CN103333892A

CN103333892A - 针对hpv16e7基因的小干扰rna及其应用

Info

Publication number: CN103333892A
Application number: CN2013102134203A
Authority: CN
Inventors: 汤涛; 东硕; 曹宇; 李珺; 万力; 毕宏伟
Original assignee: TIANJIN BAISIPU BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN BAISIPU BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明涉及用于预防和治疗人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)感染的双链核糖核酸(dsRNA)。所述dsRNA包含具有长度为19-25个核苷酸，并且基本互补于选自HPV16E7基因的至少一部分。本发明也涉及包含所述dsRNA和可药用载体的药物组合物；使用所述dsRNA以及使用所述药物组合物预防及治疗HPV16感染和由HPV16感染引起的疾病的方法；以及应用所述dsRNA以及使用所述药物组合物用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的方法。

Description

针对HPV16E7基因的小干扰RNA及其应用

本申请是申请日为2011年9月27日、申请号为201110288582.4、发明名称为“针对HPV16E7基因的小干扰RNA及其应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)，并涉及其通过RNA干扰(RNAi)作用来预防及治疗人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)感染所引起的相关疾病的用途，其中所述疾病例如宫颈癌、外阴癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症，以及由HPV16所引起的癌前病变和生殖器疣等疾病。

背景技术

1998年，Andrew Z.Fire和Craig C.Mello共同发现了体内RNA干扰的作用机制，并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药物(RNA干扰类药物)的研发开启了一扇大门。此RNA干扰类药物具有作用方式新颖、作用机制明确、靶向性强和副作用小等优点。

人类乳突病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)，属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是一种小型无包膜的病毒颗粒，呈球形，二十面体对称，直径约45-55nm，病毒的核心为双链DNA；病毒衣壳由两种结构蛋白构成的72个壳微粒组成。病毒DNA包含约8000碱基对，其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架(L1和L2)和1个非编码长控区(LCR)。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，单独E7编码的E7蛋白就可以引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。

HPV是世界上最流行的性传染疾病源之一，同时也是一类重要的人类肿瘤病毒。目前已经鉴定超过100种HPV病毒的亚型。HPV各型之间有共同抗原，存在于L1蛋白保守区域，这些抗原具有属特异。依其感染的上皮所在部位：分为皮肤上皮型HPV和粘膜上皮型HPV。

最早确定以及最重要的HPV相关肿瘤是宫颈癌，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490,000例左右的新发病例，其中约130,000发生在中国，每年约有270,000人死于该疾病，约50,000是中国人。随后，更发现外阴癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等恶性肿瘤的发生、发展都与HPV感染相关。迄今发现的100多种HPV亚型中，高致癌的HPV亚型(即高危型HPV)有10多种，包括HPV16、18、31、58等。目前认为，HPV感染对宫颈癌的发生是必要但非充分的。据研究显示，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。

已感染HPV的女性初期症状不明显。通过基于对异常宫颈细胞组织学评估的Pap测试以及基于核酸的PCR及杂交技术可以确定HPV的存在并确定HPV亚型。异常宫颈细胞分级为低度鳞状上皮内病变(LSIL)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)。其中LSIL包括宫颈上皮内瘤变一级(CIN I)的细胞；HSIL包括宫颈上皮内瘤变二级(CIN II)和三级(CIN III)的细胞。

目前用于治疗HPV感染的药物及疗法主要有：1、鬼臼树脂(podophyllin)；2、鬼臼毒素podophyllotoxin(podofilox)；3、三氯乙酸(TCA)/二氯乙酸(BCA)；4、冷冻疗法；5、手术切除；6、干扰素(IFN)；7、咪喹莫特hniquimod[1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo(4，5-quinolin-4-amine)]；8、5-氟尿嘧啶/肾上腺素；9、无环核苷酸类似物Cidofovir(HPMPC：[5]-1-[3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy-propyl]-cytosine)等等。然而，临床上应用的这些抗病毒以及其它抗肿瘤类药物的不但特异性不强，而且副作用大。目前世界上没有一种特异、高效的抑制HPV的药物来降低甚至抑制其相关癌症的发生和发展。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了通过小干扰核酸分子抑制引起细胞良性和恶性增生的HPV E7基因表达，来预防和治疗HPV16感染相关疾病的解决方案。

在本发明的第一方面，提供了小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的制剂中的应用，所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现所述的抑制。在本发明中，所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够抑制HPV16E7基因在细胞中的表达。小干扰核酸的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小干扰核酸的至少一条链具有长度为0至6个核苷酸的3’突出端，优选情况下两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3’突出端。当正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小干扰核酸为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小干扰核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为19至29个核苷酸，可以为19、20、21、23、25、27和29个，优选为19、21、25、27个核苷酸。上述小干扰核酸分子可以被直接导入所述细胞中，也可以是将编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。该人体是患有HPV感染症状的患者，并且所述小干扰核酸分子被施用足够的量以实现对所述症状的治疗，所述HPV感染症状为子宫颈癌或者尖锐湿疣。

本发明第二方面提供了一种分离的HPV16E7基因小分子干扰核酸靶序列，其中所述靶序列为HPV16E7的mRNA(cDNA)上任意连续19-30个核苷酸序列，优选的，所述靶序列为表1中SEQ ID NO：201-270中任意一条序列。

在本发明的第三方面，提供了一种小干扰核酸分子，其指导细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV16E7表达的抑制，优选情况下该小干扰核酸分子包含与表1中SEQ ID NO：201-270中任意一条序列互补的序列。上述小干扰核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸是化学修饰的核苷酸，化学修饰方式选自如下修饰中的至少一种：

(1)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。

本发明所述的小干扰核酸与表达HPV16E7mRNA的细胞接触后可有效降低HPV16E7mRNA的表达量

本发明最后还提供了一种包含上述任一项所述的小干扰核酸分子和药学上可接受的载体的组合物，优选情况下，药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。

本发明的有益效果

本发明提供的针对HPV16E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制HPV16E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV16E7基因表达的药物。

具体实施方式

本发明通过RNA干扰方式沉默能够引起细胞良性和恶性增生的HPV16E7基因表达，来预防和治疗HPV16感染相关疾病这一问题。本发明中HPV16E7基因有时也称为HPV靶基因。

本发明提供的小干扰核酸分子包括具有长度低于30个核苷酸并且基本互补于至少部分HPV靶mRNA转录物的区域的核酸片段(反义片段)。这些小干扰核酸分子的使用可以通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程导致HPV靶基因mRNA被剪切。本发明提供的小干扰核酸分子可以天然的未经修饰的核酸分子，也可以对其中至少一个核苷酸进行化学修饰。根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

(1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4 所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式13所示。

这些修饰可以增加所述小干扰核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进小干扰核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸分子的正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。

通过基于细胞及动物水平的测试，发明人证实这些小干扰核酸分子可以有效地介导RNAi，导致HPV16E7基因表达的显著抑制，并抑制植入瘤体的生长。因此，包含本发明的小干扰核酸分子可以通过靶向HPV靶基因来治疗由HPV感染介导的病理过程。

本发明提供的小干扰核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。

所述小干扰核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海艾博思生物科技有限公司进行合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。

例如，具有HPV16E7si01所示核苷酸序列的siRNA化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成

在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到siRNA的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的siRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的siRNA产物。

(4)脱盐

用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次(每次2毫升)，以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有siRNA的溶液。

本研究发现，将上述siRNA转染细胞后，能够有效抑制细胞及动物异体移植瘤内HPV16E7RNA和蛋白的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：设计HPV E7小干扰核酸序列

HPV E7mRNA序列从美国国立卫生院建设的生物医学网站NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中得到，在siDESIGN Center和DSIR在线设计特异性针对该基因的siRNA序列。通过在线软件定义的选取小干扰核酸分子序列的原则是：主要基于结合有小干扰核酸分子序列和目标序列特征的线性模型。小干扰核酸分子5’末端的高稳定性可能阻断小干扰核酸分子正义链装载入RNA诱导沉默复合体(RISC)；小干扰核酸分子反义链5’末端的低稳定性可能促进小干扰核酸分子反义链装载入RISC；以及小干扰核酸分子中间区域的低稳定性可以促进RISC-小干扰核酸分子复合体释放。

根据上述小干扰核酸分子序列的设计原则，设计出包含正义链和反义链的dsRNA HPV16E7si01～HPV16E7si70的70个针对HPV16E7的小干扰核糖核酸序列(siRNA)(见下表2)，所述小干扰核酸分子在正义链和反义链的3’端包含2个脱氧胸苷酸(T)。所述dsRNA中，HPV16E7si01～HPV16E7si60全长为21bp的带有两个核苷酸3’突出末端的结构，HPV16E7si61～HPV16E7si70全长为27bp的带有两个核苷酸3’突出末端的结构，HPV16E7si71～HPV16E7si80全长为25bp的平末端结构。表2中最后10个dsRNA为对表2中HPV16E7si01～HPV16E7si10修饰的结构，正义链中加粗表示的是经过修饰的核苷酸，ome表示2’-甲氧基修饰，F表示2’-脱氧-2’-氟代修饰，S表示硫代磷酸酯键修饰。

表1.HPV16E7基因靶序列

序列名称	靶序列(5’-3’)	对应序列号
			HPV16E7 01	GATTTGCAACCAGAGACAA	SEQ ID NO：201
HPV16E7 02	GGACAGAGCCCATTACAAT	SEQ ID NO：202
			HPV16E7 03	GCACACACGTAGACATTCG	SEQ ID NO：203
HPV16E7 04	GCTCAGAGGAGGAGGATGA	SEQ ID NO：204
			HPV16E7 05	CAGAGGAGGAGGATGAAAT	SEQ ID NO：205
HPV16E7 06	AGAGGAGGAGGATGAAATA	SEQ ID NO：206
			HPV16E7 07	AGGAGGAGGATGAAATAGA	SEQ ID NO：207
HPV16E7 08	GGATGAAATAGATGGTCCA	SEQ ID NO：208
			HPV16E7 09	CGTACAAAGCACACACGTA	SEQ ID NO：209
HPV16E7 10	GCAATTAAATGACAGCTCA	SEQ ID NO：210
			HPV16E7 11	AGACATTCGTACTTTGGAA	SEQ ID NO：211
HPV16E7 12	GCATGGAGATACACCTACA	SEQ ID NO：212
			HPV16E7 13	CGGACAGAGCCCATTACAA	SEQ ID NO：213
HPV16E7 14	AAGCACACACGTAGACATT	SEQ ID NO：214
			HPV16E7 15	TCTCTACTGTTATGAGCAA	SEQ ID NO：215
HPV16E7 16	TGAAATAGATGGTCCAGCT	SEQ ID NO：216
			HPV16E7 17	AGATTTGCAACCAGAGACA	SEQ ID NO：217
HPV16E7 18	GGAGGAGGATGAAATAGAT	SEQ ID NO：218
			HPV16E7 19	ACACCTACATTGCATGAAT	SEQ ID NO：219
HPV16E7 20	GGACAAGCAGAACCGGACA	SEQ ID NO：220
			HPV16E7 21	GACAGAGCCCATTACAATA	SEQ ID NO：221
HPV16E7 22	CACCTACATTGCATGAATA	SEQ ID NO：222
			HPV16E7 23	TGTTAGATTTGCAACCAGA	SEQ ID NO：223
HPV16E7 24	AGATACACCTACATTGCAT	SEQ ID NO：224
			HPV16E7 25	GTACAAAGCACACACGTAG	SEQ ID NO：225
HPV16E7 26	CTTTGGAAGACCTGTTAAT	SEQ ID NO：226
			HPV16E7 27	TCTACTGTTATGAGCAATT	SEQ ID NO：227
HPV16E7 28	AAGCAGAACCGGACAGAGC	SEQ ID NO：228
			HPV16E7 29	GTTAATGGGCACACTAGGA	SEQ ID NO：229

[0053]

HPV16E7 30	GGAGGATGAAATAGATGGT	SEQ ID NO：230
			HPV16E7 31	AATGGGCACACTAGGAATT	SEQ ID NO：231
HPV16E7 32	ATGACAGCTCAGAGGAGGA	SEQ ID NO：232
			HPV16E7 33	TCAGAGGAGGAGGATGAAA	SEQ ID NO：233
HPV16E7 34	AGGATGAAATAGATGGTCC	SEQ ID NO：234
			HPV16E7 35	CCTACATTGCATGAATATA	SEQ ID NO：235
HPV16E7 36	ACAGAGCCCATTACAATAT	SEQ ID NO：236
			HPV16E7 37	ACACGTAGACATTCGTACT	SEQ ID NO：237
HPV16E7 38	GTACTTTGGAAGACCTGTT	SEQ ID NO：238
			HPV16E7 39	CCTGTTAATGGGCACACTA	SEQ ID NO：239
HPV16E7 40	CTACTGTTATGAGCAATTA	SEQ ID NO：240
			HPV16E7 41	ACAGCTCAGAGGAGGAGGA	SEQ ID NO：241
HPV16E7 42	GGAGATACACCTACATTGC	SEQ ID NO：242
			HPV16E7 43	ACATTCGTACTTTGGAAGA	SEQ ID NO：243
HPV16E7 44	TTAATGGGCACACTAGGAA	SEQ ID NO：244
			HPV16E7 45	TAATGGGCACACTAGGAAT	SEQ ID NO：245
HPV16E7 46	CAACCAGAGACAACTGATC	SEQ ID NO：246
			HPV16E7 47	ACGTAGACATTCGTACTTT	SEQ ID NO：247
HPV16E7 48	ACCTACATTGCATGAATAT	SEQ ID NO：248
			HPV16E7 49	GAGGAGGATGAAATAGATG	SEQ ID NO：249
HPV16E7 50	CAATTAAATGACAGCTCAG	SEQ ID NO：250
			HPV16E7 51	AGAACCGGACAGAGCCCAT	SEQ ID NO：251
HPV16E7 52	GCATGAATATATGTTAGAT	SEQ ID NO：252
			HPV16E7 53	CAGAGACAACTGATCTCTA	SEQ ID NO：253
HPV16E7 54	CAACTGATCTCTACTGTTA	SEQ ID NO：254
			HPV16E7 55	ACTGTTATGAGCAATTAAA	SEQ ID NO：255
HPV16E7 56	AGATGGTCCAGCTGGACAA	SEQ ID NO：256
			HPV16E7 57	GCCCATTACAATATTGTAA	SEQ ID NO：257
HPV16E7 58	TGTTGCAAGTGTGACTCTA	SEQ ID NO：258
			HPV16E7 59	GCTTCGGTTGTGCGTACAA	SEQ ID NO：259

[0054]

HPV16E7 60	CGGTTGTGCGTACAAAGCA	SEQ ID NO：260
			HPV16E7 61	CAGAACCGGACAGAGCCCATTACAA	SEQ ID NO：261
HPV16E7 62	GAACCGGACAGAGCCCATTACAATA	SEQ ID NO：262
			HPV16E7 63	GGACAGAGCCCATTACAATATTGTA	SEQ ID NO：263
HPV16E7 64	GCGTACAAAGCACACACGTAGACAT	SEQ ID NO：264
			HPV16E7 65	CAAAGCACACACGTAGACATTCGTA	SEQ ID NO：265
HPV16E7 66	CACACACGTAGACATTCGTACTTTG	SEQ ID NO：266
			HPV16E7 67	CATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTA	SEQ ID NO：267
HPV16E7 68	GGAAGACCTGTTAATGGGCACACTA	SEQ ID NO：268
			HPV16E7 69	GAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG	SEQ ID NO：269
HPV16E7 70	GACCTGTTAATGGGCACACTAGGAA	SEQ ID NO：270

[0055]

实施例二：体外验证所述dsRNA序列抑制HPV E7表达的效率

(一)细胞培养

人宫颈癌细胞系(SiHa，ATCC)应用含有1％的青霉素-链霉素-新霉素(PSN，Gibco)抗生素合剂和10％小牛血清(FBS，Gibco)的MEM培养基(Gibco)，在37℃、5％二氧化碳和95％空气湿度的细胞培养箱中培养。

(二)细胞转染

(1)转染前一天，SiHa细胞在不包含抗生素的培养基中接种，至转染时细胞的汇合度为30～50％。

(2)制备转染样品：

分别将1μl浓度为20μM的siRNA(见表2)和0.5μl细胞转染试剂Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)稀释于0.05ml Opti-MEM(Invitogen)，轻轻混匀，孵育5分钟。轻轻混匀，孵育5分钟。

以无意义对照siRNA(其正义链包含：5-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3；反义链包含：5-ACgUgACACgUUCggAgAA-3)和细胞转染试剂Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)进行转染，作为正常对照组(NC组)。

取稀释的siRNA组和NC组，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，形成siRNA-Lipofectamine2000(Invitrogen)复合物和无意义siRNA-Lipofectamine2000(Invitrogen)复合物。孵育时间不超过30分钟，更长的孵育时间可能会降低活性。

将siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，通过轻轻地前后摇动培养板混合，在37℃，CO₂培养箱孵育24～96小时，直到适合进行基因阻断分析。不需要去除复合物或者改换培养基。然而，在转染后4～6小时改换培养基也不会损失转染的活性。

表3给出了通过各种组织培养方式转染细胞时使用试剂的优选的量和体积。

表3转染细胞时使用试剂的量和体积

(三)总RNA提取、反转录和实时定量PCR检测基因表达

转染过后48小时，收集细胞。培养的细胞用QIAGEN公司的RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN，Cat.No.74106)来进行细胞RNA的抽提。吸出细胞培养液，用含有0.1～0.25％胰蛋白酶的PBS冲洗细胞，然后加入含有血清的培养基激活胰蛋白酶，将细胞转移至RNase-free离心管，300×g离心5分钟。离心后，加入350μl RLT缓冲液溶解细胞，混合均匀，8000×g(10000rpm)离心5分钟，弃去上清液，加入70％体积的乙醇混匀，转移至RNeasy旋转柱膜上，8000×g(10000rpm)离心15秒，缓冲液RW1冲洗RNeasy旋转柱膜。加入RNase-free water，8000×g(10000rpm)离心1分钟，即提取得到总RNA。用分光光度计测定RNA纯度。1个单位的吸收值相当于0.04μg/μl RNA。

将1μg抽提的RNA反转录成cDNA。将提取的RNA用DEPC水吹起，加入50ng/μl随机引物1μl，加入1mM dNTP1μl，放入65℃水浴5min，快速冰浴。离心，收集沉淀，加入4μl5×First-Stand缓冲液，2μl0.1M DTT和1μl RNaseOUT^TM(40单位/μl)，混匀，加入1μl(200单位)SuperScript^TM IIRT。42℃水浴50分钟，然后70℃水浴15分钟。

以此cDNA为模板进行实时定量多聚酶链式反应(Real time PCR)来定量检测HPV16E7mRNA的表达水平。首先采用SDS2.1软件相对标准曲线法计算mRNA表达水平，从相应的曲线中确定周期阈值(Ct)，周期阈值反映每个目标基因的相对表达水平。然后，通过细胞内参照基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，简写为GAPDH)对照划分目标量获得常态目标值，从而确定mRNA的相对表达水平。

实验中用到的引物序列：

HPV16E7上游引物：5’-CGGACAGAGCCCATTACAATATT-3’

HPV16E7下游引物：5’-CGCACAACCGAAGCGTAGA-3’

人GAPDH上游引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’

人GAPDH下游引物：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’

计算所siRNA抑制基因表达的效率可通过下述公式计算：

公式中“处理细胞”是指分别转染表1中siRNA的细胞，“对照细胞”是指转染无意义对照siRNA的细胞，“相对表达值”是指细胞中HPV E7mRNA与GAPDH mRNA的比值。

表4显示转染48小时后所述siRNA的抑制HPV E7mRNA表达的效率。

表4siRNA对HPV E7mRNA表达的抑制效率

双链名称	抑制效率	标准差
			HPV16E7si01	95.8％	2.3％
HPV16E7si02	93.1％	3.3％
			HPV16E7si03	97.5％	1.5％
HPV16E7si04	90.2％	3.4％
			HPV16E7si05	83.1％	3.2％
HPV16E7si06	88.2％	4.1％
			HPV16E7si07	60.3％	2.6％
HPV16E7si08	77.9％	6.3％
			HPV16E7si09	40.5％	9.3％
HPV16E7si10	91.4％	1.2％
			HPV16E7si11	84.2％	3.9％
HPV16E7si12	79.6％	8.4％
			HPV16E7si13	77.9％	5.3％
HPV16E7si14	86.6％	5.2％
			HPV16E7si15	91.5％	2.1％
HPV16E7si16	50.2％	10.4％
			HPV16E7si17	60.6％	4.3％
HPV16E7si18	79.3％	8.1％

[0090]

HPV16E7si19	82.5％	7.5％
			HPV16E7si20	89.8％	3.0％
HPV16E7si21	70.1％	4.3％
			HPV16E7si22	82.0％	7.2％
HPV16E7si23	63.7％	7.9％
			HPV16E7si24	65.9％	5.4％
HPV16E7si25	91.5％	2.4％
			HPV16E7si26	76.7％	12.3％
HPV16E7si27	82.7％	8.6％
			HPV16E7si28	54.6％	7.5％
HPV16E7si29	90.1％	2.2％
			HPV16E7si30	77.2％	3.4％
HPV16E7si31	81.2％	7.1％
			HPV16E7si32	84.7％	3.6％
HPV16E7si33	68.9％	6.6％
			HPV16E7si34	73.3％	7.9％
HPV16E7si35	73.5％	4.3％
			HPV16E7si36	84.8％	7.2％
HPV16E7si37	78.2％	4.5％
			HPV16E7si38	79.3％	4.1％
HPV16E7si39	67.5％	7.8％
			HPV16E7si40	49.2％	8.6％
HPV16E7si41	78.4％	8.7％
			HPV16E7si42	87.6％	3.1％
HPV16E7si43	74.4％	9.8％
			HPV16E7si44	85.5％	3.6％
HPV16E7si45	91.0％	2.3％
			HPV16E7si46	53.9％	10.9％
HPV16E7si47	82.7％	4.7％
			HPV16E7si48	75.3％	5.1％

HPV16E7si49	77.7％	6.1％
			HPV16E7si50	84.5％	3.8％
HPV16E7si51	62.8％	7.5％
			HPV16E7si52	78.3％	7.2％
HPV16E7si53	74.5％	6.2％
			HPV16E7si54	86.2％	4.3％
HPV16E7si55	79.6％	5.1％
			HPV16E7si56	86.3％	5.8％
HPV16E7si57	77.1％	9.1％
			HPV16E7si58	89.5％	1.8％
HPV16E7si59	51.3％	7.8％
			HPV16E7si60	72.6％	7.9％
HPV16E7si61	96.3％	1.4％
			HPV16E7si62	92.5％	2.1％
HPV16E7si63	94.5％	3.6％
			HPV16E7si64	91.7％	2.5％
HPV16E7si65	85.6％	1.9％
			HPV16E7si66	87.3％	4.2％
HPV16E7si67	91.2％	2.2％
			HPV16E7si68	90.1％	2.1％
HPV16E7si69	80.9％	6.9％
			HPV16E7si70	77.6％	8.7％
HPV16E7si71	96.6％	4.2％
			HPV16E7si72	92.8％	7.6％
HPV16E7si73	87.4％	5.3％
			HPV16E7si74	91.2％	6.9％
HPV16E7si75	79.5％	6.2％
			HPV16E7si76	88.3％	7.9％
HPV16E7si77	95.7％	4.4％
			HPV16E7si78	79.6％	8.3％

[0091]

HPV16E7si79	88.2％	6.4％
			HPV16E7si80	76.1％	8.5％
HPV16E7si01ome	93.7％	4.8％
			HPV16E7si02F	96.2％	6.7％
HPV16E7si03ome	94.4％	2.9％
			HPV16E7si04ome	84.3％	8.3％
HPV16E7si05ome	79.8％	4.6％
			HPV16E7si06S	88.7％	7.2％
HPV16E7si07S	72.5％	6.3％
			HPV16E7si08F	82.6％	5.7％
HPV16E7si09S	47.9％	5.2％
			HPV16E7si10ome	84.2％	7.3％

实施例三对E7的蛋白的抑制

一、样品处理

按照实施例一所述方法转染细胞72小时后离心收集细胞，细胞样品加50～100ul裂解液(配方：50mM Tris-base，1.0mM EDTA，150mM NaCl，0.1％SDS，1％TritonX-100，1％sodium deoxycholate(去氧胆酸钠)，1％PMSF)，悬浮，超声后20,000g离心30min，取上清。

根据样品浓度，等质量上样。

二、SDS-PAGE蛋白质电泳

1、配分离胶

i)胶板清洗，双蒸水冲洗，无水乙醇脱水，吹风机吹干上架，玻璃下沿封上透明胶防漏；

ii)加入夹板，至梳齿下端1cm左右；

iii分离胶上加约100ul正丁醇压住，晃动使胶面平整；

iv)约90min后，用水及双蒸水冲去正丁醇，滤纸吸干。

2、配浓缩胶

i)加入夹板后，立即插入梳子(注意：不能有气泡)

3、电泳

i)浓缩胶凝固约10min后，放入电泳槽，加Gly电泳缓冲液检查封闭性；

ii)拔梳齿，微量注射器上样(总体积小于20ul)；

iii)加缓冲液使外围淹过电泳铂金丝；

iv)恒流10mA/块胶60分钟；20mA/块胶2小时，以刚跑出胶为宜；

v)电泳结束后，撬开胶板；

vi)去上层胶，在Marker边切去一角作记号。

三、转膜

i)配制新鲜的转膜液，4℃预冷；

ii)SDS-PAGE电泳后取下胶，在双蒸水中漂洗五分钟；

iii)剪适当大小PVDF膜1张和稍大的滤纸2张，PVDF膜用甲醇浸润；

iv)滤纸、棉花、胶浸入转膜液中10-20min，(胶浓度低多浸会)；

v)从阴极(一)开始，依次放棉花、滤纸、胶、膜、滤纸、棉花，到阳极(+)；

vi)加入冰盒，在一盆冰里，4℃冰箱里转膜；

vii)转膜条件：250mA，2h。

四、封闭

i)膜放入杂交袋(正面向上，下同)，加适量封闭液(5％脱脂牛奶)液，预杂交1～2hr。

五、一抗孵育

i)封闭液中1∶100加入一抗(鼠抗人HPV16E7单克隆抗体，购自Abcam)，杂交过夜；

ii)TBST预洗1min，再洗3次，每次5min。

六、二抗孵育

i)封闭液中1∶10000加入二抗(羊抗鼠，购自Abcam)，杂交1h；

ii)TBST预洗1min，再洗3次，每次5min。

七、显影

i)加A、B显色液1∶1，每cm2加80ul，封膜显色5min

ii)膜置于处片架中，X光片曝光30s-5min

iii)显影1min，清水漂30s，定影1min，清水漂30s

八、灰度分析

胶片扫描后通过Gel Pro Analyzer4.0软件分析转染siRNA后HPV E7蛋白的表达量，并计算相应siRNA的干扰效率，结果如表4所示。

表5显示转染72小时后所述siRNA的抑制HPV E7蛋白表达的效率。

表5siRNA对HPV E7蛋白表达的抑制效率

双链名称	抑制效率	标准差
			HPV16E7si01	91.8％	1.5％
HPV16E7si02	85.2％	4.5％
			HPV16E7si03	92.6％	2.3％
HPV16E7si04	87.3％	4.4％
			RPV16E7si05	80.2％	3.6％
HPV16E7si06	80.1％	4.5％
			HPV16E7si07	50.3％	7.6％

[0139]

HPV16E7si08	69.7％	5.3％
			HPV16E7si09	20.5％	10.8％
HPV16E7si10	87.1％	5.2％
			HPV16E7si11	80.2％	4.8％
HPV16E7si12	70.5％	7.5％
			HPV16E7si13	67.6％	6.8％
HPV16E7si14	81.5％	6.2％
			HPV16E7si15	88.5％	4.3％
HPV16E7si16	35.9％	11.6％
			HPV16E7si17	50.0％	6.1％
HPV16E7si18	71.2％	7.3％
			HPV16E7si19	77.6％	7.5％
HPV16E7si20	81.7％	3.8％
			HPV16E7si21	60.9％	4.9％
HPV16E7si22	75.2％	6.2％
			HPV16E7si23	49.6％	6.9％
HPV16E7si24	40.8％	3.4％
			HPV16E7si25	80.4％	7.7％
HPV16E7si26	68.5％	9.3％
			HPV16E7si27	73.8％	9.5％
HPV16E7si28	30.6％	8.8％
			HPV16E7si29	80.6％	5.2％
HPV16E7si30	60.2％	4.4％
			HPV16E7si31	68.5％	7.9％
HPV16E7si32	77.6％	4.7％
			HPV16E7si33	50.8％	10.7％
HPV16E7si34	54.2％	12.7％
			HPV16E7si35	60.7％	13.1％
HPV16E7si36	72.6％	6.4％
			HPV16E7si37	57.7％	9.5％

[0140]

HPV16E7si38	59.0％	8.1％
			HPV16E7si39	43.5％	6.3％
HPV16E7si40	26.8％	13.8％
			HPV16E7si41	65.2％	8.5％
HPV16E7si42	69.7％	12.1％
			HPV16E7si43	57.7％	10.8％
HPV16E7si44	74.5％	8.5％
			HPV16E7si45	78.0％	7.3％
HPV16E7si46	41.2％	12.9％
			HPV16E7si47	78.4％	7.3％
HPV16E7si48	76.3％	12.2％
			HPV16E7si49	62.7％	7.3％
HPV16E7si50	75.2％	8.2％
			HPV16E7si51	32.8％	9.4％
HPV16E7si52	61.2％	10.2％
			HPV16E7si53	71.3％	9.1％
HPV16E7si54	60.5％	8.5％
			HPV16E7si55	70.3％	7.1％
HPV16E7si56	50.8％	18.9％
			HPV16E7si57	66.2％	9.2％
HPV16E7si58	80.2％	9.4％
			HPV16E7si59	49.3％	6.6％
HPV16E7si60	50.5％	10.7％
			HPV16E7si61	91.5％	3.1％
HPV16E7si62	87.8％	5.3％
			HPV16E7si63	89.5％	2.7％
HPV16E7si64	70.7％	9.7％
			HPV16E7si65	73.5％	7.6％
HPV16E7si66	80.3％	6.3％
			HPV16E7si67	78.6％	7.8％

[0141]

HPV16E7si68	80.2％	5.1％
			HPV16E7si69	69.7％	7.9％
HPV16E7si70	50.8％	11.2％
			HPV16E7si71	83.6％	5.2％
HPV16E7si72	82.5％	6.7％
			HPV16E7si73	92.4％	6.8％
HPV16E7si74	86.4％	9.2％
			HPV16E7si75	66.7％	4.8％
HPV16E7si76	68.5％	8.9％
			HPV16E7si77	76.2％	7.4％
HPV16E7si78	69.6％	7.3％
			HPV16E7si79	90.3％	8.2％
HPV16E7si80	66.9％	5.8％
			HPV16E7si01ome	89.7％	8.4％
HPV16E7si02F	90.6％	7.3％
			HPV16E7si03ome	82.9％	7.9％
HPV16E7si04ome	75.8％	6.2％
			HPV16E7si05ome	63.3％	8.6％
HPV16E7si06S	91.7％	6.9％
			HPV16E7si07S	80.5％	8.3％
HPV16E7si08F	67.7％	6.8％
			HPV16E7si09S	50.3％	9.6％
HPV16E7si10ome	86.3％	8.1％

实施例四：小鼠体内实验验证所述siRNA序列抑制能够表达HPV16E7的植入宫颈癌细胞的生长

将分别转染HPV16E7si01、HPV16E7si0、HPV16E7si03和无意义dsRNA宫颈癌细胞(SiHa)注射到6周大C57BL/6雌性小鼠背部皮下荷瘤，每个小鼠注射2×10⁷个细胞。3周后分析不同dsRNA对小鼠体内靶基因mRNA表达的静默作用以及瘤体重量。实验结果如下表6显示，3种体外高效抑制HPV E7表达的dsRNA在小鼠体内也能高效抑制HPV E7的表达，并能抑制植入瘤体的生长。

表6siRNA对小鼠肿瘤生长的抑制效率