细胞中miR-873-5p抑制减少对胆汁酸的凋亡响应的结果的图。图5A是在DCA处理(100μM)之前和之后2小时在对照肝细胞和miR-873-5p抑制的肝细胞中的胱天蛋白酶3(C3)活性的图。图5B至D提供了在DCA处理的不同时间点在对照肝细胞和miR-873-5p抑制的肝细胞中通过qPCR对所指定的基因进行mRNA表达分析的结果图。图5B示出了GNMT、Bcl-2、HNF1α和HNF4α(从左到右)的结果。图5C示出了FXR、SHP、BSEP、Abcg5和Abcg8(上排，从左到右)以及MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和MRP5(下排，从左到右)的结果。图5D示出了mdr1、mdr2和mdr3(从左到右)的结果。统计分析表示：p＜0.05*；P＜0.01**；p＜0.001***(对照(ct1)vs873-5p-Inh)。黑条表示miR-Ctl，白条表示miR-837-5p-inh处理。
图6A至C提供了与肝中miR-873-5p和miRNA-518d-5p表达有关的信息。图6A是与健康的肝相比，在肿瘤肝样品中对所指定的miRNA进行表达分析的结果的表。图6B是示出肝肿瘤中的miRNA-518d-5p表达水平与GNMT表达水平之间相关性研究的结果的图。图6C是示出在GNMT3′UTR片段中miR-873-5p的推定结合位点的示意图。
图7A至B示出了证明在GNMT不存在下miR-873-5p抑制的缺乏作用的图。图7A提供了培养时在去分化的不同时间点在对照和miR-873-5p抑制的Gnmt-KO-肝细胞中通过qPCR对所指定的基因的mRNA表达进行分析的结果的图，示出了HNH4α、Matlα、白蛋白和HK4(从左到右)的结果。图7B是示出DCA处理(100μM)1小时和2小时后对照和源自Gnmt-KO小鼠的miR-873-5p抑制的肝细胞中的胱天蛋白酶3活性测定的图。统计分析表示：p＜0.05*；P＜0.01**；#与0小时的DCA miR-Ctrl相比。
图8是说明阻断肝去分化和靶向GNMT表达的纤维化之miR-873-5p抑制的示意图。该示意图表示肝脏中的miRNA-873-5p对调节GNMT表达的作用，影响肝脏去分化和纤维化表型。在左侧，示出了抑制miR-873-5p恢复GNMT表达的效果。
图9A至D提供了示出NAFLD中miR-873-5p表达的图。图9A示出了健康(对照)、脂肪变性患者和NASH患者的肝中的GNMT表达。图9B示出了健康(对照)、脂肪变性患者和NASH患者的肝中的miR-873-5p表达。图9C示出了健康和NASH患者的肝中GNMT表达与miR-873-5p表达之间的相关性。图9D示出了健康和NAFLD/NASH患者的血清中的miR-873-5p水平。
图10A至C提供了示出NAFLD小鼠模型中的miR-873-5p表达的图。图10A至C示出了饲以正常饮食(Chow)的小鼠与图10A中的饲以甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(MCDD)的小鼠、图10B中的饲以高脂肪饮食(HFD)的小鼠和图10C中的饲以高胆固醇(HC)饮食的小鼠相比的结果。将各小鼠对象饲以所指定的饮食四周，然后测定miR-873-5p和GNMT mRNA水平。
图11A-G提供了证明MCDD中miR-873-5p的抑制抵消NAFLD的示意图、显微图像和图。在四周期间，研究中的小鼠被饲以MCDD，并且在三周期间被尾部注射抗miR-873-5p。图11A示出了小鼠注射的示意图。图11B至C示出了在抗miR处理的小鼠或正常对照(ctrl)小鼠的肝中的组织学分析(包括苏木精和曙红(H＆E)、苏丹III、天狼星红、F4/80、SMA和GNMT)的结果。图11D至F提供了示出肝转氨酶(图11D)、甘油三酯(图11E)和酮体(图11F)的血清水平的三个图。图11G提供了示出被饲以标准饮食(Chow)和MCD饮食并且经或未经抗miR-873-5p处理的小鼠的肝游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇的图。MCD饮食在本文中也可互换地称为MCDD和DDMC。
具体实施方式
现在已经确定miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p均通过调节GNMT表达影响肝病(其非限制性实例包括：NAFLD、NASH、肝脏炎症、脂肪肝、肝失代偿、肝纤维化、肝硬化等)以及肝癌的发展和治疗。还发现高水平的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p与肝病动物模型中的低水平GNMT有关，并且也存在于患有某些肝疾病或病症的对象中。在一些方面，本发明包括抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性作为对肝原致癌性病症(liver pro-oncogenic condition，LPOC)(例如NAFLD、肝硬化)以及肝细胞癌(HCC)和其他肝疾病和病症的治疗。在本发明的某些方面，抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性可以增加LPOC中的化学保护并且降低与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性相关的疾病中的抗肿瘤化学抗性。在本发明的某些方面，提供了包括靶向降低miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性水平作为对NAFLD、肝硬化、HCC、肝原致癌性病症以及其他肝疾病和病症的治疗的方法。
微RNA(在本文中也称为miRNA)是小内源性RNA分子，其作用是将RNA诱导的沉默复合体(RISC)导向mRNA分子中的靶序列。负载RISC的miRNA以序列特异性方式与其靶mRNA结合，并通过诸如翻译抑制和RNA失稳的手段抑制靶mRNA。本文中以SEQ ID NO：1至15示出的微RNA的序列包括：MIR-873-5p的智人序列(也称为：hsa-miR-873-5p)，其具有与以下序列相同的序列：MIR-873-5p的小家鼠序列(也称为：mmu-miR-873a-5p)、MIR-873-5p的褐家鼠序列(也称为：rno-miR-873-5p)、MIR-873-5p的毛果杨序列(也称为：ptr-miR-873)、MIR-873-5p的牛序列(也称为：bta-miR-873)、MIR-873-5p的马序列(也称为：eca-miR-873)和MIR-873-5p的婆罗洲猩猩序列(也称为：ppy-miR-873)。还提供了MIR-518d-5p的智人序列(也称为：hsa-miRNA-518d-5p)，其具有与以下序列相同的序列：MIR-526a(也称为：hsa-miR-526a)、MIR-520c-5p的智人序列(也称为：hsa-miR-520c-5p)、MIR-526a的毛果杨序列(也称为：ptr-miR-526a)、MIR-518d-5p的大猩猩序列(也称为：ggo-miRNA-518d-5p)、MIR-520C的大猩猩序列(也称为：ggo-miR-520cd)、MIR-526a的大猩猩序列(也称为ggo-miR-526a)和MIR-518g-5p的婆罗洲猩猩序列(也称为：ppy-miRNA-518g-5p)。
如本文所使用的，抑制微RNA活性意指抑制微RNA的靶mRNA并减少从靶mRNA转录的蛋白质。如本文所使用的，增强微RNA活性意指加强微RNA的靶mRNA的作用并且增加从靶mRNA转录的蛋白质的量。现在已经确定细胞和对象中的微RNA(miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p)的活性与疾病和病症(包括但不限于肝疾病和病症)的存在或不存在相关。在细胞、组织或器官的一者或更多者中更高水平的miRNA-873-5p活性和miRNA-518d-5p活性分别增加细胞、组织或器官中肝疾病或病症的可能性。在细胞、组织或器官的一者或更多者中降低水平的miRNA-873-5p活性和miRNA-518d-5p活性分别降低细胞、组织或器官中的肝疾病或病症的可能性。
现在还确定，提高细胞中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性可以使细胞去分化，并且可以使细胞获得更多的“胎儿(fetal)”特征。本发明的某些方面包括增强细胞、组织、器官或对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性。
miRNA-873-5p、miRNA-518d-5p和GNMT的活性
本发明在一些方面涉及用于调节细胞、组织和/或对象中的miRNA-873-5p活性、miRNA-518d-5p活性和GNMT活性中的一者或更多者的方法。如本文所使用的，术语“调节”意指改变细胞中的miRNA-873-5p活性、miRNA-518d-5p活性和/或GNMT活性的水平(例如，水平和/或功能)。在本发明的一些实施方案中，改变miRNA-873-5p活性、miRNA-518d-5p活性和/或GNMT活性包括改变细胞或组织中的miRNA-873-5p、miRNA-518d-5p和GNMT中的一者或更多者的水平。因此，降低细胞中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性可以包括降低细胞中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的水平(例如，量)。
本发明的一些实施方案包括以有效降低细胞、组织或对象中的miRNA-873-5p活性和miRNA-518d-5p活性中的一者或更多者的量将一种或更多种miRNA-873-5p抑制剂化合物和miRNA-518d-5p抑制剂化合物施用于细胞、组织或对象作为对肝疾病或病症的治疗的方法。肝疾病或病症例如肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎和化学抗性可以在与具有miRNA-873-5p抑制剂化合物和miRNA-518d-5p抑制剂化合物之一或两者的细胞或组织接触的细胞或组织中进行治疗，由此分别降低细胞或组织中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性，从而治疗细胞或组织中的肝疾病或病症。
肝疾病或病症如肝癌、肝脏中的转移癌、原致癌性肝病、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎和化学抗性可以通过以分别有效降低对象中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性的量将一种或更多种miRNA-873-5p抑制剂化合物和miRNA-518d-5p抑制剂化合物施用于对象以治疗对象中的肝疾病或病症来在对象中进行治疗。
在一些实施方案中，本发明的方法包括降低细胞、组织或对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中一者或更多者的活性(例如通过将微RNA抑制剂化合物递送到细胞、组织或对象中)以治疗肝疾病或病症。为了治疗对象中的肝疾病或病症，可使一个或更多个细胞与微RNA抑制剂化合物(例如miRNA-873-5p抑制剂化合物或miRNA-518d-5p抑制剂化合物)接触，这使得细胞中的miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中至少一种的活性水平降低。如果要与微RNA抑制化合物接触的细胞在对象中，则可以将微RNA抑制化合物施用于对象。
微RNA抑制剂化合物和增强剂化合物
可用于本发明方法的一些实施方案的微RNA抑制剂化合物的实例包括但不限于miRNA-873-5p抑制剂化合物和miRNA-518d-5p抑制剂化合物。可用于本发明方法的某些实施方案以提高miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性的微RNA增强剂化合物的非限制性实例为外源性双链miRNA模拟化合物，例如miRNA-873-5p模拟化合物或miRNA-518d-5p模拟化合物。本发明部分涉及调节微RNA活性的方法。在一些情况下，调节是“抑制”微RNA活性，而在另一些情况下，调节是“增强”微RNA活性，因此术语“微RNA抑制剂”化合物和“微RNA增强剂”化合物在本文中可以被称为总称“微RNA调节剂”化合物。本领域技术人员将认识到，如本文所使用的，诸如更高、更低、减小、抑制、降低、提高/增加和增强的术语可表示与对照水平或值相比的相对水平或值。
降低miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的方法
本发明部分地包括降低一种或更多种微RNA(miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p)的活性(例如，水平和/或功能)以治疗细胞、组织、器官和/或对象中肝疾病或病症的方法。本发明的组合物、化合物和方法可用于治疗患有或有风险患有可表征为和/或与细胞、组织或对象的一种或更多种中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性相关的肝疾病或病症的对象，所述miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的活性分别增加了细胞、组织或对象中肝疾病或病症的可能性。本发明的某些方面提供了可用于抑制细胞中miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的方法和化合物，其提高了细胞中的甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)酶活性。在一些实施方案中，本发明的方法包括使细胞与有效提高细胞中GNMT酶活性的量的miRNA抑制剂化合物接触。在一些实施方案中，本发明的方法包括使细胞与有效降低细胞中DNA超甲基化的量的miRNA-抑制剂化合物接触以治疗细胞、组织、器官和对象中的肝疾病或病症。本发明部分地还涉及将miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性从对象的一种或更多种细胞中的初始活性水平降低/抑制至有效地减少或消除对象的肝疾病或病症的症状并且治疗对象的肝疾病或病症的更低活性水平。
在本发明的某些实施方案中，抑制miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性包括降低细胞、组织和/或对象中miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的功能。降低miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p功能可能由于细胞、组织或对象中miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的量的减少和/或miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p分子的活性的降低。应理解，在一些实施方案中，本发明的方法降低了细胞或组织中miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的活性而不改变miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的量。降低miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的活性的本发明方法的非限制性实例包括使miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p与微RNA抑制剂接触，所述微RNA抑制剂与miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p结合并且分别抑制miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性。应理解，在一些实施方案中，本发明的方法减少了细胞或组织中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的量，由此降低了细胞、组织或对象中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性。本发明的治疗方法可包括向细胞、组织或对象施用一种或更多种微RNA抑制剂化合物，从而降低miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的活性，减少miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的量，和/或降低细胞、组织和/或对象中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的量和活性。
抑制miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的分子和化合物在本文中是指微RNA抑制剂化合物。微RNA抑制剂化合物降低了靶miRNA作用于miRNA的靶mRNA的能力。如本文所使用的，术语“靶miRNA”意指其活性将被miRNA-抑制剂化合物降低的miRNA。在本发明的某些方面中，靶微RNA是miRNA-873-5p。在本发明的一些方面中，靶微RNA是miRNA-518d-5p。
通过施用微RNA抑制剂化合物来降低靶miRNA的活性可能由于其靶微RNA的活性的直接或间接抑制。如本文所使用的，术语“直接抑制”意指由微RNA-抑制剂化合物与其靶微RNA的结合产生的微RNA活性抑制。在本发明的一些实施方案中，直接微RNA抑制降低或消除了靶微RNA与其靶mRNA的结合，从而抑制靶微RNA的活性。在本发明的某些实施方案中，直接微RNA抑制可能不能阻止微RNA与其靶mRNA的结合，但是可干扰微RNA与其靶mRNA之间的相互作用，从而抑制微RNA的活性。如本文所使用的，术语“间接微RNA抑制”意指微RNA抑制剂化合物与微RNA的靶mRNA的结合引起的微RNA活性的抑制。在本发明的一些实施方案中，间接微RNA抑制导致微RNA与其靶mRNA结合的降低或消除，从而抑制微RNA的活性。在本发明的某些实施方案中，间接微RNA抑制可能不能阻止微RNA与其靶mRNA的结合，但是可能会干扰微RNA与其靶mRNA之间的相互作用，从而抑制微RNA的活性。制备和使用微RNA抑制剂化合物的一般方法(直接和间接两者)在以下公开中进行了描述，例如：美国专利No.8,288,356；美国专利No.8,906,871；美国专利No.8,247,543；美国专利申请公开No.US 2013-0171242；美围专利No.9,096,850；和Robertson，B.等，Silence 2010，1：10(doi：10.1186/1758-907X-1-10)；Baigude，H.和Rana，T.M.2014，Nanomedicine(Lond)9：2545；Esau，C.C.2008，Methods 44：55；以及Zhao，J.J.等，2015Cancer Res.Epub ahead of print；其各自的内容通过引用整体并入本文。
许多类型的微RNA抑制剂化合物可用于本发明的多个方面，包括但不限于包含以下的一种或更多种的化合物：RNA分子、antagomir、blockmir、miRNA海绵分子、反义抑制剂分子、变体miRNA分子等。降低miRNA-873-5p活性的微RNA抑制剂化合物的非限制性实例是miRIDIAN微RNA发夹抑制剂miRNA-873-5p(Dharmacon，Lafayette，CO)，其是结合并隔离互补的成熟微RNA链miRNA-873-5p的单链的、化学增强的RNA寡核苷酸。降低miRNA-518d-5p活性的微RNA抑制剂化合物的非限制性实例是miRIDIAN微RNA发夹抑制剂miRNA-518d-5p(Dharmacon，Lafayette，CO)，其是结合并隔离互补的成熟微RNA链miRNA-518d-5p的单链、化学增强的RNA寡核苷酸。结合至并降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的另一些序列包含RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸包含分别与miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的序列互补的序列。在本发明的一些方面中，将抑制剂化合物用于抑制本文所公开的另一miRNA，例如MIR-526a、MIR-520c-5p、MIR-520C和MIR-518g-5p的方法。
可用于本发明的化合物和方法以抑制微RNA活性的另外类型的分子包括但不限于antagomir、blockmir和微RNA海绵。Antagomir是特异性结合至感兴趣的靶微RNA的经化学修饰的寡核苷酸并抑制微RNA的细胞靶标的活性。在本发明的某些方面中，结合并抑制miRNA-873-5p的antagomir和结合并抑制miRNA-518d-5p的antagomir中的一种或更多种可递送至细胞以治疗细胞中的肝疾病或病症，和/或可递送至对象以治疗对象中的肝疾病或病症。制备和施用antagomir的方法在本领域中是已知的，参见例如，Krützfeldt，J.等，(2005)Nature 438(7068)：685-9；Czech M.P.(2006)N.Engl.J.Med.354(11)：1194-5；Tay，F.C.等，2015，Adv Drug Deliv Rev.81：117；Ebert，M.S.和Sharp，P.A.2010，RNA 16：2043；和Velu C.X.2014，J.Clin Invest 124：222；其各自通过引用整体并入本文。
设计blockmir以使得它们包含与作为微RNA结合位点的靶mRNA序列互补的序列。blockmir与mRNA结合，从而通过空间阻断微RNA与靶mRNA上相同位点的结合来抑制微RNA活性，这阻止了通过RNA诱导的沉默复合体(RISC)降解靶mRNA。制备和施用blockmir的方法在本领域中是已知的，参见例如，美国专利No.8,691965；Stenvang等，Silence 2012，3：1；和Young，J.A.2013，Blood 122：2911；其各自通过引用整体并入本文。
海绵RNA是与多种微RNA结合的小合成RNA，所述多种微RNA在其“种子区”中具有相同序列。miRNA海绵化合物的非限制性实例是高度表达的转基因，其包含多个miRNA靶位点，因此可以结合并隔离miRNA。施用至(例如，递送至或在其中表达)细胞的微RNA“海绵”可导致细胞内连续的miRNA功能丧失。可用于本发明方法的一些实施方案中的海绵RNA包含提供miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p互补结合位点的RNA序列，并且当在细胞中表达或递送至细胞时，细胞内的海绵RNA功能分别抑制了miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性。微RNA海绵的结合位点可以与miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的miRNA种子区互补并且特异于miRNA种子区。在本发明的某些方面中，miRNA-873-5p的种子区可以是miRNA-873-5p序列的核苷酸2-8。在本发明的某些方面中，miRNA-518d-5p的种子区可以是miRNA-518d-5p序列的核苷酸2-8。海绵RNA的设计和使用在本领域中是公知的。参见例如Ebert，M.，等，Nature Methods4，721-726(2007)和Ebert，M.＆P.Sharp，RNA.2010，11月；16(11)：2043-2050，其各自通过引用整体并入本文。
反义抑制方法和化合物可用于本发明的多个方面以降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性并提高GNMT活性。反义抑制剂分子的非限制性实例为：抗-miRNA和经化学修饰的反义寡核苷酸，其隔离成熟miRNA并从而与细胞靶mRNA竞争。该竞争降低了miRNA与其细胞靶mRNA的结合水平，从而抑制了miRNA的活性。反义抑制化合物和方法在本领域中是已知的。参见例如：A.G.Torres等，RNA(2011)，17：933-943；和Torres A.G.2011，ArtifDNAPNA XNA 2：71；其各自通过引用整体并入本文。
变体miRNA化合物可用于本发明的一些实施方案中以降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性和/或提高GNMT活性。变体miRNA分子的非限制性实例是结合其靶标但是该结合不导致miRNA活性的“空”miRNA。参见例如：Katoh T.2009 Genes Dev 23：433和WymanS.K.2011 Genome Res 21：1450；其各自通过引用整体并入本文。
提高miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的方法和化合物
本发明部分地包括提高一种或更多种微RNA(miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p)的活性(例如，水平和/或功能)的方法。提高这种活性可导致经处理的细胞去分化，并且经处理的细胞可获得“胎儿”细胞特征。本发明的组合物、化合物和方法可用于接触(例如，处理)一种或更多种细胞，以提高miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性并导致一种或更多种细胞的去分化。本发明的某些方面提供了可用于增强细胞中miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p的活性的方法和化合物，其降低细胞中的GNMT酶活性。增强miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的分子和化合物在本文中被称为微RNA增强剂化合物。微RNA增强剂化合物提高了其靶miRNA作用于miRNA的靶mRNA的能力，因此它可以提高来自靶mRNA的蛋白质的转录。如本文所使用的，术语“靶miRNA”意指其活性将被miRNA增强剂化合物提高的miRNA。在本发明的某些方面中，靶微RNA是miRNA-873-5p。在一些实施方案中，本发明的方法包括使细胞与有效降低细胞中GNMT酶活性的量的miRNA增强剂化合物接触。在一些实施方案中，本发明的方法包括使细胞、组织或器官与有效提高细胞、组织或器官中DNA超甲基化的量的miRNA-增强剂化合物接触。在本发明的某些方面中，经接触或处理的细胞是培养的细胞、体外细胞、体内细胞或离体细胞。
细胞、对象和对照
本发明的方法可用于与细胞、组织、器官和/或对象结合。在本发明的一些方面中，对象是人或脊椎动物哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、羊、小鼠、大鼠和灵长类动物，例如猴。因此，本发明可用于治疗人以及非人对象的疾病或病症。在本发明的一些方面中，对象可以是农场动物、动物园动物、家养动物或非家养动物，并且本发明的方法可以用于兽医预防和治疗方案。在本发明的一些实施方案中，对象是人，并且本发明的方法可以用于人预防和治疗方案。
可以应用于本发明的对象的非限制性实例是被诊断为患有、疑似患有或有风险患有肝疾病或病症的对象。本发明的方法可以应用于在治疗时已被诊断为患有肝疾病或病症的对象或被认为有风险患有或发展为肝疾病或病症的对象。在本发明的一些方面中，肝疾病或病症是急性肝疾病或病症，并且在本发明的某些方面中，肝疾病或病症是慢性肝疾病或病症。
可应用于本发明方法的细胞包括为体外、体内、离体细胞的细胞。细胞可在对象中、培养物中和/或混悬液中，或处于任何其他适合的状态的条件。可应用于本发明方法的细胞可以是肝细胞或其他类型的脊椎动物细胞，包括人和非人哺乳动物细胞。在本发明的某些方面中，可应用于本发明方法的细胞为不是肝癌细胞的健康正常细胞。在本发明的某些实施方案中，可应用于本发明方法的细胞是以下的一种或更多种：肝癌细胞、转移癌细胞、癌前肝细胞、肝硬化肝细胞、癌症后肝细胞、纤维化肝细胞、肝细胞、炎性肝癌细胞和化学抗性肝细胞。在本发明的某些实施方案中，与微RNA调节剂接触的细胞是肝癌细胞、转移癌细胞、癌症前肝细胞、肝硬化肝细胞、癌症后肝细胞、纤维化肝细胞、肝细胞、炎性肝癌细胞和化学抗性肝细胞。在本发明的某些方面中，对照细胞是正常细胞，但是应理解，具有疾病或病症(例如但不限于肝疾病或病症)的细胞在特定情况下也可用作对照细胞，例如以比较具有疾病或病症的经处理的细胞与具有疾病或病症的未经处理的细胞的结果等。
根据本发明的方法，可以确定GNMT、miRNA-873-5p、和/或miRNA-518d-5p活性水平并分别与GNMT、miRNA-873-5p、和/或miRNA-518d-5p活性的对照水平相比。对照可以是预定值，其可以采取多种形式。它可以是单个截止值，例如，中值或平均值。可以基于比较组，例如具有正常水平的GNMT，miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的组以及具有降低水平的GNMT、miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性的组。比较组的另一个实例可以是具有一种或更多种肝疾病或病症的症状或诊断为肝疾病或病症的组或者没有一种或更多种肝疾病或病症的症状或诊断为肝疾病或病症的组。通常地，对照可以基于适当年龄段中明显健康的正常个体或明显健康的细胞。应理解，根据本发明的对照除了预定值之外还可以是与实验材料平行测试的材料的样品。实例包括来自对照群体的样品或待与实验样品平行测试的通过制造产生的对照样品。
在本发明的一些方面中，对于对象测定的GNMT、miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性中的一种或更多种的值可以用作同一对象中稍后分别测定GNMT、miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性的对照值，从而允许评估对象的“基线”GNMT、miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性的变化。因此，初始GNMT、miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性水平可以存在于对象、细胞或组织中和/或在对象、细胞或组织中确定并且本发明的方法和化合物可用于降低对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p活性水平并提高GNMT活性水平，其中初始水平用作该对象的对照水平。使用本发明的方法和微RNA抑制剂化合物，与分别作为治疗细胞和/或对象中的肝疾病或病症的初始水平相比，或者分别与细胞和/或对象中未接触的对照水平相比，细胞和/或对象中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性水平可以降低至少0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。使用本发明的方法和微RNA抑制剂化合物，与分别作为治疗细胞和/或对象中的肝疾病或病症的初始水平相比，或者分别与细胞和/或对象中未接触的对照水平相比，细胞和/或对象中的GNMT活性水平可以提高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、250％、500％、1000％、5000％或更大。
使用本发明的方法和微RNA增强剂化合物，与在这种接触之前的细胞中的初始水平相比，或者与未接触的对照细胞水平相比，在与微RNA增强剂化合物接触之后，细胞和/或对象中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性水平可以提高至少0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、250％、500％、1000％、5000％或更大。使用本发明的方法和微RNA增强剂化合物，与这种接触之前的细胞中的初始水平相比或者与非接触对照细胞水平相比，细胞和/或对象中的GNMT活性水平可以降低至少0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
治疗
肝疾病和病症是可以使用本发明的方法抑制miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性和/或提高GNMT来治疗的疾病和病症的实例。在本发明的方法中可以用微RNA抑制剂治疗的肝疾病和病症包括但不限于：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、失代偿性肝、脂肪性肝炎和化学抗性。在一些实施方案中，本发明的方法可用于在对象中降低化学抗性并减少肿瘤生长和复发。微RNA抑制剂化合物的施用可以用于降低正在治疗癌症的对象中的化学抗性，并且可以提高成功癌症治疗的可能性，对于该对象而言与不存在本发明的治疗方法相比具有更积极的治疗结果。因此，施用本发明的微RNA抑制剂可以降低正在用化学治疗剂治疗或将用化学治疗剂治疗的对象的化学抗性。
在本发明的某些方面中，可以在诊断肝疾病或病症之前或之后的一个或更多个时间时向对象施用微RNA抑制剂化合物。在本发明的一些方面中，对象有风险患有或发展为肝疾病或病症。与有风险发展为肝疾病或病症的对照相比，有风险发展为肝疾病或病症的对象是发展为肝疾病或病症可能性提高的对象。在本发明的一些实施方案中，与风险对照水平相比，风险水平可能在统计学上是显著的。有风险的对象可包括例如对象将是具有先前存在的疾病和/或遗传异常的对象，其使得对象比没有先前存在的疾病或遗传异常的对照对象更易患肝疾病或病症；具有肝疾病或病症的家庭和/或个人病史的对象；以及先前已经治疗过肝疾病或病症的对象。应理解，使对象更容易患肝疾病或病症的先前存在的疾病和/或遗传异常可以是存在时先前已经被鉴定为与更高可能地发展成肝疾病或病症具有相关关系的疾病或遗传异常。
如本文所使用的，术语“治疗(treat)”、“经治疗的(treated)”、或“治疗(treating)”当用于肝疾病或病症时可以是指降低对象发展为肝疾病或病症的可能性的预防性治疗，并且也可以是指在对象已经发展为肝疾病或病症之后的治疗，以消除或降低肝疾病或病症的水平，防止肝疾病或病症变得更晚期(例如更严重)，和/或与不存在治疗的对象相比，减缓对象中肝疾病或病症的进展，以降低对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性，并提高对象中GNMT活性水平。
递送/施用微RNA调节剂化合物
本发明的微RNA抑制化合物可以以有效降低miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量和方式施用于对象，和/或提高对象中GNMT酶的活性，从而治疗肝疾病或病症。在一些实施方案中，本发明的方法包括向需要这种治疗的对象施用一种或更多种微RNA抑制化合物以减少对象中的肝疾病或病症。可以施用本发明的微RNA抑制化合物以降低体外、离体和体内细胞的一种或更多种中的miRNA-873-5p和/或miRNA-518d-5p活性。
在本发明的一些实施方案中，miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性可以通过将微RNA抑制剂化合物遗传引入细胞而降低。可以使用靶向剂和方法来帮助将微RNA抑制化合物递送至对象内的特定细胞类型、细胞亚型、器官、空间区域，和/或细胞内的亚细胞区域。本领域已知的方法(例如基因靶向)也可用于本发明的实施方案中以控制细胞和/或对象中微RNA调节剂化合物的量。本发明的一些实施方案可以包括用于基因靶向表达微RNA调节剂化合物的试剂。
微RNA调节剂化合物可以在本发明的方法中单独施用或与一种或更多种另外的化合物组合施用。向对象或细胞施用以治疗肝疾病或病症的微RNA抑制剂化合物可以与一种或更多种其他治疗剂或活性剂以协同方式起作用，并提高所述一种或更多种治疗剂或活性剂的有效性，和/或提高微RNA抑制剂化合物在治疗肝疾病或病症中的有效性。
包括施用微RNA抑制剂化合物的本发明的治疗方法可以在肝疾病或病症发作之前和/或当肝疾病或病症存在时使用，包括在肝疾病或病症的早期、中期和后期以及任何这些阶段的之前和之后的所有时间。本发明的方法还可以治疗先前用一种或更多种其他药物已经治疗过肝疾病或病症的对象，所述药物在治疗对象的肝疾病或病症中是不成功的、最小成功的、和/或不再成功的。
应理解，另外的微RNA抑制剂化合物可以被鉴定并用于本发明的治疗方法中。例如，使用本文提出的测定和方法，可以测试候选化合物降低miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的能力，其提高GNMT酶活性的能力以及其治疗肝疾病或病症的能力。
微RNA调节剂化合物的组分
可用于本发明方法的微RNA调节剂化合物可以在本发明的治疗方法中单独施用或与一种或更多种要素(如靶向剂、标记剂、跨膜递送剂、序列标签等)结合施用。因此，在本发明的一些实施方案中，微RNA抑制剂化合物由微RNA抑制剂分子组成，并且在本发明的某些实施方案中，微RNA抑制剂化合物包含微RNA抑制剂分子以及一种或更多种另外的要素。类似地，在本发明的一些实施方案中，微RNA增强剂化合物由微RNA增强剂分子组成，并且在本发明的某些实施方案中，微RNA增强剂化合物包含微RNA增强剂分子和一种或更多种另外的要素。
根据本发明方法的一些实施方案，可用的靶向剂可以包含将本发明的微RNA调节剂化合物导向和/或导入待处理的细胞，例如肝细胞或其他类型的细胞的试剂。靶向化合物的选择将取决于肝疾病或病症的性质以及所靶向的细胞类型。在一个非限制性实例中，在本发明的一些实施方案中，可能需要将微RNA调节剂化合物靶向和/或靶入肝细胞中。应该理解，在本发明方法的一些实施方案中，微RNA调节剂化合物包含微RNA调节剂分子，而没有任何另外的连接的要素。例如，在本发明的一些方面中，微RNA调节剂可以以“裸”形式施用于细胞和/或对象，这意味着没有递送连接于微RNA调节剂化合物的分子、标记等，并且在本发明的一些方面中，微RNA调节剂可以通过转染方式施用于细胞和/或对象。
在其中微RNA调节剂化合物连接至或连接在具有以下一种或更多种的组合物中的情况下：细胞或组织载体剂、靶向剂、标记剂、递送剂等，本领域技术人员将意识到并且能够选择和使用用于本发明方法的合适试剂。在本发明的一些方面中，载体剂包含纳米载体、纳米颗粒、细胞穿透载体、聚合物、树枝状聚合物、生物缀合物、基于脂质的载体、或其他合适的载体剂中的一种或更多种。本领域中描述了可用于本发明的多个方面的另外的递送和靶向方式和过程。参见例如，Torres A.G.2011，Artif DNA PNA XNA 7月至12月：2(3)：71-8，Chen，Z.等，(2012)Expert Opin Drug Deliv.6月；9(6)：649-56，Li，F.，＆J.Y.Wang(2009)Expert Opin Drug Deliv.5月；6(5)：531-41，和Poelstra，K.等，(2012)J.ControlRelease 7月20日；161(2)：188-97，各自内容通过引用整体并入本文。
标记剂可以用于本发明的方法中以确定在细胞和组织中微RNA调节剂化合物的位置，并且也可以用于评估在本文明的方法中已经施用的治疗化合物的细胞、组织或器官位置。连接和使用标记剂(如酶标记、染料、放射性标记等)的过程在本领域中是公知的。
有效量
在一些方面中，本发明的方法包括以有效治疗肝疾病或病症的量，或者在微RNA增强剂化合物的情况下以有效导致所接触细胞去分化的量向对象施用一种或更多种微RNA抑制剂化合物。在治疗肝疾病或病症或者导致细胞去分化的术语中使用的“有效量”是实现期望的生物学效应所必需或足够的量。例如，微RNA抑制剂化合物的有效量可以是(i)减缓或停止疾病或病症发展；或者(ii)逆转、减轻或消除肝疾病或病症的一种或更多种症状所必需的量。在本发明的一些方面中，有效量是当向需要治疗肝疾病或病症的对象施用时导致预防和/或治疗肝疾病或病症的治疗响应的微RNA抑制剂化合物的量。根据本发明的一些方面，有效量是当与肝疾病或病症的另一种治疗处理组合或共施用时导致预防和/或治疗肝疾病或病症的治疗响应的微RNA抑制剂化合物的量。在本发明的一些实施方案中，用微RNA抑制剂化合物治疗对象的生物学效应可以是改善和或完全消除由肝疾病或病症引起的症状。在本发明的一些实施方案中，生物学效应是肝疾病或病症的完全消除，如例如通过表明对象没有肝疾病或病症的诊断测试所证明的。
通常微RNA抑制剂化合物有效降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性和/或提高GNMT酶活性至治疗肝疾病或病症的水平的量在临床试验中确定，在盲研究中建立测试群体相对于对照群体的有效剂量。在一些实施方案中，有效量是导致期望响应的量，例如在具有肝疾病或病症的细胞、组织和/或对象中减轻肝疾病或病症的量。因此，微RNA抑制剂化合物的治疗肝疾病或病症(可以通过降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性治疗)的有效量可以是这样的量，当施用时在对象中使miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性量降低至低于在没有施用微RNA抑制剂化合物的情况下细胞、组织和/或对象中存在的量。相似地，微RNA抑制剂化合物的治疗肝疾病或病症(可以通过提高GNMT酶活性治疗)的有效量可以是这样的量，当施用时使对象中的GNMT酶活性量增加至大于在没有施用微RNA抑制剂化合物的情况下细胞、组织和/或对象中存在的量。在本发明的某些方面中，未接触或未施用微RNA抑制剂化合物的细胞、组织和/或对象中存在的miRNA-873-5p活性、miRNA-518d-5p活性或GNMT酶活性的水平被称为“对照”量。在治疗肝疾病或病症的情况下，期望响应可以是减轻或消除细胞、组织和/或对象中的肝疾病或病症的一种或更多种症状。减轻或消除可以是暂时的，或者可以是永久性的。应理解，可以使用确定miRNA-873-5p活性、miRNA-518d-5p活性和/或GNMT酶活性的方法、症状评估、临床测试等来监测肝疾病或病症的状态。在本发明的一些方面中，针对治疗肝疾病或病症的期望响应也可以是延迟发作或者甚至预防肝疾病或病症的发作。
化合物降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性和/或提高GNMT酶活性的有效量还可以通过评估在细胞或对象上施用微RNA抑制剂化合物的生理效应(例如，施用后肝疾病或病症的减轻)来确定。对象的测定和/或症状监测可以用于确定本发明药物化合物的功效和确定针对治疗的响应的存在或不存在。一个实例(但是不旨在是限制性的)是使用本领域已知的肝功能测试来确定在用微RNA抑制剂化合物治疗对象之前和之后对象中的肝疾病或病症的状态。应理解，向对象施用的微RNA抑制剂化合物的量可以至少部分基于疾病和/或病症状态的这种确定来修改。治疗的量可以例如通过增加或减少微RNA抑制剂化合物的量、通过改变施用的微RNA抑制剂化合物的组成、通过改变施用途径、通过改变给药时机等来改变。微RNA抑制剂化合物的有效量将随着治疗的特定病症、治疗对象的年龄和身体状况；病症的严重程度、治疗的持续时间、伴随治疗的性质(如果有的话)、具体的施用途径以及保健医生的知识和专业技能内的其他因素改变。例如，有效量可以取决于有效治疗肝疾病或病症的miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性和/或GNMT酶活性的期望水平。本领域技术人员可以依经验确定用于本发明方法的特定微RNA抑制剂的有效量而不需要过多实验。结合本文中提供的教导，通过从多种微RNA抑制剂化合物和权重因子(例如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和优选的施用方式)中选择，可以计划有效治疗特定对象的有效预防性或治疗性处理方案。
如本发明的一些实施方案所用的，微RNA增强剂化合物的有效量可以是增加与微RNA增强剂化合物接触的细胞的去分化和/或降低其GNMT酶活性所必需的量。在本发明的一些方面中，有效量是当与细胞接触时在细胞中导致期望生物学效应的微RNA增强剂化合物的量。
微RNA调节药物组合物和给药
使用本发明的方法施用的微RNA调节剂化合物在本文中还被称为“药物化合物”。药物化合物剂量，特别是在任何并发症的情况下可以由个体健康护理提供者或兽医来调整。治疗有效量通常在一天或更多天内在一次或更多次每日给药施用中从0.01mg/kg至约1000mg/kg，从约0.1mg/kg至约200mg/kg或从约0.2mg/kg至约20mg/kg改变。绝对量取决于多种因素，包括伴随治疗、给药次数和个体对象参数(包括年龄、身体状况、体型和体重)。这些是本领域普通技术人员公知的因素，并且可以仅使用常规实验来解决。在一些实施方案中，可以使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
在一些实施方案中，本发明的方法可以包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量的微RNA抑制剂化合物。在一些情况下，可以向对象至少每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月等施用药物化合物(例如，微RNA抑制剂化合物、微RNA增强剂化合物、miRNA-873-5p-抑制剂化合物或miRNA-518d-5p-抑制剂化合物等)。可以每天一次或每天多于一次(例如在一个24小时期间内2、3、4、5或更多次)地施用剂量。
在一些方面中，本发明的方法包括单独，与一种或更多种其他微RNA抑制剂化合物组合，和/或与向患有肝疾病或病症的对象施用的其他药物治疗或治疗活动或方案组合施用药物化合物。药物化合物可以以药物组合物施用。本发明的方法中使用的药物组合物可以是无菌的，并且包含一定量的微RNA抑制剂化合物，其使miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性降低至足以在适用于施用到对象的重量或体积单位下产生期望响应的水平。包含微RNA抑制剂化合物以降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的药物组合物向对象施用的剂量可以根据不同的参数，特别是根据使用的施用方式和对象的状态来选择。其他因素包括期望的治疗时间。在对象的响应在施加的初始剂量下不足的情况下，可以采用更高的剂量(或通过不同的更局部的递送途径以实际上更高的剂量)，其程度为患者耐受性所允许。
施用方法
用于微RNA调节化合物(例如，微RNA抑制剂化合物或微RNA增强剂化合物)的多种施用途径可用于本发明的方法中。所选择的特定递送方式至少部分地取决于治疗的特定病症和治疗功效所需的剂量。一般而言，本发明的方法可以使用医学上可接受的任何施用方式来实施，意指任何产生治疗肝疾病或病症的有效水平而不引起临床上不可接受的不良作用的方式。在本发明的一些实施方案中，微RNA调节剂化合物可以通过经口、经肠、经黏膜、经皮和/或胃肠外途径施用。术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内注射或者输注技术。其他途径包括但不限于经鼻(例如，通过胃-鼻管)、经皮、经阴道、经直肠和舌下。本发明的递送途径可以包括鞘内、心室内或颅内。在本发明的一些实施方案中，可以将微RNA调节剂化合物放置在缓释基质内并通过将该基质放置在对象中来施用。在本发明的一些方面中，可以使用经靶向特定细胞或细胞器的递送剂包被的纳米颗粒将微RNA调节剂化合物递送到对象细胞。多种递送方式、方法、试剂是本领域已知的。递送方法和递送剂的非限制性实例另外在本文其他地方提供。在本发明的一些方面中，关于微RNA调节剂的术语“递送”可以意指向细胞或对象施用一种或更多种“裸露的”微RNA抑制剂化合物序列，并且在本发明的某些方面中，“递送”意指通过转染方式向细胞或对象施用。使用转染方式递送微RNA调节剂化合物可以包括向细胞和/或对象施用载体。
在本发明的一些方法中，一种或更多种微RNA调节剂化合物可以以制剂施用，所述制剂可以以可药用溶液施用，其可以常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、助剂和任选的其他治疗成分。在本发明的一些实施方案中，微RNA调节剂化合物可以与同时施用的其他治疗剂一起配制。根据本发明的方法，微RNA调节剂化合物可以以药物组合物施用。通常，药物组合物包含微RNA调节剂化合物和任选的可药用载体。可药用载体是本领域普通技术人员公知的。如本文中所用的，可药用载体意指不干扰活性成分的生物活性有效性(例如微RNA抑制剂化合物等治疗肝疾病或病症的能力)的无毒材料。施用和递送用于治疗用途的微RNA调节剂化合物的许多方法是本领域已知的，并且可以用于本发明的方法中。
可药用载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其他材料。示例性的可药用载体在美国专利号5,211,657中被描述，其他是本领域技术人员已知的。这样的制剂可以常规地包含盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选的其他治疗剂。当在医学中使用时，盐应该是可药用的，但不可药用盐可以方便地用于制备其可药用盐，并且不排除在本发明的范围外。这样的药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而且，可药用盐可以被制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
本发明方法的一些实施方案包括直接向组织施用一种或更多种微RNA调节化合物。在一些实施方案中，施用化合物的组织是其中肝疾病或病症存在或可能出现的组织，其非限制性实例是肝。直接组织施用可以通过直接注射或其他方式来实现。许多经口递送的化合物自然地到达并穿过肝，并且本发明的治疗方法的一些实施方案包括向对象经口施用一种或更多种微RNA抑制剂化合物。单独或与其他治疗剂联合的微RNA抑制剂化合物可以施用一次，或者它们可以以多次施用来施用。如果施用多次，则微RNA抑制剂化合物可以通过不同途径施用。例如，但不旨在是限制性的，第一次(或前几次)施用可以通过经口施用来进行，并且一次或更多次另外的施用可以是经口和/或全身施用。
对于本发明的期望全身施用微RNA抑制剂化合物的一些实施方案，微RNA抑制剂化合物可以被配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)胃肠外施用。用于注射的制剂可以在有或无添加的防腐剂的情况下以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中。微RNA调节剂化合物制剂(也被称为药物组合物)可以采用在油性或水性载剂中的如混悬剂、溶液剂或乳剂这样的形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载剂包括氯化钠溶液、林格葡萄糖(Ringer’s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格、或不挥发性油(fixedoil)。静脉内载剂包含流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更低的剂量产生于其他施用形式，例如静脉内施用。在对象的响应在施加的初始剂量下不足的情况下，可以采用更高的剂量(或通过不同的更局部的递送途径以实际上更高的剂量)，其程度为患者耐受性允许。根据需要，可以使用每天多剂量以实现一种或更多种微RNA抑制剂化合物适当的全身或局部水平并且实现miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性适当的降低。
在又一些实施方案中，本发明的方法包括使用适用于植入接受者(例如对象)中的递送载剂，例如生物相容性微粒、纳米颗粒或植入物。根据该方法可用的示例性的生物蚀解性(bioerodible)植入物在PCT公开号WO 95/24929(通过引用并入本文中)中被描述，其描述了用于包含生物大分子的生物相容的可生物降解的聚合物基质。这样的递送方式是本领域公知的，并且可以用于实现微RNA调节剂化合物在对象中的持续释放，并且可以选择不降解，而是在延长的时间内通过扩散释放。
在本发明的方法中，不可生物降解和可生物降解的聚合物基质二者都可以用于将一种或更多种微RNA调节化合物递送到对象。在一些实施方案中，基质可以是可生物降解的。基质聚合物可以是天然或合成的聚合物。聚合物可以基于期望释放的时间来选择，通常约几小时至一年或更长。通常，可以使用在几小时至三到十二个月的时间内的释放。聚合物任选为在水中可以吸收其重量的多至约90％的水凝胶形式，并且还任选与多价离子或其他聚合物交联。
通常，在本发明的一些实施方案中，可以使用生物蚀解性植入物以扩散的方式或通过聚合物基质的降解来递送微RNA调节化合物。用于这种用途的示例性的合成聚合物是本领域公知的。可以使用本领域已知的方法将可生物降解的聚合物和不可生物降解的聚合物用来递送微RNA调节剂化合物。生物粘附性聚合物(例如，生物蚀解性水凝胶)(参见H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell，Macromolecules，1993，26，581-587，其教导通过引用并入本文)也可以用于递送用于治疗肝疾病或病症的微RNA抑制剂化合物。其他合适的递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。这样的系统可以避免微RNA调节剂化合物的重复施用，增加对象和医疗护理专业人员的方便。许多类型的释放递送系统是可用的并且是本领域普通技术人员已知的。(参见例如：美国专利号5,075,109；4,452,775；4,675,189；5,736,152；3,854,480；5,133,974和5,407,686(其中每一个的教导通过引用并入本文)。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适于植入。
长期持续释放植入物的使用可以适用于预防性治疗对象和处于发生复发性肝疾病或病症风险的对象。本文中所用的长期释放意指植入物被构建和布置为在至少多至10天、20天、30天、60天、90天或更长的时间内递送治疗水平的微RNA抑制剂化合物。长期持续释放植入物是本领域普通技术人员公知的，并且包括上述一些释放系统。
可以通过将具有期望纯度的分子或化合物与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合[Remington′s Pharmaceutical Sciences第21版，(2006)]以冻干制剂或水溶液的形式制备微RNA调节剂化合物的治疗制剂以用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如或聚乙二醇(PEG)。
评估调节剂效果和治疗功效
候选微RNA调节剂化合物在细胞或组织中降低或提高miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的功效的评估也可以使用本发明的测定在来自培养物的细胞中完成，例如，如评估候选微RNA调节化合物提高或降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的能力的筛选测定。在细胞、组织或对象中降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的微RNA抑制化合物可以用于治疗肝疾病或病症，在细胞或组织中提高miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的微RNA增强剂化合物可以用于使细胞去分化，这可用于药物测试，细胞系的培养、维持等。
合适的测定可以包括确定微RNA活性(例如，细胞、组织和对象中的miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性)的方式。当实施本发明的各种方法时，可以以许多方式确定miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的水平。在本发明的一些实施方案中，在细胞、组织或对象中miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的水平可以分别相对于miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的对照水平来测量。miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性水平的一种可能测量是测量miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的绝对水平。例如，这可以用每单位细胞或组织的miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性水平表示。miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性水平的另一种测量是测量miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的水平和/或活性随时间的变化和/或相关细胞和组织中GNMT酶的水平和/或活性随时间的变化。这可以用绝对量表示，或可以用随时间提高或降低的百分比来表示。miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性测定还可以用于评估miRNA-873-5p-抑制剂、miRNA-518d-5p-抑制剂、miRNA-873-5p-增强剂或miRNA-518d-5p-增强剂化合物的功效。另外，在本发明的某些实施方案中，与多肽结合的抗体或其抗原结合片段可以用于评估在与微RNA调节剂化合物接触(例如治疗)后miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p的活性，所述多肽以与miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性相关的方式增加或减少。
在本发明的一些实施方案中，细胞或组织中miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的降低可以降低至少0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，包括此范围内的所有值。与微RNA抑制剂化合物接触后miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的降低可以表明微RNA抑制性化合物在对象中治疗肝疾病或病症的功效。
如本领域普通技术人员将会理解的，本发明的治疗评价还可以基于对肝疾病或病症的症状或临床终点的评价，并且这样的评价可以与本发明的方法联合使用以评估肝疾病或病症的状态和/或肝疾病或病症的治疗功效。
试剂盒
试剂盒同样在本发明的范围内，其包含一种或更多种微RNA调节剂化合物，例如miRNA-873-5p-抑制剂化合物、miRNA-518d-5p-抑制剂化合物、miRNA-873-5p-增强剂化合物或miRNA-518d-5p-增强剂化合物和其在本发明方法中使用的说明书。本发明的试剂盒可以包含可以用于治疗肝疾病或病症或与一种或更多种细胞接触以导致细胞去分化的一种或更多种微RNA调节剂化合物。包含微RNA调节剂化合物的试剂盒可以被制备用于本发明的治疗方法。本发明试剂盒的组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装。本发明的试剂盒可以包含载体，所述载体被分隔成其中严密封闭地容纳一个或更多个容器装置或一系列容器装置，例如测试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。第一容器装置或一系列容器装置可以包含一种或更多种化合物，例如微RNA调节剂化合物。第二容器装置或一系列容器装置可以包含靶向剂、标记剂、递送剂等，在本发明治疗方法的一个实施方案中其可以作为待施用的微RNA调节剂化合物的一部分被包括在内。
本发明的试剂盒还可以包含说明书。说明书通常以书面形式，并为实施通过试剂盒实现的治疗和基于该治疗作出决定提供指导。
鉴定候选化合物的方法
本发明的某些方面包括鉴定和/或筛选可以用作本发明方法中的微RNA调节剂来在细胞、组织和/或对象中提高或降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的候选化合物的方法。所述方法可以包括使候选化合物与细胞或组织接触和/或将候选化合物施用到对象，以及在细胞、组织和/或对象与候选化合物接触之前和之后确定miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的量。与合适的对照相比，miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性量的降低指示化合物能够降低miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的水平，与合适的对照相比，miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性量的增加指示化合物能够提高miRNA-873-5p或miRNA-518d-5p活性的水平。
提供以下实施例以举例说明本发明实践的具体实例，并不旨在限制本发明的范围。对本领域普通技术人员来说明显的是，本发明将以多种组合物和方法应用。
实施例
实施例1
材料和方法
人样品
肝DNA和RNA从来自BCLC组织收集(Hospital Clinic，Barcelona，Spain)的HCC患者(在表1中描述)和由Institute of Oncology of Asturias Tumour Bank提供的2个健康肝获得。
表1：HCC患者信息
变量 例
总患者 35
男性 25
女性 10
年龄(平均值±sd) 59.47±12.62
疾病病因
HCV 14
HBV 10
HCV＆HBV 1
饮酒 4
饮酒＆HBV 1
脂肪性肝炎 2
血色素沉着病 1
健康肝 2
肿瘤大小
＜5cm 25
5-10cm 7
＞10cm 3
肿瘤扩散
单肿瘤 32
具有卫星或血管侵袭 12
多病灶肿瘤 3
Erica Villa博士(University of Modena and Reggio Emilia，Modena，Italy)提供了47例患有肝硬化和肝功能保留的HCC并且对应于BCLC阶段A(n＝34)和B(n＝13)的患者。更多信息提供于Villa E.，等，Gut.2016年5月；65(5)：861-9，电子出版于2015年2月9日中。根据赫尔辛基宣言所体现的伦理原则，从本研究中包括的所有患者获得知情同意。
动物
本研究中使用三个月大的雄性(C57BL6)小鼠、GNMT野生型(WT)小鼠和Gnmt敲除(KO)小鼠。动物程序获得具有AAALAC认证的CIC bioGUNE动物设施指南的批准。
细胞系
人肝细胞瘤细胞系BCLC3先前已进行表征并且由Jordi Bruix博士和Loreto Boix博士(BCLC group Hospital Clinic，Barcelona，Spain)提供。将细胞维持在含有10％FBS的DMEM-F12中。
原代肝细胞的分离和培养
如Embade，N.等，Hepatol，Baltimore，MD 2012；55：1237-1248中所述，通过胶原酶灌注从雄性WT Gnmt-KO小鼠中分离原代肝细胞。将粘附细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)的MEM中。
体外沉默
遵循制造商的程序使用DharmaFECT转染试剂(Dharmacon)用miRIDIAN微RNA发夹抑制剂/模拟物hsa-miR-873-5p(Dharmacon，Lafayette，CO)转染原代WT和Gnmt-KO肝细胞。对照用不相关的siRNA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)转染。通过特异性miRNA qPCR确认模拟物转染，而通过qPCR和Western印迹根据其靶标mRNA GNMT的调节来确认抑制剂转染。
体内hsa-miR-873抑制
根据制造商的说明，使用jetPEI(Polyplus Transfection，lllkirch，France)从BDL后第三天开始每两天向3个月大雄性WT小鼠的尾静脉中静脉内注射miRIDIAN微RNA发夹抑制剂hsa-miR-873-5p(2.5μM)或不相关对照siRNA直至第7天。然后，处死动物，取出肝并将其在液氮中快速冷冻或福尔马林固定用于后续分析。
免疫组织化学
将石蜡包埋的肝样品切片，脱蜡并水合。
免疫组织化学如Barbier-Torres，L.，等，Oncotarget 2015；6：2509-2523中所述进行。
药物处理
将在MEM(0％FBS)中培养过夜的原代肝细胞用脱氧胆酸(DCA)100μM处理指定的时间。
微RNA定量实时PCR
根据微RNA逆转录试剂盒程序对所分析的每种miRNA进行特异性RT-PCR。将10至50ng的RNA用于反应。根据制造商的程序使用TaqMan通用PCR主混合物无AmpErase UNG试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)和针对每种miRNA的特异性引物进行定量PCR。在每种情况下，将所分析的每种miRNA用U6 snRNA miRNA归一化。
凋亡测量
胱天蛋白酶3活性测定如Embade N.，等，Hepatol.Baltim.Md(2012)；55：1237-1248中所述进行。
萤光素酶报道子测定
鼠和人GNMT cDNA序列购买自Source biosciences(分别为cDNA克隆MGC：13738IMAGE：4210236和cDNA克隆MGC：45044 IMAGE：5229272)。将其3′UTR序列亚克隆到pmirGLO载体(Promega，Sunnyvale，CA)中，获得pmirGLO-GNMT-3′UTR。在MEM或DMEM-F12中使用DharmaFECT Duo转染试剂(Dharmacon)用pmirGLO或pmirGLO-GNMT-3′UTR载体与miRIDIAN微RNA发夹抑制剂/模拟物hsa-miR-873-5p或不相关siRNA分别转染肝细胞和BCLC3细胞。用双萤光素酶测定系统(Promega)测定细胞裂解物中萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的活性。归一化数据计算为萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶活性的比。
SAMe测量
如Martínez-López N.，等，Gastroenterology(2012)；143：787-798e13中所述，使用与装配有Lockspray电离源的Waters Micromass LCT Premier质谱仪耦合的WatersACQUITY-UPLC系统通过LC-MS来确定肝S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。
全局DNA甲基化测量。通过质谱的5mC量化
根据Le，T.等，Anal.Biochem.(2011)；412：203-209中所述的方法进行全局DNA甲基化(5mC)和羟甲基化(5hmC)分析。
统计学分析
数据表示为平均值±SEM。在指示处，每当发现不等方差时，通过Student t检验或Welch检验确定统计学显著性。p值＜0.05被认为是显著的。
结果
靶向GNMT表达的miRNA的鉴定
为了鉴定可以控制GNMT表达的miRNA，使用三种独立的无偏方法：TargetScanHuman、MicroCosm和微RNA。根据从分析中检索到的所有数据库重合miRNA的广谱，选择人肝细胞瘤BCLC细胞中的miRNA组中显示诱导的具有较高评分的那些(图6A)。相对于健康的正常肝，发现miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p二者在这些肝细胞瘤细胞中的大多数中被诱导(图6A)。此外，在选定的HCC患者肿瘤样品组群(患者的特征描述于表1中)中评价这些miRNA的表达和GNMT水平。在具有低GNMT表达的肝肿瘤与高miR-873-5p之间发现显著的统计学相关性(图1A左图)，而在miRNA-518d-5p的情况下未鉴定到关联(图6B)。此外，比较配对的肝硬化组织与其非肝硬化组织鉴定到miR-873-5p表达水平的重要差异以及miR-873-5p与GNMT表达水平之间的显著负相关性(图1A右图)。
尽管GNMT主要在成体肝中表达，但是在出生后器官中表达很少。实验结果表明，充分分化肝细胞中GNMT水平的提高伴随着miR-873-5p水平的降低(图1B)。相反，在培养的原代肝细胞的去分化期间，观察到GNMT表达降低，这与miR-873-5p水平的提高明显相关(图1C)。
在肝损伤小鼠模型(例如胆管结扎(BDL)诱导的肝纤维化)中进一步研究miR-873-5p与GNMT水平之间的关联。在这些情况下，在BDL 1、3和7天后，GNMT mRNA表达降低，联合miR-873-5p表达明显提高(图1D)。BDL诱导的肝纤维化是胆汁酸在肝中积累的直接后果，并且用胆汁酸脱氧胆酸(DCA)处理原代肝细胞导致观察到GNMT表达的下调伴随着miR-873-5p水平升高(图1E)。总之，这些发现表明在肝分化和肝损伤中，miR-873-5p表达的变化都与肝GNMT水平的变化密切相关，支持其在调节GNMT表达中的作用。
GNMT 3′UTR包含miR-873-5p的结合位点
为了研究miR-873-5p如何调节GNMT表达，使GNMT的3′UTR与萤光素酶报道基因融合，并克隆到pmirGLO载体中(pmirGLO-GNMT-3′UTR)。图6C示出了GNMT的3′UTR中miR-873-5p的推定结合位点。萤光素酶活性揭示，在原代野生型小鼠肝细胞中，与用对照miRNA转染的那些相比，模拟miR-873-5p的转染使3′UTR GNMT的报道子活性降低约50％(图1F，左图)。在另一方面，BCLC3细胞(特征在于高水平的hsa-miR-873-5p)中由pmirGLO-GNMT-3′UTR驱动的萤光素酶活性的响应揭示甚至在通过特异性抑制剂使miR-873-5p沉默后中和的基础水平该报道子活性也降低(图1F，右图)。总之，这些结果支持miR-873-5p作为调节GNMT表达的关键参与者的作用。
miR-873-5p抑制使原代肝细胞保持分化
GNMT是肝分化的标志物(参见Aliva，M.A.，等，J.Hepatol.2000；33：907-914)。为了评价miR-873-5p的表达变化是否抵消原代肝细胞在培养中进行的去分化，用其特异性抑制剂抑制miR-873-5p。结果表明，随着培养时间的增加，GNMT水平逐渐降低。另外，在去分化过程期间，miR-873-5p的消除在mRNA和蛋白质水平上都提高GNMT表达(图2A至2D)。显著地，在阻断miR-873-5p之后，关键分化标志物(例如肝细胞核因子4α(HNF4α))和与正常分化肝相关的那些基因(例如白蛋白和己糖激酶4(HK4))被部分地重新稳定(图2B)。同样地，与去分化表型相关的基因和蛋白质(例如丙酮酸激酶M2同工型(PKM2)、甲胎蛋白(AFP)(图2C)和谷氨酰胺酶1(GLS1)(数据未示出))的表达降低。在miR-873-5p抑制后在原代肝细胞中发现良好保留的细胞色素P450基因(CYP)解毒系统(图2D)。结果支持以下发现：使miR-873-5p的水平维持在受控下调下对肝表型具有显著影响。值得注意的是，还确定，在培养的原代肝细胞中进行hsa-miR-873-5p敲减之后GNMT表达的提高升高了诱导S6K活化、S6磷酸化(Thr389)和4EBP1升高(Th37/46)的有丝分裂因子肝细胞生长因子(HGF)的水平，如先前所述。(参见Yen，C.-H.，等，Mol.Med.2011：18；286-296)。
明显地，从Gnmt-KO小鼠获得的原代肝细胞中miR-873-5p的抑制未能抵消肝表型的丧失，进一步突出了在肝去分化期间miR-873-5p在GNMT表达中的特异性(图7A)。然而，重要的是注意到，miR-873-5p在Gnmt-KO肝细胞中的去分化中不受调节。
miR-873-5p的抑制减弱胆管结扎后的肝损伤
为了评价miR-873-5p和GNMT的变化是否在肝损伤中起重要作用，如下调节miR-873-5p的水平：从手术后3天(此时在肝中发生炎性响应和胆汁酸稳态改变)开始在BDL诱导的纤维化小鼠模型中i.v.注射这种miRNA的特异性抑制剂。发现，BDL啮齿动物中的miR-873-5p抑制使GNMT mRNA和蛋白质表达恢复至正常值(图3A，上图和下图)。与miR-对照处理小鼠中低于40％的存活百分比相比，miR-873-5p的特异性抑制明显提高BDL后小鼠的存活百分比-达100％(图3C)。这一效果伴随着胱天蛋白酶3活性、作为凋亡活性读出的PARP切割以及最后ALT和AST水平的显著降低(图3A至3E)。另外，与miR对照相比，在miR-873-5p抑制的小鼠中炎性标志物(例如F4/80)的染色和纤维发生指示物(例如天狼星红、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞角蛋白19(CK19))的迹象更低(图3F)。
另外，在敲减肝中检测到促纤维发生细胞因子转化生长因子β(TGF-β)表达以及金属蛋白酶9(MMP9)表达的降低，伴随着JNK和Smad2/3的活性降低(图4A)。在miR-873-5p抑制的肝中重新编程胆汁酸代谢显示强响应(图4B)，其中肝细胞核因子1α(HNF1α)和法尼醇X受体(FXR)表达恢复，并且通过上调ABCG5和ABCG8而诱导胆汁酸的主动转运。
此外，在miR-873-5p抑制后还检测到BDL后炎性响应的降低。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达、直接参与免疫应答的趋化因子受体(C-X-C基序配体1(CXCL1))的水平和急性期响应基因血清淀粉样蛋白A1(SAA1)的降低证明这一结果(图4C)。此外，在其中GNMT保持上调的那些肝中，促炎信号白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的减少消除BDL后由STAT3活化介导的响应(图4C)。
总之，数据支持以下结论：miR-873-5p抑制抵消了肝损伤期间GNMT的减少，从而减弱与不存在该肿瘤抑制基因相关的促纤维发生和促炎表型。
miR-873-5p的不存在调节原代肝细胞中由胆汁酸介导的凋亡响应
胆汁酸深度参与BDL诱导的损伤以及临床纤维化和肝硬化的发病机制。基于在DCA处理后由miR-873-5p水平升高引起的GNMT下调(图1F)，分析了该miRNA的抑制作用。结果表明，阻断miR-873-5p以与GNMT水平相应地提高一致的方式使得原代肝细胞中由胱天蛋白酶3活性介导的凋亡响应降低(图5A)。在Gnmt-KO肝细胞中抑制miR-873-5p之后没有观察到对凋亡活性的影响，从而突出了miR-873-5p在GNMT表达中作用的特异性，并且在DCA处理后在Gnmt-KO肝细胞中没有观察到miR-873-5p表达的显著改变。野生型肝细胞中消除miR-873-5p后针对由DCA介导的凋亡刺激的抗性与凋亡抑制因子Bcl-2的显著增加相关(图5B)。此外，在不存在miR-873-5p的情况下鉴定到为保持肝稳态与胆汁酸代谢相关的基因谱的适当调节。先前已报道，胆汁酸阻遏转录因子HNF1α的关键水平的中心机制是通过下调HNF4α(参见Jung，D.＆Kullak-Ublick G.A.，Hepatol.Baltim.Md 2003；37：622-631)。另外，在DCA存在下，miR-873-5p的消除24小时之后使HNF1α和HNF4α保持升高(图5B)。与稳定GNMT水平相关的FXR、胆汁盐输出泵(Bile salt export pump，BSEP)和小异二聚体配偶体(SHP)基因以及ATP结合盒转运蛋白(ABC)(MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和MRP5)和ABCG5的量增加表明DCA的毒性作用较小(图5C)。此外，miR-873-5p的抑制诱导多重抗药性基因(MDR)(MDR1、MDR2和MDR3)成体肝标志物的表达(图5D)。最后，Western印迹结果表明，当GNMT表达保持稳定时，所得JNK活化明显降低，并且在不存在miR-873-5p的情况下，显示在DCA的信号传导中具有保护作用的c-jun磷酸化提高。
通过抑制肝GNMT依赖性miR-873-5p介导的表观基因组学机制
GNMT是总甲基转移通量的必要调节因子，使这种酶成为表观遗传控制物。此外，发现GNMT在肝细胞分化的过程中改变。因此，在miR-873-5p抑制之后，诱导与SAMe含量和甲基化反应(其中GNMT发挥基本作用)直接相关的基因和蛋白质(例如甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)I/III(负责SAMe合成的第一种酶)、MTA磷酸化酶(MTAP)(参与甲硫氨酸拯救途径以再生SAMe)，以及催化S-腺苷高半胱氨酸(AdoHcy)向腺苷(Ado)和L-高半胱氨酸(Hcy)可逆水解的基因S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)。此外，在miR-873-5p抑制之后，明显地诱导催化5，10-亚甲基四氢叶酸向5-甲基四氢叶酸(高半胱氨酸重新甲基化为甲硫氨酸的共同底物)转化的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)。因此，抑制miR-873-5p维持分化肝细胞的表观遗传状态。事实上，miR-873-5p的敲减显著降低SAMe/SAH比的增加，SAMe/SAH比是肝细胞去分化期间细胞甲基化能力的指数(表2A)。
表2A：培养的肝细胞中的肝SAMe和SAH含量
*p CTRL vs.BDL
#p BDL vs.BDL 873-5p-Inh
同样地，BDL小鼠中的miR-873-5p抑制阻止了SAMe水平和SAMe/SAH比的提高(表2B)。
表2B：BDL小鼠中的总SAMe和SAH肝含量
*p CTRL vs.BDL
#p BDL vs.BDL 873-5p-Inh
已经描述了DNA(CpG)甲基化在驱动肝中促纤维发生转化的表观基因组的全局改变中具有作用(参见Mann，D.A.，Hepatol.Baltim.Md 2014；60：1418-1425)。在本文描述的实验中，发现在BDL期间敲减miR-873-5p和提高GNMT表达阻止了全局DNA(CpG)甲基化速率的提高。
结果表明，BDL后miR-873-5p抑制在STAT3和c-Raf(Ser259)磷酸化相应关闭的肝中诱导STAT和RAS途径的细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)和Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族成员(RASSF1A)抑制剂的水平。这些结果与先前在通过其对应启动子的超甲基化使GNMT长期沉默之后针对SOCS3和RASSF1A所述的阻遏效果一致(参见Martínez-ChantarM.L.等，Hepatol.Baltim.Md 2008；47：1191-1199)并且与异常增殖程度和肝恶性转化相关。
强化这一观点，过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(PPARγ)(成肌纤维细胞转分化中的关键抑制剂并且因此与静息肝星状细胞表型相关)在BDL后miR-873-5p抑制下重表达。组蛋白赖氨酸甲基转移酶(zeste增强子同源物2(EZH2))调节PPARγ表达的阻遏(参见MannJ.等，Gastroenterology 2010；138：704-714，714.el-4)。现在已确定，通过上调GNMT的miR-873-5p抑制在mRNA和蛋白质水平上明显降低了BDL后促纤维发生hub EZH2的高代表性水平，由此在该促纤维发生过程潜在的表观遗传网络中发挥关键控制，从而支持以下结论：肝GNMT-miR-873-5p依赖性表达的及时恢复可以导致特定基因的表观遗传调节。
实施例2
材料和方法
人样品：
来自肝硬化患者组群的RNA由Javier Crespo博士(Hospital UniversitarioMarqués de Valdecilla.Santander)(n＝42)和Ramiro Jover(University of Valencia)(n＝30)提供。根据赫尔辛基宣言所体现的伦理原则，从本研究中包括的所有患者获得知情同意。
苏丹III方法：
将OCT包埋的冷冻样品切片(8至12μm厚)，用60％异丙醇清洗，然后用新鲜制备的苏丹III溶液(异丙醇中0.5％苏丹III Panreac Ref：251731.1606，经0.2mm过滤器过滤)染色1小时，并最后再用60％异丙醇清洗。根据制造商的说明将切片用Mayer苏木精(SigmaRef：MHS32-1L)复染，并装片在水性装片介质中以用于脂质量化。
H＆E方法：
将石蜡包埋的肝样品切片(5μm厚)，用二甲苯替代物(Histoclear，NationalDiagnostics Ref：HS-202)脱蜡并通过分级醇溶液与蒸馏水水合。将切片用Harry苏木精(Sigma Ref：HHS128-4L)染色5分钟，并用伊红水溶液(Sigma Ref：HT110232-1L)染色15分钟。将样品通过分级醇溶液脱水并用Histoclear清洗10分钟。最后，将切片装片在DPX装片介质(Sigma 06522-500ml)中。
天狼星红方法：
将石蜡包埋的肝样品切片(5μm厚)，用二甲苯替代物(Histoclear，NationalDiagnostics Ref：HS-202)脱蜡并通过分级醇溶液与蒸馏水水合。将切片用饱和苦味酸中的0.01％固绿FCF染色15分钟，并立即置于饱和苦味酸中的0.04％固绿FCF/0.1％天狼星红中15分钟。将切片在100％醇中直接脱水30秒并用Histoclear清洗10分钟。最后，将切片装片在DPX装片介质(Sigma 06522-500ml)中。
α平滑肌肌动蛋白免疫荧光
在不启动沸腾选项下在PT联接模块(DAKO Denmark，Agilent Technologies，Glostrup，Denmark)中在97℃下在20分钟内用10mM柠檬酸钠缓冲液pH 6.0对经脱蜡且再水合的切片进行抗原恢复，然后用山羊抗小鼠Fab片段(Jackson Immunoresearch，WestGrove，PA)进行封闭(1小时，RT，1：10)，之后与3％过氧化氢孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。然后，用PBS中的5％正常山羊血清封闭切片30分钟，并在RT下与第一Cy3-SMA抗体(1：200)(Sigma Ref：C6198)孵育1小时。将载玻片用DAPI复染并用DAKO荧光装片介质(DAKO Ref：S3023)装片。
F4/80免疫组织化学：
在RT下用蛋白酶K对经脱蜡且再水合的切片进行抗原恢复15分钟。通过与3％过氧化氢孵育10分钟来阻断内源性过氧化物酶活性，然后将切片用PBS中的5％正常山羊血清封闭30分钟，并与F4/80一抗孵育(1：50，37℃下1小时，Bio-rad Ref：MCA497BB)(Bio-rad，Hercules，CA)，随后与抗大鼠Immpress试剂(Vector Ref：MP-7404)(VectorLaboratories，Burlingame，CA)孵育30分钟。用Vector Vip紫色底物(Vector Ref：sk-4600)完成比色检测。将载玻片用Mayer苏木精(Sigma Ref：MHS32-1L)复染，并最后将样品通过分级醇溶液脱水，用Histoclear清洗，并装片在DPX装片介质(Sigma 06522-500ml)中。
甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)(免疫组织化学)：
用山羊抗小鼠Fab片段(Jackson Immunoresearch)封闭再水合的切片(1小时，RT，1：10)，然后用小鼠单克隆抗GNMT一抗(1：400)染色，之后用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体Envision系统(DAKO)在室温下染色3小时，用过氧化物酶底物3，33-二氨基-联苯胺色原(3，33-diamino-bencidine chromogen)(DAKO)染色，并用苏木精复染。
抗miR-873-5p的静脉内(i.v.)施用：
合成抗miR-873-5p用于体内研究(Dharmacon)。使用的抗Mir-875-5p购买自Dharmacon(hsa-miR-873-5p)。这些发夹抑制剂是用专有修饰模式设计的单链RNA寡核苷酸以增强功能性并靶向miR-873中的以下序列：gcaggaacuugugagucuccu(SEQ ID NO：1，对于人)(miRBase登录号：MIMAT0004953)。这些序列结合并隔离互补的成熟微RNA链，还参见实施例1)。使用Invivofectamine 3.0(Life Technology)作为递送系统以获得将抗miRNA体内递送到肝细胞中的高效率。根据制造商的建议，将1.7mg/Kg与invivofectamine 3.0组合使用。如制造商所建议的进行用Invivofectamine的抗miRNA的制备。每周两次地向小鼠施用150μl的抗miRNA/invivofectamine。
qPCR方法：
用DNA酶I(Invitrogen)处理2μg所获得的RNA，并在随机引物和RNaseOUT(Invitrogen)存在下用M-MLV(Invitrogen)合成cDNA。将所得cDNA在无RNA酶水(Sigma-Aldrich)中稀释1/20，并将5微升用于PCR反应。在20μl的总反应体积中用iQ SYBR GreenSuper Mix(Bio Rad)和特异性引物使用BioRad iCycler iQ5热循环仪进行PCR，并以一式三份进行所有反应。对这些引物的PCR条件进行优化，并使用40个解链温度为60℃且每个步骤30秒的循环。使用Primer 3软件设计引物并由Sigma-Aldrich合成。在用解链曲线检查PCR产物的特异性之后，将Ct值外推至与样品同时进行的标准曲线，然后将数据以管家基因(GAPDH)的表达归一化。
微RNA定量实时PCR
根据微RNA逆转录试剂盒程序对miR-873-5p进行特异性RT-PCR。将10至50ng的RNA用于反应。根据制造商的程序，用TaqMan通用PCR主混合物无AmpErase UNG试剂盒(Life Technologies)和针对miR-873-5p的特异性引物进行qPCR。将miR-873-5p用U6snRNA归一化。
动物
本研究中使用三个月大的雄性C57BL/6小鼠。动物程序获得具有AAALAC认证的CICbioGUNE动物设施指南的批准。向小鼠饲喂标准维持饮食、甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(MCDD)、高脂肪饮食(HFD)或高胆固醇饮食(HCD)。
采血方法和样品处理
通过用无菌4-mm柳叶刀(MediPoint，Mineola，NY)切开未麻醉小鼠的右下颌下静脉来获得下颌下血液样品。从麻醉小鼠的右眶后丛收集眶后血液样品。通过将每只小鼠置于用校准蒸发器调节的4％异氟烷(IsoFlo，Abbott Laboratories，Berkshire，UK)的吸入室中来诱发麻醉。将血液样品沉积在血清分离凝胶管(Microtainer，Becton-Dickinson，Franklin Park，NJ)中并离心(9,300×g，15分钟，4℃)以进行血清分离。
临床化学参数
进行一组血清生化测定，并且其包括天冬氨酸转氨酶(AST-GOT)、丙氨酸转氨酶(ALT-GPT)、甘油三酯、葡萄糖、胆固醇、蛋白质和白蛋白。根据制造商建议的方案，使用Selectra Junior Spinlab 100分析仪(Vital Scientific，Dieren，Netherland)分析样品。在每次使用之前运行经校准的对照并且其在分析样品之前在确定的范围内。
总脂质的量化
如Bligh，E.G.和W.J.Dyer(1959)Can J Biochem Physiol.8月；37(8)：911-7所述均质化肝(300mg)并提取脂质。根据制造商的说明(A.Menarini Diagnostics，Italy)使用试剂盒量化TG。从血液中提取血清，并使用制造商的说明使用来自Wako chemicals GmbH(Richmond，VA)的可商购获得试剂盒量化酮体。用于酮体量化的试剂盒为具有两个组分的以下试剂盒和校准试剂盒：Autokit T-KB Rl Set ref 415-73301、Autokit T-KB R2 SetRef 413-73601；和酮体校准器300 Ref 412-73791。
结果
NAFLD中的miR-873-5p表达
GNMT表达和SAMe代谢在患有脂肪变性和脂肪性肝炎的患者中明显受损。使用qPCR，在健康对照患者和NAFLD患者的肝样品中测量GNMT和miR-873-5p表达，揭示GNMT的减少并伴随着miR-873-5p水平的提高(图9A至B)。另外，已经确定GNMT-miR-873水平之间的显著负相关(图9C)。最后，与健康对照患者相比，发现在来自患有NAFLD的患者的血清样品中miR-873-5p水平提高(图9D)。
NAFLD小鼠模型中的miR-873-5p表达
为了研究GNMT/miR-873调节在脂肪肝发生中的作用，在不同的NAFLD小鼠模型中测量GNMT和miR-873-5p表达水平两者。向小鼠饲喂标准维持饮食、甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(MCDD，图10A)、高脂肪饮食(HFD，图10B)或高胆固醇饮食(HCD，图10C)。在所有研究的饮食中，都观察到GNMT与miR-873-5p表达之间的负相关，表明miR-873-5p在NAFLD发生中的作用。
MCDD中的miR-873-5p抑制抵消NAFLD发生
为了研究miR-873-5p在NAFLD中的作用，向小鼠饲喂MCD饮食4周，并通过每周两次尾静脉注射来用特异性抗miR-873-5p抑制miR-873-5p，持续3周。MCD饮食后miR-873抑制小鼠通过免疫组织化学(IHC)的最后表征显示较低量的肝脂质含量(苏丹红)，以及促炎性和促纤维发生标志物(F4/80、天狼星红和αSMA)的减少。与对照MCD饮食小鼠相比，这些结果伴随着提高的GNMT水平(图11A至C)。此外，从MCD饮食小鼠收集的血清的分析显示抗miR-873-5p处理小鼠中肝转氨酶水平(GOT、GPT)的降低，表明肝损伤较轻。另一些血清标志物揭示甘油三酯减少以及酮体增加(图11D至F)，表明甘油三酯从肝向血液中的输出降低并且肝中脂肪酸氧化提高，随之血液中的酮体增加。最后，分析这些肝的总脂质含量。在这种情况下，研究显示，miR-873抑制介导MCD饮食结束时肝中不同脂质的显著减少，显示游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇的含量更低(图11G)。
讨论
代谢综合征是以下临床因素的集群：糖尿病、腹部肥胖、高胆固醇和高血压。据估计，全世界的成人群体中有约20％至25％患有代谢综合征，并且与未患这种综合征的人相比，其死亡的可能性是两倍并且患有心脏病发作或卒中的可能性是三倍。此外，患有代谢综合征的人具有5倍大发生2型糖尿病的风险。每年，全世界有320万人死于与糖尿病相关的并发症。此外，肥胖已成为世界范围的流行病。人类历史上首次超重人数与体重不足人数相当。在全球，有＞10亿的超重成人，其中约3亿是临床上肥胖的。在欧盟的不同地区，肥胖占医疗保健成本的2％至8％并导致10％至13％的死亡。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的肝病，因为估计其在西方国家的普通人群中的流行率为20％至30％。已表明，NAFLD与代谢综合征的特征强烈相关。胰岛素抗性是NAFLD和代谢综合征两者的关键致病因素。来自临床研究、实验研究和流行病学研究的可用数据表明，NAFLD可能是代谢综合征的肝表现。
甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)是哺乳动物肝中总甲基转移通量的必要调节因子。不同的DNA甲基化模式是肝发育、肝去分化和肝疾病进展的特征，其中有NAFLD、纤维化、肝硬化和肝癌，这是其中GNMT水平由于仍然了解甚少的机制而明显降低的过程[Avila MA，等，(2000)J.Hepatol.33：907-9141]。
微RNA(miRNA)是新兴的一类通过RNA沉默或在转录后水平上调节基因表达的高度保守的非编码小RNA[Filipowicy w.，等，(2005)Curr.Opin Struct.Biol.15：331-341]。miRNA调节基本的生物学过程，包括分化和代谢，以及细胞响应，例如增殖、凋亡和肿瘤发生[Meltzer，P.S.(2005)Nature 435：745-74]。在肝中，miRNA特征与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化和肝癌相关[Croce，CM.(2008)N.Engl.J.Med 358：502-511]。
令人感兴趣的是，在GNMT的3′UTR中鉴定到微RNA miRNA-873-5p的推定结合位点，表明miRNA-873-5p在GNMT调节中的潜在作用。现在已经确定，在NAFLD患者组群中，miRNA-873-5p的肝表达提高。在这些情况下，抑制miRNA-873-5p诱导GNMT水平。事实上，通过miRNA-873-5p抑制来重建GNMT表达降低了脂肪变性饮食下小鼠中脂肪变性和脂肪性肝炎的发生。总之，结果突出了miRNA-873-5p作为NAFLD和其他肝疾病的新治疗方法的作用。
实施例3
miRNA-518d-5p的抑制
还使用抗miR-518-5p(Dharmacon)进行实验。参见本文中的实施例1和2中的方法。抗Mir-518-5p从Dharmacon获得(hsa-miR-518-5p)。这些发夹抑制剂是用专有修饰模式设计的单链RNA寡核苷酸以增强功能性并靶向miR-518中的以下序列：cucuagagggaagcacuuucug(SEQ ID NO：8；对于人)(miRBase登录号：MIMAT0005456)。抗miR序列结合并隔离互补的成熟微RNA链，还参见实施例1和2。抑制实验如本文中的实施例1和2中所示进行。实验证明，miR-518d-5p的抑制诱导GNMT水平。通过miRNA-518d-5p抑制重建GNMT表达降低了脂肪变性饮食下小鼠中脂肪变性和脂肪性肝炎的发生。总之，结果突出了miRNA-518d-5p作为NAFLD和其他肝疾病的治疗方法的作用。
等同方案
虽然本文中已经描述并举例说明了本发明的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文所述功能和/或获得本文所述结果和/或一个或更多个优点的多种其他方式和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改均被认为在本发明的范围内。更一般性地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都旨在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导所用于的具体应用。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述且要求保护的方式来实施。本发明涉及本文所述的每种单独特征、系统、物品、材料和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不相互不一致，则两种或更多种这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任意组合都包括在本发明的范围内。
本文中定义并使用的所有定义均应理解为控制字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此连接的要素中的“一个或二者”，即要素在一些情况下联合存在，而在另一些情况下分离存在。除非明确指出相反，否则除由“和/或”短语明确确定的要素之外可以任选地存在其他要素，不管与这些明确确定的要素相关还是不相关。
本申请中引用或参考的所有参考文献、专利和专利申请以及出版物在此通过引用整体并入本文。
序列表
<110> Asociacion centro de Investigacion Cooperativa en
Biociencias-CIC bioGUNE
Martinez Chantar, Maria
Anguita, Juan
<120> 治疗肝疾病和病症的方法和组合物
<130> MI02.700WO
<150> US 62/207,456
<151> 2015-08-20
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-873-5p
<400> 1
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<212> RNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
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<213> 褐家鼠（Rattus novergicus）
<220>
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<213> 毛果杨（Populus trichocarpa）
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<213> 牛（Bos taurus）
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<213> 马（Equus caballus）
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<213> 婆罗洲猩猩（Pongo pygmaeus）
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Claims (72)

1.用于在对象中治疗肝疾病或病症的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的对象以在所述对象中有效治疗肝疾病或病症的量施用微RNA抑制剂化合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物降低所述对象中至少一种细胞中的微RNA活性。
3.权利要求2所述的方法，其中降低所述微RNA活性包括降低微RNA水平或功能。
4.权利要求1所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物降低所述对象中至少一种细胞中的微RNA活性并提高甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)酶活性。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述肝疾病或病症是以下中的一种或更多种：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪堆积(脂肪肝)、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎和化学抗性。
6.权利要求1所述的方法，其中治疗所述肝疾病或病症包括与GNMT活性的对照水平相比提高所述对象中至少一种细胞中的GNMT活性。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物以药物组合物施用，并且任选地所述药物组合物还包含可药用载体。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂。
9.权利要求8所述的方法，其中所述靶向剂是肝靶向剂。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物、反义抑制剂分子和变体miRNA分子。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肝疾病或病症不是癌症。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用用于治疗以下的一种或更多种的另外的治疗：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿性脂肪性肝炎、或化学抗性。
15.权利要求14所述的方法，其中在向所述对象施用所述miRNA抑制剂化合物之前、同时和之后的一个或更多个时间向所述对象施用所述一种或更多种另外的治疗。
16.权利要求14所述的方法，其中所述一种或更多种另外的治疗独立地选自放射治疗、手术治疗、化学治疗、分子靶向治疗、细胞抑制治疗和细胞毒性治疗。
17.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中施用所述miRNA抑制剂化合物和所述一种或更多种另外的治疗导致对所述对象中所述肝疾病或病症的协同治疗作用。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂化合物是外源性miRNA抑制剂化合物。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂化合物的施用方式包括以下的一种或更多种：经口施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、肝内施用、经鼻施用、表面施用、经皮施用、植入物施用和输注施用。
20.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中用于所述miRNA抑制剂化合物的施用制剂包括以下的一种或更多种：缓释制剂、纳米颗粒、微粒、水凝胶、可吸收载体、可植入制剂和生物可降解基质。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所施用的miRNA抑制剂化合物减少所述对象中至少一种细胞的去分化。
22.权利要求2、4和21中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞是肝细胞。
23.提高细胞中GNMT酶活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效提高所述细胞中GNMT酶活性的量的miRNA抑制剂化合物接触，并且其中GNMT酶活性的提高减少所述细胞中的DNA超甲基化。
24.权利要求23所述的方法，其中提高所述GNMT酶活性包括提高所述细胞中所述GNMT酶的水平或功能。
25.权利要求23或24所述的方法，其中所述细胞是体外或离体细胞。
26.权利要求23或24所述的方法，其中所述细胞是体内细胞。
27.权利要求26所述的方法，其中所述体内细胞在对象中并且所述接触包括向所述对象施用所述miRNA抑制剂化合物。
28.权利要求27所述的方法，其中所述miRNA抑制剂化合物以药物组合物施用，并且任选地，所述药物组合物还包含可药用载体。
29.权利要求28所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂，其中任选地所述靶向剂是肝靶向剂。
30.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物、反义抑制剂化合物和经修饰的miRNA分子。
31.权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。
32.权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。
33.权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
34.权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述细胞是以下中的一种或更多种：肝癌细胞、转移癌细胞、癌前肝细胞、肝硬化肝细胞、癌症后肝细胞、纤维化肝细胞、肝细胞、炎性肝癌细胞和化学抗性肝细胞。
35.权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述细胞不是癌细胞。
36.权利要求23至35中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与用于治疗以下的一种或更多种的另外的治疗接触：肝癌、转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎和化学抗性。
37.权利要求36所述的方法，其中在使所述细胞与所述miRNA抑制剂化合物接触之前、同时和之后的一个或更多个时间使所述细胞与所述一种或更多种另外的治疗接触。
38.权利要求36所述的方法，其中所述一种或更多种另外的治疗独立地选自放射治疗、手术、化学治疗、分子靶向癌症治疗、细胞抑制治疗和细胞毒性治疗。
39.权利要求36至38中任一项所述的方法，其中与所述miRNA抑制剂化合物和所述一种或更多种另外的治疗接触导致所述miRNA抑制剂化合物和/或所述一种或更多种另外的治疗对所述细胞的协同作用。
40.权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂化合物是外源性miRNA抑制剂化合物。
41.权利要求23至40中任一项所述的方法，其中所述miRNA抑制剂化合物减少所接触细胞的去分化。
42.降低细胞中GNMT酶活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效降低所述细胞中GNMT酶活性的量的miRNA增强剂化合物接触。
43.权利要求42所述的方法，其中降低所述细胞中的GNMT酶活性提高所述细胞中的DNA超甲基化。
44.权利要求42或43所述的方法，其中降低所述GNMT酶活性包括降低所述细胞中所述GNMT酶的水平或功能。
45.权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述细胞是体外细胞或离体细胞。
46.权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内细胞。
47.权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述miRNA增强剂化合物在药物组合物中，并且任选地，所述药物组合物还包含可药用载体。
48.权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述微RNA增强剂化合物还包含一种或更多种可检测标记和靶向剂。
49.权利要求42至48中任一项所述的方法，其中所述微RNA增强剂化合物包含微RNA序列。
50.权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述微RNA增强剂化合物包含miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种、或其功能变体。
51.权利要求42至50中任一项所述的方法，其中所施用的miRNA增强剂化合物增加所接触细胞的去分化。
52.权利要求51所述的方法，其中所述所接触细胞是肝细胞。
53.鉴定在细胞中改变miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性之miRNA调节化合物的方法，所述方法包括
(a)使细胞接触候选miRNA调节化合物；
(b)确定所述细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量；以及
(c)分别将对于miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者确定的活性的量与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性的对照量相比较，其中分别与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性的对照量相比，所接触细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量降低鉴定所述候选miRNA调节化合物为miRNA抑制化合物，并且其中分别与miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p的活性的对照量相比，所接触细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量增加鉴定所述候选miRNA调节化合物为miRNA增强化合物。
54.权利要求53所述的方法，其中确定所述细胞中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p之一或两者的活性的量包括将所述所接触细胞中的GNMT酶活性与未和所述候选miRNA调节剂化合物接触的对照细胞中的GNMT活性相比较，其中与所述对照细胞相比，所述所接触细胞中GNMT酶活性的提高鉴定所述候选miRNA调节剂为miRNA抑制剂化合物，并且其中与所述对照细胞相比，所述所接触细胞中GNMT酶活性的降低鉴定所述候选miRNA调节剂为miRNA增强剂化合物。
55.权利要求53或54所述的方法，其中所述细胞是体外细胞或离体细胞。
56.权利要求53或54所述的方法，其中所述细胞是体内细胞。
57.权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述所接触细胞是肝细胞。
58.权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述所接触细胞是以下中的一种或更多种：肝癌细胞、转移癌细胞、癌前细胞、肝硬化细胞、癌症后细胞、纤维化细胞、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞、NASH细胞、纤维化肝细胞、脂肪性肝炎肝细胞、化学抗性肝细胞和正常细胞。
59.权利要求53所述的方法，其还包括向对象施用所鉴定的miRNA抑制化合物。
60.权利要求59所述的方法，其中所述对象患有肝疾病或病症。
61.用于在对象中治疗肝疾病或病症的药物组合物，其包含在对象中有效治疗肝疾病或病症的量的至少一种miRNA调节化合物。
62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述miRNA调节化合物是miRNA活性抑制化合物。
63.权利要求62所述的药物组合物，其中所述miRNA抑制化合物抑制所述对象中miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中至少一种的活性。
64.权利要求62或63所述的药物组合物，其中抑制miRNA活性包括降低所述miRNA的水平或功能。
65.权利要求62至64中任一项所述的药物组合物，其中微RNA抑制剂化合物包含一种或更多种RNA分子、miRNA海绵化合物、反义抑制剂分子和变体miRNA分子。
66.权利要求62至65中任一项所述的药物组合物，其中微RNA抑制剂化合物包含微RNA发夹抑制剂分子。
67.权利要求62至66中任一项所述的药物组合物，其中微RNA抑制剂化合物抑制miRNA-873-5p和miRNA-518d-5p中的至少一种。
68.权利要求61至67中任一项所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症是：肝癌、肝脏中的转移癌、癌前肝病、肝细胞癌、肝硬化、癌症后肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、隐源性肝硬化、肝细胞癌、肝失代偿、脂肪性肝炎或化学抗性。
69.权利要求61所述的药物组合物，其中所述miRNA调节化合物是miRNA活性增强化合物，并且其中增强miRNA活性包括提高所述对象中所述miRNA的水平或功能。
70.权利要求61至69中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含可药用载体。
71.权利要求61至70中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含靶向剂。
72.权利要求62至71中任一项所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症中的至少一种不是癌症并且所述对象未患有癌症。
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