CN105441446A - 针对hpv18e7基因的小干扰rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了针对HPV18E7基因的小干扰RNA及其应用，针对HPV18E7基因的小干扰RNA，该小干扰RNA分子的靶序列分离自HPV18E7基因，其中所述靶序列为SEQ？ID？NO:8所示的序列。本发明提供的针对HPV18E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制HPV18E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV18E7基因表达的药物。

Description

针对HPV18E7基因的小干扰RNA及其应用

技术领域

本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)，并涉及其通过RNA干扰(RNAi)作用来预防及治疗人乳头瘤病毒18亚型(HPV18)感染所引起的相关疾病的用途，其中所述疾病例如宫颈癌、外阴癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症，以及由HPV16所引起的癌前病变和生殖器疣等疾病。

背景技术

1998年，AndrewZ.Fire和CraigC.Mello共同发现了体内RNA干扰的作用机制，并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药物(RNA干扰类药物)的研发开启了一扇大门。此RNA干扰类药物具有作用方式新颖、作用机制明确、靶向性强和副作用小等优点。

人类乳突病毒(HumanPapillomavirus，简称HPV)，属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是一种小型无包膜的病毒颗粒，呈球形，二十面体对称，直径约45—55nm，病毒的核心为双链DNA；病毒衣壳由两种结构蛋白构成的72个壳微粒组成。病毒DNA包含约8000碱基对，其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架(L1和L2)和1个非编码长控区(LCR)。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，单独E7编码的E7蛋白就可以引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。

HPV是世界上最流行的性传染疾病源之一，同时也是一类重要的人类肿瘤病毒。目前已经鉴定超过100种HPV病毒的亚型。HPV各型之间有共同抗原，存在于L1蛋白保守区域，这些抗原具有属特异。依其感染的上皮所在部位：分为皮肤上皮型HPV和粘膜上皮型HPV。

最早确定以及最重要的HPV相关肿瘤是宫颈癌，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490,000例左右的新发病例，其中约130,000发生在中国，每年约有270,000人死于该疾病，约50,000是中国人。随后，更发现外阴癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等恶性肿瘤的发生、发展都与HPV感染相关。迄今发现的100多种HPV亚型中，高致癌的HPV亚型(即高危型HPV)有10多种，包括HPV16、18、31、52、58等。目前认为，HPV感染对宫颈癌的发生是必要但非充分的。据研究显示，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。

已感染HPV的女性初期症状不明显。通过基于对异常宫颈细胞组织学评估的Pap测试以及基于核酸的PCR及杂交技术可以确定HPV的存在并确定HPV亚型。异常宫颈细胞分级为低度鳞状上皮内病变(LSIL)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)。其中LSIL包括宫颈上皮内瘤变一级(CINI)的细胞；HSIL包括宫颈上皮内瘤变二级(CINII)和三级(CINIII)的细胞。

目前用于治疗HPV感染的药物及疗法主要有：1、鬼臼树脂(podophyllin)；2、鬼臼毒素podophyllotoxin(podofilox)；3、三氯乙酸(TCA)/二氯乙酸(BCA)；4、冷冻疗法；5、手术切除；6、干扰素(IFN)；7、咪喹莫特hniquimod[1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo(4，5-quinolin-4-amine)]；8、5-氟尿嘧啶/肾上腺素；9、无环核苷酸类似物Cidofovir(HPMPC：[5]-1-[3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy-propyl]-cytosine)等等。然而，临床上应用的这些抗病毒以及其它抗肿瘤类药物的不但特异性不强，而且副作用大。目前世界上没有一种特异、高效的抑制HPV的药物来降低甚至抑制其相关癌症的发生和发展。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对HPV18E7基因的小干扰RNA。

本发明的第二个目的是提供包括针对HPV18E7基因的小干扰RNA的组合物。

本发明的第三个目的是提供针对HPV18E7基因的小干扰RNA的用途。

本发明的技术方案概述如下：

针对HPV18E7基因的小干扰RNA，该小干扰RNA分子的靶序列分离自HPV18E7基因，其中所述靶序列为SEQIDNO:8所示的序列。

所述小干扰RNA指导细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7基因表达的抑制，该小干扰RNA分子包含与SEQIDNO:8所示的序列互补的序列，正义链为SEQIDNO:25所示的序列，反义链为SEQIDNO:26所示的序列。

所述小干扰RNA中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

(1)连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)核糖的2'-OH的修饰；

(3)碱基的修饰。

一种包含上述针对HPV18E7基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体组成的组合物。

所述药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。

针对HPV18E7基因的小干扰RNA在制备抗癌药物中的应用。

为解决上述问题，本发明提供了通过小干扰核酸分子抑制引起细胞良性和恶性增生的HPV18E7基因表达，来预防和治疗HPV18感染相关疾病的解决方案。

在本发明的第一方面，提供了小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV18E7基因在细胞中表达的制剂中的应用，所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现所述的抑制。在本发明中，所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够抑制HPV18E7基因在细胞中的表达。小干扰核酸的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小干扰核酸的至少一条链具有长度为0至6个核苷酸的3’突出端，优选情况下两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3’突出端。当正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小干扰核酸为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小干扰核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为19至29个核苷酸，可以为19、20、21、23、25、27和29个，优选为19、21、25、27个核苷酸。上述小干扰核酸分子可以被直接导入所述细胞中，也可以是将编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。该人体是患有HPV感染症状的患者，并且所述小干扰核酸分子被施用足够的量以实现对所述症状的治疗，所述HPV感染症状为子宫颈癌或者尖锐湿疣。

本发明第二方面提供了一种分离的HPV18E7基因小分子干扰核酸靶序列，其中所述靶序列为HPV18E7的mRNA(cDNA)上任意连续19-30个核苷酸序列，优选的，所述靶序列为表1中SEQIDNO：1-10中任意一条序列。

在本发明的第三方面，提供了一种小干扰核酸分子，其指导细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7表达的抑制，优选情况下该小干扰核酸分子包含与表1中SEQIDNO：1-10中任意一条序列互补的序列。上述小干扰核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸是化学修饰的核苷酸，化学修饰方式选自如下修饰中的至少一种：

(1)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。

本发明所述的小干扰核酸与表达HPV18E7mRNA的细胞接触后可有效降低HPV18E7mRNA的表达量

本发明最后还提供了一种包含上述任一项所述的小干扰核酸分子和药学上可接受的载体的组合物，优选情况下，药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。

本发明的有益效果

本发明提供的针对HPV18E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制HPV18E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV18E7基因表达的药物。

具体实施方式

本发明通过RNA干扰方式沉默能够引起细胞良性和恶性增生的HPV18E7基因表达，来预防和治疗HPV18感染相关疾病这一问题。本发明中HPV18E7基因有时也称为HPV靶基因。

本发明提供的小干扰核酸分子包括具有长度低于30个核苷酸并且基本互补于至少部分HPV靶mRNA转录物的区域的核酸片段(反义片段)。这些小干扰核酸分子的使用可以通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程导致HPV靶基因mRNA被剪切。本发明提供的小干扰核酸分子可以天然的未经修饰的核酸分子，也可以对其中至少一个核苷酸进行化学修饰。根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

(1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2,4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2,6－二氨基嘌呤修饰，如式13所示。

这些修饰可以增加所述小干扰核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进小干扰核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸分子的正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。

通过基于细胞及动物水平的测试，发明人证实这些小干扰核酸分子可以有效地介导RNAi，导致HPV18E7基因表达的显著抑制，并抑制植入瘤体的生长。因此，包含本发明的小干扰核酸分子可以通过靶向HPV靶基因来治疗由HPV感染介导的病理过程。

本发明提供的小干扰核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。

所述小干扰核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海艾博思生物科技有限公司进行合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。

例如，具有HPV18E7si01所示核苷酸序列的siRNA化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成

在自动DNA/RNA合成仪(例如，AppliedBiosystemsEXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1：3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到siRNA的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的siRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的siRNA产物。

(4)脱盐

用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次(每次2毫升)，以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mMTris，pH＝7.5-8.0，50mMNaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有siRNA的溶液。

本研究发现，将上述siRNA转染细胞后，能够有效抑制细胞及动物异体移植瘤内HPV16E6RNA和蛋白的表达。

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：设计HPV18E7小干扰核酸序列

HPV18E7mRNA序列从美国国立卫生院建设的生物医学网站NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中得到，在siDESIGNCenter和DSIR在线设计特异性针对该基因的siRNA序列。通过在线软件定义的选取小干扰核酸分子序列的原则是：主要基于结合有小干扰核酸分子序列和目标序列特征的线性模型。小干扰核酸分子5’末端的高稳定性可能阻断小干扰核酸分子正义链装载入RNA诱导沉默复合体(RISC)；小干扰核酸分子反义链5’末端的低稳定性可能促进小干扰核酸分子反义链装载入RISC；以及小干扰核酸分子中间区域的低稳定性可以促进RISC-小干扰核酸分子复合体释放。

根据上述小干扰核酸分子序列的设计原则，设计出包含正义链和反义链的dsRNAHPV18E7si01～HPV18E7si10的10个针对HPV18E7的小干扰核糖核酸序列(siRNA)(见下表2)，所述小干扰核酸分子在正义链和反义链的3’端包含2个脱氧胸苷酸(T)。所述dsRNA中，HPV18E7si01～HPV18E7si10全长为21bp的带有两个核苷酸3’突出末端的结构。正义链中加粗表示的是经过2’-甲氧基修饰的核苷酸。

表1.HPV18E7基因靶序列

序列名称	靶序列(5’-3’)	对应序列号
			HPV18E701	CGGTTGACCTTCTATGTCA	SEQ ID NO:1
HPV18E702	GTCACGAGCAATTAAGCGA	SEQ ID NO:2
			HPV18E703	ATGAAATTCCGGTTGACCT	SEQ ID NO:3
HPV18E704	TGTCACGAGCAATTAAGCG	SEQ ID NO:4
			HPV18E705	GAATTGAGCTAGTAGTAGA	SEQ ID NO:5
HPV18E706	CTATGTCACGAGCAATTAA	SEQ ID NO:6
			HPV18E707	GGTGTGCATCCCAGCAGTA	SEQ ID NO:7
HPV18E708	GAACCACAACGTCACACAA	SEQ ID NO:8
			HPV18E709	GCAAGACATTGTATTGCAT	SEQ ID NO:9
HPV18E710	GCAATTAAGCGACTCAGAG	SEQ ID NO:10

表2HPV18E7小干扰核糖核酸序列

实施例2：体外验证所述dsRNA序列抑制HPV18E7表达的效率

(一)细胞培养

人宫颈癌细胞系(HeLa，ATCC)应用含有1％的青霉素-链霉素(PS，Gibco)抗生素合剂和10％小牛血清(FBS，Gibco)的MEM培养基(Gibco)，在37℃、5％二氧化碳和95％空气湿度的细胞培养箱中培养。

(二)细胞转染

(1)转染前一天，HeLa细胞在培养基中接种，至转染时细胞的汇合度为30～50％。

(2)制备转染样品：

分别将1μl浓度为20μM的siRNA(见表1)和0.5μl细胞转染试剂Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)稀释于0.05mlOpti-MEM(Invitogen)，轻轻混匀，孵育5分钟。轻轻混匀，孵育5分钟。

以无意义对照siRNA(其正义链包含：5-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3；反义链包含:5-ACgUgACACgUUCggAgAA-3)和细胞转染试剂Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)进行转染，作为正常对照组(NC组)。

取稀释的siRNA组和NC组，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，形成siRNA-Lipofectamine2000(Invitrogen)复合物和无意义siRNA-Lipofectamine2000(Invitrogen)复合物。孵育时间不超过30分钟，更长的孵育时间可能会降低活性。

将siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，通过轻轻地前后摇动培养板混合，在37℃，CO2培养箱孵育24小时。不需要去除复合物或者改换培养基。然而，在转染后4～6小时改换培养基也不会损失转染的活性。

表3给出了通过各种组织培养方式转染细胞时使用试剂的优选的量和体积。

表3转染细胞时使用试剂的量和体积

(三)总RNA提取、反转录和实时定量PCR检测基因表达

转染过后24小时，收集细胞。培养的细胞用TAKARA公司的RNA抽提试剂(RNAisoPlus,TAKARA,Cat.No.9108)来进行细胞RNA的抽提。吸出细胞培养液,用1×PBS清洗一次。每10cm2生长的培养细胞中加入1-2ml的RNAisoPlus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面。将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温(15-30℃)静置5分钟，然后从核蛋白中分离RNA。向匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5分钟，12,000g4℃离心15分钟。从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。12,000g4℃离心10分钟。弃去上清,加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500×g4℃离心5分钟后小心弃去上清,打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

将100ng抽提的RNA用TAKARA公司的PrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)(Cat.No.RR036A)反转录成cDNA。将提取的RNA用DEPC水吹起(共8μl)，加入2μl5×PrimeScriptRTMasterMix(含有PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer),放入37℃水浴15分钟，85℃水浴5秒,然后快速冰浴。

以此cDNA为模板进行实时定量多聚酶链式反应(RealtimePCR)来定量检测HPV18E7mRNA的表达水平。首先采用SDS2.1软件相对标准曲线法计算mRNA表达水平，从相应的曲线中确定周期阈值(Ct)，周期阈值反映每个目标基因的相对表达水平。然后，通过细胞内参照基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，简写为GAPDH)对照划分目标量获得常态目标值，从而确定mRNA的相对表达水平。

实验中用到的引物序列：

HPV18E7上游引物：5-ATTCCGGTTGACCTTCTATG-3

HPV18E7下游引物：5-TCGGGCTGGTAAATGTTGAT-3

GAPDH上游引物：5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3

GAPDH下游引物：5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3

计算所siRNA抑制基因表达的效率可通过下述公式计算：

公式中“处理细胞”是指分别转染表1中siRNA的细胞，“对照细胞”是指转染无意义对照siRNA的细胞，“相对表达值”是指细胞中HPVE7mRNA与GAPDHmRNA的比值。

表4显示转染24小时后所述siRNA的抑制HPVE7mRNA表达的效率。

表4siRNA对HPV18E7mRNA表达的抑制效率

双链名称	抑制效率	标准差
			HPV18E7si01	67.7％	7.8％
HPV18E7si02	72.7％	7.1％
			HPV18E7si03	80.6％	1.6％
HPV18E7si04	64.9％	10.8％
			HPV18E7si05	69.1％	6.4％
HPV18E7si06	65.7％	9.4％
			HPV18E7si07	65.9％	1.9％
HPV18E7si08	79.7％	4.6％
			HPV18E7si09	69.9％	8.3％
HPV18E7si10	73.1％	6.8％

实施例3：体外验证所述dsRNA序列抑制人宫颈癌细胞系HeLa的增殖

(一)细胞培养

同上

(二)细胞转染

同上

(三)四唑盐(MTT)测定细胞抑制率

每孔加1/10培养基体积的MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4小时。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μlDMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。按下式计算细胞抑制率：细胞抑制率＝(1－处理组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。实验结果如下表5显示，

表5siRNA对宫颈癌细胞系(HeLa)生长抑制率

双链名称	抑制效率	标准差
			HPV18E7si01	9.2％	8.7％
HPV18E7si02	22.6％	3.8％

HPV18E7si03	15.2％	4.4％
			HPV18E7si04	9.9％	4.2％
HPV18E7si05	7.1％	9.9％
			HPV18E7si06	8.3％	5.2％
HPV18E7si07	8.0％	6.0％
			HPV18E7si08	42.2％	6.7％
HPV18E7si09	11.5％	5.7％
			HPV18E7si10	8.3％	6.5％

实施例4：小鼠体内实验验证注射所述siRNA序列能够抑制植入宫颈癌细胞的生长

将宫颈癌细胞(HeLa)注射到6周大BALB/c雌性裸鼠背部皮下荷瘤，每个小鼠注射2x10⁶个细胞。荷瘤后第14天在瘤上用微针注射HPV18E7si08和无意义dsRNA，每隔三天注射一次，每次注射5μlsiRNA溶液(10μg/μl)。荷瘤后第23天分析瘤体重量。实验结果如下表6显示，HPV18E7si08dsRNA能抑制植入瘤体的生长。

表6HPV18E7si08抑制植入瘤体的生长

双链名称	瘤体重量	标准差
			HPV18E7si08	0.143g	0.022g
无意义dsRNA	0.236g	0.036g

Claims (6)

1.针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征在于该小干扰RNA分子的靶序列分离自HPV18E7基因，其中所述靶序列为SEQIDNO:8所示的序列。

2.根据权利要求1所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征是所述小干扰RNA指导细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7基因表达的抑制，该小干扰RNA分子包含与SEQIDNO:8所示的序列互补的序列，正义链为SEQIDNO:25所示的序列，反义链为SEQIDNO:26所示的序列。

3.根据权利要求2所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征是所述小干扰RNA中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

(1)连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)核糖的2'-OH的修饰；

(3)碱基的修饰。

4.一种包含权利要求2或3所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体组成的组合物。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。

6.权利要求1-3之一的针对HPV18E7基因的小干扰RNA在制备抗癌药物中的应用。