CN102203254A - 有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法 - Google Patents

有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法 Download PDF

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Abstract

尚没有抗病毒剂能够成功治疗H5N1病毒感染。我们证明一组高效的靶向H5N1病毒基因的siRNAs共同具有独特基序GGAGU/ACUCC。我们进一步证明含有此基序的siRNAs的有效性不是序列特异性的。结果表明该独特基序的结构对于确定siRNA-介导的针对病毒感染的保护效果的效力至关重要，以及这种有效的体内保护与该基序诱导的β-防卫素和IL-6的早期产生有关。提供了用于针对H5N1流感病毒和其他病毒感染的方法以及预防剂和治疗剂。

Description

有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月11日提交的美国临时申请序列号61/121614的权益，其通过引用整体并入本文，包括所有的附图、表格、氨基酸序列和核酸序列。
背景技术
最近在家禽和人类中爆发的高致病性H5N1禽流感病毒感染已经引起关注，不远的将来可能发生大范围流行的新型流感（1）。考虑到H5N1禽流感相关的死亡率高达45%到81%（2，3），以及现有疫苗和药物疗效有限（4，5），开发用于预防和治疗禽流感H5N1病毒感染的新策略迫在眉睫。
H5N1禽流感病毒属于甲型流感病毒，是一种包膜的、负链RNA病毒。单链RNA病毒的独特性质使采用小干扰RNAs（siRNAs）作为抗禽流感预防剂和治疗剂具有吸引力。siRNA是双链RNA，其反义链与RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合后，介导mRNA序列特异性的降解（6，7）。已报道针对H5N1病毒的PA和NP基因的siRNA在培养的细胞中可以有效抑制病毒复制，并在小鼠模型中提供预防效果，但是不能提供任何显著的治疗效果（8，9）。因此，对于开发基于RNA干扰的抗H5N1剂来说，迫切需要设计和鉴定更有效的siRNAs。
发明内容
我们设计和鉴定了25个候选siRNAs，其靶向H5N1病毒基因PB1、PB2、PA、NP、M、NS和HA的相对保守区。有意思的是，几个与任何其他报道过的siRNAs（8-13）不同的有效siRNAs包含新型基序（命名为“siRNA-m”）。与不含此基序的siRNAs（命名为“siRNA-n”），包括两种已经报道的在培养的细胞和体内最有效的siRNAs（8，9）相比，这些siRNAs在细胞培养测定中显示出较低的抗病毒效果，但是在被致死量高致病性流感病毒攻击的小鼠模型中，出人意料地提供高得多的保护作用。并且，该强大的体内保护效果可与该基序诱导的β-防卫素和IL-6的早期产生有关。因此提供了新型的病毒抑制剂。提供了新的筛选潜在抗病毒药物的方法。还提供了制备有效的病毒抑制剂的方法，以及预防、抑制和治疗病毒感染和增殖的方法。
本发明提供下列技术方案：
1. siRNA，其包含基序GGAGU或反向基序ACUCC。
2. 根据第1 项（item）的siRNA，其包含选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
3. 在对象中刺激IL-6产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的如第 1项所述的siRNA。
4. 在对象中刺激IL-6产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的如第 2项所述的siRNA。
5. 组合物，其包含如第 1项所述的siRNA和药学可接受的载体。
6. 组合物，其包含如第 2项所述的siRNA和药学可接受的载体。
7. 在对象中刺激IL-6产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的如第 5项所述的siRNA。
8. 在对象中刺激IL-6产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的如第 6项所述的siRNA。
9. 筛选潜在抗病毒剂的方法，其包括：
获得如第 1项所述的siRNA；
在所述siRNA的抗病毒性质可以被观察的条件下，使所述siRNA与培养的细胞接触；并
将所述siRNA的任何抗病毒性质与对照比较；其中显示高于所述对照的抗病毒性质的siRNA被确定为潜在抗病毒剂。
10. 根据第9 项的方法，其中所述对照为阴性对照或未处理的细胞培养物。
11. 根据第9 项的方法，其中所述对照为阳性对照。
12. 根据第11 项的方法，其中所述阳性对照为siRNA，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
13. 筛选潜在抗病毒剂的方法，其包括：
获得一个根据第1 项的siRNA；
在所述siRNA的抗病毒性质可以被观察的条件下，将所述siRNA施用给动物模型，并用病毒攻击所述动物；以及
测定所述siRNA是否在体内显示抗病毒性质。
14. 根据第 13项的方法，进一步包括将所述siRNA的任何抗病毒性质与对照比较；其中显示高于所述对照的抗病毒性质的siRNA被确定为潜在抗病毒剂。
15. 根据第 14项的方法，其中所述对照为阴性对照或未处理的动物。
16. 根据第 14项的方法，其中所述对照为阳性对照。
17. 根据第 16项的方法，其中所述阳性对照为siRNA，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
18. 根据第9 项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质。
19. 根据第9 项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗H5N1病毒性质。
20. 根据第10 项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质。
21. 根据第 10项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗H5N1病毒性质。
22. 根据第 11项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质。
23. 根据第 11项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗H5N1病毒性质。
24. 根据第 12项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质。
25. 根据第 12项的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗H5N1病毒性质。
26. 根据第 13项的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒。
27. 根据第13 项的方法，其中所述病毒为H5N1。
28. 根据第 14项的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒。
29. 根据第14项的方法，其中所述病毒为H5N1。
30. 根据第15项的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒。
31. 根据第15项的方法，其中所述病毒为H5N1。
32. 根据第16项的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒。
33. 根据第16项的方法，其中所述病毒为H5N1。
34. 根据第17项的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒。
35. 根据第17项的方法，其中所述病毒为H5N1。
36. 在对象中刺激β-防卫素产生的方法，其包括向所述对象施用有效剂量的根据第1项的siRNA。
37. 在对象中刺激β-防卫素产生的方法，其包括向所述对象施用有效剂量的根据第2项的siRNA。
38. 在对象中刺激β-防卫素产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据第5项的组合物。
39. 在对象中刺激β-防卫素产生的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据第6项的组合物。
附图说明
图1为siRNA靶序列位置的示意图。25个siRNA针对所示的病毒基因，其包括4个siRNAs-m（黑色箭头）和21个siRNAs-n（白色箭头）。两个报道过的siRNAs（含向上对角线的箭头）也进行了标示。
图2图解地描述了在血清样本中检测siRNA-m刺激的先天免疫应答。（a）IFN-α应答的检测。（b）IFN-γ应答的检测。（c）TNF-α应答的检测。（d）IL-6应答的检测。标示的小鼠血清样本中的细胞因子的检测如图6的注释所述进行。
图3表示在细胞培养中抑制H5N1甲型流感病毒的有效siRNAs的筛选。（a）25个siRNAs在细胞培养中的抗病毒效果。MDCK细胞用化学合成的siRNAs转染12小时，然后用100TCID50的H5N1 A/Vietnam/1194/04病毒株感染48小时。收集细胞上清液进行RT-PCR来检测病毒RNA拷贝。12个siRNAs（包括新设计的4个siRNAs-m（黑色）和6个siRNAs-n（白色），以及2个之前报道有效的阳性对照siRNA（8，9））显示超过75%的抑制效果，用虚线标示。（b）所选择的siRNAs-m和siRNAs-n的序列以及独特基序的鉴定。siRNAs-m中鉴定的序列基序在正链（F）中用下划线标示，在负链（R）中用框标示。对小RNAPB2-1291中的基序也进行了强调。
图4图解地描述了siRNAs-m和siRNAs-n的体内抗病毒效果的评价。（a）、（b）、（c）和（d）：评价4对分别靶向病毒PB1、PB2、PA和NP基因的siRNAs-m和siRNAs-n的预防效果。小鼠气管内（i. t.）施用一个剂量的100、50或25μg（括号内标明）siRNAs-m或siRNAs-n，16-18小时后进行病毒攻击。给予对照小鼠（对照）PBS和/或PEG8-PEI1.8。监测生存率、体重和一般状况至21天或直到死亡前。(e)、(f)、(g) (h)和(j) ：监测siRNA-m和siRNA-n处理的小鼠体重。监测这些小鼠的体重21天或直到死亡。（i）评价siRNA-m和siRNA-n的治疗效果。小鼠被病毒攻击后24小时，鼻内（i. n.）给予4个剂量的NP-1122（siRNA-m）或NP-1496（siRNA-n）。给予对照小鼠（对照）PEG8-PEI1.8。监测生存率、体重和一般状况21天或直到死亡前。
图5表示在用siRNAs-m和siRNAs-n处理的小鼠肺部中病毒复制和组织损伤的检测。攻击后的第6天从用siRNAs-m（黑色）或siRNAs-n（白色）处理的小鼠获取肺部组织。给予对照小鼠（对照）PEG8-PEI1.8。（a）小鼠肺部组织的病毒滴度的检测。通过TCID50确定肺部样品病毒滴度。检测限为1:10，用虚线标示。（b）小鼠肺部组织中病毒RNA拷贝的检测。通过实时RT-PCR测量病毒RNA拷贝。（c）肺部组织中组织病理学的检测。肺部组织典型的组织切片用H&E染色（原始放大倍数100X）。在此放大倍数下，可见炎症浸润和肺泡损伤为肺泡隔加厚，伴有部分肺泡腔的消失。
图6研究独特基序在体内抗病毒效果的效力方面的作用。（a）所选择的siRNA-m（PA-2109）和在不同H5N1病毒株中相应区的序列。通过序列比对发现一个错配核苷酸（nt）（粗体）。（b）siRNA-m在细胞培养中的交叉株抗病毒效果。使用实时RT-PCR通过测量感染后48小时收集的培养上清液中病毒RNA拷贝来检测PA-2109针对完全匹配的病毒株A/Vietnam/1194/2004 (VN)以及不完全匹配的病毒株A/Shenzhen/406H (SZ)和A/Hong Kong/156/97 (HK)的抗病毒效果。结果表示为与它们未处理的对照相比，siRNAs-m针对不同病毒株的抑制率。（c）和（d）在分别用不完全匹配的病毒株攻击的动物中评价siRNA-m的交叉保护作用。给予小鼠一个剂量的25μg PA-2109，并在处理后16-18小时，分别用10 LD50的A/Shenzhen/406H和A/Hong Kong/156/97攻击。（e）含有该基序的小RNA的体内抗病毒效果。给予小鼠一个剂量的PB2-1291（根据一般接受的标准其不是最优化的siRNA，但是包含该基序），然后在16-18小时后用H5N1病毒株A/Vietnam/1194/2004感染。给予这些试验（c，d和e）的对照小鼠（对照）PEG8-PEI1.8。监测存活率、体重和一般状况21天或直到死亡。
图7 图解地描述了在肺部组织中siRNA-m刺激的先天免疫应答的检测。（a）IFN-α应答的检测。（b）IFN-γ应答的检测。（c）TNF-α应答的检测。（d）IL-6应答的检测。（e）不同时间点IL-6应答的检测。（f）接受不同剂量siRNA-m的小鼠中IL-6应答的检测。（g）在用siRNA-m的正义和反义链处理的小鼠中IL-6应答的检测。（h）在用另外一种siRNA-m（PA-2109）处理的小鼠中IL-6应答的检测。小鼠气管内施用一个剂量的100 μg或所示量的siRNA-m（PB2-719）或所示的siRNAs及其对照。在处理后7小时或所示的时间点收集肺部样本。用ELISA检测肺部样本中所示的细胞因子。这些细胞因子的检测限用虚线标示。**与其他处理相比P < 0.005，* 与其他处理相比P < 0.05。
图8 图解地描述了在肺部组织中siRNA-m刺激的β-防卫素-4应答的检测。（a）siRNAs-m (PB2-719和PA-2109)和siRNAs-n (PB2-696和PA-2087)刺激的β-防卫素-4（β-D-4）应答的检测。（b）用siRNA-m（PB2-719）的正义和反义链处理的小鼠中β-D-4应答的检测。（c）不同时间点β-D-4应答的检测。（d）用不同剂量siRNA-m（PB2-719）给予的小鼠中β-D-4应答的检测。（e）用siRNAs-m (PB2-719和PA-2109)和siRNAs-n (PB2-696和PA-2087)处理的小鼠肺部组织中β-D-4产生的检测。肺部组织的代表性组织切片用被合成的β-D-4多肽免疫的兔抗血清染色或正常兔血清染色（未染色）（原始放大倍数100X）。小鼠气管内施用一个剂量的100 μg或所示剂量的siRNAs-m或所示剂量的siRNAs-n及其对照（PEG/PEI和PBS）。在处理后7小时或所示的时间点收集肺部样本。**与其他处理相比P < 0.005，* 与其他处理相比P < 0.05。
图9图解地描述了β-防卫素-4体外（ex vivo）和体内抗病毒效果的评价。（a）细胞培养中β-防卫素-4（β-D-4）体外抗病毒效果的评价。所示浓度的β-D-4加入到MDCK细胞中，然后用100 TCID50的H5N1 A/Vietnam/1194/04株感染细胞48小时。收集细胞上清液用于噬菌斑测定来检测释放的病毒滴度。感染率定义为β-D-4处理的细胞培养物的病毒滴度相比未处理的细胞培养物的病毒滴度。（b）β-D-4在H5N1病毒感染的小鼠模型中体内抗病毒效果的评价。小鼠鼻内施用一个剂量的75 μg β-D-4或对照蛋白，然后用10 LD50 的H5N1 A/Vietnam/1194/04株攻击。监测存活率、体重和一般状况21天或直到死亡。
序列简述
SEQ ID NO:1为siRNA-n"PB1-666"的正向序列
SEQ ID NO:2为siRNA-n"PB1-788"的正向序列
SEQ ID NO:3为siRNA-m"PB1-797"的正向序列
SEQ ID NO:4为siRNA-n"PB1-1688"的正向序列
SEQ ID NO:5为siRNA-n"PB1-1780"的正向序列
SEQ ID NO:6为siRNA-n"PB1-696"的正向序列
SEQ ID NO:7为siRNA-m"PB2-719"的正向序列
SEQ ID NO:8为siRNA-n"PB2-1558"的正向序列
SEQ ID NO:9为siRNA-n"PB2-18318"的正向序列
SEQ ID NO:10为siRNA-n"PA-209"的正向序列
SEQ ID NO:11为siRNA-n"PA-359"的正向序列
SEQ ID NO:12为siRNA-n"PA-2036"的正向序列
SEQ ID NO:13为报道的siRNA"PA-2087"的正向序列
SEQ ID NO:14为siRNA-m"PA-2109"的正向序列
SEQ ID NO:15为siRNA-n"NP-321"的正向序列
SEQ ID NO:16为siRNA-m"NP-1122"的正向序列
SEQ ID NO:17为siRNA-n"NP-1178"的正向序列
SEQ ID NO:18为报道的siRNA"NP-1496"的正向序列
SEQ ID NO:19为siRNA-n"HA-869"的正向序列
SEQ ID NO:20为siRNA-n"HA-855"的正向序列
SEQ ID NO:21为siRNA-n"M-97"的正向序列
SEQ ID NO:22为siRNA-n"M-101"的正向序列
SEQ ID NO:23为siRNA-n"M-925"的正向序列
SEQ ID NO:24为siRNA-n"NS-338"的正向序列
SEQ ID NO:25为siRNA-n"NS-604"的正向序列
SEQ ID NO:26为siRNA-n"NS-677"的正向序列
SEQ ID NO:27为siRNA-n"NS-782"的正向序列
SEQ ID NO:28为siRNA-m"PB1-797"的反向序列
SEQ ID NO:29为siRNA-n"PB1-788"的反向序列
SEQ ID NO:30为siRNA-m"PB2-719"的反向序列
SEQ ID NO:31为siRNA-n"PB2-696"的反向序列
SEQ ID NO:32为siRNA-m"PA-2109"的反向序列
SEQ ID NO:33为报道的siRNA"PA-2087"的反向序列
SEQ ID NO:34为siRNA-m"NP-1122"的反向序列
SEQ ID NO:35为报道的siRNA"NP-1496"的反向序列
SEQ ID NO:36为小RNA"PB2-1291"的正向序列
SEQ ID NO:37为小RNA"PB2-1291"的反向序列。
具体实施方式
我们已发现了在体内能够有效抑制H5N1甲型流感病毒感染的siRNAs共同具有的一个独特基序。使用公认的高毒性人H5N1病毒株A/Vietnam/1194/04 (17)感染的小鼠模型，我们证明siRNAs-m具有有效的体内保护效果。关于预防作用，即使给予动物低达25μg的siRNAs-m，它们仍然可以完全保护试验动物（100%存活率）免于H5N1病毒的致死攻击，而siRNAs-n，其包括两条已经报道能够完全保护小鼠免于几种其他流感病毒株致死攻击的siRNAs(9)，即使动物被给予100μg的siRNAs-n，它们也对动物提供很少或没有保护作用（图4a、b、c 和 d）。关于治疗，我们的研究表明60%的在病毒攻击后24小时接受siRNA-m的动物存活，但是所有给予siRNA-n的小鼠均死亡（图4i）。这是至今报道的由siRNAs介导的最好的治疗效果(8,18,19)，很可能的是通过递送系统、施用途径和siRNAs-m剂量的常规优化可以获得甚至更好的效果。此外，siRNAs-m针对两种不完全匹配的H5N1病毒株的致死攻击可以提供全面的交叉保护（图6c 和 6d），表明siRNAs-m甚至可以成为能够靶向突变病毒。考虑到甲型流感病毒的快速突变，这些siRNAs-m可以是高效的预防和治疗剂。
如本文所使用的，术语“分离的”分子（例如，分离的核酸分子）指实质上不含其它细胞物质，或通过重组技术产生时实质上不含培养基，或通过化学合成时实质上不含化学前体或其他化学物质的分子。另外，分离的分子，例如核酸分子，如果其借助人类活动处于与其在自然界中发现时不同的条件、背景或成分中，则也认为是“分离的”。
如本文所使用的，siRNA的“有效量”是siRNA体外（例如先体外后体内）或体内施用时，有效地在细胞内带来期望的生理变化的量。如本文使用的术语“治疗有效量”指在研究人员、兽医、医生或其他医师尝试的细胞（例如组织）中引发生物学或医学应答（其中包括减轻和/或预防和/或抑制所治疗的疾病或病症的症状）的单独siRNA或与另一种根据本发明的具体方面的试剂组合的量。
本发明的各种方法可以包括涉及与“合适的对照”（指本文中可互换的“适当的对照”）比较数值、水平、特征、特点、性质等的步骤。“合适的对照”或“适当的对照”指本领域普通技术人员熟知的用于比较目的的任何对照或标准。在一个实施方式中，“合适的对照”或“适当的对照”是如本文所述在进行RNAi方法学之前确定的数值、水平、特征、特点、性质等。例如，在将本发明的siRNA引入细胞或生物体之前可以确定转录速率、mRNA水平、翻译速率、蛋白水平、生物活性、细胞特点或性质、基因型、表型等。在另外一个实施方式中，“合适的对照”或“适当的对照”是细胞或生物体内确定的数值、水平、特征、特点、性质等，例如对照或正常细胞或生物体显示出的例如正常特征。在还另一个实施方式中，“合适的对照”或“适当的对照”是预先确定的数值、水平、特征、特点、性质等。
病毒减少（抑制）导致病毒量（viral load）降低（或抑制）。例如，在细胞培养中，通过施用siRNA产生的病毒抑制导致病毒量相比未处理的细胞培养物的降低。抑制可以是部分的。优选的抑制程度为至少50%，更优选为至少60%、70%、80%、85%或90%之一，以及最优选在90%到100%之间。
术语“处理”和“治疗”在本文中可互换地使用，并且如本文使用，包括预防和应答处理，可以是急性短期或慢性长期，以及表示患者中病毒感染的抑制或改善。“患者”包括动物，其包括人。术语“治疗有效的”意思是治疗剂（siRNA）的量是足够抑制或改善病毒感染症状的量。
RNA干扰
RNAi是双链RNA（dsRNA，本文也称作siRNAs或ds siRNAs，指双链小干扰RNAs）在动物和植物细胞中诱导靶向的单链RNA序列特异性降解的高效过程（Hutvagner和Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 225-232 (2002); Sharp, Genes Dev., 15:485-490 (2001)）。在哺乳动物细胞中，RNAi可以被小干扰RNA（siRNA）的21个核苷酸（nt）的双链体引发（Chiu等人, Mol. Cell. 10:549-561 (2002); Elbashir等人, Nature 411:494-498 (2001)），或被微RNAs（miRNA），功能性小发夹RNA（shRNA），或其他可使用DNA模板用RNA聚合酶III启动子在体内表达的dsRNAs引发（Zeng等人, Mol Cell 9:1327-1333 (2002); Paddison等人, Genes Dev 16:948-958 (2002); Lee等人, Nature Biotechnol 20:500-505 (2002); Paul等人, Nature Biotechnol 20:505-508 (2002); Tuschl, T., Nature Biotechnol 20:440-448 (2002); Yu等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052 (2002); McManus等人, RNA 8:842-850 (2002); Sui等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520 (2002)），其中各个通过整体引用而并入本文。
科学文献包括很多使用siRNA沉默内源性或外源性基因表达的报道，突出了它们的治疗潜力（Gupta, S.等人, PNAS, 2004, 101:1927-1932; Takaku, H. Antivir Chem. Chemother, 2004, 15:57-65; Pardridge, W.M. Expert Opin. Biol. Ther., 2004, 4:1103-1113; Zheng, B.J. Antivir. Ther., 2004, 9:365-374; Shen, W.G. Chin. Med. J. (Engl), 2004, 117:1084-1091; Fuchs, U.等人, Curr. Mol. Med., 2004, 4:507-517; Wadhwa, R.等人, Mutat. Res., 2004, 567:71-84; Ichim, T.E.等人, Am. J. Transplant, 2004, 4:1227-1236; Jana, S.等人, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65:649-657; Ryther, R.C.等人, Gene Ther., 2005, 12:5-11; Chae, S-S.等人, J. Clin. Invest., 2004, 114:1082-1089; Fougerolles, A.等人, Methods Enzymol., 2005, 392:278-296），其中各个通过整体引用而并入本文。通过全身施用siRNAs治疗性沉默内源基因已在文献中描述（(Kim B.等人, American Journal of Pathology, 2004, 165:2177-2185; Soutschek J.等人, Nature, 2004, 432:173-178; Pardridge W.M., Expert Opin. Biol. Ther., 2004, July, 4(7):1103-1113),）其中各个通过整体引用而并入本文。
相应地，本发明包括针对病毒、甲型流感病毒尤其是H5N1病毒的这种干扰RNA分子。干扰RNA可以是双链siRNA。本领域普通技术人员应理解并且如本文进一步解释，siRNA分子也可以包括短3’DNA序列。可选地，核酸可以是DNA（通常是双链DNA），在细胞内转录时，其产生具有两个互补区通过间隔区连接的RNA，以使当互补部分相互杂交时，该RNA形成发夹形式。在哺乳动物细胞中，发夹结构可以通过Dicer酶从分子中切除，产生两个不同的但是杂交的RNA分子。
在一个实施方式中，本发明提供了干扰RNA，其当其被适合地引入可被病毒攻击的细胞或在其中表达时，能够通过RNAi来抑制病毒载荷表达，其中干扰RNA一般针对病毒。优选地，干扰RNA序列在大约19到23个核苷酸范围内。例如，在那些利用shRNA的实施方式中，shRNA针对病毒的部分优选在大约19到23个核苷酸范围内。
如本文所解释，在本发明所述方法中所使用的干扰RNA和靶病毒序列之间的完全同一性/互补性虽然有时是优选的，但不是必须的。相应地，与靶病毒序列相比，干扰RNA可以包括一些错配。
siRNA分子
短干扰RNAs（siRNAs）诱导由RNAi过程引起的序列特异性抑制或沉默基因（例如减少表达，可以是部分或完全抑制的程度）。因此，siRNA发挥RNAi过程的效应分子的作用。发挥病毒抑制剂作用的siRNA分子可以是化学合成，或可以在体外从DNA模板转录，或在体内从例如shRNA转录。dsRNA分子可以使用现有技术已知的任何方法设计，例如通过使用下列方法：
1. 使用现有技术任何已知方法，将潜在目标与适当基因组数据库（人类、小鼠、大鼠等）进行比较，并排除任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列。已知的这样一种序列同源性搜索的方法是BLAST，可美国国立卫生研究院的国家生物技术信息中心（NCBI）网站得到。NCBI网站上还可利用的是HomoloGene数据库，该数据库是公众可利用的系统，用于自动检测几个完全测序的真核基因组中注解的基因之间的同源基因，并且是本领域普通技术人员容易使用的。
2. 选择一个或多个符合你的评价标准的序列。关于siRNA的设计和使用的进一步的一般信息可见于“The siRNA User Guide”，在洛克菲勒大学Dr. Thomas Tuschl的实验室网站可得到（Elbashir等人, EMBO J., 2001, 20:6877-6888）。
3.  阴性对照siRNAs优选具有与所选择的siRNA相同的核酸组成，但是与相应的基因组没有显著的序列互补性。这些阴性对照可以通过随机打乱所选择的siRNA的核苷酸序列进行设计；可以进行同源性搜索以保证阴性对照与相应的基因组中任何其他基因缺乏同源性。另外，阴性对照siRNAs有时可以通过向序列中引入一个或多个碱基错配来设计。
最初，定义了鉴定有效siRNA的基本标准，例如mRNA内容中靶序列GC含量和组成（Elbashir SM.等人, Methods, 2002, 26:199-213）。最近获得了进一步的进展，RNAi酶复合物的组装被描述为取决于siRNA的热力学特征（Khrvorova A.等人, Cell, 2003, 115:209-216; Schwarz D.S.等人, Cell, 2003, 115:199-208）。确定双链体两端的相对稳定性，对于单个链进入RNAi途径的程度有影响。另外，报道了在siRNA的确定位点的某些序列基序能够影响其效力（Amarzguioui M.和H. Prydz, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 316:1050-1058; Reynolds A.等人, Nature Biotechnol., 2004, 22:326-330）。在此基础上，开发了复杂算法来增加siRNA设计的成功率，并且这些方法对于本领域普通技术人员是可以获得的（Amarzguioui M.和H. Prydz, 2004; Reynolds A.等人, 2004;以及Ui-Tei K.等人, Nucl Acids Res., 2004, 32:936-948, 其中各个均通过引用整体并入本文）。
其他可以用于选择本发明siRNAs的计算工具包括在麻省剑桥的生物医药研究白头研究所（Whitehead Institute）的生物信息学研究组开发的白头siRNA选择网络服务器，以及Yuan, B. 等人（“siRNA Selection Server: an automated siRNA oligonucleotide prediction server”, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, W130-W134, Web Server issue）和Bonetta L.（“RNAi: Silencing never sounded better”, Nature Methods, October, 2004, 1(1):79-86）中公开的其他工具，其中各个均通过引用整体并入本文。
如本文所述，不同siRNAs的效果可能有显著差异。但是，存在有效干扰RNA的合理设计策略（Gong D.和J.E. Ferrell Jr., TRENDS in Biotechnology, 2004, 22(9):451; Schubert S.等人, J. Mol. Biol., 2005, 348:883-893; Pancoska P.等人, Nucleic Acids Research, 2004, 32(4):1469-1479; Mittal V., Nat. Rev. Genet., 2004, 5(5):355-365，其中各个均通过引用整体并入本文）。
可以进行使用细胞培养筛选最有效的siRNAs。已经开发了几种基于使用siRNA混合物的体外筛选方法，混合物中可含有特别有效的siRNA（或者几种）。这些方法包括使用RnaseIII或Dicer酶来消化较长的双链RNAs，例如BLOCK-IT产物，来制备siRNA混合物（INVITROGEN, Carlsbad CA）（Yang D.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99:9942-9947; Myers J.W.等人, Nat. Biotechnol., 2003, 21:324-328）。已经发现这些消化产生的短RNAs在RNAi中是有效的。寡核苷酸阵列也可用于有效制备siRNAs的确定混合物，以减少外源和内源基因例如PKC-ι的表达（Oleinikov A.V.等人, Nucleic Acids Research, 2005, 33(10):e92）。
本发明的病毒抑制剂可以包括现有技术中已知的未修饰的siRNAs和修饰的siRNAs。因此，本发明包括siRNA衍生物，其包括具有两条互补链核酸的siRNA，以使两条链交联。例如，其中一条链的3’OH端可以被修饰，或者两条链可以交联并在3’OH端修饰。siRNA衍生物可以包含单交联（例如，补骨脂素交联）。在一些实施方式中，siRNA衍生物在其3’端具有生物素分子（例如，可以光裂解的生物素）、多肽（例如，Tat多肽）、纳米颗粒、拟肽、有机化合物（例如，染料，如荧光染料），或树状高分子。用这种方式修饰siRNA衍生物可以改善所产生的siRNA衍生物与相应siRNA相比的细胞吸收或增强细胞靶向活性，可以用于在细胞中追踪siRNA衍生物，或提高siRNA衍生物相比相应siRNA的稳定性。
本发明的病毒抑制剂可以不偶联或可以偶联到另一个部分，例如纳米颗粒，以增强组合物的性质，例如药代动力学参数，例如吸收、有效性、生物可利用度和/或半衰期。偶联可以通过本领域已知的方法实现，例如使用Lambert等人, Drug Deliv. Rev. 47(1): 99-112 (2001) (描述了将核酸负载至聚氰基丙烯酸烷酯（PACA）纳米颗粒); Fattal等人, J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (描述了核酸结合纳米颗粒); Schwab等人, Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (描述了核酸连接到嵌入剂、疏水基团、多聚阳离子或PACA纳米颗粒); 以及Godard等人, Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (描述了核酸连接到纳米颗粒)所描述的方法。
本发明的病毒抑制剂还可以使用任何本领域已知方法进行标记，例如核酸可以用荧光团，例如Cy3、荧光素或罗丹明标记。可以使用剂盒进行标记，例如SILENCER siRNA标记剂盒(AMBION)。另外，siRNA可以被放射性标记，例如使用3H、32P或其他适当的同位素。
因为RNAi被认为是通过至少一个单链RNA中间体进行加工，本领域普通技术人员应理解ss-siRNAs（例如ds-siRNA的反义链）也可以如本文所述进行设计，并根据要求保护的方法学使用。
有大量公司生产针对特定基因的干扰RNAs。Thermo Electron Corporation (Waltham、MA) 已经开展了客户合成服务用于合成短干扰RNA（siRNA）。每条链由18-20个RNA碱基和在3’端突出的两个DNA碱基组成。Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO)使用2’-ACE RNA合成技术提供siRNA双链体。Qiagen (Valencia, CA)使用TOM-化学法提供siRNA，具有高的个体偶联产率(Li, B.等人, Nat. Med., 2005, 11(9), 944-951)。
用于长期表达的siRNA递送
合成的siRNA可以通过本领域已知的方法递送到细胞内，例如包括阳离子脂质体转染（例如LIPOFECTAMINE 2000试剂）和电穿孔。但是这些外源siRNA通常显示短期持续的沉默效果（在培养的细胞中4到5天），在某些实施方式中可能是有益的。为了获得对病毒表达的长期抑制并为了促进某些环境下的递送，一种或更多种siRNA双链体，例如H5N1 ds siRNA-m可以在细胞内从重组DNA构建体表达（McIntyre G.J.和G.C. Fanning, BMC Biotechnology, 2006, 6:1-8）。这些在细胞内从重组DNA构建体表达siRNA双链体以使得在细胞内对靶基因长期抑制的方法在本领域中是已知的，其包括哺乳动物Pol III启动子系统（例如，H1或U6/snRNA启动子系统（Tuschl (2002), 如上）能够表达功能性双链siRNAs; (Bagella等人, J. Cell. Physiol. 177:206-213 (1998); Lee等人, (2002), 如上; Miyagishi等人, (2002), 如上; Paul等人, (2002), 如上; Yu等人, (2002), 如上; Sui等人, (2002), 如上）。RNA Pol III转录终止发生在运行到DNA模板中4个连续T碱基处，提供了在特定序列处终止siRNA转录的机制。siRNA在5'-3' 和3'-5'方向与靶基因序列互补，siRNA的两条链可以在同一个构建体或分开的构建体中表达。H1或U6 snRNA启动子驱动的发夹siRNA可以在细胞内表达，并可抑制靶基因表达（Bagella等人, (1998), 如上; Lee等人, (2002), 如上; Miyagishi等人, (2002), 如上; Paul等人, (2002), 如上; Yu等人, (2002), 如上; Sui等人, (2002), 如上）。当与表达T7 RNA聚合酶的载体共转染到细胞内时，含有在T7启动子控制下的siRNA序列的构建体也可以产生功能性siRNAs（Jacque (2002), 如上）。单个构建体可以含有多个编码siRNAs的序列，例如病毒RNA的多个区域，以及例如可以被分离的Pol III启动子位点驱动。
动物细胞表达一系列的大约22个核苷酸的非编码RNAs，称作微RNA（miRNA），可以在动物发育过程中在转录后水平或翻译水平调节基因表达。miRNAs的一个共同特征是它们均从大约70个核苷酸前体RNA茎-环切割，可以是被一种III型核糖核酸酶Dicer酶或其同源物消化。通过使用与靶mRNA互补的miRNA序列替换miRNA前体的茎部序列，可以使用表达新型miRNA的载体构建体产生siRNAs以在哺乳动物细胞中启动针对特定mRNA靶标的RNAi（Zeng (2002), 如上）。当被含有聚合酶III启动子的DNA载体表达时，微RNA产生的发夹结构可以沉默基因表达（McManus (2002), 如上）。病毒介导的递送机制也可以通过表达siRNA用于诱导靶基因的特异性沉默，例如通过产生含有在RNA Pol II启动子转录控制下的siRNA的重组腺病毒(Xia等人, (2002), 如上)。这些重组腺病毒感染HeLa细胞使得减少的内源靶基因表达。将重组腺病毒载体注射进表达siRNA靶基因的转基因小鼠中引起在体内靶基因表达的减少。在动物模型中，全胚胎电穿孔可以有效将合成的siRNA递送到移植后的小鼠胚胎中（Calegari等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(22):14236-40 (2002)）。在成年小鼠中，siRNA的有效递送可以通过“高压”递送技术实现，其为通过尾静脉将大量含有siRNA的溶液快速注射（5秒内）到动物体内（Liu (1999), 如上; McCaffrey (2002), 如上; Lewis, Nature Genetics 32:107-108 (2002)）。纳米颗粒、脂质体和其他阳离子脂分子也可以用于将siRNA递送到动物体内。已显示在非人类的灵长类中，以脂质体制剂全身递送siRNAs可以沉默疾病靶载脂蛋白B（ApoB）（Zimmermann T.S.等人, Nature, 2006, 441:111-114）。也可利用基于凝胶的琼脂/脂质体/siRNA制剂（Jiamg M.等人, Oligonucleotides, 2004, Winter, 14(4):239-48）。
使用工程化的RNA前体来诱导RNAi
如本文所述，将工程化的RNA前体引入细胞或整个生物体，将引起所期望的siRNA分子的产生。然后，这种siRNA分子与RNAi途径的内源性蛋白成分相关，以结合并靶向特定的mRNA序列进行切割和破坏。在此方式下，工程化的RNA前体产生的siRNA所靶向的病毒将被从细胞或生物体内清除，导致细胞或生物体内该mRNA所编码的任何翻译产物的浓度降低。RNA前体是典型的核酸分子，其能够单独编码dsRNA的一条链或编码RNA发夹环结构的整个核苷酸序列。
药学组合物和施用方法
本发明的病毒抑制剂可以被并入药学组合物中。这些组合物一般包括病毒抑制剂和药学可接受的载体。如本文所使用的，术语“药学可接受的载体”包括盐水、溶剂、分散介质、涂层（coatings）、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等，能够与药学施用相容。补充的活性化合物也可以被并入组合物。制剂（组合物）描述在本领域普通技术人员公知和容易得到的大量来源中。例如Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin E.W., Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed., 1995)描述了能够与本发明联合使用的制剂。
配制了能与其预期的施用途径相容的药学组合物。施用途径的例子包括肠胃外的，如静脉内、皮内、皮下、口腔（如吸入）、局部、透皮、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外的、皮内或皮下应用的溶液或悬液可以包括下列组分：无菌稀释液，例如注射用水、盐溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。pH值可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制备物可以密封在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多个剂量瓶中。
适合可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液（水可溶的）或分散剂和用于临时制备无菌可注射的溶液或分散剂的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR EL (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲液（PBS）。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动性应为存在简易的注射能力的程度。其应当在制备和储存条件下稳定，并且保存免于微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）及其适当的混合物。适当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂包被，通过在分散剂的情况下保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠也可以包括在组合物中。通过在组合物中包含的延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射的组合物的延缓吸收。
可以根据需要，在含有上文列举一种成分或其组合的适当溶剂中加入所需量的活性化合物（例如，本发明的多核苷酸），然后过滤除菌，来制备无菌注射液。一般来说，将活性化合物加入无菌容器（其中含有基础分散介质和所需的其他上文列举的成分）来制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，适当的制备方法包括真空干燥和冻干，其从之前无菌过滤的溶液中产生活性成分与任何另外希望的成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释液或可食用的载体。对于口服治疗施用的目的，活性化合物可以并入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用液体载体制备，作为漱口水使用。药学相容的结合剂和/或佐剂材料可以被包含作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如褐藻酸、PRIMOGEL或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。
对于吸入施用，本发明病毒抑制剂可以从加压容器或含有适合的喷射剂例如气体如二氧化碳的分散器，或喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送。这些吸入方法和吸入制剂包括那些在美国专利号6,468,798中描述的那些。
病毒抑制剂的全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用对于所要穿透的屏障适当的渗透剂。这些渗透剂在本领域中公知，并且例如对于透粘膜施用，包括去垢剂、胆酸盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂进行透粘膜施用。对于透皮施用，活性化合物（例如，本发明的多核苷酸）被配制成本领域中公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏（cream）。
药学组合物也可以制备成栓剂的形式（例如，传统的栓剂基质，例如可可脂和其他甘油酯）或保留灌肠用于直肠施用。
病毒抑制剂也可以使用本领域中已知的方法通过转染或感染来施用，但是不限于McCaffrey等人, Nature 418(6893):38-39 (2002) (水动力转染); Xia等人, Nature Biotechnol 20(10):1006-10 (2002) (病毒介导的递送);或Putnam, Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2):151-160 (1996), 在Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3):325 (1996)更正中所描述的方法。
多核苷酸病毒抑制剂也可以使用任何适合核酸试剂施用的方法例如DNA疫苗进行施用。这些方法包括基因枪、生物注射器和皮肤钳以及无针方法例如美国专利号US6194389中公开的微颗粒DNA疫苗技术，以及美国专利号US6168587中公开的使用粉末形式的疫苗进行哺乳动物透皮无针接种。另外，鼻内递送也是可能的，如Hamajima等人, Clin. Immunol. Immunopathol. 88(2):205-10 (1998)中所述。也可以使用脂质体（例如美国专利号US6,472,375所述）和微囊化技术。也可以使用生物可降解的可靶向的微颗粒递送系统（例如美国专利号US6,471,996所述）。
在一个实施方式中，多核苷酸病毒抑制剂使用这样的载体制备，其将保护多核苷酸在体内不会快速清除或降解，例如控释制剂，其包括内植体和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合体，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。这些制剂可以使用标准的技术制备。脂质体悬液（包括具有单克隆抗体的针对抗原呈递细胞的脂质体）也可以用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域普通技术人员已知的方法制备，例如美国专利号4522811中所述。可以应用抑制RNAse A家族酶类成员或可另外保护本发明多核苷酸病毒抑制剂免于这些酶作用的策略。例如美国专利号6,096,720 (Love等人)描述了针对人raf mRNA的寡核苷酸，其被包埋在空间稳定的脂质体中。在一个实施方式中，在Love等人中所述的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸，其包含用以增强目标亲合力的第一区域和作为RNase底物的第二区域。siSHIELD RNAse抑制剂被设计用于防止siRNA被RNase（MP BIOMEDICALS, Irvine, CA）降解。将短的寡核苷酸浓缩（compaction）至完好确定（well-defined）的浓缩物的策略也可以用于递送本发明的多核苷酸（Sarkar T.等人, Nucleic Acids Research, 2005, 33(1):143-151），其通过引用整体并入本文。
具体地，在体外或体内将多核苷酸病毒抑制剂例如干扰RNA进行细胞施用的合适技术在下列文献中公开：
一般综述：
Borkhardt, A. Cancer Cell, 2002, 2:167-8; Hannon, G.J. Nature, 2002, 418:244-51; McManus, M.T. and Sharp, P.A. Nat Rev Genet., 2002, 3:737-47; Scherr, M.等人, Curr Med. Chem., 2003, 10:245-56; Shuey, D.J.等人, Drug Discov Today, 2002, 7:1040-6; Gilmore, I.R.等人, J. Drug Target., 2004, 12(6):315-340; Dykxhoorn, D.M. and Lieberman J., Annu. Rev. Med., 2005, 56:401-423.
使用脂质体全身施用：
Lewis, D.L.等人, Nat Genet., 2002, 32:107-8; Paul, C.P.等人, Nat Biotechnol., 2002, 20:505-8; Song, E.等人, Nat Med., 2003, 9:347-51; Sorensen, D.R.等人, J Mol Biol., 2003, 327:761-6.
病毒介导的转移：
Abbas-Terki, T.等人, Hum Gene Ther., 2002, 13:2197-201; Barton, G.M. and Medzhitov, R. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:14943-5; Devroe, E. and Silver, P.A. BMC Biotechnol., 2002, 2:15; Lori, F.等人, Am J Pharmacogenomics, 2002, 2:245-52; Matta, H.等人, Cancer Biol Ther., 2003, 2:206-10; Qin, X.F.等人, Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:183-8; Scherr, M.等人, Cell Cycle, 2003, 2:251-7; Shen, C.等人, FEBS Lett., 2003, 539:111-4; Lee S.K.等人, Blood, 2005, 106(3):818-826, epub April 14, 2005.
多肽递送：
Morris, M.C.等人, Curr Opin Biotechnol., 2000, 11:461-6; Simeoni, F.等人, Nucleic Acids Res., 2003, 31:2717-24.
Song E.等人描述了通过细胞表面受体的抗体介导的siRNAs体内递送 (Song E.等人, Nat. Biotechnol., 2005, 23(6):709-717, epub May 22, 2005).
其他可适用于向靶细胞递送多核苷酸病毒抑制剂例如干扰RNA的技术基于纳米颗粒或纳米胶囊，例如美国专利号6,649,192B和5,843,509B所公开。可以用于选择、递送和监测干扰RNA分子的最近的技术包括 Raab, R.M.和Stephanopoulos, G. Biotechnol.Bioeng., 2004, 88:121-132; Huppi, K.等人, Mol. Cell, 2005, 17:1-10; Spagnou, S.等人, Biochemistry, 2004, 43:13348-13356; Muratovska, A. and Eccles, M.R. FEBS Lett., 2004, 558:63-68; Kumar, R.等人, Genome Res., 2003, 13:2333-2340; Chen, A.A.等人, Nucleic Acids Res., 2005, 33:e190; Dykxhoorn, D.M.等人, Gene Ther., 2006, 先于印刷的电子出版; Rodriguez-Lebron, E. 和Paulson, H.L. Gene Ther., 2005, 先于印刷的电子出版; Pai, S.I.等人, Gene Ther., 2005, 先于印刷的电子出版; Raoul, C.等人, Gene Ther., 2005, 先于印刷的电子出版; Manfredsson, F.P.等人, Gene Ther., 2005, 先于印刷的电子出版; Downward, J. BMJ, 2004, 328:1245-1248。
相同类型或不同类型的病毒抑制剂混合物可以在体内或体外引入细胞。例如，可以向细胞内引入多核苷酸病毒抑制剂例如干扰RNA分子（例如，2-4种干扰分子或更多）的混合物或库（Oleinikov A.V.等人, Nucleic Acids Research, 2005, 33(10):e92）。优选地，干扰RNA分子靶向病毒RNA的不同区域。优选地，这些干扰RNA分子之前已经被单独验证具有降低病毒载荷的功能。混合物中单独的干扰RNAs可以被化学合成（Elbashir S.M.等人, Genes Dev., 2001, 15:188-200），或作为含RNA多聚酶启动子的短DNA模板引入，其在体内或体外在细胞内转录（Yu J.Y.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:6047-6052）。
组合物的毒性和疗效可以通过标准的药学方法在细胞培养物或实验动物中进行测定，例如测定LD50（50%群体致死的剂量）和ED50（对50%群体有治疗效果的剂量）。毒性和疗效的剂量比为治疗指数，可用LD50/ED50的比值表示。可以使用显示出高治疗指数的组合物。当使用显示毒副作用的组合物时，应注意设计这样的递送系统，其将这些化合物靶向到被感染组织位点，以便将对未感染细胞的潜在损伤最小化，以及从而降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究中获取的数据可以用于设计用于人类的剂量范围。这些组合物的剂量一般在循环浓度范围之内，包括具有很小毒性或没有毒性的ED50。剂量可以在此范围内变化，取决于使用的剂量形式和利用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何组合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中设计剂量以获得循环血浆浓度范围，其包括如在细胞培养中测定的IC50（即，获得症状最大抑制效果的一半的测试组合物的浓度）。这些信息可以用于更准确地测定用于人体的剂量。血浆水平可以通过例如高效液相色谱测量。
病毒抑制剂可以根据任何合适的时间表施用，例如，从每天一次或多次到每周一次或多次，包括隔一天一次，进行任何天数或周数，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2个月、3个月、6个月或更长，或其任何变化。本领域普通技术人员应理解某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时间，其包括但不限于疾病或紊乱的严重性、前期治疗、对象的一般健康状况和/或年龄、存在的其他疾病。而且，使用治疗有效量的病毒抑制剂来治疗对象可以包括单一治疗或可包括一系列治疗。
多核苷酸病毒抑制剂可以在体内或体外使用如本文所述的已知技术引入（施用）至细胞（例如哺乳动物细胞）来抑制病毒。类似地，含有本发明DNA的遗传构建体（例如，转录载体）可以在体内或体外使用如本文所述的暂时或稳定表达RNA的已知技术引入细胞来抑制病毒。当在体内施用给细胞时，多核苷酸病毒抑制剂可以向对象全身施用（例如，静脉内施用）。
如本文所使用的， 术语“对象”、“患者”和“个体”可以互换施用，并且意在包括人类和非人类哺乳动物物种。类似地，本发明的体外方法可以在这些哺乳动物物种的细胞中进行。包含本发明的外源多核苷酸的宿主细胞可以施用给对象，并且可以是相对于对象例如自体（使用其自身细胞）、异体（从一个人到另一个人）或转基因或异种基因（从一个哺乳动物物种到另一个哺乳动物物种）。
本发明的多核苷酸病毒抑制剂可以插入遗传构建体，例如，病毒载体、逆转录病毒载体、表达盒或质粒病毒载体，例如使用本领域已知方法，包括但不限于那些Xia等人, (2002), 如上中描述的方法进行。遗传构建体可以通过例如吸入、口服、静脉内注射、局部施用（参见美国专利号5,328,470）或通过立体定位注射（参见，例如，Chen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 (1994)）来递送给对象。递送载体的药学制备物可以包括在可接受的稀释液中的载体，或可包含其中包埋递送载体的缓释基质。可选地，在完整的递送载体可从重组细胞中完整地产生的情况下，例如反转录载体，药学制备物可以包括产生多核苷酸递送系统的一个或多个细胞。
多核苷酸病毒抑制剂可以是小发夹RNAs（shRNAs）和工程化表达shRNAs的表达构建体。shRNA的转录在聚合酶III（pol III）启动子处起始，并认为在4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的第2位终止。一旦表达，认为shRNAs折叠成具有3’ UU-突出的茎-环结构；然后，这些shRNAs的末端被加工，将shRNA转化成siRNA样的大约21个核苷酸的分子（Brummelkamp等人, Science 296:550-553 (2002); Lee等人, (2002), 如上; Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500 (2002); Paddison等人, (2002), 如上; Paul (2002), 如上; Sui (2002), 如上; Yu等人, (2002), 如上）
针对病毒的siRNAs可以融合到其他核酸分子上或多肽上，以引导它们的递送或者完成其他功能。因此，例如，含有能够特异性干扰靶病毒的siRNA寡核苷酸的融合蛋白可以包含亲和标签多肽序列，其指通过与配体的特异性亲和相互作用促进多肽检测和分离的多肽或肽。配体可以是任何分子、受体、反受体、抗体或类似物，亲和标签可以通过本文提供的特异性结合相互作用与之作用。这些肽包括例如多聚His或“FLAG”或类似物，例如美国专利号5,011,912和Hopp等人 (Bio/Technology 6:1204, 1988)中所述抗原鉴定肽，或XPRESS表位标签(INVITROGEN, Carlsbad, Calif.)。在细菌宿主的情况下，亲和序列可以是例如pBAD/His (INVITROGEN)或pQE-9载体提供的6个组氨酸标签，用于纯化融合到标记上的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主例如COS-7时，亲和序列可以是血凝素（HA）标签。HA标签对应来自于流感病毒血凝素蛋白的抗体限定的表位（Wilson等人, 1984 Cell 37:767）。
本发明还涉及载体和包含或编码多核苷酸病毒抑制剂（例如siRNA）的构建体，特别涉及“重组核酸构建体”，其包含任意核酸例如DNA多核苷酸片段，可以被转录以产生如本文所提供的根据本发明的抗病毒siRNA多核苷酸；涉及宿主细胞，其被用本发明的载体和/或构建体遗传工程化，以及涉及通过重组技术生产本发明的siRNA多核苷酸、多肽和/或融合蛋白，或其片段或变体。本文公开的如RNA多核苷酸的siRNA序列可以使用已良好确立的方法例如本文中所述方法被工程化以产生相应的DNA序列。因此，例如，DNA多核苷酸可以产生自本文描述的任意siRNA序列，以使本发明的siRNA序列将被认为还提供相应的DNA多核苷酸（及其互补体）。因此，这些DNA多核苷酸被包括在本发明预期的范围内，例如，并入到本发明重组核酸构建体中，在构建体中siRNA可以被转录。
根据本发明，载体可以包含重组核酸构建体，其含有一个或几个启动子用于转录RNA分子，例如人U6 snRNA启动子（参见，例如Miyagishi等人, Nat. Biotechnol. 20:497-500 (2002); Lee等人, Nat. Biotechnol. 20:500-505 (2002); Paul等人, Nat. Biotechnol. 20:505-508 (2002); Grabarek等人, BioTechniques 34:73544 (2003); 也可参见Sui等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20 (2002)）。siRNA多核苷酸的各条链可以单独转录，每一条由单独的启动子控制，然后在细胞内杂交形成siRNA多核苷酸双链体。各条链也可以从单独的载体转录（参见Lee等人, 如上）。可选地，特异性针对靶病毒序列的正义和反义序列可以在单个启动子的控制下转录，这样siRNA多核苷酸形成发夹分子（Paul等人, 如上）。在这种情况下，siRNA特异性序列的互补链由间隔区分开，间隔区包含至少4个核苷酸，但是可以如本文所述包含至少 5、6、7、8、9、10、11、12、14、16或18或更多个核苷酸。另外，在U6启动子控制下被转录的形成发夹的siRNAs可以在3’末端延伸大约4个尿嘧啶，其作为转录终止信号（Miyagishi等人, 如上; Paul等人, 如上）。通过说明，如果靶序列为19个核苷酸，siRNA发夹多核苷酸（从5’末端起始）具有19个核苷酸的正义序列，然后是间隔区（其为靠近19个核苷酸正义序列的3’端的两个尿嘧啶核苷酸），并且间隔区连接19个核苷酸的反义序列，然后是4个尿嘧啶的终止序列，形成突出。具有这种突出的siRNA多核苷酸有效干扰靶多肽的表达。也可以用另一个RNA聚合酶III启动子，H1 RNA启动子制备重组构建体，该启动子可以被可操作地连接到siRNA多核苷酸特异性序列，可用于转录包含siRNA特异性序列的发夹结构，或者单独转录siRNA双链体多核苷酸的每条链（参见，例如Brummelkamp等人, Science 296:550-53 (2002); Paddison等人, 如上）。可用于插入序列进行转录siRNA多核苷酸的DNA载体包括pSUPER载体（参见，例如Brummelkamp等人, 如上）；源自pCWRSVN的pAV载体（参见，例如Paul等人, 如上）和pIND（参见，例如Lee等人, 如上）等。
如本文所提供的，多核苷酸病毒抑制剂可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中在适当的启动子的控制下表达，为评价能够抑制病毒载荷的siRNA多核苷酸提供现成的系统。在原核和真核宿主中使用的适当的克隆和表达载体在例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., (2001)中描述，。
适当的DNA序列可以通过各种方法插入载体。一般来说，DNA序列通过本领域已知的方法插入适当的限制性内切酶位点。克隆、DNA分离、扩增和纯化、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应的标准技术，以及各种分离技术是本领域普通技术人员公知和常用的技术。很多标准技术描述在例如Ausubel等人, (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, Mass.); Sambrook等人, (2001 Molecular Cloning, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.); Maniatis等人, (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.)等中。
表达载体中的DNA序列可操作地连接到至少一个适当的表达控制序列上（例如，启动子或被调节的启动子）以指导mRNA合成。这些表达控制序列的代表性实例包括LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，λ噬菌体PL启动子和其他已知的能够在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的启动子。使用CAT（氯霉素转移酶）载体或其他带有选择标记的载体，启动子区域可以选自任何期望的基因。真核启动子的实例包括CMV前早期、HSV胸腺激酶、早期和晚期SV40、反转录病毒LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择适当的载体和启动子是在本领域普通技术人员水平之内熟知的，本文描述了某些特别优选的重组表达构建体的制备，其包含至少一个启动子或受调节的启动子可操作地连接到本发明的多核苷酸上。
如上文所述，在某些实施方式中，载体可以是病毒载体，例如哺乳动物病毒载体（如，反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒）。例如，可衍生自反转录病毒质粒的反转录病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒，脾坏死病毒，反转录病毒，如劳斯肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，猿长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生肉瘤病毒，和乳腺肿瘤。
病毒载体包含一个或几个启动子。可以使用的适当的启动子包括，但不限于，反转录病毒LTR、SV40启动子和人巨细胞病毒（CMV）启动子，如Miller等人, Biotechniques 7:980-990 (1989)中所述的，或任何其他启动子（例如细胞启动子，例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子）。其他可以使用的病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子、腺相关病毒启动子、胸腺激酶（TK）启动子和B19细小病毒启动子。合适的启动子的选择对于本领域普通技术人员根据本文所含的教导是显而易见的，并可以来自受调节的启动子（例如，组织特异性的或可诱导的启动子）或上文所述的启动子。
在另一方面，本发明涉及含有上述重组构建体的宿主细胞。宿主细胞使用本发明的载体和/或表达构建体被遗传工程化/修饰（转导、转化或转染），所述本发明的载体和/或表达构建体可以是例如克隆载体、穿梭载体或表达构建体。载体或构建体可以是，例如，以质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养，培养基被修饰为适于活化启动子、选择转化子或扩增特定基因例如编码siRNA多核苷酸或其融合蛋白的基因。选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件，例如温度、pH等对于本领域普通技术人员是显而易见的。
宿主细胞可以是高等真核细胞，例如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，例如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。根据本发明适当的宿主细胞的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，例如大肠杆菌（E. coli）、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS或293细胞；腺病毒；植物细胞或任何已经适于体外增殖的或如此从头建立的适合的细胞。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于从本发明的重组核酸构建体产生多核苷酸病毒抑制剂。因此本发明部分涉及产生多核苷酸例如siRNA的方法，其通过培养含有重组核酸构建体的宿主细胞来进行，所述构建体包含至少一个可操作连接多核苷酸病毒抑制剂的启动子。在某些实施方式中，启动子可以是本文提供的受调控的启动子，例如四环素可抑制性启动子。在某些实施方式中，重组表达构建体是本文提供的重组病毒表达构建体。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman, Cell 23:175 (1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及能够表达相容载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa、HEK和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、适当的启动子和增强子，还包括任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧非转录序列，例如，如本文关于重组多核苷酸构建体制备所述的序列。源自SV40剪接位点和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录遗传元件。将构建体引入宿主细胞可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法实现，其包括但不限于，例如脂质体，其包括阳离子脂质体、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法（Davis等人, 1986 Basic Methods in Molecular Biology）或其他适合的技术。
表达的多核苷酸可以用于完整的宿主细胞；完整的细胞器、例如细胞膜、胞内囊泡或其他细胞器；或破损的细胞制备物，其包括但不限于细胞匀浆或裂解液、微粒体、单层或多层膜泡或其他制备物。可选地，表达的多核苷酸可以从重组细胞培养物中回收和纯化，采用的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最后，高效液相色谱（HPLC）可以用于最终的层析步骤。
如本文所用，术语“施用”、“引入”、“应用”、“处理”、“移植”、“植入”、“递送”及其语法上的变化可以互换使用，以在体外（例如，先体外后体内）或体内将病毒抑制剂提供给靶细胞，或者将本发明的遗传修饰（工程化）的细胞提供给对象。
如本文所用，术语“共同施用”及其变化是指将两种或更多试剂同时（在一种或多种制备物中）施用或连续施用。例如，一种或多种类型的本发明的遗传修饰的细胞可以与其他试剂共同施用。
病毒抑制剂（本文中也称为“活性化合物”）可以加入适合施用的药学组合物中。这些组合物一般包括抑制病毒的核酸分子和药学可接受的载体。如本文所用， 术语“药学可接受的载体”旨在包括任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等，能够与药学施用相容。用于药学活性物质的这些介质和试剂是本领域公知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的，其他在组合物中用途都在考虑范围之内。补充的活性化合物也可以被并入组合物。
配制了可与其预期的施用途径相容的药物组合物。施用途径的实例包括肠胃外，如静脉内、皮内、皮下、口腔（如吸入）、透皮（局部）、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可以包括下列组分：无菌稀释液，例如注射用水、生理盐水、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。pH值可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制备物可以密封在安瓿，一次性注射器或玻璃或塑料制成的多个剂量瓶中。
适合可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液（水可溶的）或分散剂和用于临时制备无菌可注射的溶液或分散剂的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR EL (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲液（PBS）。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动性应为存在简易的注射能力的程度。其必须在制备和储存条件下稳定，并且必须保存免于微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）及其适当的混合物。适当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂包被，通过在分散的情况下保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来达到防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选地包含等渗剂，例如在组合物中的糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包含的延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射的组合物的延缓吸收。
可以根据需要，在含有上文列举一种成分或其组合的适当溶剂中加入所需量的活性化合物，然后过滤除菌，来制备无菌注射液。一般来说，将活性化合物加入无菌载体（其中含有基础分散介质和所需的其他上文列举的成分）来制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其从之前无菌过滤的溶液中产生活性成分与任何另外希望的成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释液或可食用的载体。它们可以被包裹在明胶胶囊中或压缩成片剂。对于口服治疗施用的目的，活性化合物可以并入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用液体载体制备，作为漱口水使用，其中流体载体中的化合物经口腔应用，漱口并吐出或咽下。药学相容的结合剂和/或佐剂材料可以被包含作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。 对于吸入施用，化合物以从加压容器或含有适合的喷射剂例如气体如二氧化碳的分散器，或喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送。
全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用对于所要穿透的屏障适当的渗透剂。这些渗透剂在本领域中公知，并且例如对于透粘膜施用，包括去垢剂、胆酸盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂进行透粘膜施用。对于透皮施用，活性化合物被配制成本领域中公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
化合物也可以制备成栓剂的形式（例如，传统的栓剂基质，例如可可脂和其他甘油酯）或保留灌肠用于直肠施用。
在一个实施方式中，使用载体制备活性化合物，所述载体将保护该化合物在体内不会快速清除，例如控释制剂，其包括内植体和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。这些剂型的制备方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。材料可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals、Inc.购得。脂质体悬液（包括具有单克隆抗体的针对靶细胞的脂质体）也可以用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域普通技术人员已知的方法制备，例如US4,522,811中所述。
尤其有利的是以易于施用和剂量一致的剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。本文所使用的剂量单位形式指对于所要施用的对象适合单一剂量的离散单位，每个单位含有预先确定量的活性化合物，经计算与所需的药学载体一起可以产生所期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格根据活性化合物的独特的特征和期望获得的具体治疗效果，以及本领域中配制这种活性化合物用于治疗个体的固有限制来规定并直接取决于上述因素。
药学组合物可以被包含在容器、包装或分散器（dispenser）中，并带有施用说明书。
筛选分析。本发明还提供了方法（在本文也称为“筛选分析”），用于鉴定病毒抑制剂，即对例如病毒增殖尤其是H5N1病毒增殖具有抑制效果的候选或测试混合物或试剂。
处理方法。本发明提供了对处于病毒感染风险（或易于感染病毒）的对象进行处理的预防性和治疗性方法。
预防性方法。在一个方面，本发明提供了用于在对象中预防有关病毒感染的疾病或状况的方法，通过向对象施用递送有效量的本发明siRNAs的试剂。
治疗性方法。本发明的另一方面涉及用于治疗目的的调节病毒活性的方法。本发明的方法中公开的靶基因表达调节涉及使细胞与试剂接触，所述试剂将有效量的本发明siRNAs递送到靶细胞。同样地，本发明提供了治疗经受特征在于病毒感染的疾病或紊乱的个体的方法。
本发明的治疗剂的施用剂量范围是对于被治疗的病毒感染症状足以产生所期望效果的剂量范围。剂量不能太大而导致不良副作用，例如不想要的交叉反应、过敏反应等。一般来说，剂量应随患者年龄、条件、性别和症状程度而变化，并可以由本领域普通技术人员所确定。在发生任何禁忌症时，医生个人可以对剂量进行调整。剂量可取决于所治疗的病毒，并且在治疗这些疾病时，可以由具有普通技能的医生使用已知的剂量调整技术很容易的加以确定。剂量一般处于对治疗化合物已经确立的治疗窗内，其应在提供治疗效果的同时将额外的发病率和死亡率最小化。典型地，治疗化合物的施用剂量范围从每个剂量0.001 mg/kg到大约100 mg/kg，优选0.1-20 mg/kg。优选的大约0.5-5 mg/kg的剂量对于含有本文所公开的治疗剂的化合物尤其有用，每天一个或几个剂量施用，施用一天或多天。
本文描述的任何组合物可以配制用于对哺乳动物或更优选地对人类的药理学或治疗性施用。同样地，该组合物可以包含在药学可接受的载体中。优选的肽活性剂的施用方式为通过注射，静脉内、动脉内、肌肉内或皮下。其他施用途径也可以是可能的，并且应包括在本发明公开的范围之内。
该组合物可以肠胃外的或腹膜内施用。以游离碱或药理学可接受的盐形式的活性化合物的溶液可以在水中制备，并适当混合表面活性剂，例如羟丙纤维素。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及油脂中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，术语“药学可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。用于药学活性物质的这些介质和试剂的用途是本领域公知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的，其他在治疗组合物中用途都在考虑范围之内。补充的活性成分也可以被并入组合物。
本发明的治疗剂可以肠道外施用，通过注射或通过缓慢的逐渐灌注进行。本发明的治疗剂可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。
肠胃外施用的制备物包括无菌的水溶液或非水溶液、悬液和乳浊液。非水溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及注射用有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳浊液或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、任氏葡萄糖（Ringer’s dextrose）、葡萄糖和氯化钠、乳酸化任氏液或非挥发油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于任氏葡萄糖的）等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。
本发明也涉及制备含有本发明治疗剂的药物或药学组合物的方法，所述药学组合物用于治疗病毒感染。
在本发明某些实施方式中，病毒是分子治疗的靶标。对于这种情况，可以应用小干扰RNA（siRNA）作为病毒拮抗剂来抑制或下调病毒复制。
“抑制”、“下调”、“敲除”或“沉默”意思是靶向的病毒RNAs的表达降低到低于不存在本发明siRNAs时所观察到的水平。在一个实施方式中，使用本发明的siRNAs-m抑制或下调H5N1在存在siRNAs-m时比其不存在时要明显。
本发明涉及使用短干扰核酸（siRNA）分子用于调节病毒例如H5N1增殖的化合物、组合物和方法。本发明进一步涉及使用小核酸分子通过RNA干扰（RNAi）用于调节H5N1和/或H5N1基因表达和活性的化合物、组合物和方法。具体地，本发明涉及小核酸分子，例如短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微-RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子和方法，用于调节病毒尤其是H5N1的增殖。本发明的siRNA可以是未修饰的或化学修饰的。本发明的siRNA可以被化学合成、载体表达或酶合成。本发明也可以涉及各种化学修饰的合成的短干扰核酸（siNA）分子，能够通过RNA干扰（RNAi）在细胞内调节病毒例如H5N1的增殖。使用化学修饰的siNA通过增加体内对核酸酶降解的抗性和/或改善的细胞吸收来改善天然siNA分子的各种性质。本发明的siNA分子提供有用的试剂和方法，用于各种治疗性、诊断性、靶标确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组应用。
在一个实施方式中，本发明的特征在于含有本发明siRNA分子的药物。
在一个实施方式中，本发明的特征在于含有本发明siRNA分子的活性成分。
在一个实施方式中，本发明的特征在于在药学可接受的载体或稀释剂中含有本发明siRNA分子的组合物。
但是，应当理解本发明不限于所描述的具体实施方式，同样地，当然其可以变化。也应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方式，不试图限制。
如本文所使用的，其包括附加的权利要求，单数“一”和“其”(“a”、“an”和“the”)包括复数，除非文中另有指出。因此，例如“一个多核苷酸”的指代包括超过一个这样的多核苷酸。“一个核酸序列”的指代包括超过一个这样的序列。“一个细胞”的指代包括超过一个这样的细胞。
术语“包含”、“由……组成”和“主要包括”根据它们标准的含义来定义。在本申请中，为了给每个术语加上具体含义，术语可以替换成另一个。
除非另有说明，所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所描述类似或等价的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但是现仅描述了优选的方法和材料。
本文所教导的siRNAs-m的出色的体内抗病毒效果主要归因于所鉴定的基序的独特特征。首先，siRNA-m，尤其是与其siRNA-n 相似物（counterpart）共享10个重叠的nt残基的PB1-797，在培养的细胞中在抑制病毒复制上显示出比其相应的siRNAs-n更低的效果（图3a）。截然相反的是，它们在动物中显示出比其siRNA-n相似物显著更高的抗病毒效果（图4和5）。其次，siRNAs-m在培养的细胞中显示较低的株间交叉抗病毒效果（图6b），但是在体内对两种不完全匹配的H5N1病毒株展示出全面的交叉保护效果（图6c和d）。第三，含有基序的小RNA（根据一般接受的标准被认为是不是最优的选择并且也不能用Promega公司的siRNA target designer程序鉴定出）在培养的细胞中没有显示出任何抗病毒效果，但是在体内比大多数siRNAs-n都显示更明显的抗病毒效果（图4和6g），而所述大多数siRNAs-n在培养的细胞中显示非常高的抗病毒活性（图3a）。这表明：除了siRNA-介导的抗病毒活性，该基序本身也能够刺激宿主产生更强的抗病毒效果。
siRNAs-m有效保护动物模型免于高毒性H5N1病毒致死攻击的的根本机理还不完全理解。但是，本文所鉴定的siRNAs-m不同于其他报道的可以序列依赖性或非依赖性的方式刺激哺乳动物先天免疫应答的siRNAs (14,16,20,21)，因为我们的结果显示：在不同时间点收集的小鼠血清样本或肺组织匀浆中，针对siRNAs-m处理的应答没有任何 IFN-α、IFN-γ 和TNF-α的产生。有意思的是，siRNAs-m在肺部急性期刺激局部IL-6的产生（图7d到f）。进一步分析揭示，基序的反义序列5’-GGAGU-3’与刺激IL-6产生有关（图7g）。这是本研究中鉴定的新序列基序，与先前报道的siRNA基序例如 5’-UGUGU-3’和5’-GUCCUUCAA-3’(15,16)不同。虽然已经报道病毒感染诱导的局部IL-6产生与急性肺损伤和流感病毒感染严重度有关(22,23)，但是几项研究已经发现局部IL-6产生与上皮细胞免疫防御系统上调有关(24-29)。也有报道IL-6介导的更直接的抗病毒活性与诱导能够通过破坏病毒特异性mRNAs、双链RNAs和蛋白质积累来抑制病毒复制的蛋白质和酶有关(30)。无论siRNA-m诱导的IL-6产生是否直接或间接与siRNAs-m的体内抗病毒活性有关，我们的结果表明IL-6产生在针对H5N1病毒感染的宿主防御中具有保护性。
我们的结果进一步显示siRNAs-m刺激小鼠肺组织中高水平的局部β-防卫素-4产生（图8a和b），处理后早达7个小时达到最高水平（图8c）。β-防卫素-4的产生是剂量依赖性的（图8d）。使用β-防卫素-4特异性抗体对肺组织进行免疫染色揭示siRNA-m刺激的β-防卫素-4主要在气管粘膜上皮细胞中表达，在肺泡组织中很少发现（图8e）。siRNAs-m在小鼠肺部对β-防卫素-4的刺激在mRNA和蛋白质水平均得到证实。
另外，已经发现β-防卫素对各种感染性病原，例如细菌、真菌和一些包膜病毒提供第一线的宿主防御 (33)。重要的是，β-防卫素在先天和获得性免疫之间还起到桥梁作用(34)。例如，β-防卫素作为Toll样受体-4的配体直接作用于未成熟的树突细胞，从而促进树突细胞的成熟 (35)。对于另一个实例，已经发现人β-防卫素-2在人体肺部的先天免疫和宿主防御应答中发挥重要作用(36)。也有报道小鼠β-防卫素-4，人β-防卫素-2的同源物，在动物模型中可以被结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和甲型流感病毒感染所诱导，并作为针对感染的先天免疫(37、38)。但是，siRNAs-m诱导的β-防卫素-4是否具有抗H5N1活性还没有被评价过。
为了检查siRNAs-m诱导的β-防卫素-4在先体外后体内和体内系统中的抗H5N1活性，对β-防卫素-4进行了克隆和表达。在先体外后体内系统中，β-防卫素-4显示强的抗H5N1活性，具有大约在45 μg/ml水平的IC50（图9a）。在体内系统中，一个剂量75 μg的β-防卫素-4可以保护40%的小鼠免于H5N1病毒的致死攻击。即使对于β-防卫素-4处理后没有存活的小鼠，它们也比对照能够多存活2天（图9b）。这些结果显示siRNAs-m的有效的抗H5N1效果可以归因于，至少部分可以归因于，新型的基序刺激强烈的β-防卫素应答，在保护宿主针对高致病性H5N1病毒感染中发挥重要作用。
因此，我们已经证明含有新型基序的siRNAs在体内大大增强了抗H5N1活性。此基序与先前报道的siRNA相关的基序不同。其他的基序通常靶向宿主基因的特定序列，而我们的新型基序看起来不以序列特异性的方式发挥作用。在本研究中，分别靶向4个不同病毒基因的siRNAs-m在保护动物针对高致病性H5N1病毒感染的致死攻击中提供了类似的效果。该基序在很多其他重要病毒中也曾发现过，例如SARS-CoV、RSV、AdV、HIV、HBV和HCV，因此可能提供不仅针对H5N1流感病毒，而且针对其他重要的病毒病原例如这些病毒的基于siRNA的抗病毒剂。
本文提及或引用的所有的专利、专利申请、临时申请和公开均通过引用整体并入，其包括所有的附图和表格，其程度为它们不与本说明书的明确教导相矛盾。
下面是解释实践本发明的方法的实施例。这些实施例不应解释为限制。除非另有说明，所有百分比都为重量百分比，所有溶剂混合物比例均为体积比。
实施例
实施例1:在培养的细胞中具有该基序的siRNAs（siRNA-m）显示低于不含基序的siRNAs（siRNA-n）的抑制效果
设计并合成了25个分别靶向甲型流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M、NS和HA基因的siRNA双链体，其包括4个含有新型基序的siRNAs（命名为siRNAs-m）和21个不含该基序的siRNAs（命名为siRNAs-n）（图1和表1）。
表1 本研究中设计和测试的siRNAs的序列
Figure 2009801430269100002DEST_PATH_IMAGE001
在培养的MDCK细胞中评价了这些针对H5N1甲型流感病毒株A/Vietnam/1194/04的siRNAs的抗病毒效果。实验中包括两个报道的siRNAs，PA-2087和NP-1496(8,9)，作为阳性对照。除了这两个阳性对照siRNAs之外，25个新设计的siRNAs中的10个可以在细胞培养中显著抑制病毒复制。观察到超过未处理的对照75%的抑制作用（图3a）。在所测试的siRNAs中，所有4个siRNAs-m（100%）均有效，但是21个siRNAs-n中仅6个（28.6%）有效。但是，除了PA-2109，siRNAs-m的抗病毒效果比靶向相同病毒基因的siRNAs-n低10到1000倍（图3a），表明如在细胞培养系统中评价的，siRNAs-m基本上显示低于类似的siRNAs-n的抗病毒效果。
虽然在培养的细胞中siRNAs-m显示较低的抗病毒效果，但是我们认为体内的环境可能不同。因此，我们选择4对分别靶向病毒基因PB1、PB2、PA 和NP的siRNAs-m和siRNAs-n，在感染高毒性H5N1病毒株A/Vietnam/1194/04的小鼠中进一步研究。这些成对siRNAs的靶向序列在病毒基因组中非常接近（图3b）。两个siRNAs-n PA-2087和NP-1496被包括在内，因为它们被报道在培养的细胞和体内均显示相当好的抗H5N1活性(8,9)。
实施例2：在动物模型中siRNAs-m显示出比siRNAs-n更明显的预防和治疗效果
为了评价预防效果，在病毒攻击前16-18小时，小鼠经气管内（i.t.）给予一个剂量（100、50或25 μg/剂量）的siRNAs（表2）。结果显示所有用siRNAs-m（PB1-797、PB2-719、PA-2109和NP-1122）处理的小鼠均存活（存活率=100%）（图4a、b、c和d）。相反，在小鼠模型中，siRNAs-n显示出低得多的保护效果。用100 μg/剂量PB1-788（图4a）和NP-1496（图4d）处理的小鼠存活率分别为30%和10%，但是当给予小鼠50或25μg/剂量siRNAs时，存活率降到0%。值得注意的是，siRNA-m PB1-797和siRNA-n PB1-788的序列有10个核苷酸（nt）的重叠。当用PB2-696（图4b）或PA-2087（图4c）处理小鼠时，所有小鼠均死亡（存活率=0%），尽管它们存活的天数比未处理的小鼠长1-2天。一致地，siRNAs-m处理的小鼠的体重在14天的观察期内保持在类似水平，而用siRNAs-n处理的小鼠的体重则从攻击后第6天下降（图4e-h）并显示病态体征。结果表明siRNAs-m可提供针对H5N1病毒高毒株的有效预防性效果，比包括两个他人已经报道的有效siRNAs(8,9)在内的siRNAs-n效果明显的多（P< 0.01 – 0.03）。
表2. 在小鼠模型中评价siRNAs-m和siRNAs-n的预防性和治疗性抗病毒效果的处理方案
Figure 2009801430269100002DEST_PATH_IMAGE002
为了评价siRNAs的治疗效果，小鼠经鼻内（i.n.）以24小时的间隔施用100 μg/剂量，4个剂量的siRNA-m NP-1122和siRNA-n NP-1496。在攻击后24小时开始处理（表2）。如图4i所示，用siRNA-m (NP-1122)处理的小鼠存活率为60%，显著高于siRNA-n (NP-1496) 处理的小鼠 (0%) (P < 0.02)。与此一致的是，前者的体重损失也比后者少（图4j）。这些结果已证明siRNAs-m在动物模型中提供了相当可观的治疗效果，而siRNAs-n没有。
实施例3. siRNAs-m有效抑制肺部病毒复制和组织损伤
为了进一步比较用siRNAs-m和siRNAs-n处理的小鼠之间肺部病毒复制和组织损伤的抑制作用，接受预防性处理的小鼠在攻击后6天被处死，收集它们的肺脏用于检测病毒复制和病理学变化。通过TCID 50测试的病毒滴度在siRNAs-m处理的小鼠肺部组织中检测不到，而用siRNAs-n处理的小鼠病毒滴度与未处理的对照类似或甚至更高（图5a）。一致地，获自siRNAs-m处理的小鼠肺部组织中用实时RT-PCR测量的病毒RNA拷贝比用siRNAs-n处理的小鼠低大约50-到100-倍（图3b）。肺部样本的组织病理学检验进一步揭示：来自于siRNAs-m处理的小鼠的肺部切片没有显示明显的病理学变化，其与来自未感染的小鼠（正常）的肺部切片类似，而来自于用siRNA-n处理的小鼠和来自于未处理的小鼠（对照）的肺部切片显示出肺泡损伤和间质炎症浸润（图5c）。这些结果已进一步证明：siRNAs-m相比siRNAs-n对于小鼠肺部病毒复制和病理学损伤能够提供更强的抑制作用。
实施例4. 基序对于体内抗病毒活性的重要性
siRNAs-m在培养的细胞中显示低得多的抗病毒效果但在体内显示更高活性的上述结果表明基序可能在siRNAs-m的体内抗病毒效果中发挥重要作用。为了证明这一点，我们选择了一个siRNA-m，PA-2109，用于进一步研究，其与两种H5N1病毒株A/Shen Zhen/406H和A/Hong Kong/156/97相比具有一个nt错配（图6a）。在培养的细胞中没有检测到PA-2109针对这两种不完全匹配的病毒株显著的抗病毒效果（图6B）。结果显示针对不完全匹配的病毒株的抗病毒效果比针对完全匹配的病毒株A/Vietnam/1194/04至少低8倍（图7b）。在小鼠中给予一个剂量25 μg的PA-2109预防性处理（表2），然后分别用这两种不完全匹配的病毒株攻击，进一步评价了PA-2109针对不完全匹配的病毒株的体内抗病毒效果。如图6c和d所示，与其在预防性处理中观察到的针对完全匹配的病毒株的抗病毒效果类似（图4e和f），所有处理的小鼠均存活（存活率=100%），并且在2周的观察期中它们的体重保持在类似的水平，表明siRNA-m可以保护小鼠免于被不完全匹配的H5N1病毒株致死攻击至类似的程度。我们在培养的细胞中和体内进一步测试了小RNA双链体PB2-1291的抗病毒活性，其靶向病毒的PB2基因。PB2-1291含有该基序，但是根据一般接受的标准不是最佳的siRNA。PB2-1291在细胞培养中不显示任何抗病毒活性（数据没有显示），但是小鼠存活率为20%，伴随存活时间增加2天（图6e）。一致地，被处理的小鼠体重损失的发生时间也比未处理的对照小鼠延迟2天，在攻击后12天，存活小鼠的体重增加（图6e）。虽然PB2-1291的体内抗病毒效果不如siRNAs-m，但仍然比大部分测试的siRNAs-n即PB2-696、PA-2087和NP-1496更明显。这些结果进一步证实独特的基序在诱导siRNAs-m有效的体内抗病毒效果中发挥重要的作用。
实施例5: siRNAs-m刺激小鼠肺部IL-6产生
由于已有报道siRNAs可以刺激体内预料不到的非特异性效果，例如先天免疫应答(14-16)，所以在不同时间点从小鼠中收集的血清样本和肺部匀浆中，测量了先天免疫应答的重要指示因子IFN-α、IFN-γ、TNF-α和IL-6（表3）。分别在处理后7、15、24和48小时收集的血清样本中IFN-α、IFN-γ、TNF-α和IL-6的水平没有增加（图2）。IFN-α、IFN-γ和TNF-α的水平在处理的小鼠的肺部匀浆中也检测不到（图7a、b和c）。有意思的是，在接受被包裹的（encapsulated）siRNA-m PB2-719（复合体）的小鼠肺部匀浆中检测到高水平的IL-6，但是在接受裸PB2-719、被包裹的siRNA-n PB2-696、递送聚合物或PBS的小鼠样本中没有发现（图7d）。处理后3小时IL-6水平增加，7小时达到峰值，然后10小时降低到低水平（图7e）。还观察到剂量依赖性效果（图7f）。并且，证明了siRNA-m的反义链而不是正义链负责刺激IL-6产生（图7g）。选择可选的靶向另一个病毒基因的siRNA-m，PA-2109重复该试验。结果显示被包裹的siRNA PA-2109在处理后7小时诱导出类似水平的IL-6（图7h），表明肺部IL-6的产生的确由该基序诱导，而不是由PB2-719的特异序列诱导。总之，siRNAs-m不可能诱导强的先天免疫应答，但是它们刺激小鼠中IL-6的早期产生。
实施例6：siRNAs-m刺激小鼠肺部强的β-防卫素-4产生
用siRNAs-m和siRNAs-n处理小鼠6小时后收集肺组织，然后用430 2.0 array GeneChip (Affymetrix, Inc, Santa Clara, CA)测试mRNAs的产生，使用Gene-Spring 10软件 (Agilent Technologies)，MA算法和基因本体注解（gene ontology annotation）进行分析。结果显示siRNA-m刺激的β-防卫素-4和IL-6的产生分别是siRNA-n诱导的大约29倍和14倍。通过使用实时RT-PCR检测mRNA产生进一步证实该结果。在接受被包裹的siRNA-m（PB2-719和PA-2109）处理的小鼠肺部匀浆中检测到高水平的β-防卫素-4的mRNA，但是在接受被包裹的siRNA-n（PB2-696和PA-2087）、递送聚合物（PEG/PEI）或PBS的小鼠样本中没有检测到（图8a）。与IL-6刺激类似，siRNA-m的反义链而非正义链负责刺激β-防卫素-4产生（图8b）。处理后3小时β-防卫素-4水平增加，7小时达到峰值，处理24小时后降到低水平（图8c）。结果还证明β-防卫素-4的产生是剂量依赖性（图8d）。并且，证明了siRNAs-m比siRNAs-n刺激气管膜上皮细胞产生高得多水平的β-防卫素-4（图8e）。这些结果证明siRNAs-m可以在小鼠中在mRNA和蛋白水平上刺激β-防卫素-4的早期产生。
实施例7: siRNAs-m诱导的β-防卫素-4在针对先体外后体内和体内H5N1病毒感染中显示出强活性
为了测试siRNAs-m诱导的β-防卫素-4是否在针对H5N1病毒感染中发挥重要作用，我们在基因优化后使用大肠杆菌系统克隆并表达了β-防卫素-4。纯化后，表达的β-防卫素-4在MDCK细胞培养中显示出强的抗H5N1病毒感染，IC50达到大约45 μg/ml 水平（图9a）。在动物模型中进一步评价了β-防卫素-4的抗H5N1活性。结果显示仅用一个剂量75 μg的β-防卫素-4处理就可以保护40%的小鼠免于H5N1病毒的致死攻击。即使对于β-防卫素-4处理后没有存活的小鼠，它们也比对照能够多存活大约2天（图9b）。这些先体外后体内和体内结果证明，siRNAs-m诱导的β-防卫素-4具有强的抗H5N1活性。
实施例8:材料与方法
细胞培养和病毒
Madin-Darby犬肾 (MDCK)细胞在添加10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素和链霉素（P/S）的极限必需培养基（MEM）（GIBCO BRL）中，在37℃和5% CO2条件下维持。等份的甲型流感病毒株A/Vietnam/1194/2004、A/Shen Zhen/406H和A/Hong Kong/156/97的储液在37℃下的鸡胚中生长。病毒接种48小时后收集含病毒的尿囊液并保存在-80oC。使用血凝测定和TCID50测量病毒滴度。将储液系列稀释之后测定小鼠中50%致死剂量（LD50）。所有涉及H5N1病毒的实验都在香港大学微生物系的生物安全水平3级的设施内进行。
siRNAs的制备
使用Promega (http://www.promega.com/siRNADesigner/program/)的siRNA target designer程序设计分别靶向H5N1甲型流感病毒PB1、PB2、PA、NP、M、NS和HA基因的siRNAs（图1和表1）。BLAST结果证实所靶向的区域与人类和小鼠基因组没有同源性。本研究所使用的所有siRNAs均通过化学合成，并且以脱盐、预退火或退火双链体形式（Invitrogen或Qiagen, USA）提供。
培养的细胞中抗病毒效果的评价
使用LIPOFECTAMINETM RNAiMAX (Invitrogen, USA)，按照供应商的说明书将siRNAs转染到24孔板中的MDCK细胞中。转染细胞在转染后16-18小时，每孔用100 TCID50病毒感染。在48小时收集上清，通过如前所述TCID50和RT-PCR检测病毒载荷 (17,31)。
PEG8-PEI1.8的制备
甲氧基N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇（mPEG-NHS）如前所述制备(32)。成通过向磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）中加入1g高分支的PEI（1.8 kDa, Aldrich）和8.8g mPEG-NHS来合成PEG8-PEI1.8，并将溶液在室温下磁力搅拌过夜。得到的溶液在蒸馏水中通过膜透析（分子量截留3.5kDa）进行纯化48小时，然后冻干得到白色粉末。根据1H NMR（Varian 300-MHz NMR spectrometer, CA, USA）在氘化氯仿中的测定，PEI中的PEG嫁接密度为8。
体内抗病毒效果评价
BALB/c雌性小鼠，6-8周龄，饲养在生物安全3级环境，并允许无限量获得标准颗粒饲料和水。所有实验方案均遵守批准的生物安全3级动物设施标准操作规程，并由动物伦理委员会批准。siRNAs以氮/磷重量比为7被包裹到PEG8-PEI1.8中。将混合物涡旋20秒，然后在室温下孵育30min。小鼠气管内给予1个剂量的siRNA混合物用于预防，或鼻内给予4个剂量的siRNAs用于治疗，并且鼻内接种10 LD50的病毒（表2）。对照小鼠给予PBS和/或PEG8-PEI1.8。监测存活率、体重和一般状况21天或直到死亡。对于病毒学和病理学测试，小鼠在攻击6天后处死。收集血液、肺、脾和大脑样本。
先天免疫应答分析
小鼠气管内给予裸的和/或被包裹的siRNAs-m、siRNA-n、PEG8-PEI1.8和PBS（附表3）。在不同时间点处死小鼠，收集血液和肺部样本。用ELISA测定来测试血清样本和肺部匀浆中的IFN-α、IFN-γ、TNF-α和IL-6。
统计学分析
存活时间和存活率的统计学分析分别使用Kaplan-Meier时序检验和卡方测试进行。在其他情况下，统计分析使用Stata统计学软件通过配对双尾斯氏t测试来计算。以P ≤ 0.05认为结果具有显著性。
登录号
A/Vietnam/1194/04、A/Hong Kong/156/97和A/Shenzhen/406H H5N1病毒序列的GeneBank登录号分别对于NP为AY651498、AF036359和EF137709，对于PA为AY651610、AF036361和EF137711，对于PB1为AY651664、AF036362和EF137712，对于PB2为AY651718、AF036363和EF137713。
应当理解本文所述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，其各种修改或变化对于本领域普通技术人员应是可以想到的，并被包括在本申请的精神和范围之内。另外，本文所公开的任何发明或其实施方式中的任何元素或限制可以与本文所公开的任何其他发明或其实施方式中的任何和/或所有其他元素或限制组合（单独或以任何组合方式），并且所有这些组合都被考虑在本发明的范围之内，但不限于此。
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序列表
 
<110>  香港大学
      
 
<120>  有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法
 
<130>  IP00295-PCT
 
<150>  US 61/121,614
<151>  2008-12-11
 
<160>  37
 
<210>  1
<211>  20
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  1
GACACUGAAC ACAAUGACAdT dT    21
 
<210>  2
<211>  20
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<223> 
 
<400>  2
GUGAGAAACU UGAGCAAUCdT dT    21
                                        
 
<210>  3
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<223> 
 
<400>  3
UUGAGCAAUC UGGACUCCCdT dT    21
 
 
<210>  4
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  4
GAGGGGAUAC GCAAAUCCAdT dT    21
 
 
<210>  5
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<223> 
 
<400>  5
GGAGGACCAA AUCUAUACAdT dT    21
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>
 
<400>  6
GCAUUUGACU CAAGGGACCdT dT    21
 
 
<210>  7
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
<400>  7
GGGAACAGAU GUACACUCCdT dT    21
 
 
<210>  8
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
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<400>  8
GAAACCCAGG GAACAGAGAdT dT    21
 
<210>  9
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
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<223> 
<400>  9
GAUACUGUCC AGAUAAUAAdT dT    21
 
 
<210>  10
<211>  23
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
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<400>  10
GAAACACCGA UUUGAAAUAdT dT    21
 
                                          
 
 
<210>  11
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  11
GACACGGAGG GAAGUUCAUdT dT   21
 
 
<210>  12
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
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<400>  12
GCUUAAUGCG UCUUGGUUCdT dT    21
 
 
<210>  13
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  13
GCAAUUGAGG AGUGCCUGAdT dT    21
 
 
<210>  14
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<400>  14
GGUUCAACUC CUUCCUCGCdT dT    21
 
 
<210>  15
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<223> 
 
<400>  15
GCUAAUUCUG UACGACAAAdT dT   21
 
 
<210>  16
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<223> 
 
<400>  16
GGACUCCAAC ACUCUUGAAdT dT    21
 
 
<210>  17
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<223> 
 
 
<400>  17
GAGGAAACAC CAACCAGCAdT dT    21
 
<210>  18
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<223> 
 
<400>  18
GGAUCUUAUU UCUUCGGAGdT dT    21
 
 
<210>  19
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<223> 
 
<400>  19
GCAACACCAA GUGUCAAACdT dT   21
 
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<400>  20
GGAAUAUGGU AACUGCAACdT dT    21
 
 
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<400>  21
GCAGGAAAGA ACACCGAUCdT dT  21
 
 
 
<210>  22
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
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<400>  22
GAAAGAACAC CGAUCUCGAdT dT   21
 
 
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  23
ACAGCAGAGU GCUGUGGAUdT dT    21
 
 
<210>  24
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
 
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<223> 
 
<400>  24
AAAUGGACCA GGCAAUAAUdT dT  21
 
 
<210>  25
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<220>
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<400>  25
GAUGAGGAUG GGAGACUUCdT dT   21
 
 
<210>  26
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GAAGAAAUAA GGUGGCUGAdT dT   21
 
 
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<213>  人工序列
 
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<400>  27
GUGGAGCAAG AGAUAAGAGdT dT   21
 
 
<210>  28
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<213>  人工序列
 
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<400>  28
GGGAGUCCAG AUUGCUCAAdT dT 21
 
 
<210>  29
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
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<400>  29
GAUUGCUCAA GUUUCUCACdT dT  21
 
 
<210>  30
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  30
GGAGUGUACA UCUGUUCCCdT dT  60
         
 
 
<210>  31
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  31
GGUCCCUUGA GUCAAAUGCdT dT  21
 
 
 
<210>  32
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>
 
<400>  32
GCGAGGAAGG AGUUGAACCdT dT  21
 
 
 
<210>  33
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  33
UCAGGCACUC CUCAAUUGCdT dT  21
 
 
<210>  34
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
<400>  34
UUCAAGAGUG UUGGAGUCCdT dT  21
 
 
<210>  35
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<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  35
CUCCGAAGAA AUAAGAUCCdT dT  21
 
<210>  36
<211>  21
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<213>  人工序列
 
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<223> 
 
<400>  36
AUGCAUCAAC UCCUGAGACdT dT  21
 
<210>  37
<211>  21
<212>  RNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 
 
<400>  37
GUCUCAGGAG UUGAUGCAUdT dT    21

Claims (19)

1.一种siRNA，其包含基序GGAGU或反向基序ACUCC。
2.根据权利要求1的siRNA，其包含选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
3.根据权利要求1或2的siRNA在制备用于在对象中刺激IL-6产生的试剂中的用途。
4.一种组合物，其包含根据权利要求1或2的siRNA和药学可接受的载体。
5.一种筛选潜在抗病毒剂的方法，其包括：
获得根据权利要求1的siRNA；
在所述siRNA的抗病毒性质可以被观察的条件下，使所述siRNA与培养的细胞接触；并
将所述siRNA的任何抗病毒性质与对照比较；其中显示高于对照的抗病毒性质的siRNA被确定为潜在抗病毒剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述对照选自阴性对照、未处理细胞培养物和阳性对照。
7.根据权利要求6的方法，其中所述阳性对照为siRNA，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
8.一种筛选潜在抗病毒剂的方法，其包括：
产生一个根据权利要求1的siRNA；
在所述siRNA的抗病毒性质可以被观察的条件下，将所述siRNA施用给动物模型，并用病毒攻击所述动物；以及
测定所述siRNA是否在体内显示抗病毒性质。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括将所述siRNA的任何抗病毒性质与对照比较；其中显示高于所述对照的抗病毒性质的siRNA被确定为潜在抗病毒剂。
10.根据权利要求9的方法，其中所述对照选自阴性对照、未处理的动物和阳性对照。
11.根据权利要求10的方法，其中所述阳性对照为siRNA，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的序列。
12.根据权利要求5的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质，优选为抗H5N1性质。
13.根据权利要求6的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质，优选为抗H5N1性质。
14.根据权利要求7的方法，其中所要观察的抗病毒性质为抗甲型流感病毒性质，优选为抗H5N1性质。
15.根据权利要求8的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒，优选H5N1。
16.根据权利要求9的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒，优选H5N1。
17.根据权利要求10的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒，优选H5N1。
18.根据权利要求11的方法，其中所述病毒为甲型流感病毒，优选H5N1。
19.根据权利要求1或2的siRNA在制备用于在对象中刺激β-防卫素产生的试剂中的用途。
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