CN100365122C - 针对乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组针对乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA及其制备方法和应用。选取乙型流感病毒多聚酶(PB2、PB1、PA)基因中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30(优选，15-27，更优选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞和动物模型攻毒实验证明，以乙型流感病毒基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对的siRNA，可以阻断该基因在细胞和动物模型中的复制与表达，从而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在细胞和动物模型的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和生物信息学领域。本发明涉及流行性感冒的预防与治疗。本发明还涉及核酸技术领域。具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及具有抑制乙型流感病毒复制与感染和/或乙型流感病毒基因表达的小分子干扰核糖核酸及其应用。
背景技术
流行性感冒简称流感，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，是一种重要的公众健康问题。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大流行，它在动物中广泛分布，也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。
流行性感冒是世界上很猖獗的传染病，曾多次席卷全球，给人类带来巨大灾难。流感病毒感染后容易发生继发性感染，死亡率非常高。由于流感病毒传播迅速、流行广泛，抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定，因此可引起局部地区流行或世界性大流行。
尽管乙型流感病毒不象甲型流感病毒那样常引起世界性大流行，但它常常引起局部暴发，而且流感的流行常由甲型和乙型流感病毒引起，在流感病毒中常出现甲、乙型流感病毒间基因混合显型现象，因此乙型流感病毒的表面抗原是三联流感疫苗的重要组成部分。
流感病毒属正粘病毒科，是有包膜的单负链、分节段的RNA病毒。乙型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，一般认为：RNA1节段编码PB2蛋白；RNA2编码PB1；RNA3编码PA；RNA4编码HA；RNA5编码NP；RNA6编码NA和一个NB非结构蛋白；RNA7编码M1和M2，可能还有M3；RNA8编码两个非结构蛋白NS1和NS2。其中，PB1、PB2、PA是三种依赖RNA的RNA多聚酶成分，PB1的功能是识别和结合由宿主细胞多聚酶II转录的帽子结构(7mGpppGPNm)，PB2的功能是负责启动后新生的病毒颗粒RNA合成的延伸，PA的功能至今不完全明了，可能是一种激酶或一种解旋结构的蛋白。
目前，预防流感的较好措施是接种疫苗，但由于流感病毒编码表面抗原的基因容易发生突变或重配，致使表面抗原发生变异，出现新的抗原，使原有的疫苗不再有效。除疫苗外，也有抗流感病毒的药物正在积极开发。至今，国际上抗流感的药物主要是神经氨酸酶抑制剂，但这些药物存在副反应和耐药性等问题，所以目前世界上还没有一种治疗流感的有效药物。鉴于近两年流感病毒活动频繁，应用现代科技手段发展方便有效的抑制流感病毒感染的方法就显得尤为重要。
RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术是近年来新发展起来的一种高效的、特异性强的基因阻断技术，是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制，它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制，广泛存在于各种生物，如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物，包括人类。简言之，该技术就是当把21-23个核苷酸长的双链RNA片段(dsRNA)导入细胞或组织中后，后者会使目的mRNA被切割，从而降解mRNA，阻碍或阻止了由mRNA翻译成相应蛋白质的过程。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值。通过RNAi技术，选择不同的靶位点应用siRNA抑制病毒复制与侵染已在多种病毒中公开(Adelmen et al.，Insect Mol Biol，10：265-273(2001)；Gitlin et al.，Nature，418，430 434(2002)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，100(5)：2718-2723(2003)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，101(23)：8676-8681(2004)；Hu WY et al.，Curr Biol，12：1301-1311(2002)；Haasnoot et al.，Biomed Sci，2003，10：607-616(2003)；Chen W et al.，J.Virol，78(13)：6900-7(2004)；Jia Q et al.，J Virol，77：3301-3306(2003)；Park WS et al.，Nucleic Acids Res，30(22)：4830-4835(2002)；Capodici J et al.，J Immunol，169：5196-5201(2002)；Coburn GAet al.，J Virol，76：9225-9231(2002))。
2002年12月20日，Small RNA&RNAi被Science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与人类基因组计划(human genomics program，HGP)相提并论的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级活动。人们对小RNA分子的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病和肿瘤等疾病的根治，开辟新的治疗途径，具有极其重要的理论和实际意义，它必将对生物学和医学的发展产生深远的影响。
依赖于RNA的多聚酶(PB2、PB1和PA)是乙型流感病毒在感染细胞内进行复制所必需的。设计并合成特异性针对编码聚合酶基因序列全长的多种dsRNA，并将其同时导入患者体内，可以选择性降解聚合酶的mRNA，阻断其蛋白表达，使乙型流感病毒在感染细胞中无法完成复制过程，从而切断病原体在体内的代谢途径，有效控制疾病进程。由于乙型流感病毒是RNA病毒，而设计的dsRNA与病毒的vRNA和cRNA都具有序列同源性，因而采用RNA干扰手段，有可能直接引发病毒vRNA和cRNA的降解，从而在根本上清除感染细胞中的病毒。
本发明应用RNAi技术，通过siRNA进行乙型流感病毒的抑制研究，为抑制流感病毒的复制与感染提供新的途径，也为流行性感冒的预防与治疗提供新的思路。有效的siRNA靶位点不仅可以作为新的化学药物靶位点，而且siRNA可以直接作为强有效的药物用于流行性感冒的预防与治疗，特异性强，不易引起副反应，给药方便、快捷，避免现行疫苗对突变流感病毒和其他动物流感病毒引起的突发流行性感冒的不能保护以及化学药物的副反应。我们认为目前研制和开发治疗流行性感冒的dsRNA药物不但具有实际可操作性而且拥有良好的应用前景。
这里引用的所有出版物、专利和专利申请，无论前述或后述，在此都以其完整形式引入作为参考。
发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：
1.分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列为流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸。
2.如段落1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列为SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：18中任意一条序列。
3.与段落1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。
4.包含段落1-3任一个的序列的核酸构建体。
5.段落1-4任一个所述的siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。
6.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含段落1-3序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。
7.如段落6所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。
8.如段落7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
9.段落6-8任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选15-27，最优选19-23，如19、20或者21)个。
10.段落6-9任一个所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基对。
11.如段落6-10任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为具有10-30(优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。
12.如段落6-11任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如约50％。
13.如段落6-12任一个所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。
14.如段落6-13任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段包含与段落1或2所述siRNA靶序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补的序列，正义RNA片段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。
15.如段落6-14任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。
16.如段落6-15任一个所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。
17.如段落6-16任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。
18.如段落6-17任一个所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQ ID NO：X，正义RNA片段序列包含SEQ IDNO：(X-18)，X为19-36中的任一整数。
19.如段落6-18任一个所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％(即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同一性。
20.如段落6-19任一个所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其中，用化学合成方法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。
21.DNA序列的组合，其包括编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列，所述正义RNA片段包含段落1-3的序列所编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。
22.段落21的DNA序列的组合，其中正义RNA片段和反义RNA片段如段落7-20任一个中所定义。
23.段落21的DNA序列的组合，第一DNA序列和第二DNA序列包含在两种不同的DNA分子中，这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一DNA序列有效连接的第一启动子和与第二DNA序列有效连接的第二启动子。
24.段落21的DNA序列的组合，其中，第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中，优选地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA链中；更优选地，所示正义RNA片段和反义RNA片段表达为一种RNA分子，还优选的是，所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区域；所述DNA分子可以另外含有与第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效连接的启动子。
25.包含段落21-24任一个的DNA组合的载体或者载体组合。
26.分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是狗肾传代(Madindarby canine kidney，MDCK)细胞，其中，所述细胞包含段落21-24任一个的DNA组合或者段落25所述的载体或者载体组合。
27.一种动物模型，其中，所述动物模型包含段落21-24任一个的DNA组合或者段落25所述的载体或者载体组合。
28.如段落27所述的动物模型，其中，所述的动物模型为9-11日龄的鸡胚。
29.包含段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合的组合物，特别是药物组合物。
30.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病。
31.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。
32.段落6-20任一个的核糖核酸、段落21-24任一个的DNA组合、段落25的载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。
33.抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予段落29的组合物。
34.抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，将宿主细胞与段落29的组合物接触。
35.以上段落任一个的主题，其中流感病毒是乙型流感病毒，特别是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03。
以下结合附图进一步说明本发明。基于这些说明，本发明的上述方面和其它方面对于本领域技术人员而言是明显的。
附图简述
图1：siRNA表达载体质粒的构建。
图2：针对PB2基因的siRNA的筛选。应用针对PB2基因不同靶位点的乙型流感病毒特异siRNA，筛选能敲低PB2-FL融合基因的表达，即有效抑制MDCK细胞中萤火虫荧光素酶表达的siRNA。图示空白对照为不转染siRNA、只转染报告基因(荧光素酶)表达载体的细胞，对照siRNA为转染能表达无关siRNA的质粒及荧光素酶表达载体的细胞，其它为转染能表达针对PB2基因不同靶位点特异siRNA表达载体及荧光素酶表达载体的细胞。纵坐标表示以转录活性内对照的海肾荧光素酶为标准化的萤火虫荧光素酶活性。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图3：针对PB1基因的siRNA的筛选。应用针对PB1基因不同靶位点的乙型流感病毒特异siRNA，筛选能敲低PB1-FL融合基因的表达，即有效抑制MDCK细胞中萤火虫荧光素酶表达的siRNA。
图4：针对PA基因的siRNA的筛选。应用针对PA基因不同靶位点的乙型流感病毒特异siRNA，筛选能敲低PA-FL融合基因的表达，即有效抑制MDCK细胞中萤火虫荧光素酶表达的siRNA。
图5：细胞中质粒表达No.6号、No.12号、No.16号siRNA在病毒感染后不同时间对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图6：细胞中转染不同量的No.6号siRNA表达质粒对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图7：细胞中转染不同量的化学合成No.6号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图8：siRNA对新产生病毒粒子的抑制
图9：细胞中质粒表达各种siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图10：细胞中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制
图11：细胞中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制
图12：细胞中siRNA与利巴韦林对乙型流感病毒的抑制效果比较
图13：鸡胚中质粒表达各种siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图14：鸡胚中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制
图15：鸡胚中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制
图16：鸡胚中化学合成siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
图17：鸡胚中siRNA与利巴韦林对乙型流感病毒的抑制效果比较
具体实施方式
本发明人选取乙型流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因中高度保守的序列作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的连续10-30(优选，15-27，更优选19-23)bp的序列设计siRNA。细胞和动物模型攻毒实验证明，以乙型流感病毒基因组中高度保守的序列作为靶序列，应用能与靶序列特定位点上的核苷酸序列互补配对的siRNA，可以阻断该基因在细胞和动物模型中的复制与表达，从而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在细胞和动物模型的复制与感染，以达到治疗流行性感冒的目的。
本发明的一个目的就是提供一组流感病毒(特别是乙型流感病毒)基因组上的小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列及其应用。其中当药物，包括所筛选出的小干扰RNA(siRNA)序列与这些靶序列中的一个或几个特异性地作用，可以阻断引起流行性感冒的流感病毒(特别是乙型流感病毒)基因在人体或动物体内的复制或表达，从而抑制流感病毒的复制与感染，达到治疗流行性感冒的目的。
本发明的另一目的就是提供一组用于预防和治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的靶向小分子干扰核糖核酸、DNA、其载体、宿主细胞及其制备方法和应用。
发明人相信，本发明的原理在于特异性siRNA针对病毒基因组保守序列，抑制病毒的mRNA(但本发明并不受该原理的束缚)。针对流感病毒(特别是乙型流感病毒)多聚酶(PB2、PB1、PA)、病毒的virionRNA(vRNA)和互补RNA(cRNA)，设计并化学合成siRNA及制备含特异siRNA编码DNA的质粒，并将此化学合成siRNA或含特异siRNA编码DNA的质粒转入选定的靶细胞进行抗流感病毒(特别是乙型流感病毒)的研究。通过特异性抑制病毒的多聚酶的转录和复制途径，最终为人类和动物提供治疗和预防流感病毒(特别是乙型流感病毒)感染的快速便宜的有效药物。
本发明所要解决的问题是针对病毒基因组靶序列提供攻击流感病毒(特别是乙型流感病毒)的小干扰RNA分子(siRNA)，用于预防或治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)感染引起的流行性感冒及与其密切相关的呼吸道疾病。为此本发明采用权利要求书中定义的技术方案。
在一方面，本发明提供了分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其选自：
(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；
(2)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18中任意一条序列；
(3)与(1)或者(2)的序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列；
(4)从(1)或者(2)的序列发生了1-5个(优选1-3个，更优选1-2个，最优选1个)核苷酸插入、替代和/或缺失。
为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math2：482)；Needleman和Wunsch的同一性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。
适合于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
因此，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
在其它实施方案中，本发明指向在中等严紧条件下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。
典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。
所述靶序列可以是流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因、多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因的转录产物、cDNA、或者其mRNA。所述的靶序列可以是流感病毒(特别是乙型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子RNA序列(virion RNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互补RNA序列(complementary RNA，cRNA)。
优选地，所述siRNA靶序列为与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18中任意一条序列的连续10个(优选15个，更优选18个)核苷酸序列相同的序列。更优选的是，所述的siRNA靶序列为与SEQ ID NO：1-SEQID NO：18所示的任意一条序列。
本发明提供了一系列流感病毒(特别是乙型流感病毒)基因上可以被siRNA或反义核酸序列攻击的靶序列，因此，凡是可以作用于本靶序列以阻断病毒基因在感染的人或动物体内复制或表达的核苷酸片段都是本发明所要求保护的范围。
本发明还提供上述siRNA靶序列的互补序列。
本发明还提供包含siRNA靶序列或其互补序列的核酸构建体。
本发明还提供siRNA靶序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。所述抗流感病毒(特别是乙型流感病毒)药物优选为治疗或预防流感病毒(特别是乙型流感病毒)所引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物。
另一方面，本发明提供小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含本发明靶序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。
在本发明中，术语“小分子核糖核酸”、“小分子干扰核糖核酸”或“siRNA”、“本发明核糖核酸”可互换使用，它们都指能够抑制流感病毒(特别是乙型流感病毒)靶基因表达、包括正义RNA片段区域(例如SEQ ID NO：1-SEQ ID No：18中任意一条序列)和反义RNA片段区域(例如SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：36中任意一条序列)的核糖核酸(RNA)。
相关地，本发明还提供DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶序列所编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。
在本发明的这方面，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。
例如，本发明的siRNA可以为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选15-27，最优选19-23，如19、20或者21)个。但也可以更长或者更短。
在正义RNA片段和反义RNA片段形成的双链RNA的互补区域至少有10个(优选15个，更优选18个，如19、20或者21个)碱基对。优选地，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。
在一个实施方案中，本发明的siRNA为具有10-30(优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。
在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如约50％。
在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。显著的同一性是指至少60％，例如70，80、90％同一性。
优选的是，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％(即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无显著同一性。
在一个具体实施方案中，所述反义RNA片段包含与如下所述siRNA靶序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补的序列：
(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因上的连续10-30个(优选，15-27个，更优选19-23个)核苷酸；或者
(2)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18中任意一条序列；
正义RNA片段序列与所述反义RNA片段序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。
在另一个具体实施方案中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少10个(优选15个，更优选18个)碱基互补。
在另一个具体实施方案中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个(例如2、3、4、5个)脱氧寡核苷酸的末端，一般为脱氧胸苷酸TT。
优选地，所述反义RNA片段序列包含SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：36所示的任意一条序列或与前述序列有连续10个(优选15个，更优选18个)碱基相同的序列。
特别优选的是，所述干扰核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQID NO：X，正义RNA片段序列包含SEQ ID NO：(X-18)，X为19-36中的任一整数。
在一个优选实施方案中，反义RNA片段包含与本发明靶序列编码的RNA序列全长互补的RNA序列。
在该实施方案中，优选地，在所述正义RNA片段中，在本发明靶序列编码的RNA序列3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为正义RNA片段的3’末端；而且，在所述反义RNA片段中，在与本发明靶序列编码的RNA序列全长互补的RNA序列3’还含有至少两个(例如2、3、4、5个)连续的脱氧胸苷酸作为反义RNA片段的3’末端。
在一个具体例子中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为21个核苷酸，正义RNA片段和反义RNA片段各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两个RNA片段除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链的形式存在。
本发明的小分子干扰核糖核酸(siRNA)可用化学合成方法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表达，或者在体外合成、转录后用Dicer酶消化的方法获得。
本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子等。
本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列可以是流感病毒(特别是乙型流感病毒)的RNA基因组序列，或病毒粒子RNA序列(virionRNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互补RNA序列(complementaryRNA，cRNA)。具体地，本发明所述的小干扰RNA可以由序列表中的至少一个序列组成。
本发明的siRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。在一个实施方案中，将候选siRNA在病毒感染前和/或病毒感染后导入体外培养细胞或体内，通过病毒滴度降低筛选出能有效防治流感病毒(特别是乙型流感病毒)的小干扰RNA。
在本发明的DNA序列的组合中，第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在两种不同的DNA分子中。这两种不同的DNA分子优选分别另外含有与第一DNA序列有效连接的第一启动子和与第二DNA序列有效连接的第二启动子。
第一DNA序列和第二DNA序列也可以包含在同一种DNA分子中。优选地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA链中。更优选地，所示有义RNA片段和反义RNA片段表达为一种RNA分子。还优选的是，所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区域。同样，所述DNA分子可以另外含有与第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效连接的启动子。
可用于本发明中的启动子可以是天然靶基因的天然启动子、异源启动子、组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或者发育调节型启动子。
当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述DNA分子可以另外在编码有义RNA片段和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。该接头可以包含一种含有功能基因如选择性标记基因的表达盒。或者，所述接头可以包含调节序列如内含子加工信号。
当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，所述有义RNA片段和反义RNA片段也可以表达为两种RNA分子。此时，优选地，第一DNA序列与第一启动子有效连接，而第二DNA序列与第二启动子有效连接；或者，第一DNA序列和第二DNA序列可以与一种双向启动子有效连接。
当第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一种DNA分子中时，在所述DNA分子中第一DNA序列和第二DNA序列可以包含于所述DNA的互补链中。
在这方面，所述第一DNA序列和第二DNA序列优选可以瞬时转染入宿主细胞中。但是，在某些实施方式中，所述第一DNA序列和第二DNA序列也可以稳定地整合在宿主细胞的基因组中。
在另一方面，本发明还提供包含本发明DNA组合的载体或者载体组合。该载体或者载体组合可以是一个载体或者多个载体，只要它们合在一起包含本发明的DNA组合即可。例如，本发明的DNA组合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在同一个载体中。或者，本发明的DNA组合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在不同的载体中。
所述载体可以是质粒、病毒颗粒及其他载体形式。表达载体中的本发明第一DNA序列和第二DNA序列可以可操作地和表达控制序列连接，表达控制序列包括但不限于用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择标记。
本发明还包括上述流感病毒(特别是乙型流感病毒)siRNA表达载体的构建。siRNA表达载体可采用本说明书中公开的或者本领域已知的方法构建。本发明所构建的流感病毒(特别是乙型流感病毒)siRNA表达载体经PCR、序列测定表明构建成功，在体外感染流感病毒(特别是乙型流感病毒)的细胞模型和体内感染流感病毒(特别是乙型流感病毒)的鸡胚动物模型中，通过血凝滴度检测实验证实表达载体表达的siRNA能较为明显地抑制病毒复制与感染。
另一方面，本发明还提供分离的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，特别是狗肾传代(Madin darby canine kidney，MDCK)细胞，其中，所述细胞包含本发明的DNA组合或者载体或者载体组合。所述宿主细胞可以是用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，真菌如酵母，昆虫细胞如sf9，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)如非洲绿猴肾细胞(Vero)、CHO或人类细胞等。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为狗肾传代(Madin darby canine kidney，MDCK)细胞。
通过本文的阐述，适当的载体、宿主细胞的选择都在本领域技术人员的知识范围内。
另一方面，本发明还提供一种动物模型，其中，所述动物模型包含本发明的DNA组合或者载体或者载体组合。优选的例子是，所述的动物模型为9-11日龄的鸡胚。
在另一方面，本发明还提供包含本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合的组合物，特别是药物组合物。
本发明提供的小干扰RNA分子(siRNA)能够特异性地针对流感病毒(特别是乙型流感病毒)，它可能通过细胞内的RISC(RNA-inducedsilencing complex)有效地降解流感病毒(特别是乙型流感病毒)的蛋白信使核糖核酸分子。本发明siRNA可以直接阻断病毒基因物质的复制、病毒的繁殖与感染，还可以抑制其和致病密切相关蛋白质的合成，为治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及与其密切相关的呼吸道疾病找到了新的有效的手段。本发明的抗流感病毒(特别是乙型流感病毒)的siRNA的作用效果显著，无副作用，将在流感病毒(特别是乙型流感病毒)的防治中起到重要的作用。
因此，在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病。
本发明还涉及了上述宿主细胞在制备治疗和/或预防流感病毒(特别是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及其它相关疾病的药物中的应用。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更优选地，所述宿主细胞为狗肾细胞。
在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒的复制和/或感染。
在另一方面，本发明还提供本发明siRNA、DNA组合、载体或者载体组合用于制备药物的用途，其中，所述药物用于抑制流感病毒蛋白质的表达。本发明还涉及了上述载体在细胞中抑制流感病毒(特别是乙型流感病毒)多聚酶表达的应用，其中，细胞中转染上述载体能有效降低多聚酶与萤火虫荧光素酶融合基因的表达。
本发明所述的小干扰RNA能抑制不同流感病毒(特别是乙型流感病毒)毒株在动物细胞中的复制与感染。
本发明所述的小干扰RNA能抑制不同流感病毒(特别是乙型流感病毒)毒株在动物模型如鸡胚、小鼠中的复制与感染。
本发明选取了流感病毒(特别是乙型流感病毒)基因组中高度保守的区段作为靶序列，实现了siRNA对不同毒株的复制与感染的干扰作用，为RNAi技术用于预防和治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)对家禽、家畜等的感染提供新的技术路线。
在另一方面，本发明还提供抑制流感病毒的复制和/或感染的方法，包括给予本发明的组合物。
在另一方面，本发明还提供抑制宿主细胞中流感病毒蛋白质的表达的方法，包括将宿主细胞与本发明的组合物接触。
本发明的组合物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但不局限于下述几种：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。例如，本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干扰RNA或上述载体可以和脂质体混合使用。给药剂量可以由本领域技术人员经过常规试验来确定。一般来说，siRNA分子的剂量范围为5ng～200mg/kg体重(优选剂量范围是5μg～5mg/kg)，此剂量可以每天一次或数次或每周一次或数次、每月一次或数次、每年一次或数次。通常可以根据测定所给药物在体内的逗留时间、药物在体液或组织中的浓度来决定给药的次数和频率。
本发明用于预防或治疗流感病毒(特别是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干扰RNA可以通过呼吸道喷雾或滴注使siRNA经过肺等呼吸系统组织或器官吸收。
在可适用的本发明任何方面，优选的是，所述流感病毒是乙型流感病毒，特别是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、或B/Jiangsu/10/03。
同现有技术相比的优点：①本发明设计了一系列针对流感病毒(特别是乙型流感病毒)多聚酶PB1、PB2或者PA编码基因不同靶位点的siRNA。②siRNA是天然存在于植物、真菌和动物细胞内的抗病毒小分子物质，它不但对正常基因调控有重要作用，而且是生命体内天然的抗病毒感染的基因免疫系统。③大量实验表明siRNA是通过与其序列互补的RNA结合并引起RNA链的断裂，从而抑制相应蛋白质的合成，因此特异性很高。④许多实验说明，RNAi存在明显的高效性，极少量的siRNA就可以引起明显的基因沉默表型。⑤无明显毒性和副作用。迄今为止，所有体外和体内的研究结果都表明有效剂量(0.1-10μg/kg)的siRNA对体外培养的细胞和实验动物没有明显的毒性和副作用，因此siRNA是一类安全的药物。⑥高抗突变性。流感病毒容易发生突变使已有疫苗失效，而针对高度保守靶序列的特异siRNA可以避免这些突变，因此siRNA基因药物具有较高的抗突变性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不限制本发明的范围。下列实施例中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)；D.Glover主编DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I&II；N.Gait主编Oligonucleotide Synthesis(1984)；B.Hames&S.Higgins主编Nucleic Acid Hybridization(1985)；B.Hames&S.Higgins主编Transcription and Translation(1984)；R.Freshney主编Animal Cell Culture(1986)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下面实施例中使用了乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03作为举例来进行试验。但是，很明显，本发明并不局限于这些病毒株，也可以采用其它乙型流感病毒株来进行试验。
实施例
实施例一 siRNA靶位点的设计
选取siRNA靶序列遵循以下基本原则是：①从转录本(mRNA)的起始密码子AUG开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，这19个碱基序列尽量以G开始，且其GC含量在45～55％左右，并避开4个连续的T或A序列，作为潜在的siRNA靶位点序列。②靶序列区域距离翻译起始点或终止点至少70-100核苷酸。③使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)，将潜在的靶序列与人的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列或EST同源的序列。
本发明根据上述siRNA的设计原则，在乙型流感病毒(B/Beijing/76/98)多聚酶PB2、PB1、PA蛋白编码区(GenBank数据库中的登录号：PB2为AY687394；PB1为AY687393；PA为AY687392)选取下列位点：
| 靶基因 | siRNA编号 | 靶位点序列及其在基因上的位点 | 序列号 |
| PB2蛋白 | 1 | 5’-GUGCUGAAGACAUAGGAAC-3’ 246～264 | 1 |
| 2 | 5’-GUGAGACUUGACAAUGCCA-3’ 374～392 | 2 | |
| 3 | 5’-GAAGCAGGAAUACCAAGAG-3’ 517～535 | 3 | |
| 4 | 5’-GACACUAGGAUGUUCCAAG-3’ 1225～1243 | 4 | |
| 5 | 5’-GUCACCCAAAGCAAGUGAG-3’ 1366～1384 | 5 | |
| 6 | 5’-GUCCUAACUAUAUGCGGCA-3’ 1999～2017 | 6 | |
| PB1蛋白 | 7 | 5’-GCAACGGCACUAAACACAA-3’ 419～437 | 7 |
| 8 | 5’-GGUUUCCUCAUAAAGAGAA-3’ 593～611 | 8 | |
| 9 | 5’-GGUUUGUAUUAGUAGUUGA-3’ 750～768 | 9 | |
| 10 | 5’-GGAUCAGCAUGACAGUAAC-3’ 891～909 | 10 | |
| 11 | 5’-GAUCUGUUUAGCAUACCAU-3’ 1115～1133 | 11 | |
| 12 | 5’-GAAGAAUGUCAAAGGAUGA-3’ 2196～2214 | 12 | |
| PA蛋白 | 13 | 5’-GAUCUGCGUCCAUCUAGAG-3’ 109～127 | 13 |
| 14 | 5’-GAGCAUGGAAUAGAGACUC-3’ 292～310 | 14 | |
| 15 | 5’-GCAGACUCACAGAACUUCA-3’ 514～532 | 15 | |
| 16 | 5’-GGAAUGAGGAGCUACAUAG-3’ 673～691 | 16 | |
| 17 | 5’-GUAGCAAGGAUGUCUCCCU-3’ 724～742 | 17 | |
| 18 | 5’-GAAAUGUAGAGUGGCAGCU-3’ 1183～1201 | 18 |
表1 针对乙型流感病毒多聚酶PB2、PB1、PA蛋白编码区的siRNA靶位点序列
表1所示的靶位点序列与相同编号的siRNA的正义RNA片段序列相同(除了正义RNA片段3’末端的“TT”外)，其在基因上的位点是从多聚酶PB2、PB1或PA编码起始密码子开始编号的，其在序列表中的序号见最右侧一列。本表格所示序列仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例二 siRNA的化学合成
siRNA的合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司，比如美国Dharmacon公司和中国上海吉玛生物制药公司，具体可通过www.Dharmacon.com和www.genepharma.com获知，所有的siRNA分子都经过2位上脱保护、脱盐、纯化、和退火形成双链处理，然后溶于DEPC处理的蒸馏水中。其所采用的合成方法均为通用的方法，比如以下文献公开的方法：Scaringe SA，Wincott FE，and Caruthers MH.Novel RNA Synthesis Method Using 5’-Silyl-2’-OrthoesterProtecting Groups.J Am Chem Soc 1998；120：11820-11821.
本发明提供的siRNAs由上海吉玛生物制药公司合成。
1.分别合成siRNA的正义链和反义链(序列见表2，表3)。
2.退火形成双链siRNAs：
1)将合成的siRNA正义、反义链溶于焦磷酸二乙酸(DEPC)处理过的水中。
2)制备退火缓冲液(2×)：200mM乙酸钾，4mM乙酸镁，60mMHepes-KOH(pH7.4)。
3)制备20μM的siRNA贮存液：
2×退火缓冲液 100μl
siRNA正义链 Xμl
siRNA反义链 Yμl
DEPC处理水 (100-X-Y)μl
上述成分混匀，于90℃放置1分钟，然后于37℃放置1小时。贮存于-20℃。
实施例三 siRNA表达载体的构建
用带有H1启动子和U6启动子的载体siBuster vector(瑞典Genordia AB公司产品，详情见www.genordia.com)，分别连接上述设计的siRNAs靶位点序列(19个碱基)加三个接头碱基(共22-mer)的DNA寡核苷酸链，形成能表达siRNAs的质粒载体(如图1所示)。
DNA寡核苷酸链为：
正义DNA片段(对应于siRNA正义RNA片段)：
5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
反义DNA片段(对应于siRNA反义RNA片段)：
5’-AAAANNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
下划线的18-mer与正义DNA片段G后的序列互补，这两条DNA寡核苷酸链经退火形成双链DNA oligos：
5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 正义DNA片段
3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5’ 反义DNA片段
1)DNA单链合成
多家DNA合成公司均可合成。
2)DNA单链退火成双链
退火反应体系如下：正义DNA片段寡核苷酸(100μM) 2μl
反义DNA片段寡核苷酸(100μM) 2μl
10 ×任何一种限制性内切酶缓冲液 2μl
水 14μl
总量 20μl
退火程序为：于95℃加热5min后，移至室温10min，即完成退火。然后用1×相同限制酶缓冲液稀释50倍，至终浓度为0.2M，待用。
3)连接
将退火后的双链DNA oligos连接入GeneBuster载体，连接反应体系为：
GeneBuster载体(1ng/μl) 1μl
退火的DNA oligos(0.2μM) 1μl
5×连接酶缓冲液(含ATP) 4μl
T4 DNA连接酶 1μl
水 13μl
总量 20μl
4)转化、鉴定
连接产物转化DH5α大肠杆菌，经氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选，挑取单克隆菌落进行PCR扩增，筛选出含目的基因的阳性克隆，并进行DNA序列分析加以确定。
鉴定正确的阳性质粒即为可以在细胞中表达siRNA的质粒。
实施例四 融合蛋白表达载体的构建
为了分析siRNA对各个靶序列的干扰效果，我们构建了一系列报告质粒，即将多聚酶组分PB2、PB1、PA三个蛋白的编码序列分别克隆到一个萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)表达载体(如pGL3)5’端，构成融合基因(如PB2-FL、PB1-FL、PA-FL)，该基因由报告质粒经转染进入细胞，在细胞内可表达融合的萤火虫荧光素酶。若靶基因被siRNA干扰则萤火虫荧光素酶(FL)的表达量降低，据此可以判断siRNA是否特异性干扰靶基因。
实施例五 质粒表达siRNA在MDCK细胞中抑制PB2、PB1、PA蛋白表达的鉴定
1.方法：
(1)细胞转染
用24孔细胞培养板进行细胞转染实验。
①在转染的前一天于24孔细胞培养板上每孔接种0.5×105个MDCK细胞(中国国家流感中心)，5％CO2培养箱37℃培养过夜。至转染时细胞铺满孔面积的30-50％。
②PB2、PB1、PA蛋白表达载体的转染用阳离子脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂，按其操作说明进行转染实验。具体用量为每孔细胞加入靶基因载体170ng，作为转录活性内对照的海肾荧光素酶(renilla luciferase，RL)表达载体pRL-TK(Promega公司产品)17ng，siRNA表达载体0.5μg，Lipofectamine2000 2μl。
③6小时后补加胎牛血清至终浓度为10％。于5％CO2、37℃继续培养至72小时后检测。
(2)荧光检测
应用Promega公司的双荧光报告系统(Dual-luciferase ReporterAssay System)，在荧光照度仪TD-20/20 luminometer(TurnurDesigns，USA)上进行荧光检测。
转染后72hr收获细胞进行荧光检测。按照Dual-luciferaseReporter Assay System的操作说明进行。具体操作步骤为：
①弃细胞培养液，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗细胞两次，以去除脱落细胞和残留的细胞培养液。
②在每孔中加入100μl 1×裂解缓冲液(Passive LysisBuffer)。
③细胞培养板置震荡器上震荡裂解15min。
④取各细胞培养孔中的细胞裂解液20μl，加至荧光照度仪所用的检测板的各孔中。
⑤检测板的各样品孔中加入100μl Luciferse Assay ReagentII，混匀后用荧光照度仪进行荧光强度检测。
⑥各样品孔中迅速加入100μl Stop&Glo Reagent，再用荧光照度仪进行荧光强度检测。
⑦进行数据计算与分析(按照Promega公司Part#TM040技术手册说明进行)。
(3)针对多聚酶组分PB2、PB1或PA编码基因的siRNA的筛选方法。
将siRNA表达载体、海肾荧光素酶(renilla luciferase，RL)表达载体(pRL-TK)与萤火虫荧光素酶融合基因表达载体(PB2-FL、PB1-FL、PA-FL)共转染MDCK细胞，72小时后收获细胞进行荧光检测及数据计算与分析。实验结果分别见图2，3，4。具体结果见表2、表3。
2.结果：
siRNA的筛选结果
抑制效率＜40％的siRNA：
| 靶基因 | siRNA编号 | 序列号 | siRNA序列(*) | 抑制效率 |
| 蛋白PB2 | No.2 | 2/20 | (+) 5’ gug aga cuu gac aau gccatt 3’(-) 5’ ugg cau ugu caa guc ucactt 3’ | ＜40％ |
| No.3 | 3/21 | (+) 5’ gaa gca gga aua cca agagtt 3’(-) 5’ cuc uug gua uuc cug cuuctt 3’ | ||
| 蛋白PB1 | No.8 | 8/26 | (+) 5’ ggu uuc cuc aua aag agaatt 3’(-) 5’ uuc ucu uua uga gga aacctt 3’ | |
| 蛋白PA | No.13 | 13/31 | (+) 5’ gau cug cgu cca ucu agagtt 3’(-) 5’ cuc uag aug gac gca gauctt 3’ |
表2
抑制效率＞40％的siRNA：
| 靶基因 | siRNA编号 | 序列号 | siRNA序列(*) | 抑制效率 |
| 蛋白PB2 | No.1 | 1/19 | (+) 5’ gug cug aag aca uag gaactt 3’(-) 5’ guu ccu aug ucu uca gcactt 3’ | 44％ |
| No.4 | 4/22 | (+) 5’ gac acu agg aug uuc caagtt 3’(-) 5’ cuu gga aca ucc uag uguctt 3’ | 63％ | |
| No.5 | 5/23 | (+) 5’ guc acc caa agc aag ugagtt 3’(-) 5’ cuc acu ugc uuu ggg ugactt 3’ | 74％ | |
| No.6 | 6/24 | (+) 5’ guc cua acu aua ugc ggcatt 3’(-) 5’ ugc cgc aua uag uua ggactt 3’ | 92％ | |
| 蛋白PB1 | No.7 | 7/25 | (+) 5’ gca acg gca cua aac acaatt 3’(-) 5’ uug ugu uua gug ccg uugctt 3’ | 69％ |
| No.9 | 9/27 | (+) 5’ ggu uug uau uag uag uugatt 3’(-) 5’ uca acu acu aau aca aacctt 3’ | 74％ | |
| No.10 | 10/28 | (+) 5’ gga uca gca uga cag uaactt 3’(-)5’ guu acu guc aug cug aucctt 3’ | 86％ |
| No.11 | 11/29 | (+)5’ gau cug uuu agc aua ccautt 3’(-)5’ aug gua ugc uaa aca gauctt 3’ | 61％ | |
| No.12 | 12/30 | (+)5’ gaa gaa ugu caa agg augatt 3’(-)5’ uca ucc uuu gac auu cuuctt 3’ | 90％ | |
| 蛋白PA | No.14 | 14/32 | (+)5’ gag cau gga aua gag acuctt 3’(-)5’ gag ucu cua uuc cau gcuctt 3’ | 78％ |
| No.15 | 15/33 | (+)5’ gca gac uca cag aac uucatt 3’(-)5’uga agu ucu gug agu cugctt 3’ | 50％ | |
| No.16 | 16/34 | (+)5’ gga aug agg agc uac auagtt 3’(-)5’ cua ugu agc ucc uca uucctt 3’ | 80％ | |
| No.17 | 17/35 | (+)5’ gua gca agg aug ucu cccutt 3’(-)5’ agg gagaca ucc uug cuactt 3’ | 75％ | |
| No.18 | 18/36 | (+)5’ gaa aug uag agu ggc agcutt 3’(-)5’ agc ugc cac ucu aca uuuctt 3’ | 69％ |
表3
表2和表3中(+)表示正义RNA片段；(-)表示反义RNA片段。其中正义RNA片段序列号与表1中相应编号靶位点序列的序列号相同，正义RNA片段序列号(Y)为相应编号的反义RNA片段序列号(X，X为19-36中任一自然数)减18，即Y＝X-18。表2、表3第三列“/”左侧为正义RNA片段序列号，右侧为反义RNA片段序列号。如编号10的siRNA的正义RNA片段为包含SEQ ID NO：10的相应序列，反义RNA片段为包含SEQ ID NO：28的相应序列。
实施例六 细胞中质粒表达No.6号、No.12号、No.16号siRNA在病毒感染后不同时间对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
将能表达No.6号、No.12号、No.16号siRNAs的质粒(500ng/well)分别转染(如实施例五中用脂质体转染)培养在24孔板中的MDCK细胞，于37℃、5％CO2培养6hr后，每孔细胞经Hank’s液冲洗后加入100μl在病毒感染培养液中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98(病毒基因工程国家重点实验室保存株)(病毒感染量为MOI 0.001，其中MOI为感染复数)，于34℃、5％CO2感染1小时(hr)后加入新鲜的不含血清的细胞培养液(含2μg/ml TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰酶(Trypsin))继续于34℃5％CO2培养，在感染后的不同时间收获细胞上清进行病毒滴度或病毒毒力的测定。
病毒感染培养液为DMEM中含有0.3％牛血清白蛋白，10mM Hepes，100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
病毒滴度与病毒毒力的测定如下：
(1)红细胞凝集滴度(简称血凝滴度)的测定
首先在96孔U形板的各孔中加入25μl 0.85％氯化钠(Nacl)，再于第一孔中加入25μl病毒液，经多次吹打充分混匀后吸取25μl液体放入第二孔，依次进行稀释，最后一孔吹打混匀后吸取25μl弃之。然后于每孔中加入25μl 1％鸡血红细胞悬液，混匀后置室温30～60min，观察结果，进行红细胞凝集滴度计算。
(2)病毒毒力的检测
TCID50检测：将病毒进行倍比稀释，接种于24孔细胞培养板培养成单层的MDCK细胞中，每个稀释度平行加4个孔，每孔加200μl稀释液，于34℃孵育1hr后用Hank’s溶液冲洗，然后加入含TPCK-Trypsin(TPCK处理的胰酶)的细胞维持液。在感染后每24hr补加TPCK-Trypsin，在感染后72hr收获病毒，冻存于-80℃冰箱过夜，并用鸡血红细胞测定血凝滴度。
空斑形成单位(PFU)检测：将病毒进行10倍比稀释，接种于含培养成单层的MDCK细胞的6-孔板中，每个稀释度两孔，0.5ml/孔，轻轻晃动使加入的病毒液均匀地铺在细胞表面上，于34℃孵育1hr后用Hank’s液冲洗，然后加入第一层覆盖液，3ml/孔，置34℃孵育72hr后加入第二层覆盖液，24～72hr取出，计数空斑。
结果如图5显示，(1)没有转染siRNAs而只感染病毒的对照细胞(空白)中，流感病毒滴度随时间的延长逐渐升高，说明病毒感染细胞后不断复制，病毒产量逐步增加，至感染后72hr达到最高(HA血凝滴度为1∶128)。(2)针对无关蛋白的siRNA(对照siRNA)对病毒复制没有影响，用实验证实了siRNA的特异性。(3)在转染了能表达No.6号、No.12号或No.16号siRNA的质粒的细胞中病毒滴度很低，说明质粒表达No.6号、No.12号、No.16号siRNA能在MDCK细胞中有效抑制病毒复制，而且随着时间的延长，病毒量没有明显增加。由此可见，siRNA可以有效抑制病毒在细胞中的复制，而且抑制效果至少可以持续4天。
实施例七 细胞中转染不同量的No.6号siRNA表达质粒对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
方法同实施例六。
培养在24孔板的MDCK细胞中转染(如实施例五中用脂质体转染)不同量的能表达No.6号siRNA的质粒(如图6中显示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量为MOI 0.001，感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图6所示。由图6中的结果可以明显地看出，随着表达No.6号siRNA的质粒的增加，No.6号siRNA对细胞中流感病毒的抑制效果也越来越明显。由此可见，质粒表达No.6号siRNA可以强有效地抑制细胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的复制与感染，而且具有量依赖性。
实施例八 细胞中转染不同量的化学合成No.6号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
方法同实施例七。
培养在24孔板的MDCK细胞中转染(如实施例五中用脂质体转染)不同量的化学合成No.6号siRNA(如图7中显示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量为MOI 0.001，感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图7所示。由图7中的结果可以明显地看出，随着化学合成No.6号siRNA量的增加，No.6号siRNA对细胞中流感病毒的抑制效果也越来越明显。这进一步说明，化学合成No.6号siRNA可以强有效地抑制细胞中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98的复制与感染，而且具有剂量依赖性。
实施例九 siRNA对新产生病毒粒子的抑制
将培养在24孔板的MDCK细胞先进行病毒感染，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量为MOI 0.001，2hr后再转染能表达No.6号siRNA的质粒(500ng/well)，转染后细胞于34℃、5％CO2继续培养，在感染病毒后72hr收获细胞及培养液进行病毒滴度或病毒毒力的测定。结果如图8所示。由图8中的结果可以看出，随着时间的延长，没有转染siRNA的空白对照和转染了无关siRNA(对照siRNA)的细胞中流感病毒的量逐渐增加，而转染了能表达No.6号siRNA的质粒的细胞中流感病毒的量只是略有增加，这说明No.6号siRNAs能有效抑制新病毒粒子的产生。
实施例十 细胞中质粒表达各种siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
方法同实施例六。
培养在24孔板的MDCK细胞中分别转染能表达针对乙型流感病毒多聚酶组分PB2、PB1或PA特异siRNA的质粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量为MOI 0.001，感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图9所示。由图9中的结果可以明显地看出，质粒表达的针对乙型流感病毒多聚酶组分PB2、PB1或PA特异siRNA可以有效地抑制细胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的复制与感染。
实施例十一 细胞中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/37/99(来自中国国家流感中心)的抑制
方法同实施例六。
培养在24孔板的MDCK细胞中转染能表达No.6号、No.12号siRNA的质粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量为MOI0.001，感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图10所示。由图10中的结果可以明显地看出，质粒表达No.6号、No.12号siRNA可以强有效地抑制细胞中的流感病毒B/Beijing/37/99的复制与感染。
实施例十二 细胞中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03(病毒基因工程国家重点实验室保存株)的抑制
方法同实施例六。
培养在24孔板的MDCK细胞中转染能表达No.6号、No.12号siRNA的质粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量为MOI 0.01，感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图11所示。由图11中的结果可以明显地看出，质粒表达No.6号、No.12号siRNA可以强有效地抑制细胞中的流感病毒B/Jiangsu/10/03的复制与感染。
实施例十三 细胞中siRNA与利巴韦林对乙型流感病毒的抑制效果比较
方法同实施例六。
培养在24孔细胞培养板中的MDCK细胞，一部分孔的细胞转染能表达No.6号、No.12号siRNA的质粒(500ng/well)，6hr后进行病毒感染：每孔细胞接种病毒100μl，其中B/Beijing/76/98和B/Beijing/37/99病毒感染量为MOI 0.001、B/Jiangsu/10/03病毒感染量为MOI 0.01；另一部分孔中的细胞，感染同样多的病毒后，在培养液中加入利巴韦林(Ribavirin)3.6μg/孔；空白对照为不加任何抑制物、只感染病毒的对照。感染病毒后细胞于34℃5％CO2培养。病毒感染后72hr收获细胞及培养液，测定病毒滴度。结果如图12所示。由图中结果可以看出，No.6号、No.12号siRNA和利巴韦林均能抑制细胞中乙型流感病毒的复制；利巴韦林对B/Beijing/37/99的抑制效果稍差；当细胞中转染500ng能表达siRNAs的质粒时，对三种乙型流感病毒的抑制效果比3.6μg利巴韦林好。
实施例十四 鸡胚中质粒表达各种siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
将500ng能表达针对乙型流感病毒多聚酶组分PB2、PB1或PA特异siRNA的质粒分别用无血清培养基(Opti-MEMI Reduced SerumMedium，Invitrogen公司产品)进行稀释，体积为100μl；然后与B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl或200μl混合，接种10日龄鸡胚的尿囊腔。接种66hr后，收获鸡胚尿囊液，进行病毒含量测定。结果如图13所示。由图中的结果可以明显地看出，质粒表达针对乙型流感病毒多聚酶组分PB2、PB1或PA特异siRNA均可以强有效地抑制鸡胚中流感病毒B/Beijing/76/98的复制与感染。
实施例十五 鸡胚中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制
方法同实施例十四。
接种的乙型流感病毒B/Beijing/37/99的毒力为5200PFU/ml。
病毒滴度测定结果如图14所示。由图中的结果可以看出，质粒表达No.6号、No.12号siRNA可以有效地抑制鸡胚中流感病毒B/Beijing/37/99的复制与感染。
实施例十六 鸡胚中质粒表达No.6号、No.12号siRNA对乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制
方法同实施例十四。
接种的乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的毒力为8500PFU/ml。
病毒滴度测定结果如图15所示。由图中的结果可以看出，质粒表达No.6号、No.12号siRNA可以强有效地抑制鸡胚中流感病毒B/Jiangsu/10/03的复制与感染。
实施例十七 鸡胚中化学合成siRNA对乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制
方法同实施例十四。
将60nmol化学合成siRNAs用Opti-MEMI Reduced Serum Medium(Invitrigen公司产品)进行稀释，体积为100μl；然后与B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl或200μl混合，接种10日龄鸡胚的尿囊腔。接种66hr后，收获鸡胚尿囊液，进行病毒含量测定。结果如图16所示。由图中的结果可以明显地看出，化学合成No.6号、No.10号、No.12号或No.16号siRNA，无论病毒接种量为650PFU/egg还是1300PFU/egg，均可以强有效地抑制鸡胚中流感病毒B/Beijing/76/98的复制与感染。
实施例十八 鸡胚中siRNA与利巴韦林对乙型流感病毒的抑制效果比较方法同实施例十四。
将能表达No.6号、No.12号siRNA的质粒(500ng)或利巴韦林3.6μg与病毒B/Beijing/76/98(650pfu/egg)或B/Beijing/37/99(520pfu/egg)或B/Jiangsu/10/03(850pfu/egg)一起接种10日龄鸡胚的尿囊腔，接种后66hr收获鸡胚尿囊液，进行病毒含量测定。结果(如图17所示)发现，对三种病毒，只接种病毒、不介入siRNA和药物的鸡胚尿囊液(对照)中均可检测到很高的病毒含量；而同时接种了能表达No.6号或No.12号siRNA的质粒和病毒的鸡胚，其尿囊液中的病毒含量很低，说明它们有效地抑制了病毒的复制；利巴韦林与病毒一起接种鸡胚尿囊腔，结果鸡胚尿囊液中的病毒含量比只接种病毒的鸡胚尿囊液中病毒量少，但比介入了siRNAs的鸡胚尿囊液中的病毒含量高。由此可见，500ng能表达No.6号或No.12号siRNA的质粒在鸡胚中产生的siRNAs抑制乙型流感病毒复制与感染的效果比3.6μg利巴韦林好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120>针对乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA序列及其应用
<130>IDC050122
<160>36
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
gugcugaaga cauaggaac 19
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
gugagacuug acaaugcca 19
<210>3
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
gaagcaggaa uaccaagag 19
<210>4
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>4
gacacuagga uguuccaag 19
<210>5
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>5
gucacccaaa gcaagugag 19
<210>6
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>6
guccuaacua uaugcggca 19
<210>7
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>7
gcaacggcac uaaacacaa 19
<210>8
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
gguuuccuca uaaagagaa 19
<210>9
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>9
gguuuguauu aguaguuga 19
<210>10
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>10
ggaucagcau gacaguaac 19
<210>11
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>11
gaucuguuua gcauaccau 19
<210>12
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>12
gaagaauguc aaaggauga 19
<210>13
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>13
gaucugcguc caucuagag 19
<210>14
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>14
gagcauggaa uagagacuc 19
<210>15
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>15
gcagacucac agaacuuca 19
<210>16
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>16
ggaaugagga gcuacauag 19
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>17
guagcaagga ugucucccu 19
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>18
gaaauguaga guggcagcu 19
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<212>RNA
<213>人工序列
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guuccuaugu cuucagcac 19
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<212>RNA
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<400>20
uggcauuguc aagucucac 19
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<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>21
cucuugguau uccugcuuc 19
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<212>RNA
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<400>22
cuuggaacau ccuaguguc 19
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<212>RNA
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<400>23
cucacuugcu uugggugac 19
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>24
ugccgcauau aguuaggac 19
<210>25
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<212>RNA
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<400>25
uuguguuuag ugccguugc 19
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<212>RNA
<213>人工序列
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uucucuuuau gaggaaacc 19
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<212>RNA
<213>人工序列
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ucaacuacua auacaaacc 19
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<212>RNA
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guuacuguca ugcugaucc 19
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<212>RNA
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augguaugcu aaacagauc 19
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<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
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ucauccuuug acauucuuc 19
<210>31
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>31
cucuagaugg acgcagauc 19
<210>32
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>32
gagucucuau uccaugcuc 19
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<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>33
ugaaguucug ugagucugc 19
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<212>RNA
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cuauguagcu ccucauucc 19
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<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>35
agggagacau ccuugcuac 19
<210>36
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>36
agcugccacu cuacauuuc 19
Claims (26)
1.分离的流感病毒小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18中任意一条序列。
2.与权利要求1的siRNA靶序列在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。
3.包含权利要求1-2任一项的序列的核酸构建体。
4.权利要求1-2任一项所述的序列在筛选抗流感病毒药物中的应用。
5.小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1或2的序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表达和/或流感病毒的复制和/或感染。
6.如权利要求5所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上。
7.如权利要求6所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
8.权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度为15-27个核苷酸。
9.权利要求8所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度为19-23个核苷酸。
10.权利要求9所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的长度为19、20或者21个核苷酸。
11.权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有10个碱基对。
12.权利要求11所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有15个碱基对。
13.权利要求11所述的核糖核酸，其中，双链RNA的互补区域至少有18个碱基对。
14.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸为具有19-23对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有18个碱基互补配对。
15.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％。
16.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为45-55％。
17.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一性。
18.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含18、19、20、或21对互补碱基。
19.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少15个碱基互补。
20.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述反义RNA片段序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示的任意一条序列有至少18个碱基互补。
21.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段与反义RNA片段的3’端包含至少两个脱氧寡核苷酸的末端。
22.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反义RNA片段序列包含SEQ ID NO：X，正义RNA片段序列包含SEQID NO：(X-18)，X为19-36中的任一整数。
23.如权利要求5-7任一项所述的核糖核酸，其中，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同一性。
24.包含权利要求5-23任一项的核糖核酸的药物组合物。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防流感病毒引起的流行性感冒或其它相关疾病、或者用于抑制流感病毒的复制和/或感染、或者用于抑制流感病毒蛋白质的表达。
26.权利要求1的序列、权利要求4的应用、权利要求5的核糖核酸、或者权利要求24的药物组合物，其中流感病毒是乙型流感病毒。
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| CN102002489B (zh) * | 2009-09-02 | 2013-06-12 | 中国科学院微生物研究所 | 抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用 |
| CN117051018A (zh) * | 2020-07-25 | 2023-11-14 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种埃博拉病毒的靶点序列及其应用 |
Citations (2)
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2005
- 2005-12-30 CN CNB2005100035637A patent/CN100365122C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1837366A (zh) | 2006-09-27 |
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