CN105688227A - miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。本发明提供了如下1)至3)中任一物质在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途：1)miR-127；2)含有miR-127的编码基因的重组载体；3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。其可用于制备治疗肌肉疾病的药物，有效治疗肌肉疾病。

Description

miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及肌肉疾病的治疗领域，具体涉及miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。

背景技术

骨生物体的生命活动中离不开骨骼肌的运动和支持功能。不仅如此，我们身体所摄取的糖和脂类等物质均在骨骼肌中代谢产生能量，这对维持整个身体的稳定状态起着非常重要的作用。许多的疾病如肿瘤、HIV感染、慢性心衰等患者在晚期多伴随有骨骼肌减少的症状。

骨骼肌组织的一个显著特征是损伤后能够再生修复，这个过程是高度协调统一的，骨骼肌干细胞(卫星细胞)在该过程中发挥了重要功能。骨骼肌干细胞位于肌纤维膜和基底膜之间[1]，是骨骼肌干细胞最主要的类型。骨骼肌干细胞的数目在不同物种及不同发育阶段是不同的：在新生小鼠中骨骼肌干细胞数目约为肌细胞的30％；成年后骨骼肌干细胞的比例减少到约4％；年老小鼠骨骼肌干细胞的比例下降到2％左右。正常生理状态下骨骼肌干细胞处于静息状态，一旦受到外界刺激如损伤或运动，处于静息状态的骨骼肌干细胞被激活。激活的骨骼肌干细胞经过增殖、分化及融合形成新的骨骼肌纤维并执行正常的生理功能。然而很多肌病的发生是因为骨骼肌干细胞自我更新受阻导致骨骼肌干细胞库的耗竭或者骨骼肌干细胞的激活、增殖功能受到抑制。

microRNA(也写作miRNA或miR)作为一类具有调控活性的非编码小分子RNA(通常18-25nt)，广泛参与各种组织器官的发育与疾病发生。miRNA参与骨骼肌发育的直接证据来自于在骨骼肌组织条件性敲除Dicer基因后小鼠的骨骼肌发育发生异常，例如骨骼肌纤维数目减少等。Dicer基因编码的蛋白是miRNA成熟加工过程中所必需的核酸内切酶，这表明miRNA在骨骼肌发育过程中发挥重要作用。目前已经报道有许多miRNA参与骨骼肌损伤再生的过程[2-5]。第一个报道在损伤修复过程中发生表达改变的是miR-181，在损伤再生的最后阶段miR-181表达量显著上调[6]。miR-351在蛇毒心脏毒素(Cardiotoxin，CTX)诱导的骨骼肌损伤再生的早期表达量瞬时增加，miR-351通过抑制细胞周期抑制因子E2F3促进骨骼肌干细胞的增殖[7]。miR-206在CTX损伤后，表达量显著上调，这提示miR-206在骨骼肌损伤再生中发挥功能,这与miR-206基因敲除小鼠中骨骼肌损伤再生功能严重受损相一致[8]。miR-206的表达量上调可以抑制许多基因的表达，其中包括Pax7、Notch3、IGFBP5[8]和HMGB3[9]，而所有这些基因都抑制分化过程。此外，在损伤过程中miR-1的表达量上调也有助于抑制Pax7的表达[10]。同样地在CTX损伤后，miR-26a表达量上调。当在胫骨前肌中敲低miR-26a后，骨骼肌损伤再生的进程减慢[11]。在相同的模型中，miR-125b在CTX损伤后表达量上调，miR-125b下游的靶基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)表达增加[12]。IGF-2可以调控成肌分化过程并抑制后损伤再生进程[12]。此外，再生期间，miR-133表达量的增加以防止骨骼肌干细胞变成棕色脂肪细胞[13]。

肌肉疾病(musculardisorders)通常是指骨骼肌疾病。肌营养不良是一组原发于肌肉组织的遗传病。临床上表现为进行性加重的骨骼肌萎缩与无力、腱反射消失、肌肉假性肥大。根据患者肌肉萎缩累及部位可分为多种类型：Duchenne/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)、面肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头肌型肌营养不良、远端型肌营养不良、进行性眼外肌麻痹型肌营养不良、眼肌-咽肌型肌营养不良。DMD型肌营养不良是最常见的一类进行性肌营养不良症。患病率为3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传。主要是男孩发病，女性为致病基因的携带者。通常5岁左右发病。肌萎缩是进行性的肌肉疾病，预后差，一般在20-30岁时伴随心肌功能衰竭或呼吸困难等致死。目前针对该病，医学界尚无有效疗法。

Mdx小鼠是肌营养不良蛋白(dystrophin)缺陷鼠，是研究骨骼肌干细胞激活、增殖、分化调控机制及骨骼肌损伤-再生机理的常用模型。目前改善mdx小鼠肌营养不良表型的治疗方案有多种，但都存在缺陷。如移植自体骨骼肌干细胞到mdx小鼠中，但自体移植的骨骼肌干细胞仍然不能表达肌营养不良蛋白。如果使用异体移植的骨骼肌干细胞来补偿mdx小鼠缺失的dystrophin蛋白，就会存在如下的问题：1)宿主的免疫排斥反应；2)移植后的骨骼肌干细胞后存活率、自我更新能力及迁移能力降低。

因此，研究治疗肌肉疾病的分子基础及治疗方法是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。

基于上述目的本发明提供了如下1)至3)中任一物质在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途：

1)miR-127；

2)含有miR-127的编码基因的重组载体；

3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。

优选地，所述miR-127的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

可选地，所述肌肉疾病是肌肉损伤，优选是急性肌肉损伤。

可选地，所述肌肉疾病是肌营养不良，任选是Duchenne/Becker型肌营养不良、面肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头肌型肌营养不良、远端型肌营养不良、进行性眼外肌麻痹型肌营养不良或眼肌-咽肌型肌营养不良。

可选地，所述药物通过促进成肌细胞的分化治疗所述肌肉疾病，所述促进成肌细胞的分化优选是提高成肌素和/或肌球蛋白重链的表达。

可选地，所述药物通过促进骨骼肌损伤再生治疗所述肌肉疾病，所述促进骨骼肌损伤再生优选是促进骨骼肌干细胞的增殖和分化。

可选地，所述药物通过改善病理和生理表型治疗所述肌肉疾病，所述改善病理和生理表型优选是降低血清肌酸激酶水平、和/或改善肌肉疲劳、和/或提高肌纤维张力及爆发力。

基于相同的发明构思，本发明还提供了如下1)至3)中任一物质在促进骨骼肌干细胞分化的药物中的用途：

1)miR-127；

2)含有miR-127的编码基因的重组载体；

3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。

本发明还提供了一种重组细胞，其是将miR-127、含有miR-127的编码基因的重组载体或含有miR-127的编码基因的重组病毒导入至出发细胞中得到的重组细胞。

可选地，将所述的重组细胞用于制备治疗肌肉疾病的药物，或用于制备促进骨骼肌干细胞分化的药物。

附图说明

图1：miR-127在成年小鼠的不同组织中的表达丰度；

图2：miR-127在C2C12细胞分化过程中的表达变化；

图3：miR-127在骨骼肌干细胞分化过程中的表达变化；

图4：C2C12细胞分化24h后未转染miR-127的对照组(NC)与稳定转染miR-127的实验组(OE)MyoG的细胞免疫荧光染色结果；

图5：相对于对照组，实验组MyoG阳性细胞数目；

图6：C2C12细胞分化24h后对照组与稳定转染miR-127实验组MyoG在转录水平的表达量；

图7：C2C12细胞分化24h后对照组与稳定转染miR-127实验组MyoG在蛋白水平的表达量；

图8：C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组表达MHC的细胞免疫荧光染色结果；

图9：相对于对照组，实验组MHC阳性细胞数目；

图10：C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组MHC在转录水平的表达量；

图11：C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组MHC在蛋白水平的表达量；

图12：CTX诱导8-10周小鼠肌肉损伤再生7.5天后胫骨前肌横切面染色结果；

图13：肌肉损伤后7.5天胫骨前肌横切面上核在中央的肌纤维(中央核纤维)数目比例统计；

图14：肌肉损伤后7.5天胚胎型MHC(myh3)的相对表达量；

图15：在CTX损伤3.5天后MyoD、Pax7的双免疫荧光染色结果，DAPI染色定位细胞核，图片显示为代表性视野；

图16：相对于野生型小鼠(WT)，转基因小鼠(TG)中MyoD/Pax7双阳性细胞相对数目；

图17：从miR-127转基因小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)中分离骨骼肌干细胞后培养分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果；

图18：从miR-127转基因小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)中分离骨骼肌干细胞后培养分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果；

图19：相对于野生型小鼠(WT)，从miR-127转基因小鼠(TG)中分离的骨骼肌干细胞分化36h后MHC阳性细胞的相对数目；

图20：野生型小鼠(WT)、miR-127转基因小鼠(TG)、mdx；miR-127(mdx；TG)小鼠和mdx小鼠血清中肌酸激酶(CK)水平检测结果；

图21：mdx；miR-127和mdx胫骨前肌伊文思蓝(EBD)浸润面积及层粘连蛋白(Laminin)的免疫荧光染色；

图22：mdx；miR-127和mdx胫骨前肌胫骨前肌中伊文思蓝浸染的面积统计结果；

图23：mdx；miR-127和mdx小鼠跑步时间记录结果；

图24：mdx；miR-127和mdx肌肉抽搐张力检测结果；

图25：mdx；miR-127和mdx肌肉强直张力检测结果。

具体实施方式

在以下实施例中，采用的肌肉损伤模型是以CTX肌肉注射胫骨前肌造成的急性肌肉损伤模型。此模型较好地提供了肌肉损伤后骨骼肌干细胞发挥功能的进程。

在以下实施例中，采用的肌营养不良模型是mdx小鼠模型，该小鼠模型以温和进行性的方式模拟了人类肌肉疾病的发生，被广泛用做DMD肌营养不良疾病模型。

C2C12细胞为小鼠成肌细胞系。

实施例1：miR-127在骨骼肌组织中高度富集并随着C2C12细胞及骨骼肌干细胞的分化过程表达量增加。

1.采用Northern印迹检测了miR-127在8周龄小鼠各个组织器官中的表达丰度。选用8周龄的小鼠，分别收取肺、肝、心脏、脾、骨骼肌、肾、胰腺、小肠、脑、及胃组织。首先分别提取RNA，然后进行NorthernBlot杂交。具体步骤如下：

(1)RNA提取

取新鲜或冰冻组织材料50-100mg，在研钵中加液氮研磨成粉末，将粉末用少量液氮转移到15mL离心管中，加入5mLTrizol匀浆，室温静置5min；加1mL氯仿(每毫升Trizol加0.2mL氯仿)震荡混匀，室温静置10min；12000g，4℃离心15min。将上清液转移到新的离心管加入2.5mL异丙醇(每毫升Trizol加0.5ml异丙醇)混匀，室温静置10min；12000g，4℃离心10min；用5mL的75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥；视沉淀多少将其溶于适量DEPC水中，置于冰上。

(2)RNA的甲醛变性凝胶电泳

①制备1.2％的甲醛变性胶：称取1.2g琼脂糖，加87mLDEPCH₂O，加热融化；待冷却到60℃时，加入10mL的10×MOPS缓冲液和37％的甲醛3mL，混匀；加荧光染料EB至终浓度0.5μg/mL，倒入准备好的琼脂糖凝胶槽中。

②RNA样品的准备(10-15μg)：将2.5μL的10×MOPS缓冲液、4.4μL37％甲醛、12.5μL的甲酰胺混合；加入10-15μg的RNA，补加DEPCH₂O到25μL；在55℃水浴加热15min；加5μL甲酰胺的上样缓冲液，点样。

③甲醛变性凝胶电泳：稀释10×MOPS缓冲液至1×MOPS，倒入清洁的电泳槽中；将制备好的凝胶置于1×MOPS缓冲液的电泳槽中，预电泳以检测设备完好，点样；在2v/cm电压降下电泳，至溴酚兰迁移到凝胶边缘停止；照相后转膜。

(3)转膜

电泳结束后，将凝胶在去离子水中浸泡30min；将凝胶置于10×SSC(或20×SSC)浸泡30min；将尼龙膜用水浸湿后，放入10×SSC(或20×SSC)中浸泡10min；将凝胶槽扣在托盘中作为支架，放长条3MM滤纸桥，在支架上铺上两层与胶相同大小的3MM滤纸，把处理好的凝胶倒扣在支架上，放上尼龙膜，再放两层3MM滤纸，放上一叠7-8cm厚的吸水纸；托盘中倒入10×SSC(或20×SSC)，覆以保鲜膜，在吸水纸上面压上500g重物，过夜(>6h)。转膜结束后，在暗室的紫外灯下观察核酸转移情况。对照凝胶用铅笔在尼龙膜上标记点样孔及分子量Marker或28SrRNA、18SrRNA的位置。最后用两层3MM滤纸夹好尼龙膜，紫外交联固定膜上的核酸，也可置80℃烘箱热固定2h。固定好的膜可置于干燥处直至杂交。

(4)探针标记、纯化与变性

①探针标记：用目的片段的PCR纯化产物或质粒酶切回收纯化产物作模板标记探针，目前常用随机引物标记法，标记反应按说明书进行(Promega)。

②探针纯化：纯化探针的目的是为了去除没有掺入的游离α-³²p-dCTP，可通过SephadexG-50分子筛层析将没有掺入的游离α-³²p-dCTP与标记的核酸片段分离，收集洗脱液即含有标记好的核酸片段而游离的α-³²p-dCTP会滞留在层析介质中。目前有商品化的SephadexG-50分子筛层析柱，上样后离心即可收集到标记的核酸片段。

③探针变性：纯化好的探针经100℃煮沸5min变性，迅速置于冰上2min，离心少许。储存于-20℃备用。

(5)预杂交与杂交

①预杂交：将尼龙膜放入杂交管，加适量杂交液，68℃(不加甲酰胺的杂交液)或42℃(加50％甲酰胺的杂交液)预杂交半小时以上。

②杂交：向杂交管中加入变性的探针，加入探针的量一般在每毫升杂交液2×10⁵-1×10⁶cpm。68℃(不加甲酰胺的杂交液)或42℃(加50％甲酰胺的杂交液)杂交8小时以上。

(6)洗膜

杂交结束后洗膜，除去没有杂交的游离探针，即可压片自显影。

(7)压片自显影

用保鲜膜将尼龙膜包好，固定在X-光暗盒中，覆以X-光片，将暗盒置于-70℃冰箱放射自显影，一般自显影时间为3-5天，有时信号较弱可自显影一周以上。

(8)冲片

自显影结束后，在暗室中用显影液和定影液冲片，有杂交信号的泳道会在X-光片相应位置出现一条黑色的带。

结果如图1所示，上排分别为miR-127在肺、肝、心脏、脾、骨骼肌、肾、胰腺、小肠、脑、及胃组织中的表达丰度，下排为与之对应的tRNA凝胶电泳图。结果表明miR-127在骨骼肌组织中高度富集。

2.Real-timePCR检测miR-127在C2C12细胞及骨骼肌干细胞分化过程中的表达。

提取增殖期(GM)和分化期(DM)不同时间(分化1、3、5天)细胞的总RNA，按以下步骤操作：

(1)逆转录：在0.2mL的PCR反应管中加入下列试剂：

16℃反应30min打开发卡结构，42℃反应30min，85℃灭活酶5min；

(2)Real-timePCR：在96孔板中加入下列试剂：

图2为miR-127在C2C12细胞分化过程中的表达变化，图3为miR-127在骨骼肌干细胞分化过程中的表达变化。如图2至图3所示，在本实施例中，miR-127的表达随C2C12细胞和骨骼肌干细胞的增殖(GM)和分化(DM)1天、3天、5天逐渐增加，表明miR-127的表达随C2C12细胞以及骨骼骨骼肌干细胞的分化增加。

实施例2：miR-127促进C2C12细胞分化。

实施例1中miR-127的表达谱提示它可能在肌细胞分化中发挥重要功能。故首先构建了miR-127高表达的(12倍左右)的稳定转染细胞系，并利用该细胞系进行功能的检测。

以2×10⁴/cm²的密度种植稳定表达miR-127的C2C12细胞，培养24h后换分化培养基，培养24h和36h后分别检测分化早期标记分子成肌素(Myogenin,MyoG)及晚期分化标记分子肌球蛋白重链(MHC)的表达。通过细胞免疫荧光染色发现，分化24h后，过表达miR-127显著增加了MyoG阳性细胞的数量，同时MyoG的表达量在转录水平及蛋白水平显著增加；分化36h后，过表达miR-127显著增加了MHC阳性细胞的数量，同时MHC的表达量在转录水平及蛋白质水平显著增加。上述结果表明过表达miR-127促进C2C12细胞分化。具体步骤如下：

(1)稳转细胞系的构建

第一天：试验前将miR-127过表达的慢病毒(过表达miR-127，SEQIDNo.1，Genbank：AJ459738.1)以及带GFP标签的对照组慢病毒置于冰上解冻(病毒由汉恒生物提供)；在35mm²的培养皿中加入1mL培养基，准备2个1.5mL的离心管；消化细胞计数，取1mL2×10⁵个细胞于1.5mL的离心管；加20L病毒于离心管中，用枪头轻轻混匀；加3.2μL聚凝胺用枪头轻轻混匀；将混合好的细胞滴加到在35mm²的培养皿中，放入培养箱培养。

第二天：将细胞转移到60mm²的培养皿中。

第三天：将细胞转移到10cm²的培养皿中，加入终浓度为1.5μg/mL嘌呤霉素；两天后转染慢病毒-GPF对照组的细胞几乎全部死掉，试验组的细胞保持良好的生长状态，表明稳转细胞系构建成功。检测表达效率，传代保种。

(2)免疫荧光检测

①试剂配置

固定液：PBS稀释37％的甲醛溶液至终浓度2％-4％；

透膜液：0.5％TritonX-100/PBS；

封闭液：1-3％BSA/PBS；

封片剂：以预先配制的2％DABCO/PBS制备90％的甘油溶液。

②步骤：将转染或进行相应处理的细胞以PBS清洗3次，沥干水分；固定液室温固定10min，PBS漂洗3次；室温下，用0.5％Triton-X100/PBS透化处理3×10min；以1-3％BSA/PBS封闭细胞，37℃30min；在Parafilm膜上加入40μL以PBS-T按一定比例稀释(通常1:50)的一抗，密封于湿盒中，37℃1h。室温下，0.5％Triton-X100/PBS漂洗3×10min。在Parafilm膜上加入40μL以PBS-T按一定比例稀释(通常1:80)的二抗，密封于湿盒中37℃，1h。室温下，0.5％Triton-X100/PBS漂洗3×10min。第二次漂洗时加入1:10000DAPI(DAPI/0.5％Triton)；去离子水漂洗去盐。取10μL封片剂滴在载玻片上。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。

结果：图4至图11结果显示miR-127可以促进C2C12细胞的分化。具体结果如下，

如图4所示：C2C12细胞分化24h后未转染miR-127的对照组(NC)与稳定转染miR-127实验组(OE)MyoG的细胞免疫荧光染色结果。可见，OE组MyoG阳性细胞明显多于NC组。

如图5所示：稳定转染miR-127实验组中，MyoG阳性细胞数目显著高于对照组。

如图6所示：C2C12细胞分化24h后，以GAPDH为内参基因，稳定转染miR-127实验组的MyoG在转录水平的表达量明显高于对照组。

如图7所示：C2C12细胞分化24h后，以β-actin为内参蛋白，稳定转染miR-127实验组MyoG在蛋白水平表达量明显高于对照组。

如图8所示：C2C12细胞分化36h后，对照组与稳定转染miR-127实验组表达MHC的细胞免疫荧光染色结果。可见稳定转染miR-127实验组，MHC阳性细胞明显多于对照组。

如图9所示：稳定转染miR-127实验组中，MHC阳性细胞数目显著高于对照组。

如图10所示：C2C12细胞分化36h后，以GAPDH为内参基因，实验组MHC在转录水平的表达量明显高于对照组。

如图11所示：C2C12细胞分化36h后，以β-actin为内参蛋白，实验组MHC在蛋白水平的表达量明显高于对照组。

实施例3：miR-127促进骨骼肌损伤再生的进程。

(1)骨骼肌组织损伤再生模型的建立

miR-127转基因小鼠由南京模式动物所构建。为确定miR-127在骨骼损伤再生中的功能，首先构建了miR-127小鼠CTX损伤再生模型；小鼠右腿胫骨前肌注射50μL×10μMCTX，左腿注射相同量的PBS做对照。

骨骼肌损伤后首先是炎症反应，大量的炎症因子被释放，处于静息状态的骨骼肌干细胞被激活，激活的骨骼肌干细胞大量增殖然后进入分化程序与损伤的肌纤维融合。该模型利用MyoD阳性细胞数目来评估激活的骨骼肌干细胞数目；骨骼肌组织损伤3天后骨骼肌干细胞大量增殖，可以通过检测MyoD/Pax7双阳性的骨骼肌干细胞的数目来评估骨骼肌干细胞增殖的进程；损伤7.5天后形成大量核在中央的新形成的肌纤维(中央核纤维)，通过比较核在中央的新形成的肌纤维横的截面积大小及胚胎期MHC(eMHC)的动态变化来评估分化的进程。因此，可在损伤后1、3、5、7天分别收取骨骼肌组织，通过HE染色观察肌肉再生的进程和形态。

(2)冰冻切片制备

将取下的新鲜胫骨前肌肌肉组织放入盛有包埋剂(樱花，4583)的模具中，将模具浸入液氮使其凝固，用全自动切片机(LeicaCM3050)将包埋块切片至10微米厚并贴至载玻片上，放入-70℃冰箱中保存。

(3)Pax7免疫荧光染色

将冰冻切片从-70℃冰箱中拿出室温平衡1h；于4％多聚甲醛中固定20min；PBS中清洗3次，每次5min；在-20℃甲醇中渗透6min；PBS中清洗3次，每次5min；配置0.01M柠檬酸钠缓冲液，预热至90℃；将切片浸入其中，80℃孵育5min；重复该步骤一次后，室温冷却切片，PBS清洗3次，每次5min；在4％BSA中室温封闭2-3h；PBS中清洗2min；稀释FAB(Jackson)1:100至PBS中，在FAB中室温封闭30min；PBS中清洗2min；与Pax7抗体(DSHB，1:20溶于4％BSA中)于4℃孵育过夜；PBS中清洗2min；在0.1％BSA中洗3次，每次10min；于GaM-Biotin(Jackson,1:1000溶于4％BSA中)室温孵育45min；PBS中清洗2min；在0.1％BSA中洗3次，每次10min；于Cy3-Strep(Jackson，1:1000溶于4％BSA中)室温孵育30min；PBS中清洗3次，每次10min；DAPI染核，PBS中清洗10min；封片照相。

(4)MyoD免疫荧光染色

将冰冻切片从-70℃冰箱中拿出放置室温晾干；于4％多聚甲醛中固定20min；PBS中清洗3次，每次5min；在-20℃甲醇中渗透6min；PBS中清洗3次，每次5min；5％BSA室温封闭2h；与MyoD抗体(SantaCruz，1:50溶于5％BSA中)于4℃孵育过夜；PBS中清洗3次，每次10min；二抗，室温孵育1h；PBS中清洗3次，每次10min；DAPI染核，PBS中清洗10min；封片照相。

结果：miR-127促进骨骼肌损伤再生的进程，具体结果如下，

如图12所示：CTX诱导8-10周野生型(WT)和miR-127转基因小鼠(TG)胫骨前肌(TA肌)损伤再生7.5天后Laminin免疫荧光染色结果。

如图13所示：TA损伤7.5天后，胫骨前肌横切面上新生肌纤维(具有中央核的肌纤维，即中央核纤维)面积比例统计。结果显示，miR-127转基因小鼠(TG)的新生肌纤维面积显著大于野生型小鼠(WT)。

如图14所示：TA损伤5.5天后，miR-127转基因小鼠(TG)的胚胎型MHC(myh3)的相对表达量显著高于野生型小鼠(WT)。该结果表明，miR-127促进骨骼肌的损伤修复进程。

如图15所示：miR-127转基因小鼠(TG)及野生型小鼠(WT)在CTX损伤3.5天后MyoD、Pax7的双免疫荧光染色结果，DAPI染色定位细胞核。

如图16所示：基于图15的染色结果，转基因小鼠(TG)中MyoD/Pax7双阳性细胞相对数目显著高于野生型小鼠(WT)。

结论：图12至14显示miR-127转基因小鼠的新生肌纤维面积显著大于野生型小鼠，miR-127转基因小鼠的胚胎型MHC(myh3)的相对表达量显著高于野生型小鼠，这说明miR-127具有促进骨骼肌损伤再生修复的功能；图15-16显示转基因小鼠中MyoD/Pax7双阳性细胞相对数目显著高于野生型小鼠，这说明miR-127具有促进骨骼肌干细胞增殖的功能。

实施例4：miR-127促进骨骼肌卫星分化。

为了确认miR-127促进骨骼肌干细胞的分化的功能，分离miR-127转基因小鼠及野生型小鼠的骨骼肌干细胞，以相同的密度种植在12孔板中，在分化36h后，通过染色分化标记基因MCH阳性细胞及检测MHCmRNA的表达量同时还分离了单根肌纤维的离体培养，用Pax7、MyoD分别染色不同类型的骨骼肌干细胞。

结果：

如图17所示：从miR-127转基因小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)中分离骨骼肌干细胞后培养分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果。

如图18所示：基于图17的染色结果，由miR-127转基因小鼠(TG)中分离得到的骨骼肌干细胞分化36h后MHC阳性细胞的相对数目显著高于野生型小鼠(WT)。

如图19所示：由miR-127转基因小鼠(TG)中分离的得到骨骼肌干细胞分化36h后MHC的转录水平表达显著高于野生型小鼠(WT)。

结论：图17-19所示，由miR-127转基因小鼠中分离得到的骨骼肌干细胞分化36h后MHC阳性细胞的相对数目显著高于野生型小鼠；由miR-127转基因小鼠中分离得到的骨骼肌干细胞分化36h后骨骼肌分化标志基因MHC的转录水平表达显著高于野生型小鼠。这说明，miR-127可以促进骨骼肌干细胞的分化。

实施例5：miR-127可以显著改善mdx小鼠的病理生理表型。

miR-127可以通过促进骨骼肌干细胞的分化加速骨骼肌损伤再生过程，为进一步证实miR-127是否可以在一定程度上缓解mdx疾病模型小鼠的病理表型，首先将mdx小鼠与miR-127转基因小鼠进行交配，得到的雄性mdx；miR-127(即mdx；TG)与mdx小鼠用于实验，B6小鼠正常对照小鼠。通过检测肌细胞中肌酸激酶外泄到血清中的浓度及伊文思蓝透过破损的肌纤维膜渗入骨骼肌细胞中的情况来判断mdx小鼠肌肉组织的损伤程度。同时，通过小鼠的跑步测试及离体的骨骼肌纤维拉力的测试来评估mdx小鼠骨骼肌功能。

(1)血清中CK水平的检测

小鼠跑步后2-4h眼球采血。将血样4℃静置1-2h，12,000rpm离心10min将血清转移到新的EP管中，取上清检测CK值。

配置反应液：每孔加10μL底物，100μL的反应缓冲液及1μL的酶；

在酶标版中加110μL：100μLH₂O和10μL标准品(Calibrator)及100μL反应液和10μL血37℃孵育20min利用酶标仪读取340nm的吸光值，然后继续孵育20min读取340nm的吸光值，然后利用一下的公式计算CK值。

$CK(U/L)=\frac{{\mathrm{OD}}_{40min}-{\mathrm{OD}}_{20min}}{{\mathrm{OD}}_{CALIBRATOR}-{\mathrm{OD}}_{H_{2}O}}\×150$

(2)小鼠跑步实验

mdx；miR-127，mdx和B6小鼠在完全相同的饲养条件下，跑步测试实验在平板跑步机上进行(Exer3/6ColumbusInstruments)。实验分为训练和正式测试，实验期间使用20度下坡倾斜角。在正式测试前训练两次，隔天进行。跑步条件设置如下：起始速度10米/min，3min后，以1米/min的速度加速到20米/min，然后以20米/min速度一直跑到小鼠疲劳为止，一般设置NOS(小鼠停在刺激器上的次数)为100。在训练之后，开始正式测试，总共测试4次，每次都是隔天进行。

(3)骨骼肌离体拉力试验

配置电解液调节到PH＝7.0，加入四腔室水浴槽中，一般组织温度在37℃。Mdx骨骼肌调节温度为25℃，其中通过95％氧气-5％二氧化碳，30min以上。

分离完整的趾长伸肌(EDL)，骨骼肌组织分离的完整与否对实验最后的结果影响很大。将完整分离的EDL固定在两个电极之间(这个步骤在电解液中操作，动作尽量要快)，先在电解液中平衡10min。

抽搐张力检测的条件：使用10V电压，持续时间为0.3ms的方波。重复3次，每次隔10秒一次。

强直张力检测的条件：使用10V电压，持续时间为200ms的一串波，其中每个为持续时间为0.3ms的方波。重复3次，每次间隔3min。

结果：

图20：野生型小鼠(WT)、miR-127转基因小鼠(TG)、mdx；miR-127小鼠和mdx小鼠血清中肌酸激酶(CK)水平检测结果。结果显示，跑步后4h，WT和TG小鼠血清CK值无显著性差异；mdx；miR-127小鼠血清CK显著性低于mdx小鼠。这说明miR-127缓解了mdx小鼠的肌膜破损程度。

图21：mdx；miR-127和mdx腓肠肌(Gas)伊文思蓝(EBD)浸润面积及Laminin免疫荧光染色。作为代表，仅显示了腓肠肌中伊文思蓝浸染损伤肌肉的染色结果图片。

图22：基于图21染色结果，统计mdx；miR-127和mdx腓肠肌(Gas)中伊文思蓝浸染的面积。结果显示，mdx；miR-127小鼠肌群伊文思蓝浸染面积明显减少。同样说明miR-127缓解了mdx小鼠的肌膜破损程度。

图23：记录WT、TG、mdx；miR-127和mdx小鼠达到疲劳程度时的跑步时间。结果显示，WT和TG小鼠跑步时长没有显著差异；mdx；miR-127小鼠组跑步时间显著长于mdx小鼠组。

图24：为mdx；miR-127和mdx肌肉爆发力检测结果。结果显示，WT和TG小鼠肌肉爆发力没有显著差异；mdx；miR-127小鼠肌肉爆发力显著大于mdx小鼠组。

图25：为mdx；miR-127和mdx肌肉耐力检测结果。结果显示，WT和TG小鼠肌肉耐力没有显著差异；mdx；miR-127小鼠肌肉耐力显著大于mdx小鼠组。

综合上述，在人类DMD疾病模型mdx小鼠中过表达miR-127可以显著地改善mdx小鼠的病理表型和生理功能。

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Claims (10)

1.如下1)至3)中任一物质在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途：

1)miR-127；

2)含有miR-127的编码基因的重组载体；

3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-127的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉疾病是肌肉损伤，优选是急性肌肉损伤。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉疾病是肌营养不良，任选是Duchenne/Becker型肌营养不良、面肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头肌型肌营养不良、远端型肌营养不良、进行性眼外肌麻痹型肌营养不良或眼肌-咽肌型肌营养不良。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物通过促进成肌细胞的分化治疗所述肌肉疾病，所述促进成肌细胞的分化优选是提高成肌素和/或肌球蛋白重链的表达。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物通过促进骨骼肌损伤再生治疗所述肌肉疾病，所述促进骨骼肌损伤再生优选是促进骨骼肌干细胞的增殖和分化。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物通过改善病理和生理表型治疗所述肌肉疾病，所述改善病理和生理表型优选是降低血清肌酸激酶水平、和/或改善肌肉疲劳、和/或提高肌纤维张力及爆发力。

8.如下1)至3)中任一物质在促进骨骼肌干细胞分化的药物中的用途：

1)miR-127；

2)含有miR-127的编码基因的重组载体；

3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。

9.一种重组细胞，其是将miR-127、含有miR-127的编码基因的重组载体或含有miR-127的编码基因的重组病毒导入至出发细胞中得到的重组细胞。

10.如权利要求9所述的重组细胞在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途，或制备促进骨骼肌干细胞分化的药物中的用途。