KR20120013163A - 정소유래 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마이크로ｒｎａ 및 그 방법 - Google Patents

정소유래 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마이크로ｒｎａ 및 그 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생식선 줄기세포에서 상대적으로 과발현 또는 저발현되는 임프린트된 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고 여기서 상기 마이크로RNA는 배아 줄기세포 및/또는 다능성 성체 생식선 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 과발현 또는 저발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물 및 그 과발현 또는 저발현되는 임프린트된 마이크로RNA의 특성을 이용한 생식선 줄기세포 식별 방법에 관한 것이다.

Description

정소유래 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마이크로ＲＮＡ 및 그 방법{MicroRNA for distinguishing testes-derived male germ-line stem cells and method thereof}
본 발명은 정소유래 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마이크로RNA 및 그 방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 포유동물에 있어서 생식세포인 정자는 남성측 유전정보를 다음세대에 전달하는 매개체이다. 따라서 정자를 생산하는 일련의 복합적인 과정을 포함하는 정자형성과정 (spermatogenesis)은 종의 보존과 유전적 다양성에 있어서 필수적인 과정이다. 이러한 정자형성과정은 성체의 세포생산 시스템 중 가장 생산적인 과정으로서, 인간의 경우 정상 성인 남성이 매일 100 x 106개의 정자를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 복합적이고 생산적인 정자형성과정에 있어서 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells)는 남성의 생애 전반에 걸쳐 정자형성과정을 유지시키는 기본이자 토대를 제공하는 중요한 세포이다. 정원줄기세포는 여러 성체 줄기세포들이 지닌 특성과 같이 자가-증식 (self-renewal) 능력과 분화 (differentiation) 능력을 지니고 있다. 정자형성과정의 첫 단계는 최종적으로 정자로 분화되는 다양한 단계의 분화된 딸세포 (daughter progeny)를 생산할 수 있는 정원줄기세포의 분화기작 결정 (fate decision)으로부터 시작된다. 비록 현재까지 단일 정원세포(single spermatogonia; As spermatogonia)군 중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만, 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다. 따라서 과거 여러 해 동안 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰에 의지한 이론적인 지식에 의존되고 있었다.
1994년 브린스터 (Brinster; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1994, 22;91(24): 11303-7) 연구팀은 생쥐 정소세포의 이식기법을 개발하여 생쥐의 정소에 정원줄기세포가 존재하는 것을 실제로 입증하고, 동시에 정원줄기세포의 기능적 특성을 직접적으로 연구할 수 있는 전기를 마련하였다. 이후 정소세포 및 정원줄기세포 이식기법은 정원줄기세포의 생물학적인 특성과 활용법 개발에 있어서 필수적이고 가장 핵심적인 기술로 사용되고 있다.
그러나 동물 종에 따라 다소 차이는 있지만, 성체의 경우 정소 내에 극히 적은 수의 정원줄기세포가 존재하기 때문에 정원줄기세포의 특성 연구 및 활용법 개발에 많은 어려움이 있는 실정이다. 실제로 성체 생쥐의 경우 정소세포 3,333개당 1개, 성체 랫트의 경우 정소세포 500개당 1개의 정원줄기세포가 존재하고, 다른 포유류의 경우에는 현재까지 정확한 보고가 없다.
포유동물의 발생에 있어서 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)는 배아의 외배엽 (embryonic ectoderm)으로부터 생성되는 원시생식세포 (primodial germ cells; PGCs)로 구별될 수 있다. 태아 (fetus) 발생과정 중 PGCs는 세포분열 과정을 통하여 증식되면서 생식선융기부(genital ridge)로 이동한다. 여성에 있어서는 PGCs가 여성 생식세포인 난자 (oocytes)를 형성하고 이후 분열은 중지되며 성숙된 난자를 생성하기 위한 감수분열에 돌입된다.
반면, 남성에 있어서는 PGCs가 성삭 (sex cord)으로 둘러싸이게 되면서 gonocyte로 분화되고 출생 시까지 세포분열이 중지된 상태로 유지된다. 따라서 gonocyte는 남성생식선발생 (male germ-line development)에 있어서 최초로 남성 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)로 분화된 세포로 이해되고 있다. 신생자 (neonate)의 정소 내에서 gonocyte는 유일한 남성생식선줄기세포로서 출생 후 세포분열을 다시 시작하면서 세포수가 증가되고 일부는 정소내 세정관 (seminiferous tubule)의 기저부로 이동하여 정원줄기세포로 분화되면서 정자형성과정을 시작하게 된다. 남성측에 있어서 최초의 생식선줄기세포인 gonocyte는 정원줄기세포로 분화되기 전까지 세정관의 중앙부위에 위치하게 되며 형태학적으로 독특한 특이성을 지니고 있다. 이러한 특이성은 신생자 정소에 존재하는 여러 다른 종류의 세포들과 비교하여 gonocyte는 크기가 다소 크며 (직경 12~15 um), 세포질의 복잡성(complexity) 정도가 낮고 구형의 핵이 두드러지게 구분되며, 경우에 따라 세포막이 위족형태 (pseudopod)를 이루는 형태학적인 독특한 특징으로 대별된다. 반면 gonocyte로부터 분화된 정원줄기세포는 상기의 gonocyte와 같은 형태학적으로 두드러진 특징을 상실하게 되기 때문에 형태학적으로 정원줄기세포를 다양한 종류의 정소세포들과 구분하는 것은 불가능하게 된다.
생식선 줄기(GS) 세포는 2 년 이상 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)의 존재하에서 인 비트로 자가-재생될 수 잇는 정소에서 SSC의 인 비트로 카운터파트이고 불임성 수컷 마우스의 세정관으로 이식될 때, 공여체 유래 정자형성을 확립하여서 정자를 생성하고 공여체 하플로타입을 자손으로 전송한다(de Rooij DG. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 7939-7940; Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Honjo T, Shinohara T. Biol Reprod 2003a; 68: 167-173;Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Hum Reprod 2003b; 18: 2660-2667; Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Iwano T, Lee J, Kazuki Y, Inoue K, Miki H, Takehashi M, Toyokuni S, Shinkai Y, Oshimura M, Ishino F, Ogura A, Shinohara T. Development 2005; 132: 4155-4163).
마우스 GS 세포의 콜로니 형성 능력은 비록 그들의 SSC 특성을 유지하는데 필수적이지는 아니지만 leukemia inhibitory factor(LIF)에 의해서 더 개선될 수 있다(Kanatsu-Shinohara et al. 2007). 마우스 GS 세포들을 이들 조건 하에서 배양을 계속할 때, 2차 세포 타입이 배아 줄기(ES) 세포에 사용된 배양 조건 하에서 선택적으로 확장될 수 있는 것이 나타난다. GS 세포와는 이들 세포들을 다능성(multipotent) GS (mGS; 신생아 정소로부터 유래) 또는 다능성 성체 GS (maGS; 성인 정소로부터 유래) 세포이라 명명하고, 이들 세포들은 다능성이고 정소의 세정관 속으로 이식하면 테라토마를 생성한다(Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G. Nature 2006; 440: 1199-1203; Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Lee J, Yoshimoto M, Ogonuki N, Miki H, Baba S, Kato T, Kazuki Y, Toyokuni S, Toyoshima M, Niwa O, Oshimura M, Heike T, Nakahata T, Ishino F, Ogura A, Shinohara T. Cell 2004; 119: 1001-1012). mGS 및 maGS 세포들은 낮은 빈도수로 그들 스스로 배양된 GS 세포로부터 기원하고, 초기 타입의 생식 세포의 일부 잔류하지 않는다(de Rooij DG. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 7939-7940).
따라서, 특정 시간 지점에서, 인 비트로 배양된 GS 세포는 수용체 정소로 그들의 이식에 대해서 정자형성을 시작하는 대신에 테라토마를 생성할 수 있는 일부 오염된 mGS 또는 maGS 세포들을 함유할 수 있다(Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Lee J, Yoshimoto M, Ogonuki N, Miki H, Baba S, Kato T, Kazuki Y, Toyokuni S, Toyoshima M, Niwa O, Oshimura M, Heike T, Nakahata T, Ishino F, Ogura A, Shinohara T. Cell 2004; 119: 1001-1012). 따라서 mGS 또는 maGS 세포들로부터 GS 세포를 구별할 수 있는 분자마커는 임상 및 연구 세팅 모두에서 그들의 성공적인 적용에 유용하다.
MicroRNA (miRNA)는 miRNA의 시드 서열(그것의 5말단의 2-8 뉴크레오타이드) 및 타겟 mRNA의 3'UTR에서 그것의 상보적인 시드 매치 서열 사이에 캐노니컬 염기 쌍을 통하여 유전자 발현을 전사 후적으로 조절하는 20-25 뉴크레오타이드 길이의 비코딩 내생 RNA 군이다. 그들은 종종 리던던트 유전자의 계열로 분류되고 증식성 항상성, 분화 또는 배아 줄기세포성의 조절을 포함하는 다양한 범위의 생물학적 과정에 필수적인 여러 추정적인 타겟을 가진다(Inui M, Martello G, Piccolo S. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11: 252-263).
임프린트된 miRNA는 일반적으로 그들이 발생한 유전자 부위 외부에서 trans로 작용하고 부모 기원 형태로 모노-대립형질적으로 발현되는 miRNA의 계열을 나타낸다(Davis E, Caiment F, Tordoir X, Cavaille J, Ferguson-Smith A, Cockett N, Georges M, Charlier C. 2005. Curr Biol 15(8):743-749;Peters J, Robson JE. 2008. Mamm Genome 19(7-8):493-502). 임프린트된 miRNA를 코딩하는 유전자들은 비록 극소소의 개체(singleton) 임프린트된 miRNA가 여러 유전자 지역에 존재하지만 마우스에서 두 are mainly clustered in two 염색체 도메인 [PWS-AS (Snurf - Snrpn 라고도 함) 클러스터 및 Dkl1 - Gtl2 클러스터]에 주로 클러스트되어있다(Peters J, Robson JE. 2008. Mamm Genome 19(7-8):493-502;Royo H, Cavaille J. 2008. Biol Cell 100(3):149-166; Seitz H, Royo H, Lin SP, Youngson N, Ferguson-Smith AC, Cavaille J. 2004. Biol Chem 385(10):905-911).
이 외에도,Igf2 - H19, Peg10, Copg2, Rasgfr1, Gnas - Nespas, Kcnq1 및 Igf2r-Air와 같은 거의 모든 잘 규명된 임프린트된 유전자들은 각 유전자 클러스트의 임프린팅 조절 부위(imprinting control region;ICR)에서 DNA 메틸화 상태에 의하여 조절되고 부모 기원 형태에 제한되는 발현을 가지는 하나 이상의 임프린트된 miRNA를 코딩한다(Peters J, Robson JE. 2008. Mamm Genome 19(7-8):493-502;Royo H, Cavaille J. 2008. Biol Cell 100(3):149-166; Seitz H, Royo H, Lin SP, Youngson N, Ferguson-Smith AC, Cavaille J. 2004. Biol Chem 385(10):905-911).
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생식선 줄기세포 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 생식선 줄기세포에서 과발현되는 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고 여기서 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA는 배아 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 과발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 및 miR-483 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 생식선 줄기세포에서 과발현되는 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고 여기서 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA는 다능성 성체 생식선 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 과발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 생식선 줄기세포에서 저발현되는 임프린트된 miR-127 또는 miR-127-5p 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고
여기서 상기 임프린트된 miR-127 또는 miR-127-5p 마이크로RNA는 배아 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 저발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 miR-127 또는 miR-127-5p 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 4, 및 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 배양된 세포에서 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA의 발현을 정량화하여, 상기 마이크로RNA가 배아 줄기 세포 또는 다능성 성체 생식선 줄기세포에 비하여 상대적으로 과발현되면 생식선 줄기세포로 판정하는 단계를 포함하는 수컷 생식선 줄기세포를 식별하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 마우스 정자에서 임프린트된 miRNA의 발현 패턴이 ES 또는 체세포와 구별되는 것을 발견하였다 (도 1). 그들은 체 세포에서 관찰된 것보다 모계적으로 임프린트된 miRNAs (miR-296-3p, miR-296-5p, miR-483)의 발현에서는 더 높았고 (P<0.001), 부계적으로 임프린트된 miRNAs (miR-127, miR-127-5p)에서는 더 낮았다 (P<0.001).
본 발명자들은 임프린트된 miRNAs가 GS 및 maGS 세포의 독특한 특징이 될 수 있고, 임프린트된 miRNA 전사 및 풍부함이 정소 유래 수컷 생식선 줄기세포의 후생학적 특징을 형성할 수 있다고 생각한다.
정자와 유사하게 대조군 ES 세포보다 GS 세포에서 모계적으로 임프린트된 miRNAs (miR-296-3p, miR-296-5p, miR-483)의 발현은 더 높았고 (P<0.001), 반면에 부계적으로 임프린트된 miRNAs (miR-127, miR-127-5p)은 더 낮았다 (P<0.001).(도 2). 이들 데이터는 GS 세포에서 임프린트된 miRNA의 발현 패턴이 안드로겐적(androgenetic)이다라는 것을 암시한다. 흥미롭게도 maGS 세포에서 임프린트된 miRNA의 발현 패턴은 maGS 세포에서 발현이 GS 세포에서의 것과 유사한(P<0.05) miR-127 및 miR-127-5p를 제외하고는 ES 세포의 것과 유사하였다(도 2). 유사하게, maGS 세포에서 임프린트된 miR-483의 발현 패턴은 GS 세포의 것보다 더 낮았지만(P<0.001), ES 세포의 것보다는 더 높았다(P<0.001). 다른 말로, maGS 세포에서 임프린트된 miRNA의 발현 패턴은 GS 및 ES 세포의 것 사이의 중간이고, 따라서 maGS 세포에서 ES 세포 유사 특징의 획득은 불완전 또는 부분적이다.
따라서 높은 발현의 모계적으로 임프린트된 miRNAs 및 낮은 발현의 부계적으로 임프린트된 miRNAs는 maGS 또는 ES 세포로부터 GS 세포를 구별할 수 있는 분자 마커로 사용될 수 있는 GS 세포에 대한 후생학적 miRNA 특징을 형성할 수 있다.
기원 의존적 유전자 발현 패턴을 야기하는 유전자 임프린팅은 주로 DNA 메틸화에 의하여 달성된다.
따라서 GS 세포에서 임프린트된 miRNA의 발현이 안드로겐적인지를 더욱 확인하기 위하여, 본 발명자들은 각 유전자 클러스트에서 모든 임프린트된 miRNAs의 발현을 조절하는 ICR의 DNA 메틸화 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 GS 세포에서 각각 Gnas - Nespas DMR, Igf2 - H19 ICR 및 Dlk1 - Dio3 IG-DMR에서 0.0, 99.6 및 95.0%의 CpGs가 메틸화된 것을 확인하였고, 정자에서 발견된 각 사이트에 대하여 관찰된 0.0, 99.3 및 90.0% 메틸화와 유사하였다(도 3). 따라서 DNA 메틸화 분석은 임프린트된 miRNAs가 GS 세포에서 안드로겐적이다라는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 부분적으로 리프로그램된 iPS 세포와는 다르게 maGS 세포는 Dlk1-Dio3 IG-DMR에서 비정상(aberrant) DNA 메틸화를 나타내지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나 흥미롭게도 ES 세포의 반(hemi)-접합체적(zygotic) 메틸화 패턴(59.2% vs. 46.3%)을 가짐에도 불구하고, maGS 세포는 miR-127 및 miR-127-5p의 발현 패턴에서 GS 세포와 다르지 않았고(P>0.05), 정자의 것과 닮았다. DNA 메틸화 및 miRNA 발현에서의 이 차이는 GS, maGS 및 ES 세포들 모두 수컷 기원이고 XY 성 염색체를 포함하고 있기 때문에 그들의 염색체 조성에서 차이에 기인하는 것이 아니다.
본 발명자들은 또한 GS 및 maGS 세포에서 임프린트된 miRNAs의 발현이 그들의 인 비트로 분화 동안에 변경되는지를 조사하였다. 예상한 것과 같이, 줄기 세포(Oct4 , Nanog , Cd9 , Rex1), 및 GS 세포(Stra8 , Cd9) 마커 유전자들은 GS 및 maGS 세포의 분화 동안에 사이런스되었지만 ES 세포에서는 완전하지 않았다(도 6). 분화 동안, 임프린트된 miRNAs는 또한 분화 단계 및 miRNA 모두에서 변하는 변화를 겪는다(도 3). 흥미롭게도 비록 명확한 패턴이 명백하지 않지만, maGS 세포의 인 비트로 분화 동안에 임프린트된 miRNA 발현 패턴의 변화는 ES 세포의 것과 더 유사하고 분화하는 GS 세포의 것과는 명백하게 달랐다(도 3).
본 발명자들은 GS 세포에서 miR-483의 높은 발현과 일치하게 Jarid1b 발현이 maGS 또는 ES 세포에서보다 GS 세포에서 현저하게 낮다는 것을 발견하였다(도 5).
본 발명자들의 데이터는 정소 유래 수컷 생식선 줄기 세포에서 후생학적 마킹이 임프린트된 miRNA의 발현 패턴에 대하여 명백하고 세포 운명의 조절과 상관관계가 있는 것 같다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 GS 세포는 maGS 세포로 그들의 전환에 대한 ES 세포 유사 패턴으로 변하는 임프린트된 miRNAs의 발현과 안드로겐적 DNA 메틸화를 가지고 따라서 그것에 의하여 정소 유래 수컷 생식선 줄기 세포에서 임프린트된 miRNAs의 가능한 기능을 예측한다.
또한 iPS 세포와 다르게, maGS 세포는 Dlk1 - Dio3 로커스에 의하여 코딩되는 miRNAs의 발현 또는 비정상 DNA 메틸화를 나타내지 않았다. 따라서 임프린트된 miRNA는 정소 유래 수컷 생식선 줄기세포의 후생학적 특징으로 작용할 수 있고, maGS 또는 ES 세포로부터 GS 세포를 구별하는 분자 마커로 사용될 수 있다. 또한 분화 동안에 임프린트된 miRNA 발현 변화는 분화 상태 및 miRNA에 의하여 변한다.
인 비트로 배양된 GS 세포는 수용체 정소로 그들의 이식에 대하여 정자 형성을 시작하는 대신에 테라토마를 생성하는 일부 오염된 mGS 또는 maGS 세포를 가질 수 있는 조건이 주어지면, 본 발명은 확장된 인 비트로 배양 동안에 GS 세포로부터 생성되는 maGS 세포를 구별하여서 GS 세포의 임상적 이식 동안에 테라토마 형성의 가능성을 회피할 수 있다.
또 이식 전에 추정적인 GS/maGS 콜로니를 대조군으로 정자 및 ES 세포를 사용하여 임프린트된 miRNAs의 임프린팅 상태를 스크리닝할 수 있다. 정자의 것과 비교하여 안드로겐적 임프린팅 상태는 GS 세포로부터 기원한 콜로니라는 것을 예측한다.
도 1은 마우스 체 세포(오픈 박스), 정자 (크로스된 박스) 및 정소-조직(클로스된 박스)에서 miR-296-3p, miR-296-5p, miR-127, miR-127-5p 및 miR-483 임프린트된 miRNAs의 발현을 보여주는 그림이다. 바 위에 값들은 체 세포에서 각 miRNA의 발현에 대하여 표준화한 miRNA들의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 바 위에 여러 알파벳(a, b, c)은 각 유전자 발현에서 유의적인 차이(P<0.01)를 나타낸다.
도 2는 수컷 생식선(GS) 및 다능성 성체 생식선(maGS) 줄기 세포에서 miR-296-3p, miR-296-5p, miR-127, miR-127-5p 및 miR-483 임프린트된 miRNAs의 발현을 보여주는 그림이다. 배아 줄기(ES) 세포를 비교의 대조군으로 사용하였다. 바 위에 값들은 ES 세포에서 각 miRNA의 발현에 대하여 표준화한 miRNA들의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 바 위에 여러 알파벳(a, b, c)은 각 유전자 발현에서 유의적인 차이(P<0.01)를 나타낸다.
도 3은 수컷 생식선(GS) 및 다능성 성체 생식선(maGS) 줄기 세포에서 Gnas -Nespas (Gnas - Nespas DMR), Dlk1 - Dio3 (Dlk - Dio3 IG-DMR) 및 Igf2 - H19 (Igf2 - H19 ICR) 로시에서 임프린트된 miRNAs의 발현을 조절하는 임프린팅 조절 부위의 DNA 메틸화 상태를 나타낸 그림이다. 정자, 난모세포 및 배아 줄기(ES) 세포들을 비교의 대조군으로 사용하였다. 각 라인은 분리된 클론을 나타내고 각 CpG 부위는 GenBank 서열에서 그것의 서열 위치에 의하여 나타내어진다. 각 서클은 증폭된 면적 내에 각 CpG 잔기들을 나타낸다. 오픈 및 클로즈된 서클들은 각각 비메틸화 및 메틸화된 CpGs를 나타낸다.
도 4는 수컷 생식선(GS) 및 다능성 성체 생식선(maGS) 줄기 세포의 인 비트로 분화 동안 miR-296-3p (A), miR-296-5p (B), miR-127 (C), miR-127-5p (D) 및 miR-483 (E) 임프린트된 miRNAs의 발현을 나타낸 그림이다. 배아 줄기(ES) 세포들을 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. 미분화된 콜로니들을 4일 동안 현적(hanging drop)법에 의해서 배아체 (EB)로 유도하고, 또 다른 4일 동안을 all-trans retinoic acid (EBRA)로 더 처리하였다. 바 위에 값들은 각 군의 미분화된 콜로니에서 각 miRNA의 발현에 대하여 표준화한 miRNA들의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 바 위에 여러 알파벳(a, b, c)은 GS, maGS 또는 ES 세포 군 내 유전자 발현에서 유의적인 차이(P<0.01)를 나타낸다.
도 5는 수컷 생식선(GS) 및 다능성 성체 생식선(maGS) 줄기 세포에서 miR-483의 추정적인 타겟인 Jarid1b의 발현을 나타낸 그림이다. 배아 줄기(ES) 세포들을 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. 바 위에 값들은 미분화된 ES 세포에서 각 miRNA의 발현에 대하여 표준화한 miRNA들의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 바 위에 여러 알파벳(a, b, c)은 유의적으로 차이가 있다(P<0.01).
도 6은 마우스에서 수컷 생식선(GS) 및 다능성 성체 생식선(maGS) 줄기 세포의 인 비트로 분화 및 특성을 나타낸 그림이다. 배아 줄기(ES) 세포들을 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. A: GS, maGS 및 ES 세포로부터 생성된 콜로니 특성, alkaline phosphatase (AP) 활성 및 배아체를 나타내고, B: maGS, ES 세포 및 GS의 all-trans retinoic acid -처리 배아체(EBRA), 배아체 및 미분화된 콜로니에서 줄기 세포 및 생식 세포 마커 유전자의 발현을 나타낸다.
실시예 1: GS 및 maGS 세포주의 확립
GS 및 maGS 세포들은 전에 기재된 방법(Jung YH, Gupta MK, Shin JY, Uhm SJ, Lee HT. 2010. MicroRNA signature in testes-derived male germ-line stem cells. Mol Hum Reprod)을 일부 수정하여 4에서 6주령의 DBA/2 마우스로(오리엔트 바이오, 대한민국)부터 분리하였다.
그 분리된 세포들은 15% (v/v) fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT), MEM 비필수 아미노산(Gibco BRL, Grand Island, NY), 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL), 50 uM 2-mercaptoethanol, 및 10 ng/ml 재조합 인간 GDNF (R & D Systems, Minneapolis, MN)가 보충된 DMEM 배지에서 미토마이신 C-처리된 STO 피더 세포 층 상에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 부가적으로, 1000 unit/ml murine LIF (Chemicon, Temecula, CA)를 생식 세포 콜로니의 형성을 촉진하기 위하여 초기 배양 배지에 첨가하였다. 그 확립된 GS 및 maGS 세포 콜로니들을 각 세포주를 형성하기 위하여 LIF 첨가(maGS) 또는 LIF 부존재(GS)에서 추가적으로 배양하였다. 확립된 GS 및 maGS 세포 주의 특성은 마커 유전자의 발현, 면역조직화학 및 DNA 메틸화에 의하여 증명하였다. 인 비트로 분화 연구를 위하여 GS 및 maGS 세포들을 4일 동안 현적 배양에 의하여 배아체(EB)를 유도하고 다음 4일 동안 1.0 uM all-trans retinoic acid (EBRA)의 존재하에서 더 배양하였다. 대조군으로서 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 표준 분석에 의한 분석을 위해서 배양하였다.
실시예 2: miRNAs 의 분석
임프린트된 miRNAs의 발현을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 Dlk1 - Dio3, Igf2 - H19 및 Gnas - Nespas 임프린트된 유전자 클러스터에 의하여 코딩되는 miRNAs를 나타내는 miR-127, miR-483 및 miR-296를 선택하였다(이 부위에서 ICR의 DNA 메틸화가 각 클러스터에서 모든 miRNAs의 발현을 조절하기 때문)(da Rocha ST, Edwards CA, Ito M, Ogata T, Ferguson-Smith AC. 2008. Trends Genet 24(6):306-316; Lin SP, Youngson N, Takada S, Seitz H, Reik W, Paulsen M, Cavaille J, Ferguson-Smith AC. 2003. Nat Genet 35(1):97-102; Veronese A, Lupini L, Consiglio J, Visone R, Ferracin M, Fornari F, Zanesi N, Alder H, D'Elia G, Gramantieri L, Bolondi L, Lanza G, Querzoli P, Angioni A, Croce CM, Negrini M. 2010. Cancer Res 70(8):3140-3149; Williamson CM, Turner MD, Ball ST, Nottingham WT, Glenister P, Fray M, Tymowska-Lalanne Z, Plagge A, Powles-Glover N, Kelsey G, Maconochie M, Peters J. 2006. Nat Genet 38(3):350-355).
그 Dlk1 - Dio3, Igf2 - H19 및 Gnas - Nespas 임프린트된 유전자 클러스터들은 Dlk1-Dio3 IG-DMR 및 Igf2 - H19 ICR 모두에서 DNA 메틸화는 각각 모계 및 부계 염색체에서 miR-127 및 miR-483의 발현을 저해하기 위하여 부계 염색체에서 임프린트되기 때문에 분석을 위하여 특이적으로 선택되었다.
한편, Gnas - Nespas DMR은 부계 염색체에서 miR-296의 발현을 억제하기 위하여 모계 염색체에서 임프린트된다(Lin SP, Youngson N, Takada S, Seitz H, Reik W, Paulsen M, Cavaille J, Ferguson-Smith AC. 2003. Nat Genet 35(1):97-102; Peters J, Robson JE. 2008. Mamm Genome 19(7-8):493-502; Royo H, Cavaille J. 2008. Biol Cell 100(3):149-166).
따라서 이들 세 임프린트된 유전자 클러스트의 분석은 부계 임프린팅 조절 모계적으로 또는 부계적으로 발현된 miRNAs 및 그 반대의 모든 가능한 조합을 포함한다. miRNAs의 발현은 실시간 TaqManR MicroRNA 분석에 의하여 정량화하였다(Melton C, Judson RL, Blelloch R. Nature 2010; 463: 621-626).
요약하면, 세포들을 PBS로 2회 세척하고, 300 uL의 라이시스/결합 용액으로 라이시스한 후 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 mirVanaR MicroRNA 분리 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 추출하였다. 그 후 그 분리된 miRNAs (10 ng)를 100 mM dNTPs, 50 U/ul MultiScribeR 역전사 효소, 20 U/ul RNase 저해제 및 3 ul의 miRNA-특이적 역전사(RT) 프라이머를 포함하는 15ul의 반응 혼합물을 사용하는 TaqManR MicroRNA Reverse Transcription Kit (Ambion)를 사용하여 cDNA로 전환하였다. 차후적으로, 1.33 ul의 RT 산물을 제조업자의 지시에 따라서 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 상에서 내생적인 sno202 대조군(Ambion) 및 각 miRNA에 대한 TaqMan 유니버설 PCR 마스터 믹스 miRNA-특이적인 프라이머를 포함하는 20ul 반응 혼합물에서 PCR 증폭하였다. RT 및 실시간 PCR에 대한 증폭 파라미터는 제조업자의 프로토콜에 따라서 채택되었다(TaqManMicroRNA assay kit; Applied Biosystems). 이 방법은 성숙 miRNAs를 독점적으로 증폭하는 것이지 그들의 전구체를 증폭하는 것은 아니다. 각 miRNAs에 대한 발현 값은 내생적인 sno202 대조군에 대해 표준화하였고, 상대적인 발현 값들은 Applied Biosystems user bulletin PN 4347825의 방법을 사용하여 얻었다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
실시예 3: DNA 메틸화의 분석
각 임프린트된 유전자 클러스트에서 miRNAs의 발현을 조절하는 임프린트된 조절 부위에서 Dlk1 - Dio3 (Dlk1 - Dio3 IG-DMR), Igf2 - H19 (H19 ICR), 및 Gnas -Nespas (Gnas - Nespas DMR) 유전자 클러스터(da Rocha ST, Edwards CA, Ito M, Ogata T, Ferguson-Smith AC. 2008. Trends Genet 24(6):306-316; Veronese A, Lupini L, Consiglio J, Visone R, Ferracin M, Fornari F, Zanesi N, Alder H, D'Elia G, Gramantieri L, Bolondi L, Lanza G, Querzoli P, Angioni A, Croce CM, Negrini M. 2010. Cancer Res 70(8):3140-3149; Williamson CM, Turner MD, Ball ST, Nottingham WT, Glenister P, Fray M, Tymowska-Lalanne Z, Plagge A, Powles-Glover N, Kelsey G, Maconochie M, Peters J. 2006. Nat Genet 38(3):350-355)의 DNA 메틸화 상태는 바이설페이트 유전자 시퀀싱에 의하여 GS 및 maGS 세포에서 분석하였다(Jung YH, Gupta MK, Oh SH, Uhm SJ, Lee HT. 2010. Exp Cell Res 316(5):747-761; Oh SH, Jung YH, Gupta MK, Uhm SJ, Lee HT. 2009. Mol Cells 27(6):635-640).
요약하면 유전자 (2 ㎍)를 Epitect bisulfite 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 sodium bisulfite를 처리하고 Dlk1 - Dio3 IG-DMR, H19 ICR 및 Gnas-Nespas DMR에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR증폭하였다 (표 1). 그 후 증폭된 PCR-산물들을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에서 클로닝하고, 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems)로 시퀀싱하고 BiQ Analyzer를 사용하여 메틸화 상태를 분석하였다(Bock C, Reither S, Mikeska T, Paulsen M, Walter J, Lengauer T. 2005. BiQ Analyzer: Bioinformatics 21(21):4067-4068). 대조군으로서 마우스 정자 및 난모세포로부터 유래한 유전자 DNA도 분석하였다.
유전자 클러스터 프라이머 서열(5'→ 3') 어닐링 온도 ( o C ) 앰플리콘 크기 ( bp )
Igf2 - H19 ICR 1st sense:
1st antisense:		 GAGTATTTAGGAGGTATAAGAATT
ATCAAAAACTAACATAAACCCCT		 50 422
2nd sense:
2nd antisense:		 GTAAGGAGATTATGTTTATTTTTGG
CCTCATTAATCCCATAACTAT		 50
Dlk1 - Dio3 IG - DMR 1st sense:
1st antisense:		 GTGTTAAGGTATATTATGTTAGTGTTAGG
TACAACCCTTCCCTCACTCCAAAAATT		 50 441
2nd sense:
2nd antisense:		 ATATTATGTTAGTGTTAGGAAGGATTGTG
TACAACCCTTCCCTCACTCCAAAAATT		 50
Gnas - Nespas DMR 1st sense:
1st antisense:		 GGGTGTGAGAGGTTTGGAGAGTTTATAAGA
CCAACTAAATCTCAACCACTAACCCACTCC		 62 607
2nd sense:
2nd antisense:		 GTGTGAGAGGTTTGGAGAGTTTATAAGATT
AACTAAATCTCAACCACTAACCCACTCCCC		 62
표 1은 bisulfite sequencing- PCR(BS-PCR)에 의한 DNA 메틸화 분석에 사용한 프라이머 쌍을 나타낸다.
실시예 4: 유전자 발현 분석
GS 및 maGS 세포들에서 유전자 발현은 반(semi)-정량 RT-PCR 또는 실시간 정량 RT-PCR (qRT-PCR)에 의하여 분석하였다(Jung YH, Gupta MK, Oh SH, Uhm SJ, Lee HT. 2010. Exp Cell Res 316(5):747-761; Oh SH, Jung YH, Gupta MK, Uhm SJ, Lee HT. 2009. Mol Cells 27(6):635-640). PCR 증폭에 사용한 프라이머 쌍을 표 2에 기재하였다.
Gene 프라이머 서열(5'→ 3') GenBank accession 번호 어닐링 온도 ( o C ) 앰플리콘 크기( bp )
Gapdh CTCACTCAAGATTGTCAGCA
CATACTTGGCAGGTT		 XM_001473623.1 58 326
Oct4 GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC
CTCGAACCACATCCTTCTCT		 NM_013633.2 58 312
Nanog AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG
CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG		 NM_001080945.1 58 553
Cd9 AGTGCATCAAATACCTGCTCTTC
CTTTAATCACCTCATCCTTGTGG		 NM_007657.3 58 329
Rex1 ATTTCAGAAAGGAAACCAAGGAG
CCGTTTTCTTCATTTGTTCATTC		 NM_009556.3 58 341
Stra8 GCCAGAATGTATTCCGAGAA
CTCACTCTTGTCCAGGAAAC		 NM_009292.1 58 631
Ret TTAGCACAATGGAGAGATTTGGT
TCAGGGAAACATCTAATCCAACT		 NM_001080780.1 58 379
Jarid1b GCTGTCCACAACCAGAGAGA
TGACAGGGAAGTTTGGTTGA		 NM_152895.1 65 137
표 2는 RT-PCR 또는 실시간 qRT-PCR에 사용된 프라이머 쌍에 대한 정보이다.
본 발명에서 임프린트된 유전자 발현 레벨은 SPSS 소프트웨어를 사용한 ANOVA에 의하여 비교하였다 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). P≤0.05에서 차이는 유의적인 것으로 간주하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> MicroRNA for distinguishing testes-derived male germ-line stem cells and method thereof <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-296-3p <400> 1 gaggguuggg uggaggcucu cc 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-296-5p <400> 2 agggcccccc cucaauccug u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-483 <400> 3 ucacuccucc ccucccgucu u 21 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-127 <400> 4 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-127-5p <400> 5 cugaagcuca gagggcucug au 22

Claims (8)

  1. 생식선 줄기세포에서 과발현되는 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고 여기서 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA는 배아 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 과발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 및 miR-483 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  3. 생식선 줄기세포에서 과발현되는 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고 여기서 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA는 다능성 성체 생식선 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 과발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 및 miR-483 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  5. 생식선 줄기세포에서 저발현되는 임프린트된 miR-127 또는 miR-127-5p 마이크로RNA를 유효성분으로 포함하고
    여기서 상기 임프린트된 miR-127 또는 miR-127-5p 마이크로RNA는 배아 줄기세포에 비하여 상대적으로 생식선 줄기세포에서 저발현되는 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 miR-127 및 miR-127-5p 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 4 및 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 수컷 생식선 줄기세포 식별용 마커 조성물.
  7. 배양된 세포에서 임프린트된 miR-296-3p, miR-296-5p 또는 miR-483 마이크로RNA의 발현을 정량화하여, 상기 마이크로RNA가 배아 줄기 세포 또는 다능성 성체 생식선 줄기세포에 비하여 상대적으로 과발현되면 생식선 줄기세포로 판정하는 단계를 포함하는 수컷 생식선 줄기세포를 식별하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 miR-296-3p, miR-296-5p 및 miR-483 마이크로RNA의 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 수컷 생식선 줄기세포 식별 방법.
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