CN105055404B - Hmgcs2抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HMGCS2抑制剂在制备治疗成瘾药物成瘾的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗可卡因成瘾的药物，它是以HMGCS2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。本发明HMGCS2抑制剂可以有效减弱可卡因奖赏行为，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

Description

HMGCS2抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途

技术领域

本发明涉及HMGCS2抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

背景技术

可卡因(Cocaine)又称古柯碱,化学名为苯甲酰甲基芽子碱(methylbenzoylecgonine)，一般呈白色晶体状,无臭,味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治疗哮喘，是最强的天然中枢兴奋剂，因其对中枢神经系统的兴奋作用而导致滥用，1985年起成为世界性主要毒品之一。

可卡因成瘾，是一种慢性复发性脑部疾病，属于药物依赖(drug dependence)类疾病，可卡因成瘾会引起大脑结构和功能的可塑性变化，相关脑区包括伏隔核、纹状体、前额皮质、海马和腹侧被盖区，健康也受到多方面的危害，包括精神颓废、人格缺损、心智功能紊乱、并发相应的感染合并症以及吸毒者不顾一切地寻求和使用毒品而诱发各种违法犯罪活动。

可卡因成瘾的主要特点表现为即使患者在知晓用药的严重后果后，依然强迫性索取和使用以满足欲望、对药物的寻觅和索取失去控制、对事物失去兴趣、成瘾记忆十分深刻，即使经过戒断治疗若干年后，接触与成瘾有关的刺激(如毒友、与过去用药有关的环境等)都可能诱发复吸。

鉴于可卡因成瘾危害甚大，找到合适的治疗靶点和药物，治疗可卡因成瘾迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗可卡因成瘾的药物。

HMGCS2：3羟3甲戊二酰辅酶A合成酶2，又称为3羟基-3甲基戊二酰辅酶A合成酶线粒体亚型。

HMGCS2抑制剂：抑制3羟3甲戊二酰辅酶A合成酶2的活性或者表达的物质。

本发明首先提供了HMGCS2抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

优选地，所述治疗可卡因成瘾的降低HMGCS2酶活的药物。进一步优选地，

所述降低HMGCS2酶活的药物是化合物I，其结构式如下：

化学式为C₁₈H₂₈O₅，分子量为324.41。

本发明还提供了一种治疗可卡因成瘾的药物，它是以HMGCS2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述HMGCS2抑制剂为降低HMGCS2酶活的药物。进一步优选地，

所述降低HMGCS2酶活的药物是化合物I，其结构式如下：

化学式为C₁₈H₂₈O₅，分子量为324.41。

优选地，所述制剂是注射制剂。

HMGCS2抑制剂可以有效减弱可卡因奖赏行为，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1小鼠条件性位置偏好箱

图2条件性位置偏好实验设计示意图。GroupⅠ：生理盐水组；GroupⅡ：可卡因组。S：腹腔注射生理盐水；C：腹腔注射可卡因。

图3小鼠自发活动箱

图4可卡因处理诱导小鼠伏隔核HMGCS2的表达及活性。(A)可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的表达水平。(B)可卡因单次给药后30min(Single-30min)和24h(Single-24h)，连续给药7天(Repeated-7days)后伏隔核HMGCS2的表达水平。(C)可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的酶活性。Saline，SA：腹腔注射生理盐水组；Cocaine，CO：腹腔注射可卡因组。n＝6/组。*p<0.05，可卡因条件性位置偏好成瘾、单次给药后30min和24h、连续给药7天，各组与生理盐水组比较有统计学差异。

图5伏隔核注射HMGCS2小分子抑制剂对可卡因诱导的行为敏化的影响。(A)伏隔核注射Hymeglusin干扰可卡因自发活动行为敏化模型建立模式图。(B)伏隔核注射Hymeglusin对可卡因诱导的自发活动的影响，n＝15/组。(C)Hymeglusin预处理对可卡因行为敏化小鼠伏隔核HMGCS2的酶活性的影响，n＝6/组。Saline-Saline：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射生理盐水组；Hymeglusin-Saline：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射生理盐水组；Saline-Cocaine：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射可卡因组；Hymeglusin-Cocaine：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因组。*p<0.05，Hymeglusin-Saline组、Saline-Cocaine组、伏Hymeglusin-Cocaine组分别与Saline-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，Hymeglusin-Cocaine组与Saline-Cocaine组比较有统计学差异。

图6伏隔核注射HMGCS2小分子抑制剂对可卡因条件性位置偏好的影响。(A)伏隔核注射Hymeglusin干扰可卡因条件性位置偏好模型建立模式图。(B)伏隔核注射Hymeglusin对可卡因条件性位置偏好的影响，n＝15/组。(C)Hymeglusin预处理对可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的mRNA转录的影响，n＝15/组。(D)Hymeglusin预处理对可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的蛋白表达的影响，n＝15/组。Saline-Saline：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射生理盐水组；Hymeglusin-Saline：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射生理盐水组；Saline-Cocaine：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射可卡因组；Hymeglusin-Cocaine：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因组。*p<0.05，Hymeglusin-Saline组、Saline-Cocaine组、Hymeglusin-Cocaine组分别与Saline-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，Hymeglusin-Cocaine组与Saline-Cocaine组比较有统计学差异。

图7HMGCS2小分子抑制剂对可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核能量形式的影响。(A)Hymeglusin干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核ATP的含量变化。(B)Hymeglusin干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的含量变化。(C)Hymeglusin干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核柠檬酸合酶活性的变化。(D)Hymeglusin干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核NAD+/NADH比率的变化。Saline-Saline：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射生理盐水组；Hymeglusin-Saline：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射生理盐水组；Saline-Cocaine：伏隔核注射生理盐水-腹腔注射可卡因组；Hymeglusin-Cocaine：伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因组。n＝6/组。*p<0.05，Hymeglusin-Saline组、Saline-Cocaine组、Hymeglusin-Cocaine组分别与Saline-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，Hymeglusin-Cocaine组与Saline-Cocaine组比较有统计学差异。

图8沉默伏隔核Hmgcs2对可卡因行为敏化的影响。(A)慢病毒shHmgcs2在伏隔核注射示意图。(B)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒对可卡因诱导的自发活动的影响，n＝15/组。(C)可卡因行为敏化模型下，伏隔核注射shHmgcs2慢病毒对HMGCS2mRNA转录水平的影响，n＝6/组。(D)可卡因行为敏化模型下，伏隔核注射shHmgcs2慢病毒对HMGCS2蛋白表达水平的影响，n＝6/组。*p<0.05，shHmgcs2-Saline组、shControl-Cocaine组、shHmgcs2-Cocaine组分别与shControl-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，shHmgcs2-Cocaine组与shControl-Cocaine组比较有统计学差异。

图9沉默伏隔核Hmgcs2基因对可卡因条件性位置偏好的影响。(A)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒对可卡因诱导的条件性位置偏好的影响，n＝15/组。(B)可卡因行为敏化模型下，伏隔核注射shHmgcs2慢病毒对HMGCS2酶活性的影响，n＝6/组。*p<0.05，shHmgcs2-Saline组、shControl-Cocaine组、shHmgcs2-Cocaine组分别与shControl-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，shHmgcs2-Cocaine组与shControl-Cocaine组比较有统计学差异。

图10沉默伏隔核Hmgcs2基因对可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核能量形式的影响。(A)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核ATP的含量变化。(B)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的含量变化。(C)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核柠檬酸合酶活性的变化。(D)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒干扰可卡因条件性位置偏好模型下伏隔核NAD+/NADH比率的变化。n＝6/组。*p<0.05，shHmgcs2-Saline组、shControl-Cocaine组、shHmgcs2-Cocaine组分别与shControl-Saline组比较有统计学差异。#p<0.05，shHmgcs2-Cocaine组与shControl-Cocaine组比较有统计学差异。

图11泳道1:空白对照；泳道2:阳性对照；泳道3～泳道9:PLLU2G-shHmgcs2①～⑧号克隆；M:100bp DNA Ladder。

图12重组载体结构示意图。

图13 PLLU2G-shHmgcs2质粒转染293T细胞48h病变情况。

图14 PLLU2G-shcontrol质粒转染293T细胞48h病变情况。

具体实施方式

实验例1 HMGCS2抑制剂治疗可卡因成瘾

1前言

本研究中，采用药理与遗传手段，向小鼠伏隔核内定位注射关键酶的小分子抑制剂或沉默关键酶基因的慢病毒，结合¹H-NMR代谢组学分析确认HMGCS2抑制剂可以有效治疗可卡因成瘾。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验试剂

(1)盐酸可卡因，购自中国药品生物制品鉴定所。

(2)生理盐水，购自四川科伦药业股份有限公司。

(3)Hymeglusin((1233A；F244；L-659-699))，购自美国Sigma-Aldrich公司，其结构式化学式为C₁₈H₂₈O₅，分子量为324.41。

(4)HMG-CoA合成酶活性试剂盒，购自美国Genmed Scientifics公司。

(5)葡萄糖激酶活性试剂盒，购自澳大利亚Protein One公司。

(6)RIPA裂解液，购自上海碧云天生物技术有限公司。

(7)BCA法蛋白浓度测定试剂盒，购自美国Pierce公司。

(8)5×SDS-PAGE电泳缓冲液，购自上海碧云天生物技术有限公司。

(9)SDS-PAGE试剂(30％聚丙烯酰胺，Tris-base，SDS，过硫酸铵，TEMED，甘氨酸)，0.22μM孔径PVDF膜，购自美国Bio-Rad公司。

(10)预染蛋白质marker，购自美国Thermo Scientfic(Fermentas)公司。

(11)化学发光显影试剂盒，购自美国Pierce。

(12)Kodak柯达胶片，购自美国柯达公司。

(13)抗体：兔抗小鼠HMGCS2单克隆抗体(ab137043)，兔抗小鼠GCK多克隆抗体(ab37796)，购自Abcam公司；兔抗小鼠β-actin抗体(4697)，购自Cell SignalingTechnology公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(AS014)，购自Abclonal公司。

(14)沉默Hmgcs2慢病毒和对照慢病毒，由广州赛业生物科技有限公司构建。

(15)液氮，购自成都侨源气体有限公司。

(16)氮气，购自成都侨源气体有限公司。

(17)色谱级甲醇，购自美国Fisher scientific公司。

(18)色谱级氯仿，购自西班牙Scharlau公司。

(19)氘代重水，购自美国CIL(Cambridge Isotope Laboratories)公司。

(20)TSP，购自美国Sigma-Aldrich公司。

(21)Trizol，购自美国Invitrogen life technologies公司。

(22)无水乙醇，购自上海化学试剂有限公司。

(23)无DNA酶/RNA酶去离子水，购自北京天根生化科技有限公司。

(24)Gold View染料，购自上海赛百胜基因技术有限公司。

(25)琼脂糖，购自美国Amerosco公司。

(26)PrimeScript RT reagent kit(逆转录试剂盒)，购自美国Bio-Rad公司。

(27)SYBR Green Supermix kit，购自美国Bio-Rad公司。

(28)乙酰辅酶A检测试剂盒，购自美国Sigma-Aldrich公司。

(29)ATP检测试剂盒、NAD⁺/NADH检测试剂盒和柠檬酸合酶活性检测试剂盒，购自美国Abcam公司。

mAcat2-F	CCCGTGGTCATCGTCTCAG
		mAcat2-R	GGACAGGGCACCATTGAAGG
mOxct1-F	CATAAGGGGTGTGTCTGCTACT
		mOxct1-R	GCAAGGTTGCACCATTAGGAAT
mOxct2b-F	GGGAGTGTCCATTTCTACACG
		mOxct2b-R	CCCAGGTAGGAGCACACCA
mAacs-F	ATACCACTGGTCTGTCCGGTC
		mAacs-R	CGTGAGTAGACGATTCCACTGA
β-actin-F	GAGACCTTCAACACCCCAGC
		β-actin-R	ATGTCACGCACGATTTCCC

(30)其他试剂均为国产或进口分析纯。

2.1.2主要试剂的配制

(1)SDS-PAGE电泳缓冲液：向15.1g Tris-base、94g甘氨酸和5g SDS，中加入800mL双蒸水，搅拌溶解后定容至1000mL，室温保存。

(2)转膜缓冲液：向2.9g甘氨酸、5.8g Tris-base和0.37g SDS中加入600mL双蒸水，搅拌溶解后定容至800mL，最后加入200mL甲醇，室温保存。

(3)10×TBS缓冲液：向60.5g Tris-base，87.5g NaCl中加入800mL双蒸水，搅拌溶解后滴加浓盐酸调节pH为7.4，最后定容至1000mL，室温保存。

(4)TBST缓冲液：用10×TBS缓冲液配制1000mL 1×TBS缓冲液，然后加入1mLTween 20充分混匀，室温保存。

(5)封闭缓冲液：向5g脱脂奶粉中加入100mL TBST缓冲液，搅拌溶解立即使用或4℃保存(现用现配)。

(6)抗体缓冲液：向5g牛血清白蛋白加入到100mL TBST缓冲液，搅拌溶解立即使用或4℃保存(现用现配)。

2.1.3实验器械

(1)脑立体定位仪，套管，平口微量进样器(1μL，5μL)，购自深圳瑞沃德公司。

(2)超声破碎仪，购自宁波新芝科器研究所。

(3)X-射线胶片自动洗片机：购自德国Protec GmbH公司。

(4)制冰机，购自美国Scotsman公司。

(5)高速低温离心机，购自德国Eppendorff公司。

(6)蛋白质电泳槽及电泳电源，购自美国Bio-Rad公司。

(7)凝胶成像仪，购自美国Bio-Rad公司。

(8)小鼠位置偏好箱，购自淮北正华生物仪器设备有限公司。

(9)小鼠自发活动箱，购自淮北正华生物仪器设备有限公司。

(10)酶标仪，购自美国Thermo scientific公司。

(11)多标记检测仪，购自美国Perkin Elmer公司。

(1)称量纸，购自成都溶海科技有限公司。

(2)药匙，购自成都宝信生物工程有限公司。

(3)抗凝管，购自江苏康健医疗用品有限公司。

(4)1.5mL离心管，购自美国Axygen公司。

(5)15mL和50mL离心管，购自美国Corning公司。

(6)吸头(1mL，200μL，10μL)，购自美国Axygen公司。

(7)5mm核磁管，购自美国Sigma-Aldrich公司。

(8)5L液氮罐，购自成都金凤液氮容器有限公司。

(9)解剖器械，购自成都溶海科技有限公司。

(10)电子分析天平，购自德国Sartorius公司。

(11)移液器，购自德国Eppendorff公司。

(12)冰箱(4℃，-20℃)，购自日本Sanyo公司。

(13)超低温冰箱(-80℃)，购自日本Sanyo公司。

(14)纯水仪，购自德国Merck millipore公司。

(15)离心机，购自美国Thermo scientific公司。

(16)制冰机，购自美国Scotsman公司。

(17)氮吹仪，购自成都云鸿科技发展有限公司。

(18)生物安全柜，购自江苏苏净集团有限公司。

(19)超声破碎仪，购自宁波新芝科器研究所。

(20)高速低温离心机，购自德国Eppendorff公司。

(21)核酸电泳装置，购自美国Bio-Rad公司。

(22)PCR扩增仪，购自美国Multigene Gradient公司。

(23)Real-Time PCR仪，购自美国Bio-Rad公司。

(24)全自动血液生化分析仪，购自瑞士Roche公司。

(25)脱色摇床，购自成都建欣实验仪器有限公司。

(26)涡旋震荡器，购自德国IKA公司。

(27)恒温孵育箱，购自广州德祥科技有限公司。

2.2实验动物

雄性SPF级健康性成熟(10-12周)C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重20-22g，未交配过。饲养条件：国家成都新药安全性评价中心SPF级动物房，温度20-25℃，相对湿度55-65％，整个实验过程中，动物自由摄食和饮水。饲养环境符合国标GB14925-2001，实验动物许可证：SCXK(川)2003-01。

2.3脑立体定位手术

脑立体定位-埋管手术：将小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg,i.p.)麻醉后固定头部，并暴露颅骨。按照伏隔核脑区坐标^[32](AP+1.6；ML±1.0；DV–4.5)向双侧伏隔核脑区植入套管，并用牙科水泥固定。牙科水泥干后缝合伤口，拧紧套管帽。将动物置于电热毯上恢复7天，并每天给予青霉素肌注抗感染。

脑立体定位-慢病毒注射手术：将小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg,i.p.)麻醉后固定头部，并暴露颅骨。按照伏隔核脑区坐标(AP+1.6；ML±1.0；DV–4.5)，将预先装载了病毒(0.25μL/侧)的微量注射针植入双侧伏隔核脑区后，以0.1μL/min的速度将病毒注射到伏隔核脑区。注射完毕后，留针5min再退针。缝合伤口，将动物置于电热毯上恢复7天。

2.4脑内使用试剂配制及给药方式

Hymeglusin：白色粉末，不溶于水，溶于DMSO，溶解度是1mg/mL。溶剂对照的配制：用生理盐水按相应比例稀释DMSO。由于还未有研究者将Hymeglusin应用于动物试验，给药剂量为1μg/mL，于可卡因给药前30分钟，以0.1μL/min向脑内注射Hymglusin或溶剂对照，给药体积为1μL/侧。

2.5构建shRNA-HMGCS2慢病毒

Ⅰ、重组载体的制备

一、载体信息：

质粒名称:PLLU2G-shHmgcs2

基因名称：Hmgcs2

基因种属：Mus musculus

基因长度：1527bp

克隆载体：PLLU2G

载体抗性：Amp

基本方案：退火、酶切连接

二、材料与方法

(一)材料

1.仪器设备

1)PCR仪，美国BIO-RAD，型号PTC-220/ALS-1296G/ALD1244G；

2)电泳仪，北京市六一仪器厂，型号DYY-12；

3)水平电泳槽，北京市六一仪器厂，型号DYCP-31DN；

4)UV transilluminator,美国UVP，型号M-26；

5)小型离心机，美国Eppendorf，型号5418；

6)微波炉，中国美的，型号MW721AAU-PW；

7)风热式电热恒温干燥箱,广州东方电热干燥设备厂,型号东方－B；

8)恒温水浴锅，HENGAO,型号HWT-6B；

9)全温空气摇床，上海福玛实验设备有限公司，型号QYC-200；

2.试剂

1)QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN，货号28704；

2)质粒小提试剂盒，TIANGEN，货号DP103-02；

3)dNTP Mix，Fermentas，货号#R0192；

4)GeneRuler^TM100bp DNA Ladder，Fermentas，货号#SM0241；

5)HpaⅠ，TAKARA，货号D1064A；

6)XhoⅠ，TAKARA，货号D1094A；

7)T4DNA Ligase，TAKARA，货号D2011A；

8)5×Annealing Buffer for DNA Oligos，Beyotime，货号D0251；

9)Taq DNA Polymerase，Fermentas，货号EP0404；

(二)方法

1.根据靶基因Hmgcs2设计并合成1对shRNA oligo，oligo序列如下：

oligo名称	oligo序列5’to 3’
		shHmgcs2-F(SEQ ID NO.1)	TCGACTTCTACAAACCAAACTTCTCGAGAAGTTTGGTTTGTAGAAGTCGTTTTTC
shHmgcs2-R(SEQ ID NO.2)	TCGAGAAAAACGACTTCTACAAACCAAACTTCTCGAGAAGTTTGGTTTGTAGAAGTCGA
		Negative-F	TGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTTC
Negative-R	TCGAGAAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGCA

2.载体构建

2.1Oligo DNA的退火

1)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM，溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×)，混匀备用。

2)设置反应体系如下：

DEPC-water	40μl
		Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)	20μl
DNA oligo-F(50μM)	20μl
		DNA oligo-R(50μM)	20μl
Total volume	100μl

按照上述反应体系依次加入各种试剂，混匀。

3)设置PCR仪进行退火反应如下：

95℃	2min
		每8s下降0.1℃，降至25℃	约90min
4℃	长时间保存

4)-20℃冰箱保存。

2.2酶切载体PLLU2G

1)酶切体系设置如下：

2)37℃酶切3个小时

3)10×loading buffer终止反应，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳并切胶回收。

2.3DNA琼脂糖凝胶电泳回收参照天根的DNA琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，回收后再次电泳，并测浓度.。

2.4连接PLLU2G与shRNA片段

1)连接体系设置如下：

PLLU2G酶切回收产物(200～300ng)	3μl
		退火的Oligo DNA(1/10dilute)	1μl
10×T4DNA ligase buffer	2.5μl
		T4DNA ligase	1μl
H2O	17.5μl
		总体系	25μl

2)4℃连接过夜。

2.5转化stb13细菌

1)把10μL连接反应物加入到100μL STBL3Chemically Competent E.coli中，冰上孵育30分钟；

2)42℃热击细胞30秒；

3)立即转移到冰上孵育2分钟；

4)加入250μL S.O.C.medium，在37℃、225RPM.的摇床里孵育1小时；

5)把100μL转化物涂到含有100μg/mL Amp的LB平板上，37℃孵育过夜。

2.6PCR筛选阳性重组子。

1)PCR鉴定引物：

F：AGGCTTAATGTGCGATAAAAGAC

R：GAGCTTATCGATACCGTCGAC

2)PCR反应体系：

3)PCR扩增程序：

2.7挑取阳性克隆质粒。

2.8送交阳性克隆测序鉴定。

测序正向引物PLLU2G-CX-F：TGATAGGCTTGGATTTCT

三、实验结果

1.PCR鉴定结果

PLLU2G-shHmgcs2PCR鉴定图如图11所示，该PCR产物大小为279bp，与阳性对照条带在同一位置的克隆即为阳性克隆。

TTTCCCCGAA AAGTGCCACC TGAC。

2.测序鉴定结果

重组载体PLLU2G-shHmgcs2的结构图图谱如图12所示，其序列如SEQ ID NO.3所示。

PLLU2G-shcontrol全序列如SEQ ID NO.4所示。

Ⅱ、病毒包装及滴度测定

一、质粒信息

目的质粒名称：PLLU2G-shHmgcs2,PLLU2G-shcontrol

基因名称：shHmgcs2

辅助质粒名称：pLV/helper-SL3,pLV/helper-SL4,pLV/helper-SL5

抗药性：无

二、实验相关仪器设备

三、实验相关试剂材料

转染试剂：Lipofectamine 2000

转染细胞：293T

培养液：H-DMEM+10％FBS

转染混合液：无血清Opti-I培养液

其他耗材：10cm培养皿、5mL离心管、0.45μm滤器、0.25％胰酶

四、实验过程

1.病毒包装

1.1取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿5×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；

1.2第二天转染前去除旧的培养液，加入5mL新鲜的含10％血清DMEM培养液；制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，以一个10cm培养皿的用量为示范：

A.准备一支无菌的5mL离心管，先加入1.5mL无血清Opti-I培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒(各4ug)，轻轻颠倒混匀；

B.准备另外一支无菌的5mL离心管里，加入1.5mL无血清Opti-I培养液和40μL的Lipofectamine 2000，轻轻颠倒混匀。室温孵育5分钟；

C.5分钟后，将已稀释DNA加入到含有Lipofectamine 2000的无血清Opti-I培养液，轻轻颠倒混匀。室温孵育20分钟；

1.3将DNA-Lipofectamine 2000复合物一滴一滴地添加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中过夜培养；

1.4转染后一天，更换10mL含10％血清DMEM培养液。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养；

1.5转染后48小时收集培养上清进行浓缩；加入10mL新鲜的培养液继续培养，转染后72小时再次收集浓缩；

A.3000rpm低速离心15min，上清用0.45μm滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；

B.每个UT离心管装20mL滤液，50000×g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清；

C.取2mL的HBSS重悬病毒沉淀；

D.取UT离心管装15mL 20％蔗糖溶液，然后在溶液上方缓慢地加入2mL病毒悬液，50000×g高速离心120min纯化病毒，弃去上清；

E.取适量的培养液重悬病毒沉淀，分装进0.5mL进口AXYGEN管中，每管100μl。

1.6分装好的病毒放置-80℃保存。

2.滴度测定

2.1滴度检测前一天，以每孔5x10³个细胞(体积为100μl)接种293T细胞到96孔板中，每种病毒需要用到10个孔，平行稀释两次；

2.2滴度检测前一天，以每孔5x10³个细胞(体积为100μl)接种293T细胞到96孔板中，每种病毒需要用到20个孔，平行稀释两次；

2.3感染前，每种病毒需准备10个无菌的Ep管，在每个管中加入90μl的新鲜培养基(DMEM+10％FBS,高糖)；取待测定的病毒原液11μl加入到第一个管中，混匀后，从第一个管中取11μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管；再取待测定的病毒原液平行稀释一次。

2.4选取所需的细胞孔并在培养板盖上做上标记，吸去90μl培养基。如各管中稀释好的90μl病毒溶液，第一个管中病毒实际为9.9μl，认作10μl，记作1E1，第二管记作1E-0....第10管为1E-8；

2.537℃，5％CO2培养48小时后，加入新鲜培养基100μl，再经过24小时后，更换新鲜培养基150μl；(小心操作，避免细胞被吹起)

2.696小时后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而耐少。数出最后1个孔中含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数。将得到数值各自除以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值。(一般认为倒数第二个孔中的读数更准确〕

如：1E-5梯度读出5个荧光细胞，那么此病毒原液的病毒滴度为：5/1E-5＝5*10⁵TU/μl,即5*10⁸TU/mL。

1E1

1E-0

1E-1

1E-2

1E-3

1E-4

1E-5

1E-6

1E-7

1E-8

阴性对照

阴性对照

1E1

1E-0

1E-1

1E-2

1E-3

1E-4

1E-5

1E-6

1E-7

1E-8

阴性对照

阴性对照

五、实验结果

1.病毒包装结果

PLLU2G-shHmgcs2质粒转染293T细胞48h病变情况如图13所示(200×视野，20mm荧光曝光率)。

PLLU2G-shcontrol质粒转染293T细胞48h病变情况如图14所示(200×视野，20mm荧光曝光率)：

2.滴度测定结果

PLLU2G-shHmgcs2滴度结果：

PLLU2G-shcontrol滴度结果：

2.6可卡因条件性位置偏好模型的建立

动物实验中所有操作均符合AAALAC要求，小鼠条件性位置偏好(CPP)模型建立方法如下，小鼠位置偏好箱如图1所示：

开始试验前3-5天，每天由同一操作人员对小鼠进行抚摸，让动物对操作人员有一定的适应。

将小鼠放入CPP箱体内，将CPP箱体隔板通道口打开，让动物在箱体内自由穿梭，适应性训练三天，第四天测定动物在黑箱和白箱停留的时间及穿梭次数作为初始测试(Pretest)的数据。每次适应训练和测试时间均为15分钟。初始测试时，当动物在一侧(黑白两侧)停留的时间差(Pretest score)超过200s或穿梭次数低于20次时，应当剔除。

将动物停留时间较长的一侧作为自然偏好箱，然后进行腹腔注射给药，给药剂量如下(表1)。

连续给药6天。盐酸可卡因组给予生理盐水时放入自然偏好箱；给予盐酸可卡因时，放入非自然偏好箱，每次训练15分钟。对照组每次给予生理盐水并放入对应箱体内(图2)。

第11天将CPP箱体隔板通道口打开，让动物自由穿梭，并测定动物在黑箱和白箱停留的时间及穿梭次数。本次测试时，将动物在初始偏好箱中停留的时间与初始非偏好箱中停留的时间差记录为Prest score。测试结束30分钟内解剖动物。

动物的CPP评分即为Test score与Pretest score的差值。

表1 可卡因给药途径、给药剂量、给药体积汇总表

2.7小鼠行为敏化模型

动物实验中所有操作均符合AAALAC(国际实验动物评估和认可委员会)要求，小鼠自发活动行为敏化模型的建立如下，小鼠自发活动箱如图3所示：

开始试验前3-5天，每天由同一操作人员对小鼠进行抚摸，让动物对操作人员有一定的适应。

将小鼠放入自发活动箱体内，让动物在箱体内自由活动，适应性训练三天后，连续三天测定动物在箱体内活动的距离，作为基线(Baseline)数据。每次适应训练和测试时间均为15分钟。在三次测定基线的过程中，基线数据(Baseline1/2/3)与平均水平存在显著性差异时，应当剔除对应的动物。

开始给药周期后，每天记录动物在腹腔注射给药后的在箱体内的活动距离，连续给药7天。给药剂量同CPP模型(表1)。

第7天给药结束后30分钟内解剖。

2.8蛋白提取

RIPA裂解液中包含50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂，可以有效抑制蛋白降解。具体操作步骤如下：

(1)使用前向RIPA裂解液中加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

(2)向组织加入含有PMSF的裂解液，超声波破碎细胞至充分无明显组织颗粒后4℃，13000g离心10min，收集上清液。

(3)使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，对上清液中蛋白浓度进行定量后，加入含有PMSF的裂解液和5×SDS上样缓冲液，调整为统一的浓度。100℃水浴加热使蛋白变性5min，即可进行后续的蛋白免疫印迹(Western blot)等操作，或于-20℃保存，一周内使用。

2.9蛋白质免疫印迹(western blot)

(1)配制SDS-PAGE凝胶：上层浓缩胶的胶浓度为5％，下层分离胶的胶浓度为10％。

(2)电泳：每孔蛋白上样量为30-50μg，60V电泳30min左右至样品进入分离胶后，80V电泳80min左右，分离样品。

(3)转膜：电泳即将结束前，将大小适中的PVDF膜置于甲醇中浸泡10s活化后，与6张同等大小的滤纸一起置于转膜缓冲液中备用。电泳结束后，将凝胶、滤纸和PVDF膜按照(黑面)海绵-3张滤纸-凝胶-PVDF膜-3张滤纸-海绵(红面)的顺序制成转膜“三明治”结构，排除各层间的气泡，并置于转膜夹内，以300mA恒流转膜60min。

(4)封闭：转膜结束后，将PVDF膜作好标记转入封闭缓冲液中室温封闭1.5h。

(5)抗体孵育和洗膜：用抗体缓冲液将一抗稀释至合适浓度后包被PVDF膜，4℃孵育过夜；次日37℃孵育1h使一抗回温；室温用TBST(8min/次，共4次)洗去膜表面多余的一抗；用抗体缓冲液将二抗稀释至合适浓度后包被PVDF膜，室温孵育1h；TBST(8min/次，共4次)洗去膜表面多余的二抗；1×TBS(8min/次，共2次)洗去膜表面TBST中的吐温。

(6)曝光：PVDF膜上均匀滴加显影液，暗室内曝光。

2.10数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。单向方差分析(ANOVA)，用于衡量条件性位置偏好试验和自发活动行为敏化试验的统计学差异。学生t检验用于衡量RT-PCR和蛋白质免疫印迹试验的统计学差异。p<0.05代表试验组间差异具有统计学意义。

3实验结果

3.1伏隔核HMGCS2的表达和活性

根据前期代谢组学、能量形式和代谢基因表达的研究结果，可卡因成瘾小鼠伏隔核内生酮代谢通路较为活跃。对可卡因条件性位置偏好小鼠伏隔核内的生酮关键酶—HMGCS2的蛋白表达情况进行检测显示，可卡因成瘾小鼠伏隔核的HMGCS2表达显著升高(图4A)。

单次注射可卡因30分钟、24小时后，以及连续可卡因注射7天后，HMGCS2表达增加(图4B)。可卡因成瘾小鼠伏隔核的HMGCS2酶活性升高(图4C)。

这些结果说明HMGCS2的表达和活性在可卡因成瘾过程中上调。

3.2抑制伏隔核HMGCS2酶活性对可卡因行为敏化的影响

采用HMGCS2小分子抑制剂Hymeglusin进行药理性干扰研究。Hymeglusin对HMGCS2的活性半胱氨酸残基上进行共价修饰形成硫酯加合物从而实现抑制作用。可卡因给药前30分钟向伏隔核脑区注射Hymglusin，再进行后续的行为敏化试验。试验流程见图5A。

小鼠自发活动行为敏化试验结果表明，伏隔核内给予Hymeglusin的可卡因成瘾小鼠的活动距离显著缩短(图5B)。Hymeglusin未对生理盐水对照组小鼠的自发活动造成影响。HMGCS2酶活性检测显示，Hymeglusin降低可卡因成瘾小鼠和生理盐水对照组HMGCS2的酶活性(图5C)。上述结果说明抑制HMGCS2的酶活性，有效减弱可卡因诱导的小鼠行为敏化。

3.3抑制伏隔核HMGCS2酶活性对可卡因条件性位置偏好的影响

可卡因给药前30分钟脑内注射Hymglusin，再进行后续的条件性位置偏好训练。给药方式见图6A。

小鼠条件性位置偏好结果(图6B)表明，Hymeglusin未对生理盐水对照组小鼠的位置偏好造成影响，但减弱了可卡因成瘾小鼠的条件性位置偏好程度。伏隔核HMGCS2的mRNA(图6C)和蛋白水平(图6D)在给予Hymeglusin后未变化，说明Hymeglusin不影响HMGCS2的转录和表达。上述结果表明干扰HMGCS2的活性，有效减弱可卡因诱导的小鼠条件性位置偏好行为。

3.4抑制伏隔核HMGCS2酶活性对可卡因诱导能量紊乱的影响

Hymeglusin预处理后可卡因条件性位置偏好小鼠的伏隔核内的ATP含量较溶剂对照处理组显著升高，说明能量消耗减少(图7A)。升高的乙酰辅酶A(图7B)、下调的柠檬酸合酶的酶活性(图7C)和增加的NAD+/NADH(图7D)共同说明Hymeglusin减弱可卡因成瘾小鼠伏隔核内的三羧酸循环。这些结果表明，小分子抑制剂Hymeglusin干扰生酮关键酶HMGCS2的酶活性，有效改善可卡因诱导的脑能量代谢异常。

3.5伏隔核沉默Hmgcs2对可卡因行为敏化的影响

为了确证HMGCS2在可卡因诱导的成瘾行为中的作用，通过慢病毒沉默伏隔核的Hmgcs2基因进行干扰研究。对注射慢病毒后的小鼠全脑进行切片，通过免疫荧光观察标记绿色荧光蛋白的慢病毒所在区域，确认病毒准确注射到伏隔核脑区(图8A)。

伏隔核定位注射沉默Hmgcs2基因的慢病毒或对照慢病毒后一周，进行小鼠自发活动行为敏化试验。如图8B所示，接受沉默Hmgcs2慢病毒注射的可卡因成瘾小鼠的活动距离显著缩短。脑内给予对照慢病毒未对生理盐水对照组小鼠的自发活动造成影响。检测慢病毒注射后伏隔核HMGCS2的mRNA和蛋白水平检测表明，HMGCS2的mRNA基因转录水平降低(图8C)，HMGCS2的蛋白表达减少(图8D)。图8C和8D证明，慢病毒干扰可以有效下调Hmgcs2基因的转录和HMGCS2蛋白水平的表达。上述结果说明伏隔核内沉默Hmgcs2基因，下调HMGCS2的表达可有效减弱可卡因诱导的行为敏化。

3.6伏隔核沉默Hmgcs2对可卡因条件性位置偏好的影响

伏隔核慢病毒注射手术后一周，进行可卡因条件性位置偏好训练后显示，给予对照慢病毒的生理盐水对照组小鼠的位置偏好未发生变化；给予沉默Hmgcs2基因慢病毒后，可卡因成瘾小鼠的条件性位置偏好程度下降(图9A)。给予沉默Hmgcs2基因慢病毒后，伏隔核HMGCS2酶活性降低(图9B)。这表明伏隔核沉默Hmgcs2基因会干扰HMGCS2的表达，同时抑制HMGCS2的酶活性，有效减弱可卡因诱导的条件性位置偏好行为。

3.7伏隔核沉默Hmgcs2对可卡因诱导能量紊乱的影响

如图10A所示，慢病毒注射沉默Hmgcs2基因后进行可卡因条件性位置偏好训练小鼠的伏隔核内ATP含量较溶剂对照处理组升高，说明ATP的消耗减少。同时，乙酰辅酶A的含量升高(图10B)，说明进入三羧酸循环供能的乙酰辅酶A减少。

三羧酸循环的关键酶—柠檬酸合酶的酶活性也下降约50％(图10C)，说明沉默Hmgcs2下调可卡因成瘾小鼠伏隔核内的三羧酸循环活化程度。同时，指示三羧酸循环效率的NAD⁺/NADH升高(图10D)，说明三羧酸循环通路趋缓。这些能量形式的变化说明在可卡因诱导的条件性位置偏好小鼠脑内，通过慢病毒沉默Hmgcs2干扰伏隔核生酮关键酶HMGCS2的表达和活性，可以减缓三羧酸循环，降低能量消耗，改善可卡因成瘾的脑能量代谢应激。

4结论

实验结果发现，通过抑制HMGCS2的活性或者用shRNA沉默Hmgcs2基因的表达，都可以显著减轻可卡因成瘾的行为敏化和条件性位置偏好程度，治疗可卡因成瘾。

综上，HMGCS2抑制剂能够有效弱化可卡因奖赏行为，减轻行为敏化和条件性位置偏好程度，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

Claims (3)

1.HMGCS2抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途；

所述HMGCS2抑制剂是化合物I，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是以HMGCS2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述制剂是注射制剂。