CN101787368A

CN101787368A - 抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101787368A
Application number: CN200910226660A
Authority: CN
Inventors: 张健; 向双林; 韩梅; 周建林; 胡翔; 周畅; 丁小凤
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2029-12-17
Also published as: CN101787368B

Abstract

本发明公开了一种了抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。本发明克隆了人非编码基因Z38序列，并设计出一组能干扰人Z38基因表达的siRNA，通过化学法合成或质粒表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人Z38基因的mRNA水平，达到抑制了乳腺癌细胞的增殖、促进癌细胞凋亡的目的。该siRNA及其表达质粒可用于制备高效、特异性强、副作用小的抗乳腺肿瘤药物。

Description

抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种小分子干扰核糖核酸(siRNA)，具体为涉及一种抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症对人类健康造成了巨大的威胁，全世界每年约700万人死于癌症，我国每年癌症死亡约130万人，在各类死因中高居第二位。攻克癌症、减轻病人痛苦一直是一个世界难题。乳腺癌是全球女性的第一号健康杀手，全球每年120万妇女罹患乳腺癌，有50万人死于该病。而处于相对低发区的中国，随着经济的发展，职业女性生活节奏的加快以及饮食习惯的改变，该病发病率正逐年上升。发病率已达25.48/10万，且趋于年轻化，严重威胁女性生命健康。和其他癌症一样，乳腺癌的发生、演进、侵袭和转移是一个多基因参与的渐进积累的过程，涉及众多基因调控、表达、突变等变化。利用分子生物学技术、从分子水平认识癌症的病理根源是为临床提供有效诊治手段的有效途径。

siRNA由于强有力的特异性RNA干扰作用，现已成为一种理想的细胞水平基因敲除手段。siRNA的出现在哺乳动物细胞中产生特异的基因表达抑制，使得siRNA为人类疾病的治疗开创了新的天地。自2001年RNA干扰现象被发现以来，RNA干扰技术的研究、开发和应用得到了迅速发展，2006年发明此技术的美国两位科学家Andrew Fire和Craig Mello因此获得了诺贝尔奖。与常规的反义核苷酸技术相比，siRNA抑制基因的表达不但高效特异，而且效应持久、操作简便。人类的许多疾病如肿瘤、传染性疾病等与人体的某些基因大量表达或外来的病毒、细菌基因的表达有密切的因果关系，因此，可以通过向肿瘤细胞或感染细胞中引入siRNA特异性沉默与疾病发生相关的基因，从而达到治疗疾病的目的。美国Sirna Therapeutics，Inc公司获得了血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA专利，这种siRNA能压抑VEGF基因表达，而VEGF基因会刺激老年性黄斑变性患者视网膜上血管的生长分子，将VEGF的siRNA直接注射到眼部，用以治疗年龄相关的黄斑退化症(UK Patent No.GB2406569，United StatesPatent 7022828)。据不完全统计，美国的Alnylam Pharmaceuticals，SirnaTherapeutics，Acuity Pharmaceuticals，Bentitec等生物药物公司已研制治疗呼吸道疾病、肌肉萎缩、艾滋病、肝炎、脑神经退化等多种疾病的siRNA类药物，目前已有多个进入临床前或临床试验。因此，siRNA在治疗和预防肿瘤发生中机制研究中显示了显示了光明的前景。

本发明人通过比较乳腺癌和正常乳腺组织的基因表达差异，鉴定出了一个非常有意义的非编码RNA基因，并命名为Z38。Z38又名为C3orf4和CLDND1。Z38原推断为一个编码253个氨基酸的基因(Fayein等，Gene，2002，289：119-129)。研究发现，Z38基因不编码蛋白质，是一个非编码基因。Z38在人类乳腺癌标本中表达量很高，而在癌旁的正常乳腺组织中表达很低。本发明人已在细胞水平上和转基因小鼠模型水平上证明：此基因编码的非编码RNA有能使相对正常乳腺细胞(Z38表达低)向癌细胞变化的趋势，并具有抗化疗药物诱导的细胞凋亡活性。因此如何获得一种抑制人Z38基因表达的siRNA并将其应用于抗乳腺肿瘤药物中是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种特异性抑制人Z38基因表达的siRNA。

本发明的第二个目的是提供一种能产生上述siRNA的表达载体。

本发明的第三个目的是提供上述siRNA或产生该siRNA的表达载体在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。

本发明提供的抑制人Z38基因表达的siRNA，包含siRNA 1或siRNA 2；或者包括siRNA 1和siRNA 2，所述siRNA 1及siRNA 2的碱基序列如下：

siRNA 1：正义链5’-GAAAAUUCCAGUGAUUUGATT -3’

反义链5’-UCAAAUCACUGGAAUUUUCTT-3’；

siRNA 2：正义链5’-CCGGAAAGAGUACACCUUATT -3’

反义链5’-UAAGGUGUACUCUUUCCGGTT-3’。

抑制人Z38基因表达的siRNA通过人工合成和质粒载体表达形成。

通过所述抑制人Z38基因表达的siRNA产生的该siRNA的表达载体。

所述的抑制人Z38基因表达的siRNA及其表达载体在治疗和预防乳腺肿瘤的药物中的应用。

本发明提供的siRNA可以特异性抑制Z38基因的表达。MTT分析和细胞流式分析实验表明本发明提供的siRNA可以抑制乳腺癌细胞的增殖、并能促进乳腺癌细胞的凋亡。重要的是本发明设计的siRNA对正常乳腺细胞几乎没有杀伤作用，却能有效地杀死Z38高表达的乳腺癌细胞，为预防和治疗乳腺癌提供了一个有效途径。

附图说明

图1是实时定量PCR检测Z38在人乳腺癌组织(编号：c1至c10)和相应的癌旁组织(编号：c1s至c10s)中表达。

图2是光学显微镜下检测siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺细胞HBL100的影响图。

图3是MTT方法分析siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺细胞HBL100增殖的影响图。

图4是细胞流式方法分析siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺细胞HBL100的凋亡的影响图。

图5是TUNEL方法分析siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺细胞HBL100的凋亡的影响图。

具体实施方式

实施例1：Z38编码基因的获得。

利用抑制消减杂交技术，筛选出一批在在小鼠乳腺癌组织中高表达的基因，通过生物信息学分析发现其中一个基因属于假想蛋白，与人的该基因有很高的相似性，其cDNA全长为2.2kb，暂命名它为Z38基因。经过5’和3’RACE实验及测序得到Z38全长序列。PCR引物序列为：1、5’-RACE：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；5’-GAAATGAGGCTAAGCACACAAGC-3’2、3’RACE：5’-gca ttctccatctccttgcag-3’；5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

实施例2：

实时定量PCR检测Z38在人乳腺癌组织中表达为了检测Z38在人乳腺癌中的表达情况，发明人收集了50例乳腺癌及癌旁组织，抽提总RNA，经反转录得到cDNA作为PCR模板。用β-actin作为内参，PCR引物Z38：F5’-GAATTTGGATGGTCCTTCTGC-3’，R 5’-ACTCTTTCCGGTTGGTGTGA-3’；β-actin：F 5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′，R 5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。PCR反应体系：SYBR GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems)10μl，cDNA20ng(5μl)，primers 0.4μM(5μl)。PCR程序：50℃2mins、95℃15s、95℃15s和60℃1min 40个循环。结果显示其中35个乳腺癌组织中Z38的表达高于其癌旁组织(见图1)。

实施例3：抑制Z38基因表达的siRNA序列的合成。

本发明所提供的Z38基因siRNA序列是根据实施例1所克隆的人Z38mRNA序列而设计，这些是RNA序列基本符合以下原则：从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。一般21个核苷酸中的GC含量在30％-70％的范围内，当GC含量较低的片段中更容易找到有效片段。而且要避免siRNA靶序列形成二级结构和相同碱基的连续重复，这些结构会影响siRNA的退火配对和靶点特异性。此外，利用BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将所选序列和人的EST数据库进行比较，排除那些和人的其他编码序列/EST同源的序列。在正义链的3’末端加两个dTdT的尾，指导siRNA形成RNAi沉默复合物，也避免受核酸酶的降解。

实施例4：siRNA转染乳腺癌细胞。

乳腺癌细胞系MDA-MB-231和正常乳腺细胞系HBL100来自美国ATCC公司。在37℃、5％CO₂、90％相对湿度培养箱中用DMEM完全培养液(加10％新生牛血清、2mM L-谷氨酸、青霉素和链霉素)进行培养，待细胞密度至70％。用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒将Z38siRNA转入MDA-MB-231细胞中，siRNA的终浓度为100nmol/L。转染之前合成无血清无抗生素的培养液，转染6小时后，换成有血清和抗生素的培养液继续培养。在光学显微镜下观察细胞状态(见图2).

实施例5：MTT分析。

上述转染过的细胞制成单细胞悬液接种于96孔培养板；10³-10⁴细胞/孔，每孔培养基总量200微升，37℃、5％CO₂培养箱中培养12-96小时。②分别在每个时间段加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔)；继续培养3小时。③吸出孔内培养液后，加入DMSO液(150微升/孔)，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。④酶标仪检测各孔OD值(检测波长为490nm)。记录结果，绘制细胞生长曲线(见图3)。

实施例6：细胞流式分析将。

上述转染过的细胞培养48h后，经0.2％胰酶处理，离心收集细胞，用4℃预冷PBS洗涤2次，然后用250ul结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为10⁶/ml，然后取100μl细胞悬浮于1ml离心管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl20μg/ml的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15分钟，随后重悬于400μlPBS，400目筛网过滤，加样于流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡。获得细胞凋亡数据后用ModFitLT软件进行细胞凋亡相对定量分析(见图4)。

实施例7：TUNEL分析。

按照In situ cell death Detection POD，kit(罗氏)的说明书操作：①MDA-MB-231细胞以1.5×1⁰5/ml细胞数接种于12孔板(孔内放置一盖玻片)，培养24小时后分别转染反义RNA-C1/C2、阴性对照RNA。继续培养48h；②终止细胞培养，4％多聚甲醛室温固定20min；③PBS洗三次，10min/次；④封闭液(3％的H₂O₂甲醇)室温孵育10min；⑤PBS洗一次；⑥Permeabilisationsolution(0.1％(v/v)Triton X-100，0.1％(w/v)柠檬酸钠)冰上放置2min；⑦TUNEL reaction mixture 37℃，孵育60min，PBS洗三次后荧光显微镜下分析(见图5)。

SEQUENCE LISTING

<110>湖南师范大学

<120>抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130>生物领域

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>1

gaaaauucca gugauuugat t 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>2

ucaaaucacu ggaauuuuct t 21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>3

ccggaaagag uacaccuuat t 21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>4

uaagguguac ucuuuccggt t 21

Claims

1.一种抑制人Z38基因表达的siRNA，其特征在于它包含siRNA 1或siRNA2；或者包括siRNA 1和siRNA 2，所述siRNA 1及siRNA 2的碱基序列如下：

siRNA 1：正义链5’-GAAAAUUCCAGUGAUUUGATT -3’

反义链5’-UCAAAUCACUGGAAUUUUCTT-3’；

siRNA 2：正义链5’-CCGGAAAGAGUACACCUUATT -3’

反义链5’-UAAGGUGUACUCUUUCCGGTT-3’。

2.根据权利要求1中所述的抑制人Z38基因表达的siRNA，其特征在于该s iRNA通过人工合成和质粒载体表达形成。

3.一种如权利要求1或2所述的抑制人Z38基因表达的siRNA的表达载体。

4.一种如权利要求1或2中所述的抑制人Z38基因表达的siRNA在制备治疗和预防乳腺肿瘤的药物中的应用。

5.一种如权利要求3所述siRNA的表达载体在制备治疗和预防乳腺肿瘤的药物中的应用。