CN101880677B

CN101880677B - 针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用

Info

Publication number: CN101880677B
Application number: CN2009102368318A
Authority: CN
Inventors: 吴志强; 金奇; 杨耀武; 王建伟
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2029-11-06
Also published as: CN101880677A

Abstract

本发明涉及一组针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因的siRNA及其制备方法和应用。选取2009新甲型流感病毒多聚酶(PB2、PB1、PA)基因中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30(优选，15-27，更优选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞实验证明，以2009新甲型流感病毒基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对的siRNA，可以阻断该基因的复制与表达，从而有效地抑制2009新甲型流感病毒毒株在细胞和动物模型的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。

Description

针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域和生物信息学领域。本发明涉及流行性感冒的预防与治疗。本发明还涉及核酸技术领域。具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及具有抑制2009新甲型流感病毒复制与感染和/或2009新甲型流感病毒基因表达的小分子干扰核糖核酸及其应用。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，是一种重要的公众健康问题。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大流行，它在动物中广泛分布，也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。

流行性感冒是世界上很猖獗的传染病，曾多次席卷全球，给人类带来巨大灾难。流感病毒感染后容易发生继发性感染，死亡率非常高。由于流感病毒传播迅速、流行广泛，抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定，因此可引起局部地区流行或世界性大流行。尤其是自2009年三四月份在美国和墨西哥鉴定出新甲型流感病毒开始，2009新甲型流感病毒全球大流行爆发，在世界范围内造成几十万人感染，其中数千人死亡。世界卫生组织于2009年6月11日正式将流感大流行警戒级别从五级升为最高的六级，宣布世界已经处于2009年流感大流行。在这种情况下，对2009新甲型流感的防治迫在眉睫。

流感病毒属正粘病毒科，是有包膜的单负链、分节段的RNA病毒。甲型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，一般认为：RNA1节段编码PB2蛋白；RNA2编码PB1；RNA3编码PA；RNA4编码HA；RNA5编码NP；RNA6编码NA；RNA7编码M1和M2；RNA8编码两个非结构蛋白NS1和NS2。其中，PB1、PB2、PA是三种依赖RNA的RNA多聚酶成分，PB1的功能是识别和结合由宿主细胞多聚酶II转录的帽子结构(7mGpppGPNm)，PB2的功能是负责启动后新生的病毒颗粒RNA合成的延伸，PA的功能至今不完全明了，可能是一种激酶或一种解旋结构的蛋白。核蛋白NP是病毒的主要结构蛋白，其与RNA结合成核糖核蛋白体复合体，参与RNA转录，同时它也是机体细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原之一。

目前，预防流感的较好措施是接种疫苗，但由于流感病毒编码表面抗原的基因容易发生突变或重配，致使表面抗原发生变异，出现新的抗原，使原有的疫苗不再有效。除疫苗外，也有抗流感病毒的药物正在积极开发。至今，国际上抗流感的药物主要是神经氨酸酶抑制剂，但这些药物存在副反应和耐药性等问题，所以目前世界上还没有一种治疗流感的有效药物。鉴于近两年流感病毒活动频繁，应用现代科技手段发展方便有效的抑制流感病毒感染的方法就显得尤为重要。

RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术是近年来新发展起来的一种高效的、特异性强的基因阻断技术，是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制，它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制，广泛存在于各种生物，如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物，包括人类。简言之，该技术就是当把21-23个核苷酸长的双链RNA片段(dsRNA)导入细胞或组织中后，后者会使目的mRNA被切割，从而降解mRNA，阻碍或阻止了由mRNA翻译成相应蛋白质的过程。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值。通过RNAi技术，选择不同的靶位点应用siRNA抑制病毒复制与侵染已在多种病毒中公开(Adelmen et al.，Insect Mol Biol，10：265-273(2001)；Gitlin et al.，Nature，418，430 434(2002)； Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，100(5)：2718-2723(2003)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，101(23)：8676-8681(2004)；Hu WY et al.，Curr Biol，12：1301-1311(2002)；Haasnoot et al.，Biomed Sci，2003，10：607-616(2003)；Chen W et al.，J.Virol，78(13)：6900-7(2004)；Jia Q et al.，J Virol，77：3301-3306(2003)；Park WS et al.，Nucleic Acids Res，30(22)：4830-4835(2002)；Capodici J et al.，J Immunol，169：5196-5201(2002)；Coburn GAet al.，J Virol，76：9225-9231(2002))。

2002年12月20日，Small RNA&RNAi被Science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与人类基因组计划(human genomics program，HGP)相提并论的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级活动。人们对小RNA分子的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病和肿瘤等疾病的根治，开辟新的治疗途径，具有极其重要的理论和实际意义，它必将对生物学和医学的发展产生深远的影响。

依赖于RNA的多聚酶(PB2、PB1和PA)是甲型流感病毒在感染细胞内进行复制所必需的。核蛋白(NP)不仅是甲型流感病毒在感染细胞内进行复制和成熟所必须的，同时它也是病毒最重要的结构蛋白。设计并合成特异性针对编码聚合酶基因和核蛋白基因序列全长的多种dsRNA，并将其同时导入患者体内，可以选择性降解病毒mRNA，阻断其蛋白表达，使甲型流感病毒在感染细胞中无法完成复制过程，从而切断病原体在体内的代谢途径，有效控制疾病进程。由于甲型流感病毒是RNA病毒，而设计的dsRNA与病毒的vRNA和cRNA都具有序列同源性，因而采用RNA干扰手段，有可能直接引发病毒vRNA和cRNA的降解，从而在根本上清除感染细胞中的病毒。

本发明应用RNAi技术，通过siRNA进行2009新甲型流感病毒的抑制研究，为抑制流感病毒的复制与感染提供新的途径，也为流行性感冒的预防与治疗提供新的思路。有效的siRNA靶位点不仅可以作为新的化学药物靶位点，而且siRNA可以直接作为强有效的药物用于流行性感冒的预防与治疗，特异性强，不易引起副反应，给药方便、快捷，避免现行疫苗对突变流感病毒和其他动物流感病毒引起的突发流行性感冒的不能保护以及化学药物的副反应。我们认为目前研制和开发治疗流行性感冒的dsRNA药物不但具有实际可操作性而且拥有良好的应用前景。

这里引用的所有出版物、专利和专利申请，无论前述或后述，在此都以其完整形式引入作为参考。

发明内容

本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：

1.分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列为流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸。

2.如段落1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列为SEQ IDNO：40-SEQ ID NO：60中任意一条序列。

3.与段落1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。

4.包含段落1-3任一个的序列的核酸构建体。

5.段落1-4任一个所述的siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。

6.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含段落1-3序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。

7.如段落6所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段和反义 RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。

8.如段落7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。

9.段落6-8任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选15-27，最优选19-23，如19、20或者21)个。

10.段落6-9任一个所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基对。

11.如段落6-10任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为具有10-30(优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。

12.如段落6-11任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如约50％。

13.如段落6-12任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。

14.如段落6-13任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段包含与段落1或2所述siRNA靶序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补的序列，正义RNA片段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。

15.如段落6-14任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。

16.如段落6-15任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。

17.如段落6-16任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。

18.如段落6-17任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQ ID NO：21-40，正义RNA片段序列包含SEQ ID NO：41-60。

19.如段落6-18任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％(即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同一性。

20.如段落6-19任一个所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其中，用化学合成方法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。

21.DNA序列的组合，其包括编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列，所述正义RNA片段包含段落1-3的序列所编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。

22.段落21的DNA序列的组合，其中正义RNA片段和反义RNA片段如段落7-20任一个中所定义。

23.段落21的DNA序列的组合，第一DNA序列和第二DNA序列包含在两种不同的DNA分子中，这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一DNA序列有效连接的第一启动子和与第二DNA序列有效连接的第二启动子。

24.段落21的DNA序列的组合，其中，第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中，优选地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA链中；更优选地，所示正义RNA片段和反义RNA片段表达为一种RNA分子，还优选的是，所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区域；所述DNA分子可以另外含有与第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效连接的启动子。

25.包含段落21-24任一个的DNA组合的载体或者载体组合。

26.分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是A549传代细胞，其中，所述细胞包含段落21-24任一个的DNA组合或者段落25所述的载体或者载体组合。

27.一种动物模型，其中，所述动物模型包含段落21-24任一个的DNA组合或者段落25所述的载体或者载体组合。

28.如段落27所述的动物模型，其中，所述的动物模型为9-11日龄的鸡胚。

29.包含段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合的组合物，特别是药物组合物。

30.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病。

31.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。

32.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。

33.抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予段落29的组合物。

34.抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，将宿主细胞与段落29的组合物接触。

35.以上段落任一个的主题，其中流感病毒是2009新甲型流感病毒，特别是2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009(H1N1)。

以下结合附图进一步说明本发明。基于这些说明，本发明的上述方面和其它方面对于本领域技术人员而言是明显的。

附图简述

图1：是siRNA对靶序列表达的抑制效果图。应用针对PB2、PB1、PA和NP基因不同靶位点的2009新甲型流感病毒特异siRNA，筛选能敲低靶序列-Fluc融合基因的表达，即有效抑制A549细胞中萤火虫荧光素酶表达的siRNA。图示对照为转染无关siRNA及荧光素酶表达载体的细胞，其它为转染能表达针对PB2、PB1、PA和NP基因不同靶位点特异siRNA及荧光素酶表达载体的细胞。纵坐标表示以转录活性内对照的海肾荧光素酶为标准化的萤火虫荧光素酶活性。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。

图2：是病毒基因组RNA抑制情况使用2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA于细胞水平检测其对2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009(H1N1))RNA合成的抑制情况。图示对照为转染无关siRNA的细胞，其它为转染2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA的细胞。对照靶基因检测指示各个siRNA作用的靶基因被抑制的情况。NP基因检测指示病毒主要结构蛋白基因NP被抑制的情况。实验内参基因为GAPDH。图中每一个数据代表三次重复实验的平均值。

图3：是病毒主要结构蛋白NP蛋白抑制情况使用2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA于细胞水平检测其对2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009(H1N1))蛋白合成的抑制情况。图示对照为转染无关siRNA的细胞，其它为转染2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA的细胞。柱状图指示转染了siRNA的实验组与对照组比较后的抑制情况，实验内参基因为β-Tubulin。图中每一个数据代表三次重复实验的平均值。

图4：融合靶序列的萤火虫荧光素酶表达载体示意图

具体实施方式

本发明人选取2009新甲型流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30(优选，15-27，更优选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞和动物模型攻毒实验证明，以2009新甲型流感病毒基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对的siRNA，可以阻断该基因在细胞模型中的复制与表达，从而有效地抑制不同2009新甲型流感病毒毒株在细胞中的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。

本发明的一个目的就是提供一组流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因组上的小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列及其应用。其中当药物，包括所筛选出的小干扰RNA(siRNA)序列与这些靶序列中的一个或几个特异性地作用，可以阻断引起流行性感冒的流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因在人体或动物体内的复制或表达，从而抑制流感病毒的复制与感染，达到治疗流行性感冒的目的。

本发明的另一目的就是提供一组用于预防和治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒的靶向小分子干扰核糖核酸、DNA、其载体、宿主细胞及其制备方法和应用。

发明人相信，本发明的原理在于特异性siRNA针对病毒基因组保守序列，抑制病毒的mRNA(但本发明并不受该原理的束缚)。针对流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)多聚酶(PB2、PB1、PA)、病毒的virion RNA(vRNA)和互补RNA(cRNA)，设计并化学合成siRNA及制备含特异siRNA编码DNA的质粒，并将此化学合成siRNA或含特异siRNA编码DNA的质粒转入选定的靶细胞进行抗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的研究。通过特异性抑制病毒的多聚酶的转录和复制途径，最终为人类和动物提供治疗和预防流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)感染的快速便宜的有效药物。

本发明所要解决的问题是针对病毒基因组靶序列提供攻击流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的小干扰RNA分子(siRNA)，用于预防或治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)感染引起的流行性感冒及与其密切相关的呼吸道疾病。为此本发明采用权利要求书中定义的技术方案。

在一方面，本发明提供了分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其选自：

(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；

(2)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20中任意一条序列；

(3)与(1)或者(2)的序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列；

(4)从(1)或者(2)的序列发生了1-5个(优选1-3个，更优选1-2个，最优选1个)核苷酸插入、替代和/或缺失。

为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math 2：482)；Needleman和Wunsch的同一性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。

适合于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

因此，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在其它实施方案中，本发明指向在中等严紧条件下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

所述靶序列可以是流感病毒多聚酶PB1、PB2、PA或者核蛋白NP编码基因、多聚酶PB1、PB2、PA或者NP编码基因的转录产物、cDNA、或者其mRNA。所述的靶序列可以是流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子RNA序列(virion RNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互补RNA序列(complementary RNA，cRNA)。

优选地，所述siRNA靶序列为与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20中任意一条序列的连续10个(优选15个，更优选18个)核苷酸序列相同的序列。更优选的是，所述的siRNA靶序列为与SEQ ID NO：1-SEQID NO：20所示的任意一条序列。

本发明提供了一系列流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因上可以被siRNA或反义核酸序列攻击的靶序列，因此，凡是可以作用于本靶序列以阻断病毒基因在感染的人或动物体内复制或表达的核苷酸片段都是本发明所要求保护的范围。

本发明还提供上述siRNA靶序列的互补序列。

本发明还提供包含siRNA靶序列或其互补序列的核酸构建体。

本发明还提供siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。所述抗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)药物优选治疗或预防流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)所引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物。

另一方面，本发明提供小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含本发明靶序列编码的RNA序列，正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。

在本发明中，术语“小分子核糖核酸”、“小分子干扰核糖核酸”或“siRNA”、“本发明核糖核酸”可互换使用，它们都指能够抑制流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)靶基因表达、包括正义RNA片段区域(例如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：40中任意一条序列)和反义RNA片段区域(例如SEQ ID NO：41-SEQ ID NO：60中任意一条序列)的核糖核酸(RNA)。

相关地，本发明还提供DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶序列所编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。

在本发明的这方面，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。

例如，本发明的siRNA可以为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。

正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选15-27，最优选19-23，如19、20或者21)个。但也可以更长或者更短。

在正义RNA片段和反义RNA片段形成的双链RNA的互补区域至少有10个(优选15个，更优选18个，如19、20或者21个)碱基对。优选地，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。

在一个实施方案中，本发明的siRNA为具有10-30(优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。

在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如约50％。

在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。显著的同一性是指至少60％，例如70，80、90％同一性。

优选的是，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％ (即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无显著同一性。

在一个具体实施方案中，反义RNA片段包含与如下所述siRNA靶序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补的序列：

(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2PA或者核蛋白NP编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；或者

(2)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20中任意一条序列；

正义RNA片段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。

在另一个具体实施方案中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。

在另一个具体实施方案中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个(例如2、3、4、5个)脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。

优选地，所述反义RNA片段序列包含SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：36所示的任意一条序列或与前述序列有连续10个(优选15个，更优选18个)碱基相同的序列。

特别优选的是，所述干扰核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQID NO：21-40，正义RNA片段序列包含SEQ ID NO：41-60。

在一个优选实施方案中，反义RNA片段包含与本发明靶序列编码的RNA序列全长互补的RNA序列。

在该实施方案中，优选地，在所述正义RNA片段中，在本发明靶序列编码的RNA序列3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为正义RNA片段的3’末端；而且，在所述反义RNA片段中，在与本发明靶序列编码的RNA序列全长互补的RNA序列3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为反义RNA片段的3’末端。

在一个具体例子中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为21 个核苷酸，正义RNA片段和反义RNA片段各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两个RNA片段除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链形式存在。

本发明的小分子干扰核糖核酸(siRNA)可用化学合成方法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。

本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子等。

本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列可以是流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子RNA序列(virion RNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互补RNA序列(complementary RNA，cRNA)。具体地，本发明所述的小干扰RNA可以由序列表中的至少一个序列组成。

本发明的siRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。在一个实施方案中，将候选siRNA在病毒感染前和/或病毒感染后导入体外培养细胞或体内，通过病毒滴度降低筛选出能有效防治流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的小干扰RNA。

在本发明的DNA序列的组合中，第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在两种不同的DNA分子中。这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一DNA序列有效连接的第一启动子和与第二DNA序列有效连接的第二启动子。

第一DNA序列和第二DNA序列也可以包含在同一种DNA分子中。优选地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA链中。更优选地，所示有义RNA片段和反义RNA片段表达为一种RNA 分子。还优选的是，所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区域。同样，所述DNA分子可以另外含有与第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效连接的启动子。

可用于本发明中的启动子可以是天然靶基因的天然启动子、异源启动子、组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或者发育调节型启动子。

当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述DNA分子可以另外在编码有义RNA片段和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。该接头可以包含一种含有功能基因如选择性标记基因的表达盒。或者，所述接头可以包含调节序列如内含子加工信号。

当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述有义RNA片段和反义RNA片段也可以表达为两种RNA分子。此时，优选地，第一DNA序列与第一启动子有效连接，而第二DNA序列与第二启动子有效连接；或者，第一DNA序列和第二DNA序列可以与一种双向启动子有效连接。

当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，在所述DNA分子中第一DNA序列和第二DNA序列可以包含于所述DNA的互补链中。

在这方面，所述第一DNA序列和第二DNA序列优选可以瞬时转染入宿主细胞中。但是，在某些实施方式中，所述第一DNA序列和第二DNA序列也可以稳定地整合在宿主细胞的基因组中。

在另一方面，本发明还提供包含本发明DNA组合的载体或者载体组合。该载体或者载体组合可以是一个载体或者多个载体，只要它们合在一起包含本发明的DNA组合即可。例如，本发明的DNA组合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在同一个载体中。或本发明的DNA组合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在不同的载体中。

所述载体可以是质粒、病毒颗粒及其他载体形式。表达载体中的本发明第一DNA序列和第二DNA序列可以可操作地和表达控制序列连接，表达控制序列包括但不限于用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择标记。

本发明还包括上述流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)siRNA表达载体的构建。siRNA表达载体可采用本说明书中公开的或者本领域已知的方法构建。本发明所构建的流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)siRNA表达载体经PCR、序列测定表明构建成功，在体外感染流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的细胞模型中，通过检测实验证实表达载体表达的siRNA能较为明显地抑制病毒复制与感染。

另一方面，本发明还提供分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是A549细胞，其中，所述细胞包含本发明的DNA组合或者载体或者载体组合。所述宿主细胞可以是用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，真菌如酵母，昆虫细胞如sf9，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)如非洲绿猴肾细胞(Vero)、CHO或人类细胞等。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为A549细胞。

通过本文的阐述，适当的载体、宿主细胞的选择都在本领域技术人员的知识范围内。

在另一方面，本发明还提供包含本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合的组合物，特别是药物组合物。

本发明提供的小干扰RNA分子(siRNA)能够特异性地针对流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)，它可能通过细胞内的RISC(RNA-induced silencing complex)有效地降解流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的蛋白信使核糖核酸分子。本发明siRNA可以直接阻断病毒基因物质的复制、病毒的繁殖与感染，还可以抑制其和致病密切相关蛋白质的合成，为治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒及与其密切相关的呼吸道疾病找到了新的有效的手段。本发明的抗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的siRNA的作用效果显著，无副作用，将在流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)的防治中起到重要的作用。

因此，在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病。

本发明还涉及了上述宿主细胞在制备治疗和/或预防流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物中的应用。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述宿主细胞为狗肾细胞。

在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。

在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。本发明还涉及了上述载体在细胞中抑制流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)多聚酶表达的应用，其中，细胞中转染上述载体能有效降低多聚酶与萤火虫荧光素酶融合基因的表达。

本发明所述的小干扰RNA能抑制不同流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)毒株在动物细胞中的复制与感染。

本发明选取了流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)基因组中高度保守的区段作为靶序列，实现了siRNA对不同毒株的复制与感染的干扰作用，为RNAi技术用于预防和治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)对家禽、家畜等的感染提供新的技术路线。

在另一方面，本发明还提供抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予本发明的组合物。

在另一方面，本发明还提供抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，包括将宿主细胞与本发明的组合物接触。

本发明的组合物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但不局限于下述几种：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。例如，本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒的小干扰RNA或上述载体可以和脂质体混合使用。给药剂量可以由本领域技术人员经过常规试验来确定。一般来说，siRNA分子的剂量范围为5ng～200mg/kg体重(优选剂量范围是5μg～5mg/kg)，此剂量可以每天一次或数次或每周一次或数次、每月一次或数次、每年一次或数次。通常可以根据测定所给药物在体内的逗留时间、药物在体液或组织中的浓度来决定给药的次数和频率。

本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)引起的流行性感冒的小干扰RNA可以通过呼吸道喷雾或滴注使siRNA经过肺等呼吸系统组织或器官吸收。

在可适用的本发明任何方面，优选的是，所述流感病毒是2009新甲型流感病毒，特别是2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009(H1N1)。

同现有技术相比的优点：①本发明设计了一系列针对流感病毒(特别是2009新甲型流感病毒)多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因不同靶位点的siRNA。②siRNA是天然存在于植物、真菌和动物细胞内的抗病毒小分子物质，它不但对正常基因调控有重要作用，而且是生命体内天然的抗病毒感染的基因免疫系统。③大量实验表明siRNA是通过与其序列互补的RNA结合并引起RNA链的断裂，从而抑制相应蛋白质的合成，因此特异性很高。④许多实验说明，RNAi存在明显的高效性，极少量的siRNA就可以引起明显的基因沉默表型。⑤无明显毒性和副作用。迄今为止，所有体外和体内的研究结果都表明有效剂量(0.1-10μg/kg)的siRNA对体外培养的细胞和实验动物没有明显的毒性和副作用，因此siRNA是一类安全的药物。⑥高抗突变性。流感病毒容易发生突变使已有疫苗失效，而针对高度保守靶序列的特异siRNA可以避免这些突变，因此siRNA基因药物具有较高的抗突变性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不限制本发明的范围。下列实施例中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)；D.Glover主编DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I&II；N.Gait主编Oligonucleotide Synthesis(1984)；B.Hame s&S.Higgins主编Nucleic Acid Hybridization(1985)；B.Hame s&S.Higgins主编Transcription and Translation(1984)；R.Freshney主编Animal Cell Culture(1986)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下面实施例中使用了2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009(H1N1)(于2009年5月分离于北京第一例2009新甲型流感确诊病人的咽拭纸中，命名为strain A/Beijing/01/2009(H1N1)，GenBank号为GQ183617-GQ183624。)作为举例来进行试验。但是，很明显，本发明并不局限于该病毒株，也可以采用其它2009新甲型流感病毒株来进行试验。

实施例

实施例1：靶位点的选择

选取siRNA靶序列遵循的基本原则是：(1)从基因转录本(mRNA)的起始密码子AUG开始，寻找连续19个碱基的靶序列，这19个碱基序列尽量以G开始，且其GC含量在45％-55％左右，避开四个连续的G或C序列，作为潜在的siRNA靶序列。(2)靶序列区域距离翻译起始点或终止点至少70-100核苷酸。(3)使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)，将潜在的靶序列与热泪基因组数据库进行比对，排除那些和其他编码序列或EST同源的序列。

本发明根据上述siRNA的设计原则，在2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009(H1N1))多聚酶(PB2、PB1、PA)、核蛋白(NP)基因编码区(GenBank数据库中的登录号：PB2为GQ183624；PB1为 GQ183623；PA为GQ183622；NP为GQ183620)，选取下列位点：

表1：针对2009新甲型流感病毒PB2、PB1、PA、NP基因编码区的siRNA靶位点序列

表1所示的靶位点序列与相同编号的siRNA的正义RNA片段序列相同(除了正义RNA片段3’末端的“TT”外)，其在基因上的位点是从多聚酶PB2、PB1或PA编码起始密码子开始编号的，其在序列表中的序号见最右侧一列。本表格所示序列仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例2：siRNA的化学合成

SiRNA的化学合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司如美国invitrogen公司和中国上海吉玛制药技术有限公司，具体可通过http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html和http://www.genepharma.com/获知，所有的siRNA双链都经过退火形成双链后HPLC纯化，然后溶于DEPC处理的无菌去离子水中。本发明提供的siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成，合成的siRNAs列表在表2中。

表2：针对2009新甲型流感病毒多聚酶PB2PB1PA基因编码区靶序列的siRNA双链正反义序列。

实施例3：融合靶序列表达载体的构建

1、方法：为了分析siRNA对各个靶序列的干扰效果，我们构建了一系列报告质粒，即将实验方案一所列20个靶序列通过化学合成后分别克隆到一个萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，Fluc)表达载体中(如图4所示)，具体方法为，分别化学合成靶序列正反义链的DNA序列后退火形成双链，然后将靶序列克隆到萤火虫荧光素酶的Fluc基因5‘端，构成融合基因(如1-Fluc，2-Fluc)，该该质粒经转染进入细胞，在细胞内可表达融合的Fluc。若靶序列被siRNA干扰则Fluc的表达量降低，据此可以判断siRNA是否特异性干扰靶序列。

实施例4：化学合成siRNA在A549细胞中抑制各自靶序列表达效果的鉴定及筛选。

细胞转染

用24孔细胞培养板进行细胞转染实验。

①在转染的前一天于24孔细胞培养板上每孔接种1×10⁵个A549细胞((肺癌细胞A549为人源肺癌细胞，购买于ATCC，ATCC number：CCL-185，该细胞为流感病毒的敏感细胞系，且易于转染siRNA))，5％CO₂培养箱37℃培养过夜。至转染时细胞铺满孔面积的80％-90％。

②靶序列-Fluc融合基因表达载体的转染用阳离子脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂，按其操作说明进行转染实验。具体用量为每孔细胞加入靶序列-Fluc融合基因表达载体170ng，作为转录活性内对照的海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)表达载体pRL-TK(Promega公司产品)17ng，siRNA 20pmol，Lipofectamine 20002μl。

③6小时后补加胎牛血清至终浓度为10％。于5％CO₂、37℃继续培养至24小时后检测。

(2)荧光检测：应用Promega公司的双荧光报告系统(Dual-luciferase Reporter Assay System)，在荧光照度仪TD-20/20luminometer(Turnur Designs，USA)上进行荧光检测。

转染后72小时收获细胞进行荧光检测。按照Dual-luciferaseReporter Assay System的操作说明进行。具体操作步骤为：

①弃细胞培养液，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗细胞两次，以去除脱落细胞和残留的细胞培养液。

②在每孔中加入100μl 1×裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer)。

③细胞培养板置震荡器上震荡裂解15min。

④取各细胞培养孔中的细胞裂解液20μl，加至荧光照度仪所用的检测板的各孔中。

⑤检测板的各样品孔中加入100μl Luciferse Assay Reagent II，混匀后用荧光照度仪进行荧光强度检测。

⑥各样品孔中迅速加入100μl Stop&Glo Reagent，再用荧光照度仪进行荧光强度检测。

⑦进行数据计算与分析(按照Promega公司Part#TM040技术手册说明进行)。

(3)针对PB2、PB1、PA和NP编码基因的siRNA的筛选方法。

将siRNA、pRL-TK与靶序列-Fluc融合基因表达载体共转染A549细胞，24小时后收获细胞进行荧光检测及数据计算与分析。实验结果分别见图1、表3。

2、结果

SiRNA的筛选结果，见图1、表3。从Fluc报告基因的表达情况来看，全部20个siRNA均能将靶序列的表达量抑制在30％以下，其中SiRNA编号为2号、6号、7号、10号、11号、12号、16号、17号和20号的siRNA能将靶序列融合Fluc报告基因的表达量抑制在5％以下。

表3siRNA对靶序列表达的抑制效果

实施例5：

挑选化学合成的SiRNA编号为2、6、7、10、11、16、17和20的siRNA在细胞水平对2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009(H1N1))复制的抑制。将化学合成的SiRNA编号为2、6、7、10、11、16、17和20的的siRNA分别转染(如实施例4中用脂质体转染)培养在24孔板中的A549细胞，于37℃、5％CO₂培养6小时后，每孔细胞经Hank’s液冲洗后加入100μl在病毒感染培养液中的2009新甲型流感病毒(A/Beijing/01/2009(H1N1))(病毒感染量为MOI 0.01，其中MOI为感染复数)，于34℃、5％CO₂感染1小时(hr)后加入新鲜的不含血清的细胞培养液(含2μg/ml TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰酶(Trypsin))继续于34℃5％CO₂培养，在感染后的24小时收获细胞检测细胞中病毒繁殖情况。

病毒感染培养液为DMEM中含有0.3％牛血清白蛋白，10mM Hepes， 100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

(1)使用荧光定量PCR技术检测病毒基因组RNA复制情况

①使用RNAeasy Mini kit(Qiagen)，按照说明书的方法抽提收获各个样品处理细胞的总RNA，并定量。

②取定量后的总RNA 2微克，使用Superscript III ReverseTranscriptase(invitrogen)进行20微升体系的反转录，将得到的总RNA反转录成为20微升单链的cDNA。

③从20微升cDNA样品中各取2微升，使用Applied Biosystems的ABI Prism 7000 Real-time PCR system系统，进行50微升体系的荧光定量反应，反应体系如下：2微升cDNA，上下游引物(分别为新甲型流感病毒目的片段上下游引物和GAPDH内参上下游引物，表4)各1微升，25微升SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)。反应完毕后。处理实验结果如图2、表5所示。

④结果

如结果所示，所挑选的siRNA均能将流感病毒靶mRNA的表达水平抑制在30％以下。同时，各条siRNA在抑制靶mRNA表达的同时，亦能将病毒主要的结构蛋白核蛋白的表达量抑制在30％以下。

表4荧光定量引物序列

引物	序列(5′-3′)	引物长度	产物长度	SEQ ID NO
					PB2-F	CACTGTTCCAGCAAATGCG	19	84	61
PB2-R	GTGGAGCAGCAGCAAAGG	18		62
					PB1-F	ATGAGGGAATACAAGCAGGAG	21	141	63
PB1-R	CCACAAATCCATAGCGATAAAA	22		64
					PA-F	GCCGACCAAAGTCTCCCA	18	155	65
PA-R	CGTGGTGTCGTCCTCAAGAA	20		66
					NP-F	CAGGAGTGGAGGAAATACCAA	21	121	67
NP-R	GCTGAATGCTGCCATAACG	19		68
					GAPDH-F	AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT	22	141	69
GAPDH-R	TTGGCCAGGGGTGCTAAG	18		70

表5siRNA对靶基因和NP基因mRNA表达的抑制效率

(2)使用In cell western检测技术分析核蛋白NP蛋白的表达情况。

①使用PBS清洗培养孔中单层细胞两次。

②使用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞于4度过夜后使用含0.1％Triton X-100的PBS洗涤5次，每次五分钟。

③含5％BSA的PBS封闭1.5小时后PBST洗涤5次，每次5分钟。

④抗甲型流感病毒NP蛋白一抗和抗内参β-Tubulin蛋白一抗共孵育2小时后PBST洗涤5次，每次5分钟.

⑤双色荧光二抗抚育1小时后使用Licor Odyssey双通道同时检测NP蛋白表达情况和内参β-Tubulin表达情况。将目的蛋白表达量与通过内参归一化后处理实验结果如图3，表6所示。

⑥结果：如结果所示，与实验对照组相比，转染了2号、6号、7号、10号、11号、16号、17号和20号siRNA以后，细胞中甲型流感病毒核蛋白NP表达情况均被抑制在40％以下。

表6siRNA对核蛋白NP蛋白表达的抑制效率

综上，我们从RNA水平和蛋白水平分别检测了siRNA对病毒RNA和蛋白表达水平的抑制情况，实验结果有利的说明了所选择的siRNA能有效地抑制病毒的繁殖。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室

<120>针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因与核蛋白基因的siRNA序列及其应用

<130>IDC090130

<160>60

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcaatagggt tgaggatta 19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggaacaagcc gtagacata 19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggatgatggc aatgagata 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

caggaggaga agtgagaaa 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gagtaaggat ggtggacat 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tggcaaatgt tgtgagaaa 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggtacatgtt cgagagtaa 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gagaagatca tttgagtta 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgagaaagat gatgactaa 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggaccaaact tatacaata 19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ggatagaact tgatgaaat 19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caaagaagga agacggaaa 19

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

agtcaaacca catgagaaa 19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gagaagatcc caaggacaa 19

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tgagataatt gaaggaaga 19

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gaaaggagtt ggaacaata 19

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ggtgaaagga gttggaaca 19

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gatcaaacgt ggaatcaat 19

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gaccaggagt ggaggaaat 19

<210>20

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gagacaatgc agag 14

<210>21

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>21

gcaauagggu ugaggauua 19

<210>22

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>22

ggaacaagcc guagacaua 19

<210>23

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>23

ggaugauggc aaugagaua 19

<210>24

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>24

caggaggaga agugagaaa 19

<210>25

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>25

gaguaaggau gguggacau 19

<210>26

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>26

uggcaaaugu ugugagaaa 19

<210>27

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>27

gguacauguu cgagaguaa 19

<210>28

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>28

gagaagauca uuugaguua 19

<210>29

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>29

ugagaaagau gaugacuaa 19

<210>30

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>30

ggaccaaacu uauacaaua 19

<210>31

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>31

ggauagaacu ugaugaaau 19

<210>32

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>32

caaagaagga agacggaaa 19

<210>33

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>33

agucaaacca caugagaaa 19

<210>34

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>34

gagaagaucc caaggacaa 19

<210>35

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>35

ugagauaauu gaaggaaga 19

<210>36

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>36

gaaaggaguu ggaacaaua 19

<210>37

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>37

ggugaaagga guuggaaca 19

<210>38

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>38

gaucaaacgu ggaaucaau 19

<210>39

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>39

gaccaggagu ggaggaaau 19

<210>40

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>40

gagacaaugc agaggagua 19

<210>41

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>41

uaauccucaa cccuauugc 19

<210>42

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>42

uaugucuacg gcuuguucc 19

<210>43

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>43

uaucucauug ccaucaucc 19

<210>44

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>44

uuucucacuu cuccuccug 19

<210>45

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>45

auguccacca uccuuacuc 19

<210>46

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>46

uuucucacaa cauuugcca 19

<210>47

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>47

uuacucucga acauguacc 19

<210>48

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>48

uaacucaaau gaucuucuc 19

<210>49

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>49

uuagucauca ucuuucuca 19

<210>50

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>50

uauuguauaa guuuggucc 19

<210>51

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>51

auuucaucaa guucuaucc 19

<210>52

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>52

uuuccgucuu ccuucuuug 19

<210>53

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>53

uuucucaugu gguuugacu 19

<210>54

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>54

uuguccuugg gaucuucuc 19

<210>55

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>55

ucuuccuuca auuaucuca 19

<210>56

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>56

uauuguucca acuccuuuc 19

<210>57

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>57

uguuccaacu ccuuucacc 19

<210>58

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>58

auugauucca cguuugauc 19

<210>59

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>59

auuuccucca cuccugguc 19

<210>60

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>60

uacuccucug cauugucuc 19

<210>61

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>61

cactgttcca gcaaatgcg 19

<210>62

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>62

gtggagcagc agcaaagg 18

<210>63

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>63

atgagggaat acaagcagga g 21

<210>64

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>64

ccacaaatcc atagcgataa aa 22

<210>65

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>65

gccgaccaaa gtctccca 18

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>66

cgtggtgtcg tcctcaagaa 20

<210>67

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>67

caggagtgga ggaaatacca a 21

<210>68

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>68

gctgaatgct gccataacg 19

<210>69

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>69

agccaaaagg gtcatcatct ct 22

<210>70

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>70

ttggccaggg gtgctaag 18

Claims

1.分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其序列如SEQ ID NO：10所示。

2.包含权利要求1的序列的核酸构建体。

3.权利要求1所述的siRNA靶序列或者权利要求2所述的核酸构建体在筛选抗流感病毒药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述流感病毒是2009新甲型流感病毒。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述流感病毒是2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009。

6.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括：正义RNA片段和反义RNA片段，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列如SEQ ID NO：49所示，正义RNA片段序列如SEQ ID NO：30所示。

7.包含权利要求1的siRNA靶序列或权利要求6的小分子干扰核糖核酸的载体。

8.权利要求1的siRNA靶序列或权利要求6的小分子干扰核糖核酸用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒。

9.根据权利要求8所述的用途，其中流感病毒是2009新甲型流感病毒。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述流感病毒是2009新甲型流感病毒株A/Beijing/01/2009。