CN104922697A - 降低磷酸吡哆醇氧化酶治疗卵巢癌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及降低磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)治疗卵巢癌。本发明通过实验证实了降低PNPO后可抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，并导致细胞周期G2/M期阻滞，提示PNPO是一种潜在的治疗卵巢癌的新型靶点，可针对卵巢癌PNPO高表达的病人给予降低PNPO的表达以达到治疗目的，同时有利于进一步研究卵巢癌的发生发展机制。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地，涉及卵巢癌的治疗，更具体地，涉及通过降低磷酸吡哆醇氧化酶治疗卵巢癌。
背景技术
磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)是催化磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)合成磷酸吡哆醛(PLP，维生素B6的活性形式)的氧化酶。PLP是多种酶的辅酶，参与140多种催化反应，如同型半胱氨酸等氨基酸的代谢、儿茶酚胺等神经递质的合成等。
肝脏或神经来源的肿瘤被检测出PNPO酶无活性(1998-Emily O.Ngo)；在乳腺癌T47D细胞(tamoxifen-sensitive，ER-positive)中，PNPO的表达可受雌二醇和他莫昔芬的调控(2006Mariam H)；多例病历报道显示PNPO基因突变可致PNPO酶缺陷，诱导新生儿癫痫性脑病。
卵巢癌，又称为卵巢恶性肿瘤，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌因病理类型不同而治疗方案不同，多用手术治疗联合化疗等综合治疗，但其效果有限。积极开发卵巢癌的治疗手段和药物是十分必要的。
目前还未见PNPO在卵巢癌中的相关研究，也未见PNPO抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的相关报道。如PNPO能成为潜在的卵巢癌的治疗靶点，则用PNPO的抑制剂等方法敲降PNPO的表达将能够在卵巢癌的治疗中发挥重大作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可治疗卵巢癌的新靶点。
本发明提供了PNPO蛋白或其编码基因的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
优选地，所述的抑制剂选自以PNPO蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制PNPO蛋白表达或基因转录的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸的DNA序列或构建物。
优选地，所述的抑制剂选自下列a)或b)
a)siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-GACUGGCUCUAUGAGAGAC-3’，
反义链：5’-GUCUCUCAUAGAGCCAGUC-3’；
b)DNA双链序列，所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'，
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
优选地，所述的抑制剂为一构建物，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
本发明还提供了PNPO蛋白或其编码基因的抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞增殖、迁移或侵袭的试剂中的应用。
优选地，所述的抑制剂选自以PNPO蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制PNPO蛋白表达或基因转录的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸的DNA序列或构建物。
优选地，所述的抑制剂选自下列a)或b)
a)siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-GACUGGCUCUAUGAGAGAC-3’，
反义链：5’-GUCUCUCAUAGAGCCAGUC-3’；
b)DNA双链序列，所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'，
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
优选地，所述的抑制剂为一构建物，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
本发明还提供了一种构建物，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
优选地，所述的构建物为慢病毒载体。
本发明优点在于：
1、实验证实敲除PNPO后可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并导致细胞周期G2/M期阻滞，提示PNPO是一种潜在的治疗卵巢癌的新型靶点，可针对卵巢癌PNPO高表达的病人给予降低PNPO的表达以达到治疗目的，同时有利于进一步研究卵巢癌的发生发展机制。
2、设计的PNPO-siRNA、PNPO-shRNA序列起到了显著的敲降作用，敲除效率高。
附图说明
图1.PNPO-siRNA对PNPO的敲除效果验证。其中，图1A为qPCR结果，图1B为Western-blot结果。
图2.PNPO-shRNA对PNPO的敲除效果验证。其中，图2A、图2B为qPCR结果，图2C、图2D、图2E、图2F为Western-blot结果；图2A、图2C、图2E为OVCAR-3中结果，图2B、图2D、图2F为SK-OV-3中结果。*P<0.01。
图3.在卵巢癌细胞株SK-OV-3和OVCAR-3中敲除PNPO，对卵巢癌细胞增殖的影响。其中，图3A是在卵巢癌细胞株OVCAR-3中的实验结果；图3B是在卵巢癌细胞株SK-OV-3中的实验结果。*P<0.01。
图4.细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果。其中，图4A、图4B是细胞划痕实验结果；图4C、图4D是Transwell迁移实验结果。*P<0.01。
图5.Transwell侵袭实验结果。其中，*P<0.01。
图6.PNPO对卵巢癌细胞周期的影响。其中，*P<0.01。
图7.pHY-LV-KD5.1慢病毒载体图谱。
具体实施方式
本申请的发明人在对卵巢癌的发生发展机制研究过程中发现，PNPO敲降后细胞增殖、迁移、侵袭受到抑制，提示PNPO是一种潜在的治疗卵巢癌的新型靶点，基于此完成了本发明。
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 PNPO-siRNA的合成及对PNPO敲除效果的验证
1、PNPO-siRNA的设计
寻找合适的靶序列，设计、筛选获得针对PNPO mRNA的PNPO-siRNA：
正义链(Sense)：5’-GACUGGCUCUAUGAGAGAC-dTdT-3’(SEQ IDNO.1)，
反义链(Antisense)：5’-GUCUCUCAUAGAGCCAGUC-dTdT-3’(SEQ IDNO.2)。
2、PNPO-siRNA沉默效果验证
卵巢癌细胞OVCAR-3铺板24小时给予PNPO-siRNA，具体使用罗氏X-tremeGENE siRNA转染试剂10μl+PNPO-siRNA 2μg转染，对照组NC转染罗氏X-tremeGENE siRNA转染试剂10μl+NC-siRNA 2μg。转染24小时后提取蛋白及mRNA。经qPCR及Western-blot验证敲除效率。
NC-siRNA序列如下：
Sense：5’-GACGUUGGACAUCGGAUCA-dTdT(SEQ ID NO.5)，
Antisense：5’-UGAUCCGAUGUCCAACGUC-dTdT(SEQ ID NO.6)。
qPCR引物如下：
β-actin：5'-ACAATGTGGCCGAGGACTTT-3'(forward，SEQ ID NO.7)，5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'(reverse，SEQ ID NO.8)；
PNPO：5'-TTGAGGAGACTCATCTGACC-3'(forward，SEQ ID NO.9)，5'-GTTAGTGAAGAAGCGGAAGC-3'(reverse，SEQ ID NO.10)。
结果：图1A为qPCR结果，PNPO-siRNA组较NC组PNPO mRNA表达量下降57％；图1B为Western-blot结果，PNPO-siRNA组较NC组PNPO表达量下降70％。
实施例2 PNPO-shRNA的合成及对PNPO敲除效果的验证
1、慢病毒干扰载体的构建
(1)PNPO-shRNA序列信息
上游链(Top strand)：5'-gatccGACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTTg-3'(SEQ ID NO.3)，
下游链(Bottom strand)：5'-aattcAAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTCg-3'(SEQ ID NO.4)。
(2)RNAi慢病毒重组质粒的构建
1)shRNA的退火；
2)慢病毒载体(pHY-LV-KD5.1，购于汉尹生物科技(上海)有限公司，载体图谱见图7)的酶切及回收：通过限制性内切酶BamH I(GGATCC)和EcoRI(GAATTC)使pHY-LV-KD5.1载体线性化；
3)shRNA载体与PNPO-shRNA DNA双链序列的连接；
4)将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞中进行转化；
5)重组质粒的制备；
6)测序鉴定阳性克隆。
经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致。
2、慢病毒的包装和病毒滴度的测定
用构建的RNAi慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度为1*109TU/ml。
3、PNPO-shRNA沉默效果验证
按MOI＝15(SK-OV-3)或MOI＝20(OVCAR-3)加入病毒建立稳转细胞株(PNPO-shRNA)。对照组(NC)空转等量慢病毒颗粒。经qPCR及Western-blot验证敲除效率，分别重复3次。
结果：qPCR结果见图2A和2B，Western-blot结果见图2C、图2D、图2E、图2F；图2A、图2C、图2E为OVCAR-3中结果，图2B、图2D、图2F为SK-OV-3中结果。PNPO-shRNA组相比于NC组的PNPO降低比例分别为：图2A：50％；图2B：87％；图2E：50％；图2F：88％。
实施例3敲除PNPO抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭
1、在卵巢癌细胞株SK-OV-3和OVCAR-3中敲除PNPO后可抑制卵巢癌细胞的增殖
如实施例2，按MOI＝15(SK-OV-3)或MOI＝20(OVCAR-3)加入病毒建立稳转细胞株(PNPO-shRNA)。对照组空转等量慢病毒颗粒(NC)。经qPCR及Western-blot验证敲除效率后，WST法检测增殖效率，具体地，分别用酶标仪测定0h、12h、24h、48h、72h OD450nm的吸光度，各时间点检测之前，每孔加10μl WST-1，放回培养箱继续培养2小时。
结果：WST法实验结果见图3A和图3B。结果表明，敲除PNPO后，卵巢癌细胞的增殖受到抑制。
2、PNPO对卵巢癌细胞株迁移的影响
(1)细胞划痕实验：SK-OV-3细胞铺于六孔板中，待密度达到60％左右时，用无菌枪头在空中央划一直线，将漂浮的细胞用PBS吸取，换新鲜培养基，分别于0h、24h、48h、72h拍照，分别重复三次。
结果：图4A是划痕后各时间点的拍照图片；图4B是测量三处划痕距离取平均值进行作图。结果显示，PNPO-shRNA细胞划痕间距在各时间点均显示比NC的间距大，表示PNPO-shRNA细胞迁移能力较NC细胞低。
(2)Transwell迁移实验：SK-OV-3细胞用无血清DMEM混悬，计数5000个/150μl，上室加入150μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的DMEM，24小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小室上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的迁移细胞，分别重复三次。
结果：图4C是穿过小室的细胞拍照图片；图4D是分别计数三视野细胞数取均值做图。结果证明PNPO-shRNA细胞迁移能力较NC细胞低。
3、PNPO对卵巢癌细胞株侵袭的影响
Transwell侵袭实验：按1:8比例用无血清DMEM稀释matrigel胶，上室加入80μl稀释后的matrigel胶，放37度静置4小时，吸弃上清析出液。SK-OV-3细胞用无血清DMEM混悬，计数5000个/150μl，上室加入150μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的DMEM，48小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小室上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的侵袭细胞，分别重复3次。
结果：图5A是穿过小室的细胞拍照图片；图5B是分别计数三视野细胞数取均值做图。结果表明PNPO-shRNA细胞侵袭能力较NC细胞低。
4、PNPO对卵巢癌细胞周期的影响
PNPO-shRNA及其对照组NC，按8*104个/孔铺于6孔板，待细胞密度至90％左右，胰酶消化加完全培养基中和后收集细胞至无菌15ml离心管，1000rpm，5分钟；加PBS 2ml洗1次1000rpm，5分钟；用100μl PBS重悬细胞，加入75％无水乙醇中，4度固定过夜；从4度冰箱拿出细胞，轻轻混悬，800rpm，5分钟；弃上清，加PBS 3ml重悬，800rpm，5分钟；弃上清，每管加500μl PI染料(BD，cat 550825)，室温避光15min，流式细胞仪测周期，分别重复3次。
结果：图6A为NC细胞周期测定结果，图6B为SK-PNPO细胞周期测定结果，图6C为统计柱状图。结果显示PNPO-shRNA细胞存在G2/M期阻滞。
表1细胞各周期比例及P值
综上所述可知，敲除PNPO后可抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，并导致细胞周期G2/M期阻滞，提示PNPO是一种潜在的治疗卵巢癌的新型靶点，可针对卵巢癌PNPO高表达的病人给予降低PNPO的表达。此外，本实施例中的PNPO-shRNA序列起到了显著的敲降作用，敲除效率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.PNPO蛋白或其编码基因的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自以PNPO蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制PNPO蛋白表达或基因转录的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸的DNA序列或构建物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自下列a)或b)
a)siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-GACUGGCUCUAUGAGAGAC-3’，
反义链：5’-GUCUCUCAUAGAGCCAGUC-3’；
b)DNA双链序列，所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'，
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为一构建物，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
5.PNPO蛋白或其编码基因的抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞增殖、迁移或侵袭的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自以PNPO蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制PNPO蛋白表达或基因转录的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的DNA序列或构建物。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自下列a)或b)
a)siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-GACUGGCUCUAUGAGAGAC-3’，
反义链：5’-GUCUCUCAUAGAGCCAGUC-3’；
b)DNA双链序列，所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'，
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为一构建物，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
9.一种构建物，其特征在于，所述的构建物包含以下DNA双链序列：
上游链：5'-GACTGGCTCTATGAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTCATAGAGCCAGTCTTTTTT-3'；
下游链：5'-AAAAAAGACTGGCTCTATGAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTCATAGAGCCAGTC-3'。
10.根据权利要求9所述的构建物，其特征在于，所述的构建物为慢病毒载体。
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