CN102002489B

CN102002489B - 抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用

Info

Publication number: CN102002489B
Application number: CN 200910090628
Authority: CN
Inventors: 黄文林; 宋丽萍; 高诗娟; 刘鹤
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2009-09-02
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2029-09-02
Also published as: CN102002489A

Abstract

本发明公开了一种抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用。本发明提供的抑制H1N1型流感病毒增殖的RNA如序列表的序列1所示。本发明同时保护所述RNA的编码序列，以及含有所述编码序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。本发明还保护一种抑制H1N1型流感病毒增殖的药物，其活性成分为所述RNA、所述编码序列、所述重组表达载体和所述表达盒中的至少一种。本发明提供的RNA可以有效的与H1N1型流感病毒的PB1蛋白编码基因相互结合，抑制PB1蛋白在细胞中的表达。该RNA可以有效地抑制H1N1型流感病毒在细胞内的复制过程。本发明提供的RNA有望作为新型的流感药物，具有重大的价值。

Description

抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用。

背景技术

流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感病毒威胁性最大。根据神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)的变异，甲型病毒又分为不同的亚型。目前已确定的HA亚型为15种，NA为9种。流感病毒属于正粘病毒科，是有包膜的单负链、分节段的RNA病毒。甲型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，一般认为：RNA1编码PB2蛋白；RNA2编码PB1蛋白；RNA3编码PA蛋白；RNA4编码HA蛋白；RNA5编码NP蛋白；RNA6编码NA蛋白和一个NB非结构蛋白；RNA7编码M1和M2，可能还有M3蛋白；RNA8编码两个非结构蛋白NS1和NS2蛋白。流感是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。该疾病潜伏期短，传播迅速。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死亡人数。美国已经将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大“杀手”。

目前人类对流感病毒感染尚没有有效疗法。尽管由死病毒、减毒毒株或者重组表面糖蛋白组成的抗流感病毒疫苗能够有效地保护70-80％的健康成人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分病毒，对于新的潜在爆发的毒株可能没有保护作用。而且对于高风险人群如婴儿、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40％。另外，疫苗所诱导的免疫反应为IgG型，一般只能保持6个月左右。用于治疗流感病毒感染的另一种手段是使用抗病毒抑制剂。这些抑制剂包括：Amamtadine，Rimatadine，Relenza和Tamiflu。临床结果表明，尽管使用这些抑制剂对部分患者有一定的疗效，但是其很容易诱导产生病毒抗性株和具有很强的副作用，特别对中枢神经系统的影响很大。鉴于近两年流感病毒频繁暴发，所以研发有效抑制流感病毒感染的方法就显得尤为重要。

MicroRNA是一类长度大约为21～23个核苷酸的单链小分子RNA，它主要是通过与相关蛋白质形成RNA诱导沉默复合物来介导基因的表达调控过程——抑制靶基因的翻译过程或者促使靶基因的mRNA降解。MicroRNA的初始转录产物是pri-miRNA。MicroRNA成熟的第一步是由Drosha RNase III核酸内切酶剪切pri-miRNA形成60-70nt长的、具有茎环结构的microRNA前体pre-miRNA，Ran-GTP/Exportin-5负责将pre-miRNA由细胞核运输到细胞质中；Dicer，另外一种RNase III核酸内切酶在胞质中负责剪切pre-miRNA，形成21～23nt长的miRNA：miRNA*双体，随后，双螺旋解旋，成熟的miRNA选择性的结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称miRISC复合物，该复合物可以结合到有互补序列的mRNA上，对mRNA的表达进行调控。

目前研究证实microRNA在细胞对抗病毒过程中扮演重要的调控角色。研究者认为miRNA可以广泛的参与调控病毒感染哺乳动物细胞的过程，这种调控作用可以促进病毒复制也可以抑制病毒复制，任何的miRNA都可能具有潜在的，独立于其细胞功能之外的抗病毒作用。2005年，Charles-Henri Lecellier等人报道在哺乳动物细胞中，人的miR-32可以通过与病毒mRNA结合有效的限制PFV-1(primate foamyvirus type 1)在细胞中的积累；同年，Catherine L.Jopling报道降低细胞中miR122的表达量可以使hepatitis C viral的RNA丧失自主复制能力。2007年，HuiZhang等人报道，miR-28，miR-125b，miR-150，miR-223和miR-382这五种microRNA与HIV病毒在resting primary CD4+T cells中的潜伏密切相关，作者认为调控细胞内microRNA的表达水平有望成为一种去除艾滋病患者体内潜伏的HIV病毒的新方法。另外，在病毒感染宿主细胞的过程中，也会自身编码一些microRNA分子来调控宿主或者其自身基因的表达过程。但是目前尚未有文章报道关于microRNA分子对流感病毒在宿主细胞内复制的调控作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用。

本发明提供的抑制H1N1型流感病毒增殖的RNA(microRNA)，是序列表的序列1所示的RNA(hsa-miR-491-5p：5′-AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG-3′)。

本发明还保护所述RNA的编码序列。

所述编码序列可为序列表的序列2所示的DNA(5′-AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG-3′)。

含有所述编码序列的重组表达载体或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为将所述RNA的编码序列插入siSTRIKE^TMU6载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将序列表的序列3和/或序列表的序列4所示DNA插入siSTRIKE^TMU6载体得到的重组质粒。

所述microRNA、所述编码序列、所述重组表达载体和所述表达盒中的一种或几种的组合均可应用于制备抑制H1N1型流感病毒增殖的药物。

本发明还保护一种抑制H1N1型流感病毒增殖的药物，它的活性成分为所述MicroRNA、所述编码序列、所述重组表达载体和所述表达盒中的至少一种。

含有所述编码序列的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述MicroRNA、所述编码序列、所述重组表达载体和所述表达盒中的一种或几种的组合均可应用于抑制pb1基因表达。所述MicroRNA针对的是pb1基因的保守序列，所以多种H1N1型流感病毒毒株中的pb1基因均可被抑制。所述pb1基因如GenBank Accession Number：J02178.1，AF389116.1，EF190972.1，EF467819.1，EF190980.1，AB036781.1，J02151.1，M25932.1，EU004454.1，CY042630，AB268552，CY005104所示。

本发明提供的microRNA可以有效的与H1N1型流感病毒的PB1蛋白编码基因的转录产物mRNA相互结合，抑制PB1蛋白在293T细胞中的表达。细胞水平实验结果表明，该microRNA可以有效地抑制H1N1型流感病毒在MDCK细胞的复制过程，为其用于流感的治疗和预防提供了实验依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的流感药物，具有重大的价值。

附图说明

图1为在293T细胞中microRNA对pb1基因表达的抑制作用。

图2为实施例4的血凝值的测定中微量板示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例3和实施例4中，每个处理均设置三个重复，结果取平均值。

实施例1、hsa-miR-491-5p及其编码序列的发现

一、hsa-miR-491-5p核苷酸序列的获得

hsa-miR-491-5p序列(序列1)：5′-AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG-3′。

hsa-miR-491-5p的编码序列(序列2)：5′-AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG-3′。

二、阴性对照核苷酸序列的获得

在Sanger数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中查阅线虫cel-let-7的核苷酸序列作为阴性对照序列。

RNA序列为：5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′；

DNA序列为：5′-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3′。

这个阴性对照已经通过BLAST比对所有人、大鼠以及大鼠的基因组序列以及microRNA序列。

实施例2、hsa-miR-491-5p表达载体的构建

一、hsa-miR-491-5p表达载体(重组质粒A)的构建

将hsa-miR-491-5p的表达序列构建到siSTRIKE^TMU6载体(Promega公司，C7920)，siSTRIKE^TMU6载体自身带有粘性末端。

合成能表达hsa-miR-491-5p及其反向互补序列的核苷酸序列如下(序列表的序列3)：

ACC AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG CTTCCTGTCA CCTCATGGAAGGGTTCCCCACT TTTTC

I II

*I部分序列是hsa-miR-491-5p核苷酸序列，II是I部分序列的反向互补核苷酸序列，能与I部分核苷酸序列形成发卡结构。

序列3所示DNA的反向互补DNA(序列表的序列4)如下：

TGCAGAAAA AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG TGACAGGAAG CCTCATGGAAGGGTTCCCCACT

A B

*A部分的序列是II部分的互补序列，B部分的序列是I部分的互补序列。

在生物公司合成上述两条序列(序列3和序列4所示DNA)，将序列退火后可以形成与载体连接的粘性末端，将退火后的序列连接到siSTRIKE^TMU6载体上形成重组质粒，重组质粒具有氨苄抗性。用重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于promega公司)，涂布于含有氨苄的LB平板上，37℃倒置12小时后挑取阳性克隆，提取质粒并进行测序。测序结果表明，得到了携带序列3所示DNA(hsa-miR-491-5p编码DNA)的重组质粒，将其命名为重组质粒A。

二、阴性对照表达载体(重组质粒B)的构建

合成能表达cel-let-7及其反向互补序列的核苷酸序列(5′至3′方向)如下(序列表的序列5)：

ACC TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCTTCCTGTCA AACTATACAACCTACTACCTCATTTTC

I II

*I部分序列是cel-let-7核苷酸序列，II是I部分序列的反向互补核苷酸序列，能与I部分核苷酸序列形成发卡结构。

序列5所示DNA的反向互补DNA(5′至3′方向)如下(序列表的序列6)：

TGCAGAAAA TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT TGACAGGAAG AACTATACAACCTACTACCTCA

A B

将序列退火后可以形成与载体连接的粘性末端，将退火后的序列连接到siSTRIKE^TMU6载体上形成重组质粒，重组质粒具有氨苄抗性。用重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于promega公司)，涂布于含有氨苄的LB平板上，37℃倒置12小时后挑取阳性克隆，提取质粒并进行测序。测序结果表明，得到了携带序列5所示DNA(cel-let-7编码DNA)的重组质粒，将其命名为重组质粒B。

实施例3、hsa-miR-491-5p序列对流感pb1基因表达的抑制作用

一、pb1表达载体(重组质粒C)的构建

根据pb1基因(GenBank Accession Number：J02178.1)设计含有xbaI酶切位点的引物序列，模板为H1N1型流感病毒(上海麦莎生物科技有限公司，B65241G)的cDNA，PCR扩增pb1基因自5′端第1位至2341位核苷酸序列并克隆到pRL-TK表达载体(Promega公司，E2241)中luciferase基因下游的XbaI酶切位点处，得到重组质粒C。

二、hsa-miR-491-5p序列对流感pb1基因表达的抑制作用

处理一：用293T细胞(购于中国细胞库典藏细胞中心，QK10428)铺24孔板；当每孔细胞密度达到60％的时候，将实施例2构建的重组质粒A转染进293T细胞(转染量为0.4μg/孔)；24h后，将重组质粒C转染到293T细胞中(转染量为0.4μg/孔)；36小时后，通过检测luciferase的表达量来确定hsa-miR-491-5p对pb1基因表达的抑制作用。

处理二(阴性对照)：用293T细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到60％的时候，将实施例2构建的重组质粒B转染进293T细胞(转染量为0.4μg/孔)；24h后，将重组质粒C转染到293T细胞中(转染量为0.4μg/孔)；36小时后，通过检测luciferase的表达量来确定对照序列对pb1基因表达的影响。

处理三(空白对照)：用293T细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到60％的时候，将重组质粒C转染到293T细胞中(转染量为0.4μg/孔)；36小时后，通过检测luciferase的表达量来确定pb1基因的表达情况。

实验结果见图1。实验结果显示，本发明设计的hsa-miR-491-5p序列可以有效地抑制pb1基因的表达。

实施例4、hsa-miR-491-5p序列对H1N1流感病毒增殖的抑制作用

处理一：用MDCK细胞(购于中国细胞库典藏细胞中心，QK10562)铺6孔板，当细胞密度达到70％的时候，用实施例2构建的重组质粒A转染MDCK细胞(转染量为0.4μg/孔)；24h后，接种H1N1型流感病毒(上海麦莎生物科技有限公司，B65241G)(转染量为0.4μg/孔)；35℃培养36小时，取细胞培养上清液，测血凝效价和PFU(空斑形成单位，Plaque-forming unit)。

处理二：用MDCK细胞铺6孔板，当细胞密度达到70％的时候，用实施例2构建的重组质粒B转染MDCK细胞(转染量为0.4μg/孔)；24h后，接种H1N1型流感病毒(转染量为0.4μg/孔)；35℃培养36小时，取细胞培养上清液，测血凝效价和PFU。

处理三：用MDCK细胞铺6孔板，当细胞密度达到70％的时候，继续培养24h，接种H1N1型流感病毒(转染量为0.4μg/孔)，35℃培养36小时，取细胞培养上清液，测血凝效价和PFU。

血凝测定结果见表1。Pfu测定结果见表2。

表1hsa-miR-491-5p对H1N1型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制(血凝效价)

样品	血凝值
		空白样品(细胞没有作任何处理)	512
阴性对照(cel-let-7)	512
		hsa-miR-491-5p	16

表2hsa-miR-491-5p对H1N1型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制(PFU)

样品	PFU
		空白样品(细胞没有作任何处理)	6.0×10⁹
阴性对照(cel-let-7)	6.8×10⁹
		hsa-miR-491-5p	4.0×10⁷

血凝效价(血凝滴度)的检测方法如下：

(一)鸡血红细胞的制备

1、抗凝剂的配制：25g葡萄糖，8.5g柠檬酸钠，4.5g NaCl，0.55g柠檬酸；加去离子水1000ml，用NaOH或HCl调整PH至6.1，用0.22μm的细菌滤器过滤。

2、0.5％鸡血红细胞悬液的配制：在注射器中吸取2ml的抗凝剂，然后用注射器在公鸡的翅静脉处取鸡血1ml，使鸡血和抗凝剂混匀；800rpm/min离心5min沉淀鸡血红细胞，去上清；用PBS洗涤鸡血红细胞3次后，用PBS重悬鸡血红细胞，终浓度为0.5％(体积百分含量)。

(二)血凝值的测定

1、选择“V”型的96孔微量板测定病毒的血凝值。将微量板横向放置(示意图见图2)：垂直方向称列，如孔A1～H1成为第一列；平行方向称行，如A1～A12成A行。

2、在第1列加入待测病毒培养液100μl，第2列到第12列加入50μl的PBS溶液。用多道加样器从第一列各孔分别取50μl病毒液，由第一列至第11列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μl。第12列作为阴性对照，不加入病毒培养液。

3、每孔加入50μl 0.5％鸡血红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒培养液充分混合。

4、室温孵育30～60分钟，观察血凝现象并记录结果。

5、红细胞凝集以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。

PFU的测定方法如下：

1、在24孔板铺MDCK细胞，当细胞密度达到100％后，吸去细胞培养上清液，用PBS洗涤细胞3次后准备接种待测病毒培养液。

2、待测病毒培养液分别稀释合适的倍数后，每孔加入100μl，使其均匀铺在细胞表面，室温静止1小时后，吸去病毒培养液，并用PBS洗涤细胞3次后在加入琼脂糖凝胶/病毒培养基混合液，待混合液凝固后，将细胞板倒置放在35℃培养，48小时后，计算病毒的PFU值。

病毒培养液的配方：DMEM培养基(购于科昊泽生物有限公司)，0.25％(质量百分含量)的胰酶。

琼脂糖凝胶/病毒培养基混合液配方：1％(质量百分含量)低熔点琼脂糖溶液与病毒培养液等体积混合。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>抑制H1N1型流感病毒增殖的microRNA及其应用

<130>CGGNARY92514

<160>6

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aguggggaac ccuuccauga gg 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agtggggaac ccttccatga gg 22

<210>3

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

accagtgggg aacccttcca tgaggcttcc tgtcacctca tggaagggtt ccccactttt 60

tc 62

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tgcagaaaaa gtggggaacc cttccatgag gtgacaggaa gcctcatgga agggttcccc 60

act 63

<210>5

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

acctgaggta gtaggttgta tagttcttcc tgtcaaacta tacaacctac tacctcattt 60

tc 62

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tgcagaaaat gaggtagtag gttgtatagt ttgacaggaa gaactataca acctactacc 60

tca 63

Claims

1.RNA、RNA的编码序列、含有所述编码序列的重组表达载体和含有所述编码序列的表达盒中的任意一种在制备抑制H1N1型流感病毒增殖的药物中的应用；

所述RNA是序列表的序列1所示的RNA。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码序列是序列表的序列2所示的DNA。

3.一种抑制H1N1型流感病毒增殖的药物，它的活性成分为RNA、RNA的编码序列、含有所述编码序列的重组表达载体和含有所述编码序列的表达盒中的任意一种；

所述RNA是序列表的序列1所示的RNA。

4.RNA、RNA的编码序列、含有所述编码序列的重组表达载体和含有所述编码序列的表达盒中的至少一种在制备抑制pb1基因表达的产品中的应用；

所述RNA是序列表的序列1所示的RNA。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述编码序列是序列表的序列2所示的DNA。