CN108342388B - 微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的应用 - Google Patents

微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微RNA hsa‑mir‑127‑3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的应用。本发明提供微RNA hsa‑mir‑127‑3p在如下任一项中的应用：(1)制备诊断流感产品中的应用；(2)制备预防流感产品中的应用；(3)制备治疗流感产品中的应用；(4)制备流感病毒抑制剂中的应用；hsa‑mir‑127‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。hsa‑mir‑127‑3p的表达有助于机体对于流感病毒的控制，通过靶向流感病毒的PB2、M和NS上的片段，从而降解其mRNA。

Description

微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的 应用
技术领域
本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的应用。
背景技术
流感病毒(Influenza virus)对人类的健康造成极大危害，在已经过去的20世纪，人类发生过4次大规模的流感流行，包括1918年的“西班牙流感”大流行、1957年的“亚洲流感”大流行、1968年的“香港流感”大流行和1977年的“俄罗斯流感”大流行。这些流感的大流行使得人类生命财产及经济发展遭受了巨大的打击。
流感病毒属于正粘病毒科，是一类分节段、有包膜的单链负链RNA病毒，传染性强且易发生变异，包括A、B、C三型，可感染不同宿主。其中A型流感病毒可以感染人类、禽类及哺乳动物，是引起季节性流行性感冒的主要病原体；B型、C型流感病毒则主要感染人类。近年来在猪和牛体内分离到新的流感病毒，由于此新病毒与A、B、C型流感病毒差异很大，被定义为新的D型流感病毒。A型流感病毒又被称作甲型流感病毒，可依据其表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)种类分为不同亚型，截止到目前为止已经发现了18种亚型的HA和11种亚型的NA。A型流感病毒近年来在我国呈现季节性流行趋势。
目前人类对流感病毒感染尚没有有效疗法。尽管由死病毒、减毒毒株或者重组表面糖蛋白组成的抗流感病毒疫苗能够有效地保护70％-80％的成人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分病毒，对于新的潜在爆发的毒株可能没有保护作用。用于治疗流感病感染的另一种手段是使用病毒抑制剂。这些抑制剂包括：Amamtadine,Rimatadine,Relenza和Tamiflu。临床结果表明，尽管使用这些抑制剂对部分患者有一定的疗效，但是其很容易诱导产生病毒抗性株和具有很强的副作用，特别对中枢神经系统的影响很大。鉴于近两年流感病毒频繁暴发，所以研发有效抑制流感病毒感染的方法就显得尤为重要。
微RNA(microRNA，miRNA)是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。microRNA通过mRNA(messenger RNA)的3’非翻译区(3’untranslational region,3’UTR)相互作用，从而调控mRNA的翻译，进而广泛作用于肿瘤、炎症等各个生物学过程。
目前研究证实microRNA在细胞对抗病毒过程中扮演重要的调控角色。研究者认为miRNA可以广泛的参与调控病毒感染哺乳动物细胞的过程，这种调控作用可以促进病毒复制也可以抑制病毒复制，任何miRNA都可能具有潜在的，独立于其细胞功能之外的抗病毒作用。hsa-mir-127-3p(miRBase编号：MIMAT0000446)，其序列如下所示：UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU。目前研究发现，mir-127-3p主要在肿瘤的发生发展中发挥重要生物学功能。
发明内容
本发明的目的在于提供微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的一种应用。
本发明提供了微RNA hsa-mir-127-3p在如下任一项中的应用：(1)制备诊断流感产品中的应用；(2)制备预防流感产品中的应用；(3)制备治疗流感产品中的应用；(4)制备流感病毒抑制剂中的应用。所述hsa-mir-127-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，hsa-mir-127-3p能够结合流感病毒中PB2、M和NS上的片段，其结合位点可为如序列表的SEQID NO.2-SEQ ID NO.7所示的DNA片段。其中，所述流感病毒抑制剂为抑制流感病毒复制的抑制剂。其中，所述微RNA hsa-mir-127-3p可通过化学合成获得，也可通过构建表达载体进行表达获得。
优选地，根据前述的应用，所述流感为甲型流感；所述流感病毒为A型流感病毒，优选自亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。所述流感病毒具体可选自Influenza virusA/PR8/34(H1N1,PR8)、A/WSN/33(H1N1,WSN),A/Jiangxi/262/2005(H3N2)、A/Swine/Fujian/0325/2008(H1N1),A/Chicken/Liaoning/1/100(H9N2)中的一种或多种。
或优选地，根据前述的应用，所述产品为药物或保健品。
本发明还提供了上述hsa-mir-127-3p的类似物在如下任一项中的应用：(1)制备诊断流感产品中的应用；(2)制备预防流感产品中的应用；(3)制备治疗流感产品中的应用；(4)制备流感病毒抑制剂中的应用。
优选地，根据前述的应用，所述流感为甲型流感；所述流感病毒为A型流感病毒，优选自亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。所述流感病毒具体可选自Influenza virusA/PR8/34(H1N1,PR8)、A/WSN/33(H1N1,WSN),A/Jiangxi/262/2005(H3N2)、A/Swine/Fujian/0325/2008(H1N1),A/Chicken/Liaoning/1/100(H9N2)中的一种或多种。
优选地，根据前述的应用，所述产品为药物或保健品。
或优选地，所述类似物为模拟物(hsa-mir-127-3p mimic)或激动剂(hsa-mir-127-3p agomir)。其中，所述模拟物为一种RNA分子，可以通过载体导入细胞内或者直接运用化学合成的方法合成，上调相应miRNA在细胞内或者活体内miRNA浓度，从而调控基因表达。所述激动剂为经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，通过模拟相应miRNA进入miRNA效应器复合物(miRISC，miRNA-induced silencing complex)来调节靶mRNA的表达而发挥作用。
本发明还提供了表达前述hsa-mir-127-3p的载体在如下任一项中的应用：(1)制备诊断流感产品中的应用；(2)制备预防流感产品中的应用；(3)制备治疗流感产品中的应用；(4)制备流感病毒抑制剂中的应用。
优选地，根据前述的应用，所述流感为甲型流感；所述流感病毒为A型流感病毒，优选自亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。所述流感病毒具体可选自Influenza virusA/PR8/34(H1N1,PR8)、A/WSN/33(H1N1,WSN),A/Jiangxi/262/2005(H3N2)、A/Swine/Fujian/0325/2008(H1N1),A/Chicken/Liaoning/1/100(H9N2)中的一种或多种。
或优选地，根据前述的应用，所述产品为药物或保健品。
本发明发现hsa-mir-127-3p的表达有助于机体对于流感病毒的控制，通过靶向流感病毒的PB2、M和NS上的片段，从而降解其mRNA。细胞水平实验结果表明，该microRNA可以有效地抑制PR8以及H3N2的复制，为其用于流感病毒的治疗与预防提供了实验依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的流感药物，具有重大的价值。
附图说明
图1为本发明实施例2Hsa-mir-127-3p在PR8病毒中的8个片段作用的实验结果；
图2为本发明实施例2Hsa-mir-127-3p在H3N2病毒中的8个片段作用的实验结果；
图3为本发明实施例3中Hsa-mir-127-3p与PR8的保守序列结合示意图以及采用双荧光实验验证Hsa-mir-127-3p的作用靶点实验结果，其中，PB2-wt、M-wt以及NS-wt分别为PR8的PB2片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列，M片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列以及NS片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列，PB2-mut、M-mut以及NS-mut分别为突变后PB2片段的靶点序列、突变后M片段的靶点序列以及突变后NS片段的靶点序列；
图4为本发明实施例3中Hsa-mir-127-3p与H3N2的保守序列结合示意图以及采用双荧光实验验证Hsa-mir-127-3p的作用靶点实验结果其中，PB2-wt、M-wt以及NS-wt分别为H3N2的PB2片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列，M片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列以及NS片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点序列，PB2-mut、M-mut以及NS-mut分别为突变后PB2片段的靶点序列、突变后M片段的靶点序列以及突变后NS片段的靶点序列；
图5为本发明实施例4中Hsa-mir-127-3p(Hsa-127-3p)在细胞水平显著抑制PR8的复制，其中M1为PR8mRNA；
图6为本发明实施例4中Hsa-mir-127-3p(Hsa-127-3p)在细胞水平显著抑制H3N2的复制，其中M1为H3N2mRNA；以及
图7为本发明实施例5中Hsa-mir-127-3p(Hsa-127-3p)对PR8，H3N2，流行性H1N1，WSN，H9N2病毒抑制的广谱性，，其中M1为相应病毒mRNA；
附图标记：
*，为p<0.05；**，为P<0.01；***，为P<0.001；****，为P<0.0001。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
如本文所使用的治疗指任何在治疗或改善损伤、病状、病症或症状(例如，疼痛)上的成功指标，包括任何客观或主观的参数，诸如消除；好转；症状减少或使患者更能忍受症状、损伤、病状或病症；降低症状或病症频率或持续时间；或者，在一些情况下，预防症状或病症的发作。症状的治疗或改善可以基于任何客观或主观参数，包括，例如身体检查的结果。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Hsa-mir-127-3p mimic以及Hsa-mir-127-3p agomir由广州锐博生物公司合成。mimic control为
Figure BDA0001531991370000041
miRNA mimic control，购买自广州锐博生物公司。Agomir control为
Figure BDA0001531991370000042
miRNA agomir control，购买自广州锐博生物公司。
实施例1构建流感病毒全片段双荧光报告系统载体
本实施例用于构建流感病毒全片段双荧光报告系统载体，具体方法如下：
(1)使用Trizol法提取流感病毒(Influenza virus)A/PR8/34(H1N1,PR8)，以下简称PR8，和A/Jiangxi/262/2005(H3N2)，以下简称H3N2的总RNA，使用PROMEGA逆转录试剂盒反转RNA获取CDNA。
逆转录体系：
Figure BDA0001531991370000051
按照试剂盒说明书进行后续实验操作。
(2)根据PubMed获得的流感病毒八个片段序列(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)，扩增两株流感病毒分别对应的八个片段。其中，PR8的PB2GenBank编号为EF190971.1，PB1GenBank编号为EF190972.1，PA GenBank编号为EF190973.1，HA GenBank编号为EF190974.1，NP GenBank编号为EF190975.1，NA GenBank编号为EF190976.1，M GenBank编号为EF190977.1和NS GenBank编号为EF190978.1；H3N2的的PB2GenBank编号为MF407459，PB1GenBank编号为MF407460，PA GenBank编号为MF407461，HA GenBank编号为MF407462，NPGenBank编号为MF407464，NA GenBank编号为MF407463，M GenBank编号为CY059688.1和NSGenBank编号为MF407465。在片段两端加上XbaI酶切位点(TCTAGA)，以便插入到pGL3(Promega)载体中荧光素酶(Luciferase)的3’-UTR区域。
(3)分别对pGL3载体以及相应的流感病毒片段进行XbaI单酶切，分别将PR8以及H3N2的八个片段连入pGL3载体。共计获得16个后续实验所需的双荧光报告系统载体。
实施例2双荧光实验验证Hsa-mir-127-3p的作用片段
本实施例用于验证Hsa-mir-127-3p的作用片段，具体方法如下：
每次实验至少3个副孔，至少重复3次实验。
(1)处理组：用293T细胞铺48孔板，当每孔细胞密度达到60％的时候，将实施例1构建的插有流感病毒单个片段的双荧光报告系统载体，RL-TK，以及Hsa-mir-127-3p mimic转染进293T细胞(双荧光报告系统载体600ng/ul，RL-TK 10ng/ml，Hsa-mir-127-3p mimic5nM)，36小时后，通过检测萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)以及海肾荧光素酶(Ranilla Luciferase)的表达量来确定Hsa-mir-127-3p对各个流感病毒片段的抑制作用。
(2)阴性对照组：与处理组不同的是，将实施例1构建的插有流感病毒单个片段的双荧光报告系统载体改为PGL3的空载体，其他操作一致。
结果如图1和图2所示。图1为Hsa-mir-127-3p对PR8流感病毒8个片段作用的实验结果，Hsa-mir-127-3p可以下调插入PR8的PB2、M和NS片段的PGL3载体的萤火虫荧光素酶的表达。图2为Hsa-mir-127-3p对H3N2流感病毒8个片段作用的实验结果，Has-mir-127-3p下调插入H3N2除NP外其他七个片段的PGL3载体的萤火虫荧光素酶的表达。结果显示：本发明所提及的Hsa-mir-127-3p mimic可以同时有效地抑制PR8以及H3N2的PB2，M以及NS片段。其中，PR8的PB2片段如SEQ ID NO.14所示，PR8的M片段如SEQ ID NO.15所示，PR8的NS片段如SEQ ID NO.16所示；H3N2的PB2片段如SEQ ID NO.17所示，H3N2的M片段如SEQ ID NO.18所示，H3N2的NS片段如SEQ ID NO.19所示。
实施例3双荧光实验验证Hsa-mir-127-3p的作用靶点
本实施例用于验证Hsa-mir-127-3p在PR8以及H3N2的PB2，M以及NS片段上的作用靶点。
具体方法如下：
每次实验至少3个副孔，至少重复3次实验。
(1)使用Miranda软件预测Hsa-mir-127-3p在PR8以及H3N2的PB2，M以及NS片段上的作用靶点，发现在这三个片段中，Hsa-mir-127-3p可以靶向这三个片段的保守片段，与如图3和图4所示的片段(靶点)结合，具体地，PB2片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点分别为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.17的第1795-1814核苷酸，M片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.18的第88-112核苷酸，NS片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点分别为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.19的第136-153核苷酸。其中，PR8中PB2片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ ID NO.2所示，H3N2中PB2片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ ID NO.3所示，PR8中M片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ ID NO.4所示，H3N2中M片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ ID NO.5所示，PR8中NS片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ ID NO.6所示，H3N2中NS片段与Hsa-mir-127-3p结合的靶点如SEQ IDNO.7所示。
(2)将软件预测的靶点上下游各200bpPCR扩增出来，两端加上XbaI的酶切位点，将该段序列插入PGL3的荧光素酶luciferase的3’-UTR，获得WT结合靶点双荧光报告系统的载体。
(3)对于软件预测的靶点进行突变，PR8突变后的PB2片段、M片段和NS片段的靶点分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，H3N2突变后的PB2片段、M片段和NS片段的靶点分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示。
(4)将软件预测的靶点上下游各200bp PCR扩增出来，两端加上XbaI的酶切位点，将靶点上游、突变靶点以及靶点下游插入PGL3的luciferase的3’-UTR，获得结合靶点突变的载体。
(5)处理组一：用293T细胞铺48孔板，当每孔细胞密度达到60％的时候，将实施例3构建的WT结合靶点双荧光报告系统的载体，RL-TK，以及Has-mir-127-3p mimic转染进293T细胞(载体600ng/ul，RL-TK 10ng/ml，Has-mir-127-3p mimic 5nM)。36小时后，通过检测Firefly Luciferase以及Ranilla Luciferase的表达量来确定Has-mir-127-3p对各个靶点的结合情况。
(6)处理组二：与处理组一不同的是，将实施例3构建的WT结合靶点双荧光报告系统的载体改为相应的结合靶点突变的载体，其他操作一致。
(7)阴性对照组(mimic control)：mimic control为合成Hsa-mir-127-3p mimic时的mimic对照。阴性对照组与处理组(即处理组一或处理组二)不同的是,将Hsa-mir-127-3p mimic改为mimic control，其他操作一致。
结果如图3和图4所示。可以看到，Hsa-mir-127-3p对于插入WT结合靶点双荧光报告系统的载体，可以显著下调其Firefly荧光素酶的表达。但是，如果将预测靶点进行突变，这种抑制效果消失。结果说明：本发明所提及的Hsa-mir-127-3p mimic确实通过上述靶点来对流感病毒的蛋白量进行下调。
实施例4细胞水平验证Hsa-mir-127-3p对于流感病毒的抑制效果
本实施例在细胞水平上验证Hsa-mir-127-3p对于流感病毒的抑制效果。
具体方法如下：
每次实验至少3个副孔，至少重复3次实验。
(1)处理组一：用293T细胞铺12孔板，当每孔细胞密度达到60％的时候，将Hsa-mir-127-3p mimic转染进293T细胞(4nM或者20nM)。24h后，向293T感染PR8(MOI＝0.1)或者H3N2(MOI＝0.1)。感染PR8组别于感染后24h，Trizol裂解细胞提取RNA。而感染H3N2的组别则于感染后48小时收取样品。
(2)阴性对照组(mimic control)：mimic control为合成Hsa-mir-127-3p mimic时的mimic对照。阴性对照组与处理组(即处理组一或处理组二)不同的是,将Hsa-mir-127-3p mimic改为mimic control，其他操作一致。
(3)实时定量RT-qPCR：细胞总RNA使用TRizol抽提，使用PROMEGA逆转录试剂盒反转RNA获取CDNA。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。microRNA的相对定量使用2-△△ct法计算，mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
结果如图5和图6所示，Hsa-mir-127-3p在20nM的工作浓度下，可以显著抑制PR8以及H3N2的复制。而在4nM的工作浓度，仅在毒力较弱的H3N2中有抑制效果。
实施例5细胞水平验证Hsa-mir-127-3p抑制效果的广谱性
本实施例在细胞水平上验证Hsa-mir-127-3p对于流感病毒抑制效果的广谱性。
具体方法如下：
每次实验至少3个副孔，至少重复3次实验。
(1)处理组一：用A549细胞铺12孔板，当每孔细胞密度达到60％的时候，将Hsa-mir-127-3p Agomir转染进A549细胞(4nM)。24h后，向A549感染PR8，H3N2，流行性H1N1(p-H1N1)，WSN或者H9N2(MOI＝0.1)。感染后24h，Trizol裂解细胞提取RNA。
(2)阴性对照组(Agomir control)：Agomir control为合成Hsa-mir-127-3pAgomir时的Agomir对照。阴性对照组与处理组一不同的是，将Has-127-3p Agomir改为Agomir control，其他操作一致。
(3)实时定量RT-qPCR：细胞总RNA使用TRizol抽提，使用PROMEGA逆转录试剂盒反转RNA获取CDNA。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。microRNA的相对定量使用
Figure BDA0001531991370000081
法计算，mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
结果如图7所示，Hsa-mir-127-3p Agomir对于PR8，H3N2，流行性H1N1，WSN以及H9N2都具有显著的抑制效果。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 微RNA hsa-mir-127-3p及其类似物，以及表达该微RNA载体的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ucggauccgu cugagcuugg cu 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 2
ggccaataca gtgggtttgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 3
agccaataca gtgggtttgt 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 4
agccgagatc gcacagagac ttga 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 5
agccgagatc gcgcagagac ttga 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 6
cgccgagatc agaaatccct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 7
cgccgagatc agaggtccct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<400> 8
ggccaataca gtgccagggt 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(24)
<400> 9
agccgagatc gcacagaccc aaca 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<400> 10
cgccgagatc agcacaacct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<400> 11
agccaataca gtgccagggt 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(24)
<400> 12
agccgagatc gcgcagaccc aaca 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<400> 13
cgccgagatc agcgcaacct 20
<210> 14
<211> 2341
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 14
agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactaag aaatctaatg 60
tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc 120
aagaagtaca cttcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg 180
gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat 240
gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgctg gatcagaccg agtgatggta 300
tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa tgacaaatac agttcattat 360
ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420
cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcgaagag ttgacataaa tcctggtcat 480
gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540
gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600
gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660
gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720
ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780
aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840
gtatcagcag acccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca aattggtgga 900
attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960
aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag 1020
agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1080
ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca 1140
gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa 1200
cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata 1260
aaagcagtta gaggtgatct gaatttcgta aatagggcga atcagcgact gaaccctatg 1320
catcaacttt taagacattt tcaaaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380
gaacctatcg acgatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc 1440
gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500
gagagggtag tggtgagcat tgaccggttt ttgagagtcc gggaccaacg aggaaatgta 1560
ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac 1620
tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa 1680
tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740
tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800
tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860
accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920
cagttctcct catttactgt gaacgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980
aattctcctg tattcaacta caacaaggcc acaaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040
gctggcactt taaccgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100
aggggattcc tcattctggg caaagaagac aggagatatg ggccagcatt aagcatcaat 2160
gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220
gtgttggtaa tgaaacgaaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280
aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 15
<211> 1027
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 15
agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaac tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctaggcaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 16
<211> 890
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 16
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180
tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taagaacatc atactgaaag 420
caaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attgctaagg gctttcaccg 480
aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc tcttccagga catactgctg 540
aggatgtcaa aaatgcagtt ggagtcctca tcggaggact tgaatggaat gataacacag 600
ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660
ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720
gaaataagat ggttgattga agaggtgaga cacaaactga aggtaacaga gaatagtttc 780
gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840
actttctcat ttcagcttat ttaataataa aaaacaccct tgtttctact 890
<210> 17
<211> 2341
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 17
agcaaaagca ggtcaaatat attcagtatg gaaagaataa aagaactacg gaatctgatg 60
tcgcagtctc gcactcgcga gatactaaca aaaaccacag tggaccatat ggccataatt 120
aagaagtaca catcggggag acaggaaaag aacccgtcac ttaggatgaa atggatgatg 180
gcaatgaaat acccaatcac tgctgacaaa aggataacag aaatggttcc ggagagaaat 240
gaacaaggac aaactctatg gagtaaaatg agtgatgctg gatcagatcg agtgatggta 300
tcgcctttgg cagtaacatg gtggaataga aacggacccg tgacaagtac ggtccattac 360
ccaaaagtat acaagactta ttttgacaaa gtcgaaaggt taaaacatgg aacctttggc 420
cctgttcatt ttagaaatca agtcaagata cgcagaagag tagacataaa ccctggtcat 480
gcagacctca gtgccaaaga ggcacaagat gtaattatgg aagttgtttt ccccaatgaa 540
gtgggagcca ggatactaac atcagaatcg caattaacaa taactaaaga gaaaaaagaa 600
gaactccgag attgcaaaat ttctcccttg atggttgcat acatgttaga gagagaactt 660
gtacgaaaaa caagatttct cccagttgct ggcggaacaa gcagtatata cattgaagtt 720
ttacatttga ctcaaggaac gtgttgggaa caaatgtaca ccccaggtgg ggaagtgagg 780
aatgacgatg ttgaccaaag cctaattatt gcggccagga acatagtaag aagagccgca 840
gtatcagcag atccactggc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca aattggcggg 900
acaaggatgg tggacattct tagacagaac ccgactgaag aacaagctgt ggatatatgc 960
aaggctgcaa tgggattgag aatcagctca tccttcagct ttggtggatt tacatttaaa 1020
agaacaagcg ggtcatcagt caaaaaagag gaagaagtgc ttacaggcaa tctccaaaca 1080
ttgaagataa gagtacatga ggggtatgag gagttcacaa tggtggggaa aagagcaaca 1140
gctatactca gaaaagcaac cagaagattg gttcagctca tagtgagtgg aagagacgag 1200
cagtcaatag ccgaagcaat aatcgtggcc atggtgtttt cacaagagga ttgcatgata 1260
aaagcagtta gaggtgacct gaatttcgtc aacagagcaa atcagcggtt gaaccccatg 1320
catcagcttt taaggcattt tcagaaagat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggaatt 1380
gaacacatcg acagtgtgat gggaatggtt ggagtattac cagatatgac tccaagcaca 1440
gagatgtcaa tgagaggaat aagagtcagc aaaatgggtg tggatgaata ctccagtaca 1500
gagagagtgg tggttagcat tgatcgattt ttgagagttc gagaccaacg tgggaatgta 1560
ttattatctc ctgaggaggt cagtgaaaca cagggaactg agagactgac aataacttat 1620
tcatcgtcga tgatgtggga gattaacggt cctgagtcgg ttttggtcaa tacctatcaa 1680
tggatcatca gaaattggga agctgtcaaa attcaatggt ctcagaatcc tgcaatgttg 1740
tacaacaaaa tggaatttga accatttcaa tctttagtcc ccaaggccat tagaagccaa 1800
tacagtgggt ttgtcagaac tctattccaa caaatgagag acgtacttgg gacatttgac 1860
accacccaga taataaagct tctccctttt gcagccgctc caccaaagca aagcagaatg 1920
caattctctt cactgactgt aaatgtgagg ggatcaggga tgagaatact tgtaaggggc 1980
aattctcctg tattcaacta caacaagacc actaaaagac taacaattct cggaaaagat 2040
gccggcactt taattgaaga cccagatgaa agcacatccg gagtggagtc cgccgtcttg 2100
agagggtttc tcattatagg taaggaagac agaagatacg gaccagcatt aagcatcaat 2160
gaactgagta accttgcaaa aggggaaaag gctaatgtgc taatcgggca aggagacgtg 2220
gtgttggtaa tgaaacgaaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280
aaaagaattc ggatggccat caattaatgt tgaatggttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 18
<211> 1027
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 18
agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag ccttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60
ctctatcgtt ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagacttg aagatgtctt 120
tgctgggaaa aacacagatc ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaattct 180
gtcacctctg actaagggga ttttagggtt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgccctcaat gggaatggag atccaaacaa 300
catggacaaa gcggttaaac tgtataggaa acttaagagg gagataacgt tccatggggc 360
caaagaaata gctctcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgcatgg gcctcatata 420
caataggatg ggggctgtaa ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacatgtga 480
gcagattgct gactcccagc acaggtctca taggcaaatg gtggcaacaa ccaatccatt 540
aataagacat gagaacagaa tggttttggc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatca agtgagcagg cagcggaggc catggagatt gctagtcagg ccagacagat 660
ggtgcaggca atgagagcca ttgggactca tcctagttcc agtactggtc taagagatga 720
tcttcttgaa aatttgcaga cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacgattcaa 780
gtgacccgct tgttgttgcc gcgaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcgtctatc gactcttcaa acacggcctt aaaagaggcc 900
cttctacgga aggagtacct gagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagaatg 960
ctgtggatgc tgacgacagt cattttgtca gcatagagtt ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 19
<211> 890
<212> DNA
<213> A型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 19
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg attccaacac tgtgtcaagt ttccaggtag 60
attgctttct ttggcatatc cggaaacaag ttgtagacca agaactgagt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaggt ccctaagggg aagaggcaat actctcggtc 180
tagacatcaa agcagccacc catgttggaa aacaaattgt agaaaagatt ctgaaagaag 240
aatctgatga ggcacttaaa atgaccatgg tctccacacc tgcttcgcga tacataactg 300
acatgactat tgaggaattg tcaagaaact ggttcatgct aatgcccaag cagaaagtgg 360
aaggacctct ttgcatcaga atggaccagg caatcatgga gaaaaacatc atgttgaaag 420
cgaatttcag tgtgattttt gaccgactag agaccatagt attactaagg gctttcaccg 480
aagagggagc aattgttggc gaaatctcac cattgccttc ttttccagga catactattg 540
aggatgtcaa aaatgcaatt ggggtcctca tcggaggact tgaatggaat gataacacag 600
ttcgagtctc taaaaatcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggggac 660
ctccacttac tccaaaacag aaacggaaaa tggcgagaac agctaggtca aaagtttgaa 720
gagataagat ggctgattga agaagtgaga cacagactaa aaacaactga aaatagcttt 780
gaacaaataa cattcatgca agcattacaa ctgctgtttg aagtggaaca ggagataaga 840
actttctcat ttcagcttat ttaatgataa aaaacaccct tgtttctact 890

Claims (6)

1.微RNA hsa-mir-127-3p在如下任一项中的应用：
(1)制备诊断流感产品中的应用；
(2)制备预防流感产品中的应用；
(3)制备治疗流感产品中的应用；
(4)制备流感病毒抑制剂中的应用；
所述hsa-mir-127-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，
所述流感为甲型流感；
所述流感病毒为A型流感病毒亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。
3.权利要求1所述hsa-mir-127-3p的模拟物或激动剂在如下任一项中的应用：
(1)制备诊断流感产品中的应用；
(2)制备预防流感产品中的应用；
(3)制备治疗流感产品中的应用；
(4)制备流感病毒抑制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，
所述流感为甲型流感；
所述流感病毒为A型流感病毒亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。
5.一种表达权利要求1所述hsa-mir-127-3p的载体在如下任一项中的应用：
(1)制备诊断流感产品中的应用；
(2)制备预防流感产品中的应用；
(3)制备治疗流感产品中的应用；
(4)制备流感病毒抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，
所述流感为甲型流感；
所述流感病毒为A型流感病毒亚型H1N1、H3N2和H9N2中的一种或多种。
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