CN109182512A

CN109182512A - 一种用于筛查先天性心脏病的生物标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN109182512A
Application number: CN201811424251.7A
Authority: CN
Inventors: 张静淑; 邱广蓉; 巩天星; 于鲲; 赵越
Original assignee: Northeastern University China; China Medical University
Current assignee: Northeastern University China; China Medical University
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-01-11

Abstract

本发明涉及一种用于筛查先天性心脏病的生物标志物及试剂盒，公开了用于筛查先天性心脏病的生物标志物的序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1互补的序列。还公开了用于筛查先天性心脏病的试剂盒，该试剂盒包括反转录引物、miR‑873引物对和内参U6引物对。本发明提供的用于筛查先天性心脏病的生物标志物为丰富先天性心脏病的遗传调控网络提供依据，而且为先天性心脏病的早期筛查诊断提供具有广泛应用前景的候选靶标。其筛查试剂盒的检测使用方法简单、准确、特异性强、灵敏度高。

Description

一种用于筛查先天性心脏病的生物标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于筛查先天性心脏病的生物标志物及试剂盒，属于生物医药制备技术领域。

背景技术

先天性心脏病(CHD)是指心脏和胸内大血管的结构畸形及其可能导致的功能性异常，其严重危害婴幼儿健康的出生缺陷。新生儿先天性心脏病筛查及随访对减少先天性心脏病患儿病死率、提高先天性心脏病患儿健康水平有着重要的意义。研究发现，先天性心脏病监测干预体系，可以减少由于延迟诊断或遗漏诊断而导致的先心病死亡，从而进一步降低婴幼儿死亡率，提升先心病患儿生活质量，对改善儿童健康状况有着重要意义。目前先天性心脏病的筛查，主要依靠超声影像检查。但是，目前县级卫生机构和乡级卫生所大多无法开展婴幼儿心脏超声普查。因此，如果能够找到可用于筛查先天性心脏病的候选靶标，并应用于临床筛查与诊断，将具有重要的理论与实践意义。

微小RNA，即microRNA(miRNA)是一类长约18～24nt的内源性、非编码单链RNA，通过与靶基因3′-非翻译区(3′-Untranslated Region,3′-UTR)互补结合，在转录后水平调控靶基因的表达，进而参与胚胎发育、细胞分化、炎症、肿瘤等不同的生理、病理过程。作为重要的调控因子，miRNA通过与靶基因3′-UTR靶向互补结合，参与心血管系统的正常发育和疾病发生。研究表明，在疾病状态时，患病的组织细胞可主动分泌miRNA，并通过外泌体、微小体等载体运送到血液循环中。这些稳定存在于外周血清中circulating microRNA的浓度与疾病的发生发展密切相关，有望成为新的生物标志物而用于疾病的诊断。但具体哪些miRNA可作为生物标记物用于疾病的诊断与筛查，还需进行大量研究探讨。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为解决目前先天性心脏病的婴幼儿筛查主要依靠超声影像检查，但是县级卫生机构和乡级卫生所大多无法开展婴幼儿心脏超声普查的问题，本发明提供一种用于制备筛查先天性心脏病试剂盒的生物标志物及检测试剂盒。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种用于制备筛查先天性心脏病试剂盒的生物标记物，其序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1互补的序列。

如上所述生物标记物用于在制备筛查先天性心脏病、临床诊断或产前诊断试剂盒中的应用。

一种用于筛查先天性心脏病的试剂盒，其包括反转录引物、miR-873引物对和内参U6引物对，其中所述反转录引物的序列如SEQ ID NO.2所示或为与SEQ ID NO.2所示互补的序列，所述miR-873引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示或为与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示对应互补的序列，所述内参U6引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示或为与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示对应互补的序列。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括反转录酶、Taq聚合酶、SYBR。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括RNA聚合酶抑制剂或2×FastStartEssential DNA Green Master。

在反转录时采用RNA聚合酶抑制剂，能有效避免样品中的RNA被RNA聚合酶降解，避免出现假阴性结果。

如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1、提取待测外周血清中的RNA；

S2、对提取的所述RNA利用反转录引物反转录合成cDNA；

S3、对合成的所述cDNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，包括miR-873反应体系和内参U6反应体系，所述miR-873反应体系为利用所述miR-873引物对对步骤S2获得的所述cDNA进行实时荧光定量PCR检测，所述内参U6反应体系为利用所述内参U6引物对对步骤S2获得的所述cDNA进行实时荧光定量PCR检测；

S4、放入荧光定量扩增PCR仪，由仪器检测生成得出Ct_miR-873与Ct_U6；其中，所述Ct_miR-873为待测血清中miR-873的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，所述Ct_U6为待测血清中内参基因U6的荧光信息到达设定阈值所经历的循环数；

S5、计算外周血清中miR-873相对表达量为2^-ΔCt，其中，所述ΔCt＝Ct_miR-873-Ct_U6；

结果判定：外周血清中miR-873相对表达量大于0.3221，判断为先天性心脏病阳性，小于0.3221为先天性心脏病阴性。

如上所述的试剂盒，优选地，在步骤S2中，所述反转录的扩增条件为16℃30min；42℃30min；85℃5min。

进一步地，反转录的扩增反应体系为20μl，包括按终浓度表示：1×Buffer，dNTP0.1～10mmol/L，RNA聚合酶抑制剂2U/μl，反转录酶0.5U/μl，MgCl₂ 5μmol/L，miR-873反转录引物25μg/ml和RNA模板1.0μg。

如上所述的试剂盒，优选地，在步骤S3中，所述miR-873引物对和内参U6引物对在反应体系中各引物的终浓度分别为0.2μmol/L。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为20.0μl，包括终浓度为1×SYBR，上下游引物的终浓度各为0.2μmol/L，ROX II，cDNA2.0μl，剩余用水补足20.0μl。

如上所述的试剂盒，优选地，在步骤S4中，所述荧光定量扩增PCR扩增程序为：95℃预变性30sec，然后95℃5sec、60℃34sec共40个循环。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种用于检测先天性心脏病的miRNA，为丰富先天性心脏病的遗传调控网络提供依据，而且为先天性心脏病的早期筛查提供具有广泛应用前景的候选靶标。本发明还提供了用于筛查先天性心脏病的检测试剂盒，其检测试剂盒的使用方法简单，准确，特异性灵敏度高。本发明提供的试剂盒适用于婴幼儿先天性心脏病的筛查。

附图说明

图1为miR-873在先天性心脏病患者外周血清中的表达水平；

图2为Real Time RT-PCR结果显示miR-873在先天性心脏病患者外周血清中表达水平明显高于正常对照组，*：P<0.05；

图3为miR-873的受试者工作曲线；

图4为miR-873最佳诊断临界值分析；(miR-873用于CHD筛查的最佳诊断临界值为0.3221)

图5为miR-873用于CHD筛查的敏感性及特异性(敏感性为88.9％，特异性为60.9％)。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

脑胶质瘤相关癌基因1(GLI1)编码一类具有五个锌指DNA结合基序的转录因子，表达于第二生心区，参与房室分隔、心脏流出道形成等。

本发明人所在课题组前期研究结果发现CHD患者心肌组织标本中GLI1基因表达降低，提示GLI1基因表达降低可能是其参与CHD发生的潜在机制。由于miRNA可在转录后水平调控靶基因表达，且在CHD的发生、发展中扮演重要角色，因此推测：CHD患者GLI1基因表达降低也可能受某个miRNA调控。通过生物信息学分析，发明人在GLI1基因3′-UTR预测到miR-873的可能结合位点。因此设想：miR-873可能通过与GLI1基因3′-UTR互补结合，在转录后水平调控GLI1基因表达，进而参与CHD的发生。发明人以U6为内参，应用Real Time RT-PCR分别检测63例先天性心脏病患者外周血清和23例正常对照外周血清中miR-873的表达水平。

本发明针对miR-873的序列为SEQ ID NO.1：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU或者其对应的互补RNA序列，设计反转录引物和Real Time RT-PCR引物，经大量实验验证确认使用的反转录引物、RT-PCR引物适用于筛查先天性心脏病，下面进一步通过实验验证miRNA-873是作为一种检测先天性心脏病的生物标记物，可用于检测先天性心脏病。

先天性心脏病患者外周血清miR-873表达分析

(1)、外周血清miRNA提取

样品为63例CHD患者外周血清标本、23例正常对照外周血清标本，均由沈阳军区总医院提供，所有CHD患者均具有典型的临床表现，经心脏超声和手术确诊。

1)全血经EDTA2K抗凝或分离胶分离后，立即3,000rpm离心15min，分离出血清。

2)样品处理：每200μl血清中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30sec。

3)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

4)室温12,000rpm离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

5)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。

6)室温12,000rpm离心15min，转移水相到新的无RNase的离心管中。

7)量取转移液的体积，缓慢加入1/3体积无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12,000rpm离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。

8)量取流出液的体积，缓慢加入2/3体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。

9)向吸附柱miRelute中加入500μl已加入乙醇的去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。

10)向吸附柱miRelute中加入600μl漂洗液RW(已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。

11)将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。

12)将吸附柱miRelute转入一个新的1.5ml离心管中，加15～30μl RNase-freeddH₂O，室温放置2min，室温12,000rpm离心2min。-70℃保存，以防降解。

(2)miR-873反转录

采用茎环反转录方法进行miR-873的反转录。

Stem loop RT引物序列为(SEQ ID NO.2)：

5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGAGACT-3′

反应体系为：

反应条件为：

16℃30min→42℃30min→85℃5min，获得cDNA。

(3)Real-time PCR检测miR-873表达

以U6为内参，应用TaKaRa Real-time PCR试剂盒检测miR-873表达，反应在ABIPrism 7500 system上进行。

miR-873引物序列为：

Forward primer(SEQ ID NO.3)：

5′-ACACTCCAGCTGGGGCAGGAACTTGTGAG-3′

Reverse primer(SEQ ID NO.4)：5′-TGTGTCGTGGAGTCG-3′

U6引物序列为：

U6-sense(SEQ ID NO.5)：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'

U6-antisense(SEQ ID NO.6)：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

反应体系为：

反应条件为：

95℃预变性30sec，然后95℃5sec、60℃34sec共40个循环。

反应结果应用标准曲线法进行分析。每个样品重复3次，取平均值。

(4)统计学分析

所有数值记为均值±标准差。采用t检验方法，SPSS 16.0软件进行统计学分析。P<0.05具有统计学意义。

(5)结果：先天性心脏病患者外周血清miR-873表达升高。

本发明中以U6为内参，应用Real Time RT-PCR分别检测63例先天性心脏病患者外周血清和23例正常对照外周血清中miR-873的表达水平。使用Excel表格自带作图工具对63例miR-873在先天性心脏病患者外周血清中的相对表达量进行了表达数据的柱状图绘制，结果如图1所示为miR-873在先天性心脏病患者外周血清中的表达水平。

Real Time RT-PCR结果显示：48例(48/63，76％)先天性心脏病患者外周血清miR-873的表达量较正常对照组升高。本研究运用SPSS16.0软件中的T检验，分析了miR-873在收集到的63例先天性心脏病患者外周血清和23例正常对照外周血清中表达的差异性。统计学分析结果如图2所示，结果表明miR-873在63例先天性心脏病患者外周血清中平均表达量显著高于正常对照组(P<0.05)。

上述结果表明miR-873与先天性心脏病相关，其表达升高可能是其参与先天性心脏病发生的潜在机制。

实施例2miR-873临床应用价值评估

(1)将实施例1中获得63例单纯性先天性心脏病患者和23例正常对照的血清miR-873表达量用2^-ΔCt表示(2^-ΔCt＝2^{-(Ct miR-873-Ct U6)})，类别组设定为：1＝先天性心脏病组，0＝对照组。

(2)采用MedCalc13.0软件对miR-873进行受试者工作曲线(ROC)分析，通过曲线下面积(AUC)判断miR-873作为先天性心脏病早期诊断生物标志物的诊断价值、最佳诊断临界值、敏感性、特异性。

(3)判断标准：AUC<0.5，无诊断价值；0.5<AUC<0.9，具有一定诊断价值；AUC>0.9，诊断“金标准”。

(4)结果：miR-873可以作为一个诊断指标应用于临床先天性心脏病的筛查。

采用MedCalc13.0软件对miR-873进行受试者工作曲线(ROC)分析。分析结果显示，曲线下面积(AUC)为0.812，标准误差(SE)为0.05，95％置信区间为0.714～0.888(P<0.01)，如图3所示，提示miR-873对于先天性心脏病的早期诊断具有临床应用价值。

进一步采用MedCalc13.0软件对miR-873在患者和正常对照外周血清中的表达进行了最佳诊断临界值的分析，如图4所示，结果提示miR-873用于先天性心脏病早期诊断的最佳诊断临界值为0.3221。

实施例3敏感性和特异性的检测

同时用MedCalc13.0软件对miR-873在患者和正常对照外周血清中的表达进行了敏感性和特异性分析，包括63例先天性心脏病患者和23例正常对照，可采用如实施例1中所述方法提取外周血RNA，对提取的RNA用miR-873反转录引物如SIQ ID NO.2所示序列或与SIQ ID NO.2所示互补的序列进行miR-873反转录，反应体系20μl终浓度为：1×Buffer，dNTP(1mmol/L)，RNA聚合酶抑制剂2U/μl，反转录酶0.5U/μl，MgCl₂5μmol/L，miR-873反转录引物25μg/ml，RNA模板1.0μg，扩增条件为：16℃30min，42℃30min，85℃5min，获得cDNA。

对获得的cDNA采用Real-time PCR检测miR-873表达，采用的miR-873引物对序列为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列或采用与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示对应互补的序列，并以U6为内参，U6引物对序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列或与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示对应互补的序列，其反应体系为20.0μl，包括2×SYBR，cDNA2.0μl，上下游引物的终浓度为5μmol/L，ROX II(Taq酶)，剩余用水补足20.0μl。上述对cDNA进行扩增除了采用TaKaRa Real-time PCR试剂盒，还可用含有SYBR Green Ⅰ燃料的试剂盒，如2×FastStart Essential DNA Green Master等试剂。

反应程序为95℃预变性30sec，然后95℃5sec、60℃34sec共40个循环。反应结果应用标准曲线法进行分析获得Ct值。用miR-873引物对测得的Ct值标记为Ct_miR-873，即待测血清中miR-873的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；用U6引物对测得的Ct值标记为Ct_U6，即待测血清中内参基因U6的荧光信息到达设定阈值所经历的循环数；ΔCt＝Ct_miR-873-Ct_U6，，其中，则计算miR-873表达量为2^-ΔCt表示，即(2^-ΔCt＝2^{-(Ct miR-873-Ct U6)})。外周血清中miR-873相对表达量大于0.3221判断为先天性心脏病阳性，小于0.3221为先天性心脏病阴性。

如图5所示；敏感性为88.9％，特异性为60.9％，用MedCalc13.0软件对miR-873在患者和正常对照外周血清中的表达进行了敏感性和特异性分析，表明检测试剂可应用于临床先天性心脏病的筛查。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 东北大学

<120> 一种用于筛查先天性心脏病的生物标志物及试剂盒

<141> 2018-11-27

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> miR-873(miR-873)

<400> 1

gcaggaacuu gugagucucc u 21

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagagga gact 44

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acactccagc tggggcagga acttgtgag 29

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgtcgtgg agtcg 15

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.一种用于制备筛查先天性心脏病试剂盒的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物的序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1互补的序列。

2.如权利要求1所述的生物标记物用于在制备筛查先天性心脏病、临床诊断或产前诊断试剂盒中的应用。

3.一种用于筛查先天性心脏病的试剂盒，其特征在于，其包括反转录引物、miR-873引物对和内参U6引物对，其中，所述反转录引物的序列如SEQ ID NO.2所示或为与SEQ IDNO.2所示互补的序列，所述miR-873引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示或为与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示对应互补的序列，所述内参U6引物对的序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示或为与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示对应互补的序列。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、Taq聚合酶、SYBR。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA聚合酶抑制剂或2×FastStart Essential DNA Green Master。

6.如权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1、提取待测外周血清中的RNA；

S2、对提取的所述RNA利用反转录引物反转录合成cDNA；

S5、计算外周血清中miR-873相对表达量为2^-ΔCt，其中，所述ΔCt＝Ct_miR-873-Ct_U6，

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在步骤S2中，所述反转录的扩增条件为16℃30min；42℃30min；85℃5min。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在步骤S3中，所述miR-873引物对和内参U6引物对在反应体系中各引物的终浓度分别为0.2μmol/L。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录的扩增反应体系为20μl，包括按终浓度表示：1×Buffer，dNTP 0.1～10mmol/L，RNA聚合酶抑制剂2U/μl，反转录酶0.5U/μl，MgCl₂ 5μmol/L，miR-873反转录引物25μg/ml和RNA模板1.0μg；

所述荧光定量PCR扩增的反应体系为20.0μl，包括终浓度为1×SYBR，上下游引物的终浓度各为0.2μmol/L，ROX II，cDNA2.0μl，剩余用水补足20.0μl。

10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在步骤S4中，所述荧光定量扩增PCR扩增程序为：95℃预变性30sec，然后95℃5sec、60℃34sec共40个循环。